Пензенська ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
Пензенська ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ ІНСТИТУТ
Курсова робота з біологічної хімії на тему:
Молекулярні механізми різноманіття антитіл
1.2. Будова антитіл і їх різноманіття ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .7
1.3. Тонка структура антитіл ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 13
2. Молекулярні механізми різноманіття антитіл ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .16
Вже на ранніх стадіях свого розвитку В-і Т-клітини з рецепторами для антигенних детермінант молекул власного організму елімінуються або супрессірующего; в результаті імунна система в нормі здатна відповідати тільки на чужорідні антигени. Зв'язування чужорідного антигену з лимфоцитом викликає імунну відповідь, спрямований проти цього антигену. При цьому деякі з лімфоцитів проліферують і диференціюються в клітини пам'яті, так що при вторинному впливі того ж антигену імунну відповідь розвивається швидше і виявляється набагато сильнішим.
Як і пророкувала гіпотеза клональною селекції, всі молекули антитіл, вироблені якоїсь однієї У-кліткою, мають однаковий антиген-зв'язуючий ділянку. Перші антитіла, синтезовані знову утворилася По-кліткою, не секретуються; замість цього вони вбудовуються в плазматичну мембрану, де служать рецепторами для антигену. Кожна В-клітина має на своїй плазматичної мембрани приблизно 10 5 таких молекул. Коли антиген приєднується до молекул антитіл на поверхні спочиває В-клітини, це зазвичай ініціює складний і маловивчену ланцюг подій, що приводить до клітинної проліферації і диференціювання з утворенням клітин, які секретують антитіла. Такі клітини, виробляють великі кількості розчинних (не пов'язаних з мембраною) антитіл з таким же антиген-зв'язує ділянкою, що і у антитіл на поверхні клітин, і виділяють ці антитіла в кров. Активовані В-клітини можуть почати секретувати антитіла, будучи ще малими лімфоцитами; кінцева стадія цього шляху диференціювання - велика плазматична клітка, яка виділяє антитіла зі швидкістю близько 2000 молекул в секунду. Мабуть, плазматичні клітини використовують для виробництва антитіл таку значну частину потужності свого білоксинтезуючої апарату, що не здатні до подальшого росту і поділу і гинуть після кількох днів секреції антитіл.
Найпростіші молекули антитіл мають форму букви Y з двома ідентичними антиген-зв'язуючими ділянками - по одному на кінці кожної з двох «гілок» (рис. 1). Оскільки таких ділянок два, ці антитіла називають валентними. Такі антитіла можуть зшивати молекули антигену в велику мережу, якщо кожна молекула антигену має три або більше число антигенних детермінант. Досягши певних розмірів, така мережа випадає з розчину. Як ми побачимо пізніше, тенденція великих імунних комплексів до осадження (преципітації) зручна для виявлення антитіл і антигенів. Ефективність реакцій зв'язування і зшивання антигену антитілами значно зростає завдяки гнучкому шарнірному ділянці в місці з'єднання обох «гілок» з «хвостом»: ця ділянка дозволяє змінювати відстань між двома антиген-зв'язуючими ділянками (рис. 2). Захисна дія антитіл пояснюється не просто їх здатністю зв'язувати антиген. Вони виконують і цілий ряд інших функцій, в яких бере участь «хвіст». Ця область молекули визначає, що станеться з антигеном, якщо він виявився пов'язаним. Антитіла з однаковими антиген-зв'язуючими ділянками можуть мати дуже різні «хвостові» області, а тому й різні функціональні властивості.
Малюнок 1. Сильно спрощена схема молекули антитіла з двома ідентичними антиген-пов'язую щими ділянками.
Малюнок 2. Шарнірний ділянку молекули антитіла підвищує ефективність зв'язування молекул антигену і зшивання їх один з одним.
1.2. Будова антитіл і їх різноманіття
Основну структурну одиницю молекули антитіла утворюють чотири поліпептидні ланцюги - дві ідентичні легкі (L-ланцюги, кожна приблизно з 220 амінокислот) і дві ідентичні важкі (Н-ланцюги, кожна приблизно з 440 амінокислот). Всі чотири ланцюга з'єднані між собою за допомогою Нековий-лентних взаємодій і ковалентних зв'язків (дисульфідних містків). Молекула складається з двох однакових половинок, у яких L-і Н-ланцюги вносять майже рівний внесок у побудову двох ідентичних антиген-пов'язую-щих ділянок (рис. 3).
Малюнок 3. Схематичне зображення типової молекули антитіла лу складається з двох ідентичних важких (Н) і двох ідентичних легких (L) ланцюгів. Антиген-зв'язуючі ділянки формуються за рахунок комплексу N-кінцевих областей L - і Н-ланцюгів, а область «хвоста» утворюють лише Н-ланцюги. Кожен ланцюг містить одну або дек ільки олігосахаридних ланцюжків, нкції в режимі яких не відома.
Протеолітичні ферменти папаїн і пепсин розщеплюють молекули антитіл на різні характерні фрагменти: папаїн дає два окремих ідентичних Fab-фрагменти, кожен з яких має один антиген-зв'язує ділянкою, і один Fc-фрагмент (Fab - скорочення слів fragment antigen binding; Fc означає «кристалізується фрагмент» (від crystallizable).; пепсин дає один Р (аb ') 2-фрагмент, що складається з двох ковалентно пов'язаних Р (аb')-фрагмент (кожен з яких трохи більше, ніж Fab-фрагмент), і багато більш легких фрагментів (рис. 4). Оскільки Р (аb ') 2-фрагменти бівалентний на відміну від моновалентних Fab-фрагментів зберігають здатність зв'язувати антигени і утворювати преципітати. Жоден з цих фрагмент володіє іншими біологічними властивостями нативних молекул антигенів оскільки вони не містять «хвостової» (Fc) області, визначає їх властивості.
Малюнок 5. Різні фрагменти, які утворюються при розщепленні молекул антитіл двома різними протеолітичними ферментами (папаїном і пепсином), допомогли дослідникам у з'ясуванні четирехцепочечной структури антитіл.
Існує п'ять різних класів Н-ланцюгів, кожен
зі своїми особливими біологічними властивостями
У вищих хребетних існують п'ять різних класів антитіл - IgA IgE, IgG і IgM, кожен зі своїм класом Н-ланцюгів - a, b, е, g, і m відповідно. Молекули IgA містять a-ланцюга, молекули IgG-g-ланцюга. Крім того, є ряд підкласів IgG та деяких інших імуноглобулінів. Різні Н-ланцюги надають «хвостовим» областям антитіл різну конформацію і визначають характерні властивості кожного класу.
IgG-антитіла складають основний клас імуноглобулінів, що знаходиться в крові. Вони виробляються у великих кількостях при вторинному імунній відповіді. Fc-область молекул IgG зв'язується зі специфічними рецепторами фагоцитуючих клітин, таких як макрофаги і поліморфноядерні лейкоцити, і в результаті ці клітини можуть більш ефективно поглинати і руйнувати упровадилися мікроорганізми, вкриті IgG-антитілами (рис. 6).
Молекули IgG-єдині антитіла, які можуть переходити від матері до плоду. Клітини плаценти, дотичні з материнською кров'ю, мають рецептори, що зв'язують Fc-області молекул IgG і забезпечують тим самим їх перехід в плід. Антитіла спочатку поглинаються шляхом ендоці-Тоза за участю рецепторів, а потім транспортуються через клітку і виводяться шляхом екзоцитозу в кров плоду. Антитіла інших класів не зв'язуються з цими рецепторами і тому не можуть проходити через плаценту.
Малюнок 6. Ця схема показує, як бактерія, покрита антитілами IgG, ефективно фагоцитируется макрофагами, що мають на своїй поверхні рецептори, здатні зв'язувати Fc-область молекули IgG. Зв'язування бакте рії з цими рецепторами активи рілої процес фагоцитозу.
