Біосенсори основи і додатки

1. ОСНОВНА ЧАСТИНА

1.1 Сенсори на основі мікроорганізмів

1.2 Сенсор для визначення засвоюваних цукрів

1.3 глюкозний сенсор

1.4 Сенсор оцтової кислоти

1.5 Сенсор спиртів

1.6 Цефалоспориновий сенсор

1.7 Сенсор БПК

2. Основні біосенсори на основі рослинних і тваринних тканин

2.1 Біосенсори АМР

2.2 Біосенсори сечовини

2.3 Цістейповий біосенсор

2.4 Мітохондріальні біосенсори

2.5 Амперометричні біосенсори

3. Можливе використання біосенсорів, застосування біосенсорів в клінічній медицині

3.1 Гази крові

3.2 Моніторинг калію

3.3 Глюкоза

ВИСНОВОК

Список використаної літератури

ВСТУП

Біосенсор - це пристрій, що включає біологічний чутливий елемент, тісно пов'язаний з перетворювачем або інтегрований з ним. Зазвичай біосенсор призначений для формування цифрового електричного сигналу, пропорційного концентрації певного хімічного з'єднання або ряду сполук. Сучасна концепція біосенсора значною мірою пов'язана з ідеями Ліланда Кларка-молодшого і співавторів, розвинутими в 1962р. Автори припустили, що якби ферменти можна було іммобілізувати на електрохімічних датчиках, то такі "ферментні електроди" розширили б діапазон аналітичних можливостей базового датчика. Послідувала потім грандіозна робота з нескінченними варіаціями цієї теми поступово розсунула горизонти цій галузі. Її нинішній стан в якійсь мірі характеризують перераховані нижче потенційні чутливі елементи і перетворювачі, які можна використовувати при конструюванні біосенсорів: біологічні компоненти (цілі організми, тканини, клітини, органели, ферменти і тд), перетворювачі (потенціометричні, Амперометричні, кондуктометричні, оптичні , калориметричні, механічні, акустичні, хімічні).

Розвиток біосенсорів обумовлено зусиллям дослідників в декількох напрямів. Значні перспективи е напрям досліджень - створення нових матеріалів для конструювання перетворювачів або більше ефективного зв'язку між компонентами сенсора. Рушійною силою в дослідженні сенсорів було яскраво виражене інстинктивне розуміння можливості їх широких практичних додатків. Ці дослідження стимулювалися перш за все потребами медицини. Можливість негайного аналізу клінічних препаратів, очевидно, однаково привертає і лікарів, і пацієнтів, хоча деякі національні служби охорони здоров'я відчувають труднощі з впровадженням цієї філософії. Більш привабливою є можливість безперервного in vivo моніторингу метаболітів, лікарських препаратів і білків за допомогою мініатюрних і портативних систем. Чудовим прикладом клінічного застосування є сенсор глюкози для хворих на діабет, що став класичним об'єктом досліджень в області біосенсорів.

В останні роки зростає інтерес до інших можливих використанням біосенсорів. Клінічні дослідження повернулися в бік ветеринарії та тваринництва. Все більше уваги надається якості продуктів у харчовій промисловості. У цій області давно визнано значення швидких методів оцінки термінів зберігання, псування і забруднення продуктів. Розвиток біотехнології стимулює розробку методів моніторингу процесів ферментації, що також розширює можливості безперервного контролю цих процесів. Проблеми охорони навколишнього та промислового середовища стимулювали розробку сенсорів для визначення таких шкідливих речовин, як оксид вуглецю та гербіциди. У той же час інтереси військових незмінно зосереджені на спеціальних вимогах біологічного та хімічного захисту.

1. ОСНОВНА ЧАСТИНА

1.1 Сенсори на основі мікроорганізмів

В останні роки розроблено безліч біосенсорів для визначення органічних сполук. Багато ферментні сенсори мають високу специфічність по відношенню до становлять інтерес субстратів, однак використовувані в них ферменти дороги і нестійкі. Мікробні сенсори складаються з іммобілізованих мікроорганізмів і будь-якого електрохімічного датчика і придатні для безперервного контролю біохімічних процесів. Принцип роботи мікробних сенсорів - це асиміляція органічних сполук мікроорганізмами, що реєструється електрохімічними датчиками.

