Контрольна робота
з біології
2009
Зміст
1. Імунологічна специфічність 3
2. Взаємодія антигену з субпопуляцією антитіл 8
1. Імунологічна специфічність
Антитіла, що утворюються у відповідь на введення в організм антигенів, специфічно взаємодіють з цими антигенами. Освіта специфічного комплексу антиген - антитіло забезпечується гідрофобними, іонними та андерваальсовыми взаимодействиями,
а также водородными связями. Наиболее существенную роль играют силы гидрофобного взаимодействия. в андерваальсовимі взаємодіями, а також водневими зв'язками. Найбільш істотну роль грають сили гідрофобної взаємодії. Неполярні зв'язування виникає в результаті прагнення гідрофобних груп у водному розчині до асоціації один з одним, що супроводжується стабілізацією всієї системи. Ефективність таких взаємодій зростає з підвищенням температури.Менший внесок у зв'язування антигену з активним центром антитіла вносять водневі і іонні взаємодії. Водневі зв'язки утворюються при взаємодії атома водню, ковалентно зв'язаного з яких-небудь негативно зарядженим атомом, з неподіленої парою електронів іншого негативно зарядженого атома. В реакції антиген - антитіло в якості таких груп зазвичай виступають аміногрупи та гідроксильні групи / Електростатичні сили виникають при взаємодії сильно заряджених іонізованих груп, таких, як Іонізована аміногрупа та іонізованих карбоксильна група.
Ступінь відповідності між антигенною детермінантою і антигензв'язуючих областю активного центру антитіла {імунологічна специфічність) визначається хімічної та просторової комплементарностью, яка обумовлена, з одного боку, взаємодією електронних хмар реагують хімічних груп, з іншого - стеричним силами відштовхування. Якщо структури антигену і активного центру не відповідають один одному, то їх тяжіння буде слабким, а відштовхування сильним. Важливим моментом в утворенні міцних специфічних комплексів є наявність множинних контактів, що дозволяють, незважаючи на слабкість окремих одиничних взаємодій, міцно утримувати антиген в активному центрі. Заміна окремих атомів або груп у молекулі антигену або в антигензв'язуючих центрах призводить до погіршення зв'язування.
Цілком зрозуміло, що один і той самий антиген можуть дізнаватися антитіла, що мають комплементарні йому структури, але дещо відрізняються за складом амінокислотних залишків у антигензв'язуючих центрі. Наприклад, антигензв'язуючих область антідекстранового антитіла людини в одному випадку представляє собою неглибокий «жолобок», в який вкладається до 6 залишків ізомальтози, в іншому - складається з глибокої порожнини, куди поміщається 1-2 залишку, і більше дрібної виїмки для 2-4 залишків ізомальтози .
З іншого боку, антигензв'язуючих центр молекули антитіла певної специфічності має здатність зв'язувати антигени, відмінні за структурою від основного. Можна уявити собі, що в такому разі у зв'язуванні беруть участь як частину загальних амінокислотних залишків у антигензв'язуючих центрах, так і відрізняються за своєю локалізації та природі.
З кількісного боку специфічність взаємодії антиген-антитіло характеризується через аффінность антитіл або рівноважну константу освіти іммунокомплекса. У найпростішому випадку взаємодія одного центру зв'язування антитіла з моновалентний антигеном може бути представлено схемою
де Аг - вільний антиген; Ат - вільне антитіло; Аг-Ат-комплекс антиген - антитіло; константы скоростей ассоциации и диссоциации комплекса соответственно.
k - константи швидкостей асоціації і дисоціації комплексу відповідно.З урахуванням закону діючих мас в умовах рівноваги можна записати
де - рівноважні концентрації Аг, Ат і комплексу Аг-Ат, відповідно, або при переході до константи рівноваги або внутрішньої афінності:
Рівноважна константа освіти К а іммунокомплекса має розмірність. На практиці часто використовують рівноважну константу дисоціації комплексу Kd, пов'язану з Ка простим співвідношенням
і має розмірність. , тем прочнее образующийся иммунокомплекс. Очевидно, що чим менше Kd, тим міцніше утворюється іммунокомплекс.
, которое может быть рассчитано по следующей формуле: ' Константа комплексоутворення є термодинамічним параметром, що характеризує зміна вільної енергії взаємодії антиген - антитіло AF, яке може бути розрахована за такою формулою: '
де R - Газова постійна; Ф - Абсолютна температура.
Загальна зміна вільної енергії при комплексообразова-ванні складається з двох термодинамічних величин - 'змін ентальпії та ентропії:
Визначення АН можна провести експериментально - або за допомогою прямих калориметричних вимірів, або із залежності рівноважної константи комплексоутворення від температури, описуваної законом Вант-Гоффа:
рассчитывают из температурной зависимости логарифма константы равновесия от обратной температуры . Д # розраховують з температурної залежності логарифма константи рівноваги від зворотної температури.
