Асоціація між людськими лейкоцитарних антигенів HLA і туберкульозом

Резюме

Легеневий туберкульоз розвивається як складна комбінація між екологічними факторами та генетичної сприйнятливістю. У даному дослідженні асоціація між людськими лейкоцитарних антигенів (HLA) та туберкульозом було вивчено в декількох популяціях, але результати виявилися суперечливими.

Передбачувана оцінка II класу HLA проводилась методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) за допомогою набору специфічних праймерів і олігонуклеотидів в мексиканській популяції.

Дослідження проводилося Клінічної службою Туберкульозу і Відділом імунології, Національному інституті респіраторних хвороб, Мексика.

В якості обстежуваних були чотири групи пацієнтів: 95 здорових, 50 неіммуносупрессірованних пацієнтів з туберкульозом легень, 15 ВІЛ-інфікованих пацієнтів з туберкульозом; 37 ВІЛ-інфікованих пацієнтів в асимптотичної стадії.

У результаті дослідження були отримані дані: частоти алелей DQA1 * 101, DQB1 * 501, DRB1 * 1501 були значно збільшені у неіммунодепрессірованних пацієнтів з туберкульозом легень в порівнянні зі здоровими пацієнтами. На відміну від цього, частоти алелів DQB1 * 402, DRB1 * 4 і DRB1 * 8 були значно зменшені у пацієнтів з туберкульозом. Також, значне збільшення частоти алелі DRB1 * 1101 було виявлено у ВІЛ-позитивних пацієнтів.

Генетичний вплив, пов'язане з системою HLA грає важливу роль у розвитку туберкульозу легень. Хоча ця сприйнятливість, можливо, не грає у ролі у пацієнтів, з серйозними порушеннями імунної системи (такими, як ВІЛ-інфекція).

Введення

Туберкульоз залишається однією з найважливіших світових проблем. За приблизними оцінками приблизно третину населення заражена Mycobacterium tuberculosis. Близько 8 мільйонів випадків активного туберкульозу і 2,9 мільйонів смертей реєструється кожен рік.

Хвороба наблизилася до епідемічних пропорцій з погіршенням навколишнього середовища, соціоекономічних умов, таких як перенаселення, неправильне харчування і розташування стічних вод. Також, останнім часом епідемічна картина асоційована з ВІЛ.

Однак, дослідження, виконані на людях і лабораторних тварин, доводять, що на додаток до навколишнього середовища генетична схильність може грати роль у прогресуванні захворювання. Нещодавно відкрито, що зміни генетичної інформації для асоційованого з вродженим імунітетом протеїну I макрофага пов'язані з сприйнятливістю до туберкульозу у жителів Західної Африки.

Головний комплекс гістосумісності людини відіграє важливу роль у формуванні імунної відповіді. Можлива асоціація між антигенами HLA і туберкульозом досліджена на багатьох популяціях, але результати виявилися суперечливими. Невідповідності можуть бути пов'язані з методологічними проблемами, тому що дослідження були зроблені головним чином серологічними методами, які можуть давати перехресні реакції і мати низьку специфічність. Крім того, серологічні методи дають помилкові значення HLA класу II більш ніж в 25% випадків у порівнянні з більш точним методом ДНК-типування. Також сприйнятливість до туберкульозу перебуває під багатофакторним генетичним контролем, що включає і контроль за системою HLA.

HLA регіон знаходиться на короткому плечі шостий хромосоми і ділиться на три регіони: HLA класу I, який кодує HLA-A,-B,-C антигени; HLA класу II, який кодує HLA-DR, DQ і DP антигени; HLA класу III, який кодує другий і четвертий компоненти комплементу С2 і С4, фактор B, туморонекротіческій фактор α і β, білок теплового шоку 70 і 21-гідроксилази. Гени класів I і II кодують поверхневі клітинні глікопротеїни, функція яких презентувати антигенні пептиди для CD8 + CD4 + клітин, що грають фундаментальну роль в гомеостазі.