1.2 Сенсор для визначення засвоюваних цукрів

При культивації мікроорганізмів на патоці цукрового очерету, що містить різні цукри, для контролю процесу бродіння важливе визначення сумарного вмісту засвоюваних Сахаров в середовищі. Так, при високій концентрації цукру спостерігається пригнічення катаболізму, що призводить до пригнічення росту клітин. Відновлені цукру і сахарозу в культуральних середовищах можна визначати ферріціанідним методом. Цей метод, однак, не цілком надійний, оскільки неусваіваемие цукру можуть заважати визначенню.

Засвоєння органічних сполук мікроорганізмами можна оцінювати по дихальної активності останніх, яку в свою чергу можна безпосередньо виміряти за допомогою кисневого електроду.

Для безперервного визначення загального вмісту засвоюваних Сахаров (глюкози, фруктози і сахарози) у бродильної середовищі сконструйований мікробний сенсор, що складається з іммобілізованих живих клітин. Загальний вміст засвоюваних Сахаров оцінювали за споживанням кисню іммобілізованими мікроорганізмами. Додавання аліквотної частини глюкози призводило до збільшення поглинання кисню в розчині. У результаті електродний струм поступово знижувався, поки не досягав деякого стаціонарного значення. Час відгуку сенсора становило 10 хв при вимірюванні стаціонарного струму і 1 хв в імпульсному режимі. Існує лінійна залежність між зменшенням струму і концентрацією глюкози (до 1 мМ), фруктози (до 1 мМ) і сахарози (до 0,8 мМ) відповідно. Чутливість мікробного сенсора до цих сахарам оцінюється співвідношенням 1,00: 0,80: 0,92. При використанні розчинів, що містять 0,8 мМ глюкози, відносне стандартне відхилення для величини зменшення струму становило 2%. Загальний вміст засвоюваних Сахаров розраховували, підсумовуючи значення аналітичних сигналів для відгуків на глюкозу, фруктозу і сахарозу, при цьому різниця істинних і розрахункових концентрацій не перевищувала 8%. Мікробний сенсор поміщали в бродильну середовище для отримання глутамінової кислоти, де він надійно працював понад 10 днів і витримав 960 вимірювань.

1.3 глюкозний сенсор

Для визначення глюкози запропонований мікробний сенсор, що складається з іммобілізованих цілих клітин Pseudomonas fluorescens і кисневого електрода. Сенсор поміщали в досліджуваний розчин, який під час вимірювань насичували киснем і перемішували магнітною мішалкою.

На рис.2.4 показана типова залежність сигналу сенсора від часу. При 30 "З стаціонарний струм встановлювався в межах 10 хв. Точний час відгуку залежало від концентрації доданої глюкози. При видаленні мікробного сенсора з розчину і приміщенні в середу, що не містить глюкози, струм поступово зростав і повертався до початкового рівня приблизно за 15 хв при 30 ° С.

Сенсор проявляє слабку чутливість до фруктози, галактози, манозе, сахарозі і не чутливий до амінокислот. Тому вибірковість визначення глюкози за допомогою цього мікробного сенсора можна вважати цілком задовільною. При вимірах стаціонарного струму залежність між струмом і концентрацією глюкози лінійна до концентрації 20 мг / л, причому нижня межа визначуваних концентрацій глюкози становила 2 мг / л. При вмісті глюкози 10 мг / л значення струму відтворювалося з точністю +6%. Стандартне відхилення склало 6,5 мг / л при числі дослідів більше 20.

Мікробний глюкозний сенсор дозволяє визначати концентрацію глюкози в патоці із середньою відносною похибкою ± 10%. Для порівняння глюкозу визначали також ферментним методом; результати корелюють з отриманими електрохімічним методом.

1.4 Сенсор оцтової кислоти

При вирощуванні мікроорганізмів на оцтової кислоти як джерелі вуглецю надлишок кислоти пригнічує їх ріст і, отже, її оптимальну концентрацію слід підтримувати за допомогою безперервного контролю в режимі "на лінії".

Пористу мембрану з іммобілізованими дріжджами закріплювали на поверхні тефлоновою мембрани кисневого електроду і покривали інший газопроникному тефлоновою мембраною. Таким чином, мікроорганізми містилися між двома пористими мембранами. Мікробна сенсорна система складалася з проточною осередку з водяною сорочкою, магнітної мішалки, перистальтичного насоса, автоматичного дозатора і самописця, що реєструє струм.