Хоча IgG-явно переважає клас антитіл, утворених при більшості вторинних імунних відповідей, на ранніх стадіях первинної імунної відповіді в кров надходять головним чином антитіла IgM. У секретируемой формі IgM представляє собою пентамер, що складається з п'яти четирехцепочечних одиниць, так що в цілому IgM має 10 антиген-пов'язую-щих ділянок. Такі пентамери навіть більш ефективно, ніж IgG, активують систему комплементу, коли вони зв'язуються з антигеном. Кожен пентамер містить полипептидную ланцюг ще одного типу, звану J-ланцюгом (joining chain, ~ 20 000 дальтон). J-ланцюг синтезується IgM-секретуючими клітинами, ковалентно вбудовується між двома суміжними Fc-областями і, мабуть, ініціює процес олігомеризації. IgM-це також перший клас антитіл, які продукуються розвиваються В-клітинами, хоча багато В-клітини з часом переходять на вироблення антитіл інших класів. Безпосередні попередники В-клітин, так звані пре-В-клітини, виробляють μ-ланцюга (але не легкі ланцюги) і накопичують їх. Пізніше, коли в пре-В-клітинах починають синтезуватися і легкі ланцюги, вони з'єднуються з j-ланцюгами, утворюючи з ними четирехцепочечние молекули IgM (кожна з двома μ-ланцюгами і двома легкими ланцюгами), які вбудовуються в плазматичну мембрану, де служать рецепторами для антигену. З цього моменту клітини стають В-лімфоцитами і здатні реагувати на антиген. Хоча вбудовуватися в мембрани (як антиген-специфічних рецепторів) і секретуватися у водорозчинній формі можуть антитіла всіх класів, на поверхні більшості покояться В-клітин знаходяться головним чином антитіла IgM та IgD. Дивно, що лише дуже небагато В-клітини активуються для секреції антитіл IgD, і в цього класу не відомо жодної функції, окрім ролі рецепторів для антигену.
IgA-основний клас антитіл в секретах (молоці, слині, сльозах, секрети дихальних шляхів і кишкового тракту). Вони існують або у вигляді пари-рехцепочечного мономеру (подібно IgG), або у вигляді димеру. Молекули IgA у складі секретів представляють собою димер, що містять одну J-ланцюг, а також додаткову поліпептидний ланцюг, звану секреторне компонентом, яку димери IgA набувають на поверхні епітеліальних клітин, що вистилають кишечник, бронхи або протоки молочних, слинних або слізних залоз. Секреторний компонент синтезується епітеліальними клітинами і експонується спочатку на їх базальної поверхні, де служить рецептором для зв'язування IgA з крові. Утворені комплекси IgA з секреторним компонентом поглинаються шляхом ендоцитозу за участю рецепторів, проходять через цитоплазму епітеліальної клітини і виводяться в протоку на протилежній стороні клітини. На додаток до такої транспортної ролі секреторний компонент, можливо, захищає молекули IgA від перетравлення протеолітичними ферментами секретів.
Fc-область молекул IgE зв'язується зі специфічними рецепторними білками на поверхні тучних клітин в тканинах і базофільних лейкоцитів у крові з дуже високою спорідненістю (> 10 10 літрів / моль). У свою чергу пов'язані молекули IgE служать рецепторами для антигену: приєднання до них антигену призводить до секреції клітинами біологічно активних амінів (зокрема, гістаміну, а у деяких видів - серотоніну). Їх захисна функція менш зрозуміла, однак передбачається, що вони роблять ділянку запалення більш доступною для лейкоцитів, антитіл та компонентів комплементу.
1.3. Тонка структура антитіл
Унікальна особливість антитіл полягає в тому, що вони існують у величезному числі різних варіантів: кожен клас імуноглобулінів містить мільйони різних антитіл, кожне з яких відрізняється від інших своїм антиген-зв'язує ділянкою і амінокислотною послідовністю. Тому кожен з таких видів антитіл становить менше однієї мільйонної частки всіх молекул імуноглобулінів, що є в крові. Цей факт поставив іммунохіміков перед надзвичайно складною проблемою білкової хімії: яким чином можна отримати достатню кількість якого-небудь антитіла для визначення його амінокислотної послідовності і тривимірної структури?
Проблема отримання індивідуальних антитіл була вирішена завдяки специфічному властивості пухлинних клітин, що утворюються при множинній мієломі - злоякісному захворюванні, при якому в кістковому мозку розвиваються множинні пухлини. Ці пухлини секретують у кров великі кількості антитіл одного виду. Такі антитіла гомогенні, або моноклональних, оскільки рак зазвичай починається з неконтрольованого зростання однієї-єдиної клітини, у даному випадку це плазматична клітка, секретуюча антитіла. Антитіло, що накопичується в крові, називають мієломні білком.
Ще з минулого століття було відомо, що сеча хворих, що страждають цим захворюванням, часто містить незвичайні білки, названі білками Бене-Джонса - По імені англійського лікаря, який їх уперше описав. Проте лише в 50-х роках нашого століття з'ясувалося, що ці білки представляють собою вільні L-ланцюги імуноглобулінів. Значна частина відомостей про детальну структурі антитіл була отримана при вивченні мієломних білків із сечі або крові хворих або ж білків від мишей, у яких були цілеспрямовано індуковані аналогічні форми раку.
При порівнянні амінокислотних послідовностей безлічі різних мієломних білків виявилася вражаюча особливість, що має важливий і несподіваний генетичний підтекст. N-кінцева частина послідовно як L-, так і Н-ланцюгів надзвичайно мінлива, а С-кінцева - постійна, приклад, якщо порівняти амінокислотні послідовності великого числа різних мієломних х-кіл (кожна довжиною близько 220 амінокислот) виявиться, що С-кінцеві половини у них однакові або розрізняються незначно, тоді як N-кінцеві половини всі різні. Таким чином, L-ланцюги містять константну область приблизно з 110 амінокислот і варіабельна область такої ж довжини. N-кінцева варіабельна область Н-ланцюги теж складається приблизно з 110 амінокислот, а константних, в залежності від класу антитіл, - з 330 або 440 амінокислот.
Саме N-кінцеві частини L-і Н-ланцюгів спільно утворюють ант зв'язує ділянку, і варіабельність їх амінокислотних послідовник-ностей забезпечує структурну основу для різноманітності таких ділянок. У зв'язку з існуванням вариабельной і константної областей в молекулах антитіл виникають важливі генетичні проблеми. Але ще до того як стало можливим пряме вивчення цих питань, в результаті дослідження мієломних білків з'ясувалися інші риси структури антитіл.
Пензенська ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ ІНСТИТУТ
Курсова робота з біологічної хімії на тему:
Молекулярні механізми різноманіття антитіл
Пенза 2004
ЗМІСТ:Введення ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 3
1. Будова антитіл ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 4
1.1. Функціональні властивості антитіл ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .41.2. Будова антитіл і їх різноманіття ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .7
1.3. Тонка структура антитіл ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 13
2. Молекулярні механізми різноманіття антитіл ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .16
Список літератури ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 28
ВСТУП
За наявними оцінками, у миші може вироблятися від 10 6 до 10 12 різних молекул антитіл, сукупність яких називають репертуаром. Цей репертуар, мабуть, досить великий для того, щоб майже для кожної антигенної детермінанти знайшовся відповідний антиген-зв'язуючий ділянку. Оскільки антитіла представляють собою білки, а білки копіюються генами, здатність тварини виробляти мільйони різних антитіл являє собою надзвичайно складну генетичну проблему: як синтезувати мільярди різних білків, не привертаючи до цього надмірно великої кількості генів. У вирішенні цієї проблеми бере участь ряд унікальних поза генетичних механізмів.1. будова антитіл
Імунна система виробилася в процесі еволюції хребетних для захисту від інфекцій. Вона складається з мільярдів лімфоцитів і включає мільйони різних клонів. Лімфоцити кожного клону несуть на своїй поверхні рецептор, який дозволяє їм пов'язувати ту чи іншу «антигенну детермінанту» - певну угрупування в молекулі антигена. Існують два класи лімфоцитів: В-клітини, що виробляють антитіла, і Т-клітини, які здійснюють імунні реакції клітинного типу.Вже на ранніх стадіях свого розвитку В-і Т-клітини з рецепторами для антигенних детермінант молекул власного організму елімінуються або супрессірующего; в результаті імунна система в нормі здатна відповідати тільки на чужорідні антигени. Зв'язування чужорідного антигену з лимфоцитом викликає імунну відповідь, спрямований проти цього антигену. При цьому деякі з лімфоцитів проліферують і диференціюються в клітини пам'яті, так що при вторинному впливі того ж антигену імунну відповідь розвивається швидше і виявляється набагато сильнішим.