Знаючи зміни ентальпії рівноважного процесу АН та вільної енергії AF, при даній температурі зміна ентропії знаходять із співвідношення
Реакція антиген - антітело.протекает з виділенням теплоти, але, як правило, зміна ентальпії невелика і становить близько 40 кДж / моль. Зміна ентропії в більшості випадків позитивно, оскільки активні центри антитіл у вільному вигляді доступні розчинника та гідратованих, а при взаємодії з антигеном з них вивільняються зв'язані молекули води, що призводить в цілому до зменшення впорядкованості системи. Таким чином, кажучи про імунологічної специфічності антитіл, ми завжди проводимо порівняльну оцінку ефективності взаємодії антиген-антитіло, яке характеризується константою рівноваги або зміною вільної енергії системи при комплексоутворенні.
Можна оцінювати як специфічність даного антитіла по відношенню до різних антигенів, так і даного антигену по відношенню до різних систем. и Аг 2 с константами комплексообразовании соответственно Якщо одна і та ж популяція антитіл взаємодіє з двома різними антигенами An і Аг 2 з константами комплексоутворенні відповідно Кй і 2, то говорять, що дані антитіла є високо специфічними по відношенню до Аг] і менш специфічними до АГГ. много больше, чем с антителами Атг, то первые являются специфическими по отношению к антигену, а вторые нет. Аналогічно, якщо константа комплексоутворення антигену з популяцією антитіл Бфй багато більше, ніж з антитілами АТГ, то перші є специфічними по відношенню до антигену, а другі ні. Ще раз підкреслимо, що поняття специфічності є відносним. Наприклад, якщо для однієї і тієї, ж популяції антитіл взаємодію з антигеном Аг] у порівнянні з Аг 2 є специфічним, то при наявності третього антигену АГЗ, для якого Ks ^ Ki, ці антитіла будуть менш специфічні до чем к Агз. Бгй, ніж до АГЗ.
На практиці часто умовно увазі, що якщо константа рівноваги процесу комплексоутворення більше, ніж 10 8 л / моль, то антитіла є високоафінними.
Звичайний діапазон зміни афінності антитіл становить 10 5 -10 ї М -1, що відповідає зміні вільної енергії зв'язування в області - 24 -. -52 кДж / моль. Максимальні значення констант зв'язування характерні для антигенів, які мають яскраво вираженими гідрофобними властивостями або ж взаємодіючих з активним центром антитіла досить великою областю молекули. Найменшою ефективністю взаємодії характеризуються антитіла проти вуглеводів.
Таким чином, кількісно специфічність можна оцінити, вимірюючи зміна вільної енергії зв'язування або внутрішню аффінность. У практичних цілях іноді дуже важливо провести порівняння специфічності взаємодії ряду антигенів з антитілами, індукованими одним з цих антигенів. Відносна специфічність у цих випадках може бути виражена як від носіння внутрішніх афінності взаємодії з антитілами розглянутого антигену та антигену, індукованого антитіла.
Подібного роду проблеми дуже часто виникають, наприклад, при розробці методів імуноферментного аналізу лікарських препаратів, стероїдних і білкових гормонів. У залежності від способу отримання антисироватки антитіла можуть бути специфічні або тільки до одного лікарського препарату, або до цілої групи близьких за структурою хімічних сполук. У цих випадках поширений спосіб оцінки специфічності, заснований на порівнянні зв'язування антитіл в даній концентрації одного і того ж кількості гомологічного і гетерологічного гап-тена. При цьому концентрація утворився імунного комплексу для гомологічного гаптену приймається рівною одиниці, а зв'язування всіх гетерологічних гаптенов оцінюється як частка від відповідного зв'язування гомологічного гаптену.
Становить великий інтерес і оцінка специфічності різних популяцій антитіл, наприклад різних типів моіокло-нальних антитіл, які продукуються різними клонами клітин. Таке порівняння може бути проведено на підставі зіставлення значень внутрішньої афінності: антитіла з більш високою специфічністю характеризуються більш високим значенням константи внутрішньої афінності.
2. Взаємодія антигену з субпопуляцією антитіл
Раніше для кількісного опису ефективності взаємодії антиген - антитіло за основу була взята проста модель взаємодії одновалентного антигену і одновалентного антитіла. Але так як молекула антитіла має кілька антигензв'язуючих центрів і, крім того, здатна взаємодіяти з кількома антигенними детермінантами молекули антигену, то така характеристика освіти імуно-хімічного комплексу є досить спрощеною.
Для опису більш складного реально існуючого процесу взаємодії полівалентного антитіла з полівалентним антигеном введено термін авідність, або функціональна аффінность. У цьому випадку прості моновалентні взаємодії характеризуються «внутрішнім спорідненістю», або «внутрішньої аффінність». З біологічної точки зору саме функціональна аффінность відіграє основну роль в імунній відповіді на інфікування організму вірусами або бактеріями, що мають на своїй поверхні повторюються антигенні детермінанти.