Принцип роботи цього сенсора аналогічний описаному вище. Оскільки ацетат-іони не можуть проходити через мембрану, рН проби підтримували істотно нижче рК оцтової кислоти (4,75 при 30 ° С). Що стосується вибірковості мікробного сенсора по відношенню до оцтової кислоти, то слід зазначити, що він не чутливий до таких летючим з'єднанням, як мурашина кислота і метанол, або нелетких компонентів живильного середовища, таким, як глюкоза або фосфат-іони. Tiichosporon brassicae можуть споживати пропионовую, н-бутанову кислоти і етанол, однак при ферментації ці речовини зазвичай відсутні або їх концентрація занадто мала, щоб заважати визначенню оцтової кислоти.

Для порівняння концентрацію оцтової кислоти в бродильної середовищі для виробництва глутамінової кислоти визначали описаним мікробним сенсором і методом газової хроматографії. Спостерігається гарну згоду результатів, отриманих двома методами: коефіцієнт кореляції дорівнює 1,04 для 26 дослідів. Вихідний сигнал сенсора (0,29-0,25 мкА) був постійний (з точністю до +10% від початкового значення) більше трьох тижнів, при цьому було виконано 1500 вимірів. Тепер цей мікробний сенсор випускається в Японії серійно.

1.5 Сенсор спиртів

У бродильних виробництвах необхідно безперервно визначати концентрації метанолу і етанолу в культуральних середовищах. При використанні спиртів в якості джерела вуглецю для культивованих мікроорганізмів концентрація спиртів повинна підтримуватися на оптимальному рівні, щоб уникнути інгібування субстратом. Як відомо, спирти утилізуються багатьма мікроорганізмами, отже, такі мікроорганізми можна використовувати для конструювання спиртового сенсора [5].

Етанольних сенсор включає іммобілізовані Trichosporon brassicae і кисневий електрод. Спосіб іммобілізації клітин і конструкція електрода такі ж, як у глюкозно сенсорі.

Для вимірів цим сенсором в стаціонарних умовах потрібно багато часу, тому був використаний імпульсний метод, що забезпечує відгук протягом всього 6 хв. Лінійна залежність між зменшенням струму і концентрацією етанолу спостерігається в діапазоні концентрацій від 2 до 22,5 мг / л. Для проби з концентрацією етанолу 16,5 мг / л різницевий струмовий сигнал відтворюємо з відносною похибкою 6%. Стандартне відхилення склало 0,5 мг / л при кількості досвідів, рівному 40.

Сенсор не проявляє чутливості ні до летючих з'єднань, таким, як метанол, мурашина, оцтова та пропіонова кислоти, ні до нелетких речовин.

Мікробний етанольних сенсор використовували в дріжджових бродильних середовищах. Визначення концентрації етанолу в тих же пробах методом газової хроматографії дало результати, порівнянні з отриманими за допомогою мікробного сенсора: коефіцієнт кореляції становив 0,98 з кількості досвідів більше 20. У діапазоні концентрацій етанолу 5,5-22,3 мг / л вихідний струм сенсора залишався постійним більше трьох тижнів, протягом яких було проведено 2100 аналізів. Зараз цей сенсор випускається в Японії серійно.

1.6 Цефалоспориновий сенсор

Антибіотики зазвичай визначають за допомогою турбідіметричних або титриметрического мікробіологічного аналізу, однак методики такого визначення досить складні і непридатні для експресних аналізів.

Відомо, що Citrobac'ter freundii виробляє фермент цефалоспориназ, який каталізує реакцію цефалоспорину з виділенням протона:

Цефалоспориназ, однак, дуже нестійка і не підходить для виготовлення ферментного сенсора. У сенсорі, чутливому до цефалоспорину, можна використовувати цілі клітини Citrobacter freundii, які мобілізують в колагенової мембрані, що поміщається потім в мембранний реактор.

На рис.2.8 показана система для безперервного визначення цефалоспоринів. Вона включає реактор мембранного типу з прокладкою в середині. Вимірювання рН, що обумовлюються ферментативної реакцією, вимірювали комбінованим скляним електродом і реєстрували за допомогою самописця.

При введенні в реактор розчинів, що містять різні кількості цефалоспоринів, різниця потенціалів на електродах поступово збільшувалася, поки не досягала деякого максимуму. Мінімальний час відгуку системи залежало від швидкості потоку та активності іммобілізованих бактерій в колагенової мембрані.

При швидкості потоку 2 мл / хв максимальна різниця потенціалів досягалася через 10 хв.