1.1. Функціональні властивості антитіл
Єдина відома функція В-лімфоцитів - вироблення антитіл. Унікальна особливість антитіл, що відрізняє їх від усіх інших відомих білків, полягає в тому, що вони можуть існувати у мільйонах різновидів - кожна зі своїм унікальним ділянкою для зв'язування антигену. У сукупності звані імуноглобулінами (Скорочено Ig) антитіла утворюють один з основних класів білків крові, складаючи по вазі приблизно 20% сумарного білка плазми.Як і пророкувала гіпотеза клональною селекції, всі молекули антитіл, вироблені якоїсь однієї У-кліткою, мають однаковий антиген-зв'язуючий ділянку. Перші антитіла, синтезовані знову утворилася По-кліткою, не секретуються; замість цього вони вбудовуються в плазматичну мембрану, де служать рецепторами для антигену. Кожна В-клітина має на своїй плазматичної мембрани приблизно 10 5 таких молекул. Коли антиген приєднується до молекул антитіл на поверхні спочиває В-клітини, це зазвичай ініціює складний і маловивчену ланцюг подій, що приводить до клітинної проліферації і диференціювання з утворенням клітин, які секретують антитіла. Такі клітини, виробляють великі кількості розчинних (не пов'язаних з мембраною) антитіл з таким же антиген-зв'язує ділянкою, що і у антитіл на поверхні клітин, і виділяють ці антитіла в кров. Активовані В-клітини можуть почати секретувати антитіла, будучи ще малими лімфоцитами; кінцева стадія цього шляху диференціювання - велика плазматична клітка, яка виділяє антитіла зі швидкістю близько 2000 молекул в секунду. Мабуть, плазматичні клітини використовують для виробництва антитіл таку значну частину потужності свого білоксинтезуючої апарату, що не здатні до подальшого росту і поділу і гинуть після кількох днів секреції антитіл.
Найпростіші молекули антитіл мають форму букви Y з двома ідентичними антиген-зв'язуючими ділянками - по одному на кінці кожної з двох «гілок» (рис. 1). Оскільки таких ділянок два, ці антитіла називають валентними. Такі антитіла можуть зшивати молекули антигену в велику мережу, якщо кожна молекула антигену має три або більше число антигенних детермінант. Досягши певних розмірів, така мережа випадає з розчину. Як ми побачимо пізніше, тенденція великих імунних комплексів до осадження (преципітації) зручна для виявлення антитіл і антигенів. Ефективність реакцій зв'язування і зшивання антигену антитілами значно зростає завдяки гнучкому шарнірному ділянці в місці з'єднання обох «гілок» з «хвостом»: ця ділянка дозволяє змінювати відстань між двома антиген-зв'язуючими ділянками (рис. 2). Захисна дія антитіл пояснюється не просто їх здатністю зв'язувати антиген. Вони виконують і цілий ряд інших функцій, в яких бере участь «хвіст». Ця область молекули визначає, що станеться з антигеном, якщо він виявився пов'язаним. Антитіла з однаковими антиген-зв'язуючими ділянками можуть мати дуже різні «хвостові» області, а тому й різні функціональні властивості.
Малюнок 1. Сильно спрощена схема молекули антитіла з двома ідентичними антиген-пов'язую щими ділянками.
Малюнок 2. Шарнірний ділянку молекули антитіла підвищує ефективність зв'язування молекул антигену і зшивання їх один з одним.
1.2. Будова антитіл і їх різноманіття
Основну структурну одиницю молекули антитіла утворюють чотири поліпептидні ланцюги - дві ідентичні легкі (L-ланцюги, кожна приблизно з 220 амінокислот) і дві ідентичні важкі (Н-ланцюги, кожна приблизно з 440 амінокислот). Всі чотири ланцюга з'єднані між собою за допомогою Нековий-лентних взаємодій і ковалентних зв'язків (дисульфідних містків). Молекула складається з двох однакових половинок, у яких L-і Н-ланцюги вносять майже рівний внесок у побудову двох ідентичних антиген-пов'язую-щих ділянок (рис. 3).
Малюнок 3. Схематичне зображення типової молекули антитіла лу складається з двох ідентичних важких (Н) і двох ідентичних легких (L) ланцюгів. Антиген-зв'язуючі ділянки формуються за рахунок комплексу N-кінцевих областей L - і Н-ланцюгів, а область «хвоста» утворюють лише Н-ланцюги. Кожен ланцюг містить одну або дек ільки олігосахаридних ланцюжків, нкції в режимі яких не відома.
Протеолітичні ферменти папаїн і пепсин розщеплюють молекули антитіл на різні характерні фрагменти: папаїн дає два окремих ідентичних Fab-фрагменти, кожен з яких має один антиген-зв'язує ділянкою, і один Fc-фрагмент (Fab - скорочення слів fragment antigen binding; Fc означає «кристалізується фрагмент» (від crystallizable).; пепсин дає один Р (аb ') 2-фрагмент, що складається з двох ковалентно пов'язаних Р (аb')-фрагмент (кожен з яких трохи більше, ніж Fab-фрагмент), і багато більш легких фрагментів (рис. 4). Оскільки Р (аb ') 2-фрагменти бівалентний на відміну від моновалентних Fab-фрагментів зберігають здатність зв'язувати антигени і утворювати преципітати. Жоден з цих фрагмент володіє іншими біологічними властивостями нативних молекул антигенів оскільки вони не містять «хвостової» (Fc) області, визначає їх властивості.
Малюнок 5. Різні фрагменти, які утворюються при розщепленні молекул антитіл двома різними протеолітичними ферментами (папаїном і пепсином), допомогли дослідникам у з'ясуванні четирехцепочечной структури антитіл.
Існує п'ять різних класів Н-ланцюгів, кожен
зі своїми особливими біологічними властивостями
У вищих хребетних існують п'ять різних класів антитіл - IgA IgE, IgG і IgM, кожен зі своїм класом Н-ланцюгів - a, b, е, g, і m відповідно. Молекули IgA містять a-ланцюга, молекули IgG-g-ланцюга. Крім того, є ряд підкласів IgG та деяких інших імуноглобулінів. Різні Н-ланцюги надають «хвостовим» областям антитіл різну конформацію і визначають характерні властивості кожного класу.
IgG-антитіла складають основний клас імуноглобулінів, що знаходиться в крові. Вони виробляються у великих кількостях при вторинному імунній відповіді. Fc-область молекул IgG зв'язується зі специфічними рецепторами фагоцитуючих клітин, таких як макрофаги і поліморфноядерні лейкоцити, і в результаті ці клітини можуть більш ефективно поглинати і руйнувати упровадилися мікроорганізми, вкриті IgG-антитілами (рис. 6).
Молекули IgG-єдині антитіла, які можуть переходити від матері до плоду. Клітини плаценти, дотичні з материнською кров'ю, мають рецептори, що зв'язують Fc-області молекул IgG і забезпечують тим самим їх перехід в плід. Антитіла спочатку поглинаються шляхом ендоці-Тоза за участю рецепторів, а потім транспортуються через клітку і виводяться шляхом екзоцитозу в кров плоду. Антитіла інших класів не зв'язуються з цими рецепторами і тому не можуть проходити через плаценту.
Малюнок 6. Ця схема показує, як бактерія, покрита антитілами IgG, ефективно фагоцитируется макрофагами, що мають на своїй поверхні рецептори, здатні зв'язувати Fc-область молекули IgG. Зв'язування бакте рії з цими рецепторами активи рілої процес фагоцитозу.
Хоча IgG-явно переважає клас антитіл, утворених при більшості вторинних імунних відповідей, на ранніх стадіях первинної імунної відповіді в кров надходять головним чином антитіла IgM. У секретируемой формі IgM представляє собою пентамер, що складається з п'яти четирехцепочечних одиниць, так що в цілому IgM має 10 антиген-пов'язую-щих ділянок. Такі пентамери навіть більш ефективно, ніж IgG, активують систему комплементу, коли вони зв'язуються з антигеном. Кожен пентамер містить полипептидную ланцюг ще одного типу, звану J-ланцюгом (joining chain, ~ 20 000 дальтон). J-ланцюг синтезується IgM-секретуючими клітинами, ковалентно вбудовується між двома суміжними Fc-областями і, мабуть, ініціює процес олігомеризації. IgM-це також перший клас антитіл, які продукуються розвиваються В-клітинами, хоча багато В-клітини з часом переходять на вироблення антитіл інших класів. Безпосередні попередники В-клітин, так звані пре-В-клітини, виробляють μ-ланцюга (але не легкі ланцюги) і накопичують їх. Пізніше, коли в пре-В-клітинах починають синтезуватися і легкі ланцюги, вони з'єднуються з j-ланцюгами, утворюючи з ними четирехцепочечние молекули IgM (кожна з двома μ-ланцюгами і двома легкими ланцюгами), які вбудовуються в плазматичну мембрану, де служать рецепторами для антигену. З цього моменту клітини стають В-лімфоцитами і здатні реагувати на антиген. Хоча вбудовуватися в мембрани (як антиген-специфічних рецепторів) і секретуватися у водорозчинній формі можуть антитіла всіх класів, на поверхні більшості покояться В-клітин знаходяться головним чином антитіла IgM та IgD. Дивно, що лише дуже небагато В-клітини активуються для секреції антитіл IgD, і в цього класу не відомо жодної функції, окрім ролі рецепторів для антигену.