Система HLA - сама поліморфна біологічна система, та популяційні відмінності представлені частотами специфічних алелей і підтипів, а також їх комбінацією. HLA-система рестріктірует Т-клітини і тісно пов'язана з генами імунної відповіді і супресії. Відповідь антиген-специфічних Т-клітин пов'язаний з презентацією процессірованного пептиду в асоціації з поверхневими глікопротеїнами МНС класу I і II. Зокрема, білки, кодовані генами МНС класу II, функціонують як рестріктірующій елемент, який опосередковує впізнавання антигену регуляторними Т-клітинами, і тісно пов'язані з імунною розпізнаванням і відповіддю.

Мета даного дослідження - порівняти частоту генів HLA класу II у дорослих з туберкульозом легень і здорових людей метом полімеразної ланцюгової реакції. Також були досліджені ВІЛ-позитивні пацієнти з туберкульозом або без нього.

Матеріали і методи. Дослідження популяції

У дослідження були включені п'ятьдесят випадково відібраних неіммунодепрессірованних пацієнтів з туберкульозом легень. Пацієнти, не пов'язані родинними зв'язками, були корінними жителями Мехіко, були госпіталізовані в Національний інститут респіраторних хвороб під час дослідження. У всіх випадках діагноз туберкульозу був поставлений на основі світловій мікроскопії, за допомогою якої виявлялося присутність кислотостійких бацил в мокроті, а також культуральним висівом M. tuberculosis.

Щоб визнати пацієнтів неіммунодепрессірованнимі, вони були оцінені за наступними критеріями: відсутність ВІЛ-інфекції; нормальна кількість лімфоцитів і Т-клітин у периферичній крові; підтверджений легеневої туберкульоз. Пацієнти з діабетом, силікоз, цирозом печінки або іншими системними захворюваннями, а також пацієнти, які зловживають алкоголем, не були включені в дослідження. Пацієнти зі СНІДом досліджувалися незалежно.

В якості контролю досліджувалися 95 не пов'язаних спорідненістю здорових пацієнтів, відібрані за етнічними та соціоекономічні особливостям; 37 ВІЛ-інфікованих пацієнтів без туберкульозу та інших інфекцій (2-я стадія ВІЛ-інфекції за класифікацією Центру з контролю і запобігання інфекцій CDC). Додатково досліджувалися 15 ВІЛ-інфікованих пацієнтів з туберкульозом (4-я стадія ВІЛ-інфекції по CDC) і 20 здорових не ВІЛ-інфікованих гомосексуальних пацієнтів. Діагноз ВІЛ ставилося за методом ІФА і підтверджувався за допомогою методу імуноблотингу. Пацієнти і контроль народилися в Мексиці і мають три покоління предків, корінних жителів Мексики. Дослідження було схвалено Науковим і Етичним комітетом, було отримано згоду всіх обстежуваних.

Проект дослідження

Геномна ДНК з цільної крові, що містить етилендіамінтетраацетат була витягнута з допомогою стандартних методик. ДНК ампліфікація і специфічна ідентифікація алелей HLA-DQ здійснювалися за допомогою методу ПЛР з набором специфічних праймерів (Bio-Sinthesis; Dallas, TX). Ідентифікація HLA-DRB1 проводилася за допомогою специфічних послідовностей олігонуклеотидів методом зворотної гібридизації dot blot (Amplicor kit; Hoffman La Roche; Базель, Швейцарія). DR1, DR2, DR4, DRB1-DR52, DRB3 і DRB5 ампліфікація проводилась методом ПЛР з використанням Taq-полімерази (Promega; Madison, WI). Праймери, що використовуються для ампліфікації: DRBAMP-B для регіону 3 'з екзона 2, і DRBAMP-1, DRBAMP-2, DRBAMP-3 DRBAMP-4, DRBAMP-5 і DRBAMP-52 для регіону 5' з екзона 2. Вони були синтезовані на автоматичному синтезаторі (DNA-SM; Beckman; Пало-Альто, Каліфорнія).