Отримана лінійна залежність між максимальною різницею потенціалів і логарифмом концентрації цефалоспорину. За допомогою цефалоспоринового розчину визначали 7-фенилацетиламидодезацетоксиспорановую кислоту (7-фенілацетіл-ADCA), цефалоридин, цефалотин і цефалоспорин С.

Стабільність мікробного сенсора перевіряли, аналізуючи розчин, що містить 125 мкг / мл 7-фснілацетіл-АОСА. Цефалоспорин визначали кілька разів на день, проте спостерігається різниця потенціалів не змінювалася протягом тижня.

Цю систему застосовували також для визначення цефалоспорину С в культуральному середовищі Cephalosporium acremonium. Результати вимірювань порівнювали з даними, отриманими методом високоефективної рідинної хроматографії. У разі мікробного сенсора відносна похибка склала 8%, отже, сенсор цілком придатний для безперервного визначення цефалоспоринів в ферментаційних середовищах.

1.7 Сенсор БПК

Біохімічне споживання кисню (БПК) - один з часто використовуваних показників забруднення органічними речовинами. Зазвичай визначення БПК вимагає п'ятиденної інкубації, тому необхідний експресний метод оцінки БПК, що дає більше відтворювані результати.

Насичений киснем фосфатний буферний розчин (0,01 М, рН 7) пропускали через проточну осередок зі швидкістю 1 мл / хв. Коли вимірюваний струм досягав стаціонарного значення, в клітинку вводили пробу зі швидкістю 0,2 мл / хв. Значення стаціонарного струму залежало від БПК аналізованого розчину. Потім струм поступово повертався до початкового рівня. Час відгуку сенсора (час, необхідний для досягнення стаціонарного струму) залежало від природи аналізованого розчину.

Лінійна залежність між різницею струмів (початкового і стаціонарного значень) і БПК, що визначається після п'ятиденної витримки в стандартному розчині глюкози і глютамінатом, спостерігалася до значення БПК 60 мг / л. Нижня межа визначуваних концентрацій становила 3 ​​мг / л. При аналізі розчину з БПК, рівним 40 мг / л, струм відтворювався з відносною похибкою +6% (число дослідів більше 10).

Розглянутий мікробний сенсор застосовували для оцінки п'ятиденного БПК необроблених стічних вод бродильного виробництва. П'ятиденна БПК стічних вод визначали також методом JIS (метод, рекомендований Japanese Industrial Standard Committee). Значення БПК, оцінені мікробним сенсором і визначені методом JIS, добре корелювали між собою. За допомогою даного сенсора оцінювали також БПК необроблених промислових стічних вод різних типів. Знайдено, що сигнал сенсора визначається сполуками, присутніми в стічних водах.

2. Основні біосенсори на основі рослинних і тваринних тканин

Тканинні матеріали рослинного і тваринного походження успішно використовують як биокаталитических компонентів біосенсорів. Біокаталітичні матеріали цього класу просто створюють природне оточення для представляє інтерес ферменту, в результаті чого необхідна ферментативна активність помітно стабілізується. У багатьох випадках тканинні біосенсори служать набагато довше, ніж аналогічні біосенсори з виділеними ферментами. Крім того, тканинні матеріали зберігають досить високу специфічну активність, необхідну для конструювання деяких біосенсорів, тоді як виділені ферменти в тих же умовах руйнуються. У більшості випадків ці переваги досягаються не на шкоду вибірковості. Якщо ж у тканинному матеріалі протікають заважають процеси, розробляють спеціальні заходи по збільшенню вибірковості. У цій главі гідності тканинних біосенсорів показані на конкретних прикладах. Розглянуто також кілька біосенсорів на основі таких биокаталитических матеріалів, як фрагменти клітин тварин. Нарешті, вперше запропоновано можливі механізми транспорту (вхід, внутрішній перенос і вихід) субстрату і продуктів у іммобілізованих клітинах тканини.

Історично тканинні біосенсори з'явилися пізніше розглянутих у попередніх розділах ферментних і мікробних біосенсорів. Можливість використання незбираного фрагмента тканини ссавців в якості біокаталітичний шару вперше була продемонстрована на прикладі аргінінових сенсора. Тонкий шар бичачої печінки і відповідну кількість ферменту - уреази спільно іммобілізований на поверхні аміачного газочутливого датчика. На кінчику сенсора протікали каталітичні реакції.

Розробка цього першого сенсора на основі тканини печінки бика відкрила шлях до створення тканинних біосенсорів.