IgA-основний клас антитіл в секретах (молоці, слині, сльозах, секрети дихальних шляхів і кишкового тракту). Вони існують або у вигляді пари-рехцепочечного мономеру (подібно IgG), або у вигляді димеру. Молекули IgA у складі секретів представляють собою димер, що містять одну J-ланцюг, а також додаткову поліпептидний ланцюг, звану секреторне компонентом, яку димери IgA набувають на поверхні епітеліальних клітин, що вистилають кишечник, бронхи або протоки молочних, слинних або слізних залоз. Секреторний компонент синтезується епітеліальними клітинами і експонується спочатку на їх базальної поверхні, де служить рецептором для зв'язування IgA з крові. Утворені комплекси IgA з секреторним компонентом поглинаються шляхом ендоцитозу за участю рецепторів, проходять через цитоплазму епітеліальної клітини і виводяться в протоку на протилежній стороні клітини. На додаток до такої транспортної ролі секреторний компонент, можливо, захищає молекули IgA від перетравлення протеолітичними ферментами секретів.
Fc-область молекул IgE зв'язується зі специфічними рецепторними білками на поверхні тучних клітин в тканинах і базофільних лейкоцитів у крові з дуже високою спорідненістю (> 10 10 літрів / моль). У свою чергу пов'язані молекули IgE служать рецепторами для антигену: приєднання до них антигену призводить до секреції клітинами біологічно активних амінів (зокрема, гістаміну, а у деяких видів - серотоніну). Їх захисна функція менш зрозуміла, однак передбачається, що вони роблять ділянку запалення більш доступною для лейкоцитів, антитіл та компонентів комплементу.
1.3. Тонка структура антитіл
Унікальна особливість антитіл полягає в тому, що вони існують у величезному числі різних варіантів: кожен клас імуноглобулінів містить мільйони різних антитіл, кожне з яких відрізняється від інших своїм антиген-зв'язує ділянкою і амінокислотною послідовністю. Тому кожен з таких видів антитіл становить менше однієї мільйонної частки всіх молекул імуноглобулінів, що є в крові. Цей факт поставив іммунохіміков перед надзвичайно складною проблемою білкової хімії: яким чином можна отримати достатню кількість якого-небудь антитіла для визначення його амінокислотної послідовності і тривимірної структури?
Проблема отримання індивідуальних антитіл була вирішена завдяки специфічному властивості пухлинних клітин, що утворюються при множинній мієломі - злоякісному захворюванні, при якому в кістковому мозку розвиваються множинні пухлини. Ці пухлини секретують у кров великі кількості антитіл одного виду. Такі антитіла гомогенні, або моноклональних, оскільки рак зазвичай починається з неконтрольованого зростання однієї-єдиної клітини, у даному випадку це плазматична клітка, секретуюча антитіла. Антитіло, що накопичується в крові, називають мієломні білком.
Ще з минулого століття було відомо, що сеча хворих, що страждають цим захворюванням, часто містить незвичайні білки, названі білками Бене-Джонса - По імені англійського лікаря, який їх уперше описав. Проте лише в 50-х роках нашого століття з'ясувалося, що ці білки представляють собою вільні L-ланцюги імуноглобулінів. Значна частина відомостей про детальну структурі антитіл була отримана при вивченні мієломних білків із сечі або крові хворих або ж білків від мишей, у яких були цілеспрямовано індуковані аналогічні форми раку.
При порівнянні амінокислотних послідовностей безлічі різних мієломних білків виявилася вражаюча особливість, що має важливий і несподіваний генетичний підтекст. N-кінцева частина послідовно як L-, так і Н-ланцюгів надзвичайно мінлива, а С-кінцева - постійна, приклад, якщо порівняти амінокислотні послідовності великого числа різних мієломних х-кіл (кожна довжиною близько 220 амінокислот) виявиться, що С-кінцеві половини у них однакові або розрізняються незначно, тоді як N-кінцеві половини всі різні. Таким чином, L-ланцюги містять константну область приблизно з 110 амінокислот і варіабельна область такої ж довжини. N-кінцева варіабельна область Н-ланцюги теж складається приблизно з 110 амінокислот, а константних, в залежності від класу антитіл, - з 330 або 440 амінокислот.
Саме N-кінцеві частини L-і Н-ланцюгів спільно утворюють ант зв'язує ділянку, і варіабельність їх амінокислотних послідовник-ностей забезпечує структурну основу для різноманітності таких ділянок. У зв'язку з існуванням вариабельной і константної областей в молекулах антитіл виникають важливі генетичні проблеми. Але ще до того як стало можливим пряме вивчення цих питань, в результаті дослідження мієломних білків з'ясувалися інші риси структури антитіл.
Кожна L-і Н-ланцюг містить по три гіперваріабельних області, які спільно формують антиген-зв'язуючий ділянку
Тільки частина вариабельной області безпосередньо бере участь у зв'язуванні антигену. Цей висновок спочатку був зроблений у результаті оцінки максимальних розмірів антиген-зв'язуючого ділянки. Перші виміри, в яких «молекулярними лінійками» служили олігомери різної величини, були проведені з використанням антитіл до декстрану - полімеру D-глюкози. Так як для інгібування зв'язування декстрану з антитілами до нього застосовані цукориди, трісахаріди і олігосахариди більшої довжини, що складаються залишків глюкози, їх дія зростала зі збільшенням довжини ланцюга приблизно до шести мономерів; з олігосахариду більшої довжини ефект не збільшувався. Це дозволяло припускати, що найбільш великі антиген-зв'язуючі ділянки можуть контактувати найбільше з п'ятьма або шістьма цукровими залишками антигену. Тому здавалося вкрай малоймовірним, що всі 220 амінокислот варіабельних областей L-і Н-ланцюгів вносять безпосередній внесок у побудову антиген-зв'язуючого ділянки. І дійсно, тепер ясно, що зв'язує ділянку антитіла формують всього лише близько 20-30 амінокислотних залишків вариабельной відносно кожної з ланцюгів. Першим свідченням на користь цього були дані про амінокислотних послідовностях, які показали, що відмінності між варіабельними областями як в L-, так і в Н-ланцюгах в основному обмежені трьома невеликими гіперваріабельні областями в кожній ланцюга. Інші частини, відомі під назвою структурних областей, щодо константних. Ці дані дозволяли передбачити, що антиген-зв'язуючий ділянку утворюють всього лише 5-10 амінокислот кожної гіперваріабельні області. Це пророцтво було згодом підтверджено рентгеноструктурним аналізом антитіл. 2. Молекулярні механізми різноманіття антитіл
Після ознайомлення з тим фактом, що шалений різноманітність антитіл є необхідною умовою правильного функціонування захисної системи організму, розглянемо забезпечують це умова механізми.
Перші прямі дані про перебудову ДНК у процесі розвитку В-клітин були отримані в 1976 р . в експериментах, в яких ДНК з ранніх мишачих ембріонів, нездатних до вироблення антитіл, порівнювали з ДНК з клітин мишачої мієломи, що виробляють антитіла. Ці два види ДНК переварювали рестрикційної нуклеаз і отримані фрагменти гибрідизуючою-вали з радіоактивними послідовностями ДНК, приготованими шляхом копіювання in vitro V-або С-послідовності молекул інформаційної РНК для L-ланцюгів, виділеної з клітин мієломи. Як показали результати цих досліджень, специфічні V-і С-кодують послідовності перебували у ембріонів в різних рестрикційних фрагментах ДНК, а в клітинах мієломи - в одному і тому ж рестрикційних фрагментів. Таким чином, у зародка, де гени імуноглобулінів не експресуються, послідовності ДНК, які кодують V-і С-галузі тієї чи іншої ланцюга, локалізуються в різних ділянках генома; тим часом у клітці мієломи, де вже утворюються ланцюги імуноглобулінів, ці дві послідовності з'єднані разом .
Зараз відомо, що для кожного типу ланцюгів імуноглобулінів-легких ланцюгів х, легких ланцюгів λ і важких ланцюгів - існує окремий «пул» (велика група) генів, які можуть бути використані при синтезі кожної окремої поліпептидного ланцюга. Кожен такий пул містить набір різних V-генів, розташованих на сотні тисяч нуклеотидів «вище» (тобто ближче до 5'-кінця кодує ланцюга ДНК) одного або декількох С-генів. У процесі розвитку В-клітин будь-який з V-генів може бути транслоцірован таким чином, що він опиниться поряд з певним С-геном. Тоді, після того як відбудеться така перебудова ДНК, може синтезуватися ланцюг імуноглобуліну.