Статистичний аналіз

Після того, як були визначені частоти фенотипів для кожних алелів у досліджуваній та контрольної популяціях, відмінності були встановлені і підтверджені за допомогою критерію χ2. Ризик розвитку туберкульозу був перевірений за допомогою комп'ютерної програми (STATA і Windows 95, Microsoft, Редмонд, WA).

Результати

Дослідження включало 50 неіммунодепрессірованних пацієнтів (середній вік 39,1 ± 13,0 років). У контроль були залучені 95 здорових осіб (35,4 ± 10,1 років); 37 ВІЛ-інфікованих пацієнтів, не заражених туберкульозом і не мають новоутворень, 15 іммунодепрессірованних пацієнтів (ВІЛ-інфікованих) з туберкульозом (31,1 ± 5,7 років); 20 здорових не ВІЛ-інфікованих гомосексуалістів (26,3 ± 8,5 років). Пізня група контролю не мала суттєвих відмінностей у фенотипі HLA з групою незв'язаних здорових людей.

За допомогою методу ПЛР і гібридизації були показані розбіжності між частотами алелів неіммунодепрессірованних пацієнтів з активним туберкульозом та пацієнтами з інших груп. Відмінності частот у кожній групі показані в таблиці 1. Серед 50 неіммунодепрессірованних пацієнтів з туберкульозом було 30 пацієнтів з алелем DQA1 * 0101, 22 з алелем DQB1 * 0501 і 24 з алелем DRB1 * 1501 (у порівнянні з контрольною групою з 95 осіб: 20, 12 і 9 осіб відповідно).

ВІЛ-інфіковані пацієнти показали високі частоти алелі DRB1 * 1101.

З іншого боку три алелі асоційовані з протекцією проти туберкульозу: DQB1 * 0402, DRB1 * 4 і DRB1 * 8 (таблиця 1).

Обговорення результатів

Молекулярне типування виявилося корисним для визначення асоціацію між системою HLA і туберкульозом. Цей метод виявився більш зручним, ніж серологічний. У даному дослідженні метод ПЛР в поєднанні зі специфічними олігонуклеотидно пробами показали асоціацію між генами DQA1 * 0101, DQB1 * 0501, DRB1 * 1501 і сприйнятливістю до туберкульозу. Ці маркери сприйнятливості визначалися незалежно один від одного, тому мова не йде про гаплотипі. Цікаво, що ВІЛ-інфіковані пацієнти з туберкульозом не мали даних генів. Передбачається, що придбання серйозного иммунодепрессивного статусу привертає до розвитку туберкульозу, незалежно від генетичної складової. Однак розмір цієї групи був занадто малий, щоб робити якісь висновки, і необхідні подальші дослідження великих груп ВІЛ-інфікованих пацієнтів з туберкульозом. До того ж частоти деяких алелів HLA DR і DQ локусів у здорової контролю були значно збільшені в порівнянні з частотами HLA у пацієнтів з туберкульозом, що можна пов'язати з тим, що ці алелі можуть робити внесок у стійкість до даного інфекційного захворювання.

Недавні дослідження пацієнтів з туберкульозом з Індії показали асоціацію з геном HLA DRB1 * 2, але більша частина даних алелей DRB1 * 1501 і DRB1 * 1502 була одночасно і у пацієнтів та у контролю. Розподіл генів HLA DQ в даному дослідженні вивчено не було. Пізніше була знайдена асоціація між HLA DQB1 * 503 і клінічним туберкульоз у пацієнтів з Камбоджі. У цьому дослідженні було також відзначено невелике збільшення частоти народження алелі HLA-DRB1 * 2.

HLA-DQ молекули унікальні серед II класу молекул МНС, тому що обидві α-і β-ланцюжка дуже поліморфні, більше того, багато варіабельні амінокислотні залишки розташовані в α-спіральної частини антиген-зв'язуючого кишені. За допомогою ПЛР аналізу було виявлено два гени DQ алелі, пов'язаних з туберкульозом.