Процес утворення комплексу антиген - антитіло складу 1:1, у якому реалізуються полівалентні взаємодії, також є оборотним і може бути охарактеризований константою комплексоутворення. З енергетичної точки зору освіту полівалентного комплексу набагато вигідніше, ніж моновалентною. -антитела с внутренней аффинностью к 2,4-динитрофенольному гаптену 10 7 л/моль имеют функциональную аффинность по отношению к комплексу ДНФ — фаг 4-174—10 10 л/моль, т. е. бивалентные взаимодействия являются в 1000 раз более прочными, чем моновалентные. Наприклад, було показано, що IgG-антитіла з внутрішньої афінності до 2,4-дінітрофенольному гаптеном 10 липень л / моль мають функціональну аффінность по відношенню до комплексу ДНФ - фаг 4-174-10 10 л / моль, тобто бівалентні взаємодії є в 1000 разів більш міцними, ніж моновалентні.
Раніше вважалося, що присутні в системі антитіла характеризуються однаковою константою асоціації з антигеном або ж однаковою енергією зв'язування. В якості такої субпопуляції може виступати субпопуляція антитіл, які продукуються одним клоном антітелпродуцірующіх клітин, - моноклональні антитіла. ', ·
Синтезовані в живому організмі антитіла гетерогенні за фізико-хімічними властивостями. Загальна популяція антитіл імунної сироватки включає в себе антитіла з різними значеннями зміни вільної енергії взаємодії з гаптеном, тобто антитіла різної афінності; Схему взаємодії-антигену із загальною популяцією антитіл, що представляє сукупність субпопуляцій, може бути представлена в наступному вигляді:
;
Для загальної характеристики такої популяції антитіл за афінності взаємодії з антигеном використовують деяке середнє значення афінності Ко для л-го числа субпопуляцій. Як правило, справжня форма розподілу антитіл за значеннями константи взаємодії невідома і зазвичай визначається тим чи іншим способом рівноважна константа взаємодії є деяким ефективним параметром.
При розробці методів иммунохимического аналізу, що базуються на реакції антиген - антитіло, знання фізико-хімічних характеристик специфічних взаємодій дуже важливо, оскільки дозволяє оцінити чутливість та специфічність методу, здійснити правильний підбір реагентів для аналізу.
Так як утворені у відповідь на введення в організм антитіла є гетерогенними по константам зв'язування, середня аффінность Ко - це, насправді, деяке середнє значення для невідомого розподілу приватних констант , где число Ki, де число з - Невідомо. Для характеристики одержуваної антисироватки. доцільно ввести деяку функцію розподілу антитіл за афінності. Найпростіше наближення - нормальний розподіл, що описується функцією Гауса:
Графічне представлення функції Гауса
де стандартне відхилення характеризує гетерогенність антитіл.
У імунохімії розподіл антитіл за константам часто описують одним з наближень нормального розподілу, запропонованого РВПС. , и значительные отклонения наблюдаются при Кп±2у. Широкое распространение этой функции для описания распределения антител по константам связывания обусловлено его сходством с обычно используемыми простыми методами обработки результатов иммунохимических равновесий. Наближення РВПС відхиляється від нормального при / З ± or, і значні відхилення спостерігаються при Кп ± 2у. Широке розповсюдження цієї функції для опису розподілу антитіл за константам зв'язування обумовлено його схожістю із зазвичай використовуваними простими методами обробки результатів імунохімічних рівноваг.
Функція РВПС стосовно взаємодії антигену з антитілом валентності з дозволяє отримати співвідношення
— средняя аффинность; а — индекс гетерогенности. де AO - середня аффінность; а - індекс гетерогенності.
Розподіл РВПС є симетричним і унімодальному та може бути повністю охарактеризовано середньої константою афінності Ко та індексом гетерогенності «а». Довільне припущення про симетричному розподілі антитіл за афінності має свої обмеження. Справжня форма розподілу залишається невідомою. Часто все ж на практиці використовують розподіл РВПС для опису гетерогенної популяції антитіл. Насправді розподіл антитіл за К буває несиметричним і мультимодальних, тому, строго кажучи, розподіл антитіл за афінності не можна апроксимувати розподілом РВПС.
Зокрема, наприклад, описані розподілу, сильно зміщені в бік антитіл з низькою афінності. Внаслідок цього подання всієї популяції антитіл як популяції, що взаємодіє з однієї середньої афінності або навіть як бімодальною, не завжди точно відображає розподіл антитіл за афінності.
У припущенні про відсутність внутрішньо-та міжмолекулярних взаємодій Муккур з співробітниками ввели поняття про загальну константі афінності Кі представляє собою суму творів рівноважних констант кожної з m субпопуляцій антитіл на множники, що враховують концентраційний внесок кожної з фракцій у загальній популяції антитіл:
>
тобто загальна константа афінності для гетерогенної популяції є средневесовим параметром і являє собою суму средневесових афінності яг-субпопуляцій в реакційній суміші. Концентрацію антигену, пов'язаного в комплекси з антитілами, можна представити у вигляді
, являющейся формальным выражением для константы равновесия, Можна показати, що граничне значення функції Q, що є формальним виразом для константи рівноваги, при концентрації в системі, а графічно залежність IgQ від має вигляд кривої з від'ємним нахилом. от к нулевой концентрации =0, можно получить предельное значение Q , равное Kt . Екстраполюючи експериментальну залежність IgQ від до нульової концентрації = 0, можна отримати граничне значення Q, рівне Kt.