Пули генів, що кодують х-, λ-і Н-ланцюги, знаходяться в різних хромосомах. У миші пул генів х в хромосомі 6 містить один С-ген (З х) і великий набір V-генів (V x l, V X 2, V X 3 ...). Пул генів λ, в хромосомі 16 містить лише два V-гена (V λ l і V λ 2), кожен з яких асоційований з одним або двома різними З-генами З λ. Пул важких ланцюгів, що знаходиться в хромосомі 12, містить великий набір V-генів (Vh) і впорядковану групу різних З-генів, кожен з яких кодує окремий клас важких ланцюгів (С α, С β, З ε і С λ) (рис. 17-40). У випадку важкого ланцюга первісна транслокація V н-гена завжди переносить його близько до Сμ-гену, тому першим антитілом, що синтезуються розвивається По-кліткою, завжди виявляється молекула IgM.
Насправді ці пули генів складніше, ніж показано на рис. 17-40. Замість того щоб кодуватися одним-єдиним V-геном, як передбачалося спочатку, кожна V-область поліпептидного ланцюга кодується двома або трьома окремими генними сегментами, які об'єднуються в функціональний V-ген тільки тоді, коли відбувається перебудова ДНК, що з'єднує разом V-і С-кодують області. Як ми побачимо, таке об'єднання різних V-сегментів, що призводить до утворення гена V-області, безпосередньо збільшує різноманітність антиген-зв'язуючих ділянок.
1978 р ., Коли був закінчений перший аналіз нуклеотидної послідовності одного з генів імуноглобулінів-гена V λ, виділеного з ембріона миші. Замість того щоб кодувати всі 110 амінокислот V λ-області, ген V λ кодував лише 97 N-кінцевих амінокислот. Виявилося, що залишилися 13 амінокислот цій галузі кодуються окремим сегментом ДНК, розташованим на сотні тисяч нуклеотидів далі і що отримав назву з'єднувального або J λ-сегмента (не плутати з бічним J-ланцюгом, яка кодується в іншій частині геному). J λ-сегмент завжди примикає до С λ,-гену, від якого він відділений інтронів. У ході розвитку В-клітини V λ-ген (який ми будемо далі називати V λ-сегментом), оскільки він кодує лише частина V λ-області поліпептидного ланцюга, транслоціруется таким чином, що виявляється поруч з J λ-сегментом, так що в ДНК виходить послідовність V λ-J λ-Інтрон-С λ. Ця послідовність транскрибується в молекули РНК, з яких інтрони після видаляються, так що після сплайсингу утворюються молекули мРНК з примикають один до одного послідовностями V, J і С. Саме ці молекули мРНК транслюються в поліпептиди легких ланцюгів.
Згодом було встановлено, що у мишей є декілька різних J-сегментів в кожному пулі генів для імуноглобулінів: по одному асоційоване з кожним С-геном в генному пулі λ-ланцюгів і по чотири - у генних пулах х-і Н-ланцюгів (кожен З -ген відділений від сусіднього з ним J-сегмента інтронів). У період розвитку В-клітин в генних пулах х-і Н-ланцюгів будь V-сегмент може об'єднатися з будь-яким J-сегментом, що збільшує в чотири рази число V-областей, які ці пули можуть виробляти. Крім того, існують деякі відмінності в точній місці з'єднання VJ, і це призводить до ще більшого розмаїттям амінокислотних послідовностей. Суттєво те, що сайт з'єднання VJ кодує частину третьої гіперваріабельні області легкого ланцюга.
Після з'єднання V і J всі «зайві» J-сегменти «нижче» приєднаного J-сегмента транскрибуються, а потім їх послідовності, так само як і послідовності інтронів, вирізаються з РНК-транскрипту (рис. 6). З'являється все більше даних на користь того, що з'єднання тих чи інших V-і J-сегментів ДНК у процесі розвитку В-лімфоцитів супроводжується елімінацією всій лежить між ними ДНК (див. рис. 6). Конкретний механізм з'єднання сегментів, які можуть бути віддалені один від одного на сотні тисяч нуклеотидів, залишається загадкою. Однак виявлені специфічні, вельми консервативні послідовності ДНК, що примикають «знизу» до V-сегментах і «зверху» до J-сегментах.
Малюнок 6. Процес з'єднання V - J, з яким пов'язано утворення ня х-легкого ланцюга у миші.
Передбачається, що вони можуть служити сайтами впізнавання для ферментів сайт-специфічної комбінації ДНК (рис. 7), але такого роду ферменти поки не ідентіфіровани.
V-область кожної Н-ланцюги кодують три генних сегмента
Збірка гена, що кодує варіабельна область важкої (Vh) ланцюга процес ще складніший, ніж складання гена вариабельной легкого ланцюга (Vl). Тут теж бере участь J-сегмент, однак на додаток до нього деякі амінокислоти третій гіперваріабельні ділянки V-області кодуються ще одним генним сегментом, який отримав назву D-сегмента (diversity gene segment). Число різних D-сегментів невідомо, але у миші їх не менше десятка. У результаті серії сайт-специфічних перекомбінації D-сегмент з'єднується з яким-небудь з Vн або з яким-небудь з Jн-сегментів, що призводить до створення функціонального Vн-гена. Існування окремих D-сегментів ще щонайменше в 10 разів збільшує число різних Vн-областей, які можуть утворитися у миші.
Малюнок 7. Схема, ілюструю щая можливу роль специфічних послідовностей ДНК (показані кольоровими), розта язків, «нижче» V-сегмента і «вище» J-сегмента, в поєднанні V - J. Взаємодія між цими по отже, ймовірно, відбувається за участю сайт-специфічної рекомбинационной системи, каталізує розрив і возз'єднання подвійних спіралей ДНК в області цих послідовностей.
Різноманітність антитіл збільшується завдяки соматичної рекомбінації, з'єднанню легких і важких ланцюгів в різних поєднаннях і виникнення соматичних мутацій. У процесі еволюції імунної системи виробився цілий ряд різних механізмів, що призводять до великої різноманітності антиген-зв'язуючих ділянок антитіл. Тільки частина з цих механізмів пов'язана з описаний вище соматичними перебудовами ДНК в ході розвитку В-лімфоцитів. Експерименти з підрахунку числа генів з використанням методу гібридизації ДНК показують, що в геномі миші, мабуть, міститься кілька сотень V х-сегментів, схоже число Vн-сегментів і два V λ-сегмента. З цього можна обчислити, що шляхом комбіновані особистих успадкованих V-, D-і J-сегментів у миші може утворитися щонайменше 10000 різних Vн-областей і 1000 різних V L-областей.
Один простий, але дуже важливий механізм, сильно збільшує різноманітність антитіл, полягає в комбінуванні різних L-і Н-ланцюгів. Оскільки в антиген-зв'язуючий ділянку антитіла вносять вклад як L-, так і Н-ланцюги, у тварини з 1000 генів, що кодують Vl-o6ласті, і з 10000 генів, що кодують Vн-області, продукти цих генів могли б утворити 1000 х 1000 різних комбінацій, тобто 10 липня різних антиген-зв'язуючих ділянок, якщо припустити, що при цьому будь-яка L-ланцюг може поєднуватися з будь-якою Н-ланцюгом.
Нещодавно було показано, що в генах V-області та поблизу від них відбуваються соматичні мутації; ймовірно, це збільшує число різних антитіл принаймні в 10-100 разів. Механізми, завдяки яким мутації виникають саме тут, невідомі. Однак було виявлено, що мутації зустрічаються набагато частіше в антитіла IgG та IgA, ніж у кодованих Vн-геном антитіла IgM. Це, мабуть, не дивно, тому що молекули IgM виробляються на ранніх стадіях імунної відповіді, a IgG і IgА з'являються відносно пізно. Тому В-клітини, переключилися на IgG або IgA, як правило, зазнали більше число поділок, ніж В-клітини, які продовжують виробляти IgM, і тому, швидше за все, накопичили більше мутацій. З іншого боку, може існувати механізм, що підвищує частоту мутації V-генів після того, як відбудеться перемикання з IgM на імуноглобуліни інших класів. Як би було, зміна антиген-зв'язуючих ділянок внаслідок соматичних мутацій може вести до того, що антиген буде особливо ефективно викликати проліферацію тих В-клітин, у яких змінені антитіла придбали високу спорідненість до антигену; можливо, що саме цим (принаймні частково ) пояснюється підвищення спорідненості антитіл, що спостерігається після імунізації (дозрівання спорідненості). Таким чином, соматичні мутації можуть не тільки збільшувати різноманітність антитіл, але і служити для тонкого підстроювання антитіл при імунній відповіді.