Також ризиком до розвитку легеневих і екстрапульмонарних захворювань є впливу навколишнього середовища і початковий результат впливу мікобактерій на організм. Хоча фактори, які впливають на розвиток хвороби та її клінічний прояв, ще недостатньо вивчені. Зокрема, при дії мікобактерій на організм не завжди відбувається зараження, а серед заражених прогресування в активну захворювання, причини хвороби і її тривалість сильно варіюють. Найбільш ймовірно, діє складний комплекс генетичних і екологічних факторів. Добре відомо, що погані навколишні умови і деякі ідентифіковані фактори ризику: діабет, силікоз, ВІЛ, зловживання алкоголем та інші, - всі вони грають роль у схильності до туберкульозу. У даному дослідженні сімейний статус і правильне харчування, відомі кофактори у розвитку туберкульозу, були однаковими в контрольній групі і групі пацієнтів з туберкульозом; пацієнти з деякими з вищезгаданих порушень були виключені з групи хворих з туберкульозом, а ВІЛ-інфіковані пацієнти з туберкульозом аналізувалися окремо.

Генетичні чинники господаря можуть впливати і на сприйнятливість до інфекційного агента, і на патогенез захворювання, хоча отримати свідоцтво генетичної схильності до туберкульозу досить складно. Нещодавно були отримані дані, що варіації в протеїні I людських макрофагів, який асоційований з вродженим імунітетом, пов'язані зі зміненою чутливістю до мокроти-позитивним туберкульоз у населення Західної Африки.

Результати досліджень, як і дані Goldfeld та ін, показують, що деякі алелі системи HLA II класу, особливо локусу DQ1, можуть брати участь у зростанні чутливості і в сприйнятливості до туберкульозу. HLA-рестріктірованная презентація процессірованних антигенів альвеолярними макрофагами може бути змінена у пацієнтів, які експресують дані специфічні алелі HLA.

Також було виявлено зростання частоти DRB1 * 1101 алелі у ВІЛ-інфікованих пацієнтів. При використанні стандартного методу мікроцітотоксічності на мононуклеарних клітинах кілька років тому була отримана висока частота зустрічальності гена HLA-DR5 у ВІЛ-інфікованих пацієнтів. Однак неясно, чи призводить ген HLA-DR5 до розвитку ВІЛ-інфекції або до деяких наступним ускладнень, таких як постійна генералізована лімфаденопатія або саркома Капоші. Після того, як було доведено, що частота DRB1 * 1101 була значно збільшена на II стадії ВІЛ-інфекції по CDC, результати дослідження доводили: генетична сприйнятливість, пов'язана з цим маркером, привертає пацієнтів до ВІЛ-інфекції, а не до вищеописаних ускладнень. На доказ цієї точки зору було досліджено 20 чоловіків-гомосексуалістів без ВІЛ-інфекції по HLA II класу. Частота алелю HLA DRB1 * 1101 в цій групі не відрізняється від контрольної групи. Проте ці дані потрібно використовувати обережно, тому що незважаючи на багато досліджень щодо типу HLA та імунної відповіді на ВІЛ-I, питання про те, чи впливає HLA на сприйнятливість до даної вірусної інфекції залишається невирішеним.

Проведені дослідження доводять, що три алелі HLA залучені в сприйнятливість до туберкульозу в мексиканській популяції.

Механізми, що лежать в основі нестійкості або сприйнятливості до інфекційних захворювань, пов'язані з HLA II класу, а також відмінності між DR і DQ локусами до цих пір до кінця не вивчені. Хоча результати дослідження підтверджують, що генетичний вплив системи HLA може грати роль в розвитку туберкульозу, але ця передбачувана чутливість не грає ролі у пацієнтів з серйозними порушеннями імунітету, як під час ВІЛ-інфекції. Також було припущено, що ген DR5 може бути асоційований з розвитком ВІЛ-інфекції.

Таблиця 1. Частоти генів HLA в чотирьох групах пацієнтів