Більше того, оскільки В-клітини (як всі соматичні клітини) диплоїдні, кожна з них має шість генних пулів, які кодують антитіла: по одному пулу для Н-ланцюги, для λ-ланцюга і для х-кола від кожного з батьків. Моноспеціфічность В-клітин означає, що в кожній клітині повинні активуватися гени тільки двох із цих шести пулів - один з чотирьох генних пулів легких ланцюгів і один з двох генних пулів важких ланцюгів. Таким чином, В-клітина повинна робити вибір не тільки між х і λ, але також і між материнськими і батьківськими генними пулами. Експресія тільки материнського або тільки батьківського алелі гена Ig в будь-якій даній По-клітці називається алельних винятком. Материнські і батьківські аутосомні гени для інших білків експресуються в клітці приблизно однаково. У хребетних з цієї закономірності випадає (крім генів імуноглобулінів) тільки інактивація однієї з двох Х-хромосом у самок.
Чому важливо, щоб В-клітини були моноспеціфічни? Моноспеціфічность гарантує, що кожна молекула антитіла буде складена з двох ідентичних половинок і тому буде містити два ідентичних антиген-зв'язуючих ділянки. Мабуть, це властивість виробилося в процесі еволюції тому, що воно наділяє антитіла здатністю утворювати великі мережі із зшитих антигенів. Механізми, що беруть участь в алельному виключення і у виборі одного типу L-ланцюгів в ході розвитку В-клітин, невідомі. Одна з очевидних можливостей полягає в тому, що в неекспрессіруемих генних пулах сегменти генів антитіл просто не піддаються перегрупуванню. Проте вже отримані переконливі дані про те, що це не так. Часто в неекспрессіруемих хромосомах перебудови відбуваються, але неправильним чином і тому не можуть забезпечити синтез ланцюгів Ig, придатних для побудови антитіл. Це наводить на думку, що, може бути, з'єднання сегментів генів V-області в ході розвитку В-клітин - до певної міри випадковий процес, частіше призводить до непродуктивних перебудов, ніж до продуктивним. У цьому випадку алельному виняток могло б бути просто результатом того, що дуже низька ймовірність успішної перебудови в більш ніж одному генному пулі для кожного кола. Але це означало б, що в багатьох клітинах взагалі не буде успішною перебудови і, отже, синтезу антитіл. Оскільки такі клітини не будуть стимулюватися ніяким антигеном, вони повинні швидко гинути. Подібний механізм представляється дуже марнотратним, однак це може бути розплатою за моноспеціфічность.
Переключення синтезу з мембранозв'язаних на секретовану форму одного і того ж антитіла відбувається шляхом зміни РНК-транскриптів для Н-ланцюги
Розглянувши генетичні механізми, від яких залежить структура антиген-зв'язуючого ділянки, ми перейдемо тепер до механізмів, що визначає біологічні властивості антитіла, тобто тип константної області важкої гілки. Якщо одного разу зроблений вибір певних сегментів ДНК для кодування антиген-зв'язуючого ділянки є остаточним і для В-клітини, і для її нащадків, то тип синтезується Сн-області може вимірюв-няться в процесі розвитку клітини.
Антитіла всіх класів можуть синтезуватися як у мембранозв'язаних, так і у розчинній, секретируемой Мембрано-зв'язані антитіла служать рецепторами для антигену на поверхні В-клітин. Після стимуляції клітини антигеном ті ж самі антитіла виробляються в секретируемой формі. У разі IgM ці дві форми розрізняються тільки С-кінцевим ділянкою μ-ланцюга: у мембранозв'язаних антитіл μ-ланцюг закінчується гідрофобним ділянкою, що закріплює її в ліпідному бішарі плазматичної мембрани В-клітини, тоді як у секретується анти-тіл IgM є натомість гідрофільний «хвіст», що дозволяє молеку-лам виходити з клітки. Здатність В-клітин виробляти μ-ланцюга з константними областями двох різних типів спочатку здавалася парадоксальної, так як В-клітини містять лише одну копію гена С "на гаплоїдний геном.
Парадокс був дозволений, коли з'ясувалося, що активація В-клітин призводить до зміни ядерних РНК-транскриптів для μ-ланцюга: ці транскрипти дещо коротший тих, що кодували мембранозв'язаних μ-ланцюг.
В-клітини можуть переключатися з виробітку одного класу антитіл на вироблення іншого
Переключення синтезу з мембранозв'язаних форми антитіл на секретовану форму - не єдиний вид змін, які можуть відбуватися в С-області важкого ланцюга в ході розвитку В-клітин. Все В-клітини починають свою діяльність з синтезу антитіл з вироблення IgM, але багато з них потім перемикаються на вироблення антитіл інших класів, наприклад IgG або IgA. Цей процес називають перемиканням класу. Здатність В-клітин змінювати виробляється ними клас антитіл без зміни антиген-пов'язую-ного ділянки означає, що один і той же зібраний Vн-ген може послідовно асоціюватися з різними Сн-генами.
Мабуть, процес перемикання класу складається з двох послідовних етапів. Спочатку клітка, що виробляє мембранозв'язаних IgM, може переключитися на одночасну вироблення мембранозв'язаних IgM і мембранозв'язаних форми антитіл іншого класу, наприклад IgD. Як вважають, така По-клітина продукує довгі первинні РНК-транскрипти, що містять поряд із зібраною послідовністю Vн-області як С μ, так і С δ-послідовності. Такі транскрипти піддаються потім сплайсингу двома різними способами, що призводять до двох різних видів молекул мРНК. Обидва види кодують одну і ту ж V н-область, але один вид містить З μ -, а інший - З δ-послідовність. Ймовірно, той же механізм діє при перемиканні В-клітини на одночасну вироблення мембранозв'язаних форм IgM і одного з інших класів антитіл-IgG, IgE або IgA.
Другий етап відбувається тоді, коли В-клітина, одночасно виробляє мембранозв'язані антитіла класу IgM і якогось другого класу, стимулюється антигеном і починає вже секретувати антитіла цього другого класу. Цей етап включає делеція ДНК. Наприклад, клітина, що синтезувала мембранозв'язані IgM та IgA в результаті сплайсингу довгого РНК-транскрипту, що містив всі послідовності Сн-генів і зібрану послідовність V н-генів зі структурою V H 2-D1-J H 3, може почати секретувати IgA в результаті делеції більшої частини ДНК між Jh3 і С а, включала гени З μ, З δ, З γ і С ε. Доказ того, що цей етап перемикання класу включає делеція ДНК, було отримано в дослідах з клітинами мієломи: виявилося, що клітини, що секретують IgG, не містять ДНК, що кодує З μ і C δ, а клітини, які виділяють IgA, не містять ДНК, що кодує константні області важких ланцюгів всіх інших класів.
Здатність будь-якого зібраного Vн-гена асоціюватися з будь-яким з Сн-генів має важливий функціональний сенс: завдяки цій здатності певний антиген-зв'язуючий ділянку, відібраний антигенами навколишнього середовища, може у даної особини бути розподілений по всіх класах імуноглобулінів і може, таким чином, придбати все біологічні властивості, характерні для кожного з класів.
Список літератури
1. Структура та функції антитіл / / Під. ред. Л. Глина, М. Стьюард. Пер. з англ., М.: Світ, 1983, 200 с.
2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д., Рефф М., Робертс К., Уотсон. Д. Молекулярна біологія клітини. - М., Мир, 1987. Т 5, 336 с.
3. Кульберг А.Я. Молекулярна імунології. - М.: ВШ, 1985. 288 с.
4. Нелезін Р.С. Будова і біосинтез антитіл. - М.: Наука, 1972. 312 з.
5. Маррі Р., Греннер Д., Мейерс П., Родуел В. Біохімія людини. - M., Світ, 1993. -Т 2, 416 с.
6. Молекулярна клінічна діагностика. Методи. / Під. ред. Херрінгтон С. Пер. з англ. - М.: Світ, 1999. 560 с.
7. Lo Y. et. al. Detection of single-copy fetal DNA sequence from maternal blood. Lancet, 335, 1463
Після ознайомлення з тим фактом, що шалений різноманітність антитіл є необхідною умовою правильного функціонування захисної системи організму, розглянемо забезпечують це умова механізми.
Кожна L-і Н-ланцюг кодується більш ніж одним генним сегментом
Участь незвичайних генетичних механізмів в утворенні антитіл стало очевидним задовго до того, як стало ясно, який внесок вносять ці механізми в розмаїття антиген-зв'язуючих ділянок. Як вже говорилося вивчення амінокислотних послідовностей мієломних білків показало, що кожне коло імуноглобуліну складається з вариабельной (V) і константної (С) областей, і тоді виникло питання: як такі ланцюги кодуються в геномі? Вже в той час припускали, що V-і С-відносно кожної з ланцюгів можуть кодуватися двома окремими генами, які якимось чином з'єднуються перед експресією.Перші прямі дані про перебудову ДНК у процесі розвитку В-клітин були отримані в
Зараз відомо, що для кожного типу ланцюгів імуноглобулінів-легких ланцюгів х, легких ланцюгів λ і важких ланцюгів - існує окремий «пул» (велика група) генів, які можуть бути використані при синтезі кожної окремої поліпептидного ланцюга. Кожен такий пул містить набір різних V-генів, розташованих на сотні тисяч нуклеотидів «вище» (тобто ближче до 5'-кінця кодує ланцюга ДНК) одного або декількох С-генів. У процесі розвитку В-клітин будь-який з V-генів може бути транслоцірован таким чином, що він опиниться поряд з певним С-геном. Тоді, після того як відбудеться така перебудова ДНК, може синтезуватися ланцюг імуноглобуліну.
Пули генів, що кодують х-, λ-і Н-ланцюги, знаходяться в різних хромосомах. У миші пул генів х в хромосомі 6 містить один С-ген (З х) і великий набір V-генів (V x l, V X 2, V X 3 ...). Пул генів λ, в хромосомі 16 містить лише два V-гена (V λ l і V λ 2), кожен з яких асоційований з одним або двома різними З-генами З λ. Пул важких ланцюгів, що знаходиться в хромосомі 12, містить великий набір V-генів (Vh) і впорядковану групу різних З-генів, кожен з яких кодує окремий клас важких ланцюгів (С α, С β, З ε і С λ) (рис. 17-40). У випадку важкого ланцюга первісна транслокація V н-гена завжди переносить його близько до Сμ-гену, тому першим антитілом, що синтезуються розвивається По-кліткою, завжди виявляється молекула IgM.
Насправді ці пули генів складніше, ніж показано на рис. 17-40. Замість того щоб кодуватися одним-єдиним V-геном, як передбачалося спочатку, кожна V-область поліпептидного ланцюга кодується двома або трьома окремими генними сегментами, які об'єднуються в функціональний V-ген тільки тоді, коли відбувається перебудова ДНК, що з'єднує разом V-і С-кодують області. Як ми побачимо, таке об'єднання різних V-сегментів, що призводить до утворення гена V-області, безпосередньо збільшує різноманітність антиген-зв'язуючих ділянок.
V-область кожної L-ланцюги кодується двома генними сегментами
Те, що V-області кодуються більш ніж одним генним сегментом, встановлено вЗгодом було встановлено, що у мишей є декілька різних J-сегментів в кожному пулі генів для імуноглобулінів: по одному асоційоване з кожним С-геном в генному пулі λ-ланцюгів і по чотири - у генних пулах х-і Н-ланцюгів (кожен З -ген відділений від сусіднього з ним J-сегмента інтронів). У період розвитку В-клітин в генних пулах х-і Н-ланцюгів будь V-сегмент може об'єднатися з будь-яким J-сегментом, що збільшує в чотири рази число V-областей, які ці пули можуть виробляти. Крім того, існують деякі відмінності в точній місці з'єднання VJ, і це призводить до ще більшого розмаїттям амінокислотних послідовностей. Суттєво те, що сайт з'єднання VJ кодує частину третьої гіперваріабельні області легкого ланцюга.
Після з'єднання V і J всі «зайві» J-сегменти «нижче» приєднаного J-сегмента транскрибуються, а потім їх послідовності, так само як і послідовності інтронів, вирізаються з РНК-транскрипту (рис. 6). З'являється все більше даних на користь того, що з'єднання тих чи інших V-і J-сегментів ДНК у процесі розвитку В-лімфоцитів супроводжується елімінацією всій лежить між ними ДНК (див. рис. 6). Конкретний механізм з'єднання сегментів, які можуть бути віддалені один від одного на сотні тисяч нуклеотидів, залишається загадкою. Однак виявлені специфічні, вельми консервативні послідовності ДНК, що примикають «знизу» до V-сегментах і «зверху» до J-сегментах.
Малюнок 6. Процес з'єднання V - J, з яким пов'язано утворення ня х-легкого ланцюга у миші.
Передбачається, що вони можуть служити сайтами впізнавання для ферментів сайт-специфічної комбінації ДНК (рис. 7), але такого роду ферменти поки не ідентіфіровани.
V-область кожної Н-ланцюги кодують три генних сегмента
Збірка гена, що кодує варіабельна область важкої (Vh) ланцюга процес ще складніший, ніж складання гена вариабельной легкого ланцюга (Vl). Тут теж бере участь J-сегмент, однак на додаток до нього деякі амінокислоти третій гіперваріабельні ділянки V-області кодуються ще одним генним сегментом, який отримав назву D-сегмента (diversity gene segment). Число різних D-сегментів невідомо, але у миші їх не менше десятка. У результаті серії сайт-специфічних перекомбінації D-сегмент з'єднується з яким-небудь з Vн або з яким-небудь з Jн-сегментів, що призводить до створення функціонального Vн-гена. Існування окремих D-сегментів ще щонайменше в 10 разів збільшує число різних Vн-областей, які можуть утворитися у миші.
Малюнок 7. Схема, ілюструю щая можливу роль специфічних послідовностей ДНК (показані кольоровими), розта язків, «нижче» V-сегмента і «вище» J-сегмента, в поєднанні V - J. Взаємодія між цими по отже, ймовірно, відбувається за участю сайт-специфічної рекомбинационной системи, каталізує розрив і возз'єднання подвійних спіралей ДНК в області цих послідовностей.
Різноманітність антитіл збільшується завдяки соматичної рекомбінації, з'єднанню легких і важких ланцюгів в різних поєднаннях і виникнення соматичних мутацій. У процесі еволюції імунної системи виробився цілий ряд різних механізмів, що призводять до великої різноманітності антиген-зв'язуючих ділянок антитіл. Тільки частина з цих механізмів пов'язана з описаний вище соматичними перебудовами ДНК в ході розвитку В-лімфоцитів. Експерименти з підрахунку числа генів з використанням методу гібридизації ДНК показують, що в геномі миші, мабуть, міститься кілька сотень V х-сегментів, схоже число Vн-сегментів і два V λ-сегмента. З цього можна обчислити, що шляхом комбіновані особистих успадкованих V-, D-і J-сегментів у миші може утворитися щонайменше 10000 різних Vн-областей і 1000 різних V L-областей.
Один простий, але дуже важливий механізм, сильно збільшує різноманітність антитіл, полягає в комбінуванні різних L-і Н-ланцюгів. Оскільки в антиген-зв'язуючий ділянку антитіла вносять вклад як L-, так і Н-ланцюги, у тварини з 1000 генів, що кодують Vl-o6ласті, і з 10000 генів, що кодують Vн-області, продукти цих генів могли б утворити 1000 х 1000 різних комбінацій, тобто 10 липня різних антиген-зв'язуючих ділянок, якщо припустити, що при цьому будь-яка L-ланцюг може поєднуватися з будь-якою Н-ланцюгом.
Нещодавно було показано, що в генах V-області та поблизу від них відбуваються соматичні мутації; ймовірно, це збільшує число різних антитіл принаймні в 10-100 разів. Механізми, завдяки яким мутації виникають саме тут, невідомі. Однак було виявлено, що мутації зустрічаються набагато частіше в антитіла IgG та IgA, ніж у кодованих Vн-геном антитіла IgM. Це, мабуть, не дивно, тому що молекули IgM виробляються на ранніх стадіях імунної відповіді, a IgG і IgА з'являються відносно пізно. Тому В-клітини, переключилися на IgG або IgA, як правило, зазнали більше число поділок, ніж В-клітини, які продовжують виробляти IgM, і тому, швидше за все, накопичили більше мутацій. З іншого боку, може існувати механізм, що підвищує частоту мутації V-генів після того, як відбудеться перемикання з IgM на імуноглобуліни інших класів. Як би було, зміна антиген-зв'язуючих ділянок внаслідок соматичних мутацій може вести до того, що антиген буде особливо ефективно викликати проліферацію тих В-клітин, у яких змінені антитіла придбали високу спорідненість до антигену; можливо, що саме цим (принаймні частково ) пояснюється підвищення спорідненості антитіл, що спостерігається після імунізації (дозрівання спорідненості). Таким чином, соматичні мутації можуть не тільки збільшувати різноманітність антитіл, але і служити для тонкого підстроювання антитіл при імунній відповіді.
Механізми експресії генів антитіл забезпечують моноспеціфічность В-клітин
Теорія клональною селекції передбачила, а різноманітні експерименти підтвердили, що окремі В-клітини моноспеціфічни, тобто виробляють антитіла з антиген-зв'язує ділянкою тільки одного типу. Значить, повинен існувати якийсь механізм, що обмежує можливості активації іммуноглобулінових генів в індивідуальних В-клітинах, так що ці клітини можуть виробляти лише один тип L-ланцюги та один тип Н-ланцюги. Наприклад, В-клітина не може одночасно виготовляти легкі ланцюги х і λ, і підтримувати при цьому моноспеціфічность, так як ці два ланцюги майже завжди мали б різні варіабельні області і тому утворювали б молекули антитіл з антиген-зв'язуючими ділянками більш ніж одного виду. Дійсно, в кожній По-клітці активується або один, або інший з цих генних пулів, але ніколи не активуються обидва пулу одночасно.Більше того, оскільки В-клітини (як всі соматичні клітини) диплоїдні, кожна з них має шість генних пулів, які кодують антитіла: по одному пулу для Н-ланцюги, для λ-ланцюга і для х-кола від кожного з батьків. Моноспеціфічность В-клітин означає, що в кожній клітині повинні активуватися гени тільки двох із цих шести пулів - один з чотирьох генних пулів легких ланцюгів і один з двох генних пулів важких ланцюгів. Таким чином, В-клітина повинна робити вибір не тільки між х і λ, але також і між материнськими і батьківськими генними пулами. Експресія тільки материнського або тільки батьківського алелі гена Ig в будь-якій даній По-клітці називається алельних винятком. Материнські і батьківські аутосомні гени для інших білків експресуються в клітці приблизно однаково. У хребетних з цієї закономірності випадає (крім генів імуноглобулінів) тільки інактивація однієї з двох Х-хромосом у самок.
Чому важливо, щоб В-клітини були моноспеціфічни? Моноспеціфічность гарантує, що кожна молекула антитіла буде складена з двох ідентичних половинок і тому буде містити два ідентичних антиген-зв'язуючих ділянки. Мабуть, це властивість виробилося в процесі еволюції тому, що воно наділяє антитіла здатністю утворювати великі мережі із зшитих антигенів. Механізми, що беруть участь в алельному виключення і у виборі одного типу L-ланцюгів в ході розвитку В-клітин, невідомі. Одна з очевидних можливостей полягає в тому, що в неекспрессіруемих генних пулах сегменти генів антитіл просто не піддаються перегрупуванню. Проте вже отримані переконливі дані про те, що це не так. Часто в неекспрессіруемих хромосомах перебудови відбуваються, але неправильним чином і тому не можуть забезпечити синтез ланцюгів Ig, придатних для побудови антитіл. Це наводить на думку, що, може бути, з'єднання сегментів генів V-області в ході розвитку В-клітин - до певної міри випадковий процес, частіше призводить до непродуктивних перебудов, ніж до продуктивним. У цьому випадку алельному виняток могло б бути просто результатом того, що дуже низька ймовірність успішної перебудови в більш ніж одному генному пулі для кожного кола. Але це означало б, що в багатьох клітинах взагалі не буде успішною перебудови і, отже, синтезу антитіл. Оскільки такі клітини не будуть стимулюватися ніяким антигеном, вони повинні швидко гинути. Подібний механізм представляється дуже марнотратним, однак це може бути розплатою за моноспеціфічность.
Переключення синтезу з мембранозв'язаних на секретовану форму одного і того ж антитіла відбувається шляхом зміни РНК-транскриптів для Н-ланцюги
Розглянувши генетичні механізми, від яких залежить структура антиген-зв'язуючого ділянки, ми перейдемо тепер до механізмів, що визначає біологічні властивості антитіла, тобто тип константної області важкої гілки. Якщо одного разу зроблений вибір певних сегментів ДНК для кодування антиген-зв'язуючого ділянки є остаточним і для В-клітини, і для її нащадків, то тип синтезується Сн-області може вимірюв-няться в процесі розвитку клітини.
Антитіла всіх класів можуть синтезуватися як у мембранозв'язаних, так і у розчинній, секретируемой Мембрано-зв'язані антитіла служать рецепторами для антигену на поверхні В-клітин. Після стимуляції клітини антигеном ті ж самі антитіла виробляються в секретируемой формі. У разі IgM ці дві форми розрізняються тільки С-кінцевим ділянкою μ-ланцюга: у мембранозв'язаних антитіл μ-ланцюг закінчується гідрофобним ділянкою, що закріплює її в ліпідному бішарі плазматичної мембрани В-клітини, тоді як у секретується анти-тіл IgM є натомість гідрофільний «хвіст», що дозволяє молеку-лам виходити з клітки. Здатність В-клітин виробляти μ-ланцюга з константними областями двох різних типів спочатку здавалася парадоксальної, так як В-клітини містять лише одну копію гена С "на гаплоїдний геном.
Парадокс був дозволений, коли з'ясувалося, що активація В-клітин призводить до зміни ядерних РНК-транскриптів для μ-ланцюга: ці транскрипти дещо коротший тих, що кодували мембранозв'язаних μ-ланцюг.
В-клітини можуть переключатися з виробітку одного класу антитіл на вироблення іншого
Переключення синтезу з мембранозв'язаних форми антитіл на секретовану форму - не єдиний вид змін, які можуть відбуватися в С-області важкого ланцюга в ході розвитку В-клітин. Все В-клітини починають свою діяльність з синтезу антитіл з вироблення IgM, але багато з них потім перемикаються на вироблення антитіл інших класів, наприклад IgG або IgA. Цей процес називають перемиканням класу. Здатність В-клітин змінювати виробляється ними клас антитіл без зміни антиген-пов'язую-ного ділянки означає, що один і той же зібраний Vн-ген може послідовно асоціюватися з різними Сн-генами.
Мабуть, процес перемикання класу складається з двох послідовних етапів. Спочатку клітка, що виробляє мембранозв'язаних IgM, може переключитися на одночасну вироблення мембранозв'язаних IgM і мембранозв'язаних форми антитіл іншого класу, наприклад IgD. Як вважають, така По-клітина продукує довгі первинні РНК-транскрипти, що містять поряд із зібраною послідовністю Vн-області як С μ, так і С δ-послідовності. Такі транскрипти піддаються потім сплайсингу двома різними способами, що призводять до двох різних видів молекул мРНК. Обидва види кодують одну і ту ж V н-область, але один вид містить З μ -, а інший - З δ-послідовність. Ймовірно, той же механізм діє при перемиканні В-клітини на одночасну вироблення мембранозв'язаних форм IgM і одного з інших класів антитіл-IgG, IgE або IgA.
Другий етап відбувається тоді, коли В-клітина, одночасно виробляє мембранозв'язані антитіла класу IgM і якогось другого класу, стимулюється антигеном і починає вже секретувати антитіла цього другого класу. Цей етап включає делеція ДНК. Наприклад, клітина, що синтезувала мембранозв'язані IgM та IgA в результаті сплайсингу довгого РНК-транскрипту, що містив всі послідовності Сн-генів і зібрану послідовність V н-генів зі структурою V H 2-D1-J H 3, може почати секретувати IgA в результаті делеції більшої частини ДНК між Jh3 і С а, включала гени З μ, З δ, З γ і С ε. Доказ того, що цей етап перемикання класу включає делеція ДНК, було отримано в дослідах з клітинами мієломи: виявилося, що клітини, що секретують IgG, не містять ДНК, що кодує З μ і C δ, а клітини, які виділяють IgA, не містять ДНК, що кодує константні області важких ланцюгів всіх інших класів.
Здатність будь-якого зібраного Vн-гена асоціюватися з будь-яким з Сн-генів має важливий функціональний сенс: завдяки цій здатності певний антиген-зв'язуючий ділянку, відібраний антигенами навколишнього середовища, може у даної особини бути розподілений по всіх класах імуноглобулінів і може, таким чином, придбати все біологічні властивості, характерні для кожного з класів.
Список літератури
1. Структура та функції антитіл / / Під. ред. Л. Глина, М. Стьюард. Пер. з англ., М.: Світ, 1983, 200 с.
2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д., Рефф М., Робертс К., Уотсон. Д. Молекулярна біологія клітини. - М., Мир, 1987. Т 5, 336 с.
3. Кульберг А.Я. Молекулярна імунології. - М.: ВШ, 1985. 288 с.
4. Нелезін Р.С. Будова і біосинтез антитіл. - М.: Наука, 1972. 312 з.
5. Маррі Р., Греннер Д., Мейерс П., Родуел В. Біохімія людини. - M., Світ, 1993. -Т 2, 416 с.
6. Молекулярна клінічна діагностика. Методи. / Під. ред. Херрінгтон С. Пер. з англ. - М.: Світ, 1999. 560 с.
7. Lo Y. et. al. Detection of single-copy fetal DNA sequence from maternal blood. Lancet, 335, 1463