2.1 Біосенсори АМР

Тканинні матеріали не тільки подовжують термін служби біосенсора, але і забезпечують велику концентрацію заданого біокаталізатора. Прикладом може служити що розглядається в цьому розділі біосенсор AMP з газоамміачним датчиком. Обмежена площа поверхні датчика не дозволяє іммобілізувати великі кількості ферментного препарату. Тому якщо специфічна активність останнього невисока, то й аналітичні характеристики сенсора будуть незадовільними. Ефект низької концентрації ферменту проявився, зокрема, у разі ферментного АМР-електрода, описаного в роботі. Використовуваний в цьому сенсорі виділений фермент зазвичай має низьку активність, що призводить до малої величиною нахилу градуювальних кривих і короткому терміну служби. Чутливість і термін служби сенсора AMP можна значно поліпшити за допомогою тонкого шару м'язової тканини кролика. Підвищення чутливості біосенсора безпосередньо пов'язано з п'ятикратним збільшенням активності біокаталізатора на поверхні датчика.

Виділений фермент мобілізують на поверхні датчика за допомогою діацетілцеллюлозной мембрани. У тканинному біосенсори тонкий шар м'язової тканини кролика утримують на датчику найлонових сіткою з отворами розміром 37 мкм. Сенсори обох типів зберігають при кімнатній температурі в робочому буферному розчині, що містить 0,1 М ТрісНС1, 0,1 М КС1 і 0,02% азиду натрію (рН 7,5). Після складання тканинний біосенсор слід витримувати від 2 до 4 год для видалення фонового аміаку.

Щоб поліпшити аналітичний сигнал тканинного АМР-сенсора, оптимізували різні параметри експерименту (рН, концентрацію іонів калію, температуру і товщину шару тканини). Знайдені оптимальні умови-рН 7,5, 0,1 М К + і 25 ° С. Збільшення товщини тканини призводить до великих часи відгуку, які стають неприйнятними при товщині шару більше 0,81 мм. З іншого боку, шматочки тканини товщиною менше 0,5 мм незручні в обігу і погано відтворювані. З цих причин для виготовлення сенсора використовують шари тканини товщиною від 0,5 до 0,8 мм, які можна легко отримати за допомогою гострого леза бритви.

Шар м'язової тканини кролика товщиною 0,5 мм містить приблизно п'ять міжнародних одиниць АМР-деаміназной активності. У той же час можна порівняти обсяг (25 мкм) комерційного препарату ферменту має активність всього 0,1 од. Така низька активність і призводить до поганої чутливості ферментних біосенсорів. Фактично перед іммобілізацією виділений фермент доводиться концентрувати фільтрацією протягом 16 год і в результаті активність ферментного шару на поверхні електрода підвищується до 0,9 од. [35]. Але навіть після такого концентрування ферментативна активність у шарі тканини залишається вище приблизно в п'ять разів. Часто буває важко знайти надійне джерело придбання деяких видів ссавців для отримання специфічного тканинного матеріалу. У таких випадках як біокаталізатора зручніше використовувати порошок з висушеної ацетоном тканини. Перша спроба такого роду описана в повідомленні про біосенсори AMP, в якому пасту з розтертої в порошок збезводненої ацетоном м'язи кролика фізично закріплювали на поверхні аміачного датчика [4].

Пасту з розтертої в порошок м'язи кролика одержують у такий спосіб. У пластикову пробірку (1 мл) вводять 300 мкл буферного розчину, що містить 0,1 М Трис-НС1, 0,1 М КВ і 0,02% азиду натрію (рН 7,9), і додають 100 мг замороженого порошку. Суміш перемішують на вихровий мішалці протягом 30 с. При такій обробці виходить однорідна паста, необхідну кількість якої (зазвичай 10 мг) наносять на тефлонову мембрану аміачного датчика. Поверх пасти поміщають діацетілцеллюлозную мембрану і загвинчують ковпачок електрода до положення, при якому паста міцно утримується на місці. Зібраний біосенсор залишають вимочувати на ніч у вказаному вище буферному розчині для видалення фонового аміаку з біокаталітичний шару.

2.2 Біосенсори сечовини

Тут описано біосенсор для визначення сечовини, а якому як біокаталітичний компонента використовують шар борошна з бобів канаваліі мечовидної. Це борошно початково містить велику кількість ферменту уреази, який каталізує реакцію

Цей біокаталітичний матеріал виявився вдалим замінником чистого ферменту.

Розглянутий біосенсор готують наступним чином. З цілого боба канаваліі мечовидної видаляють зовнішній шар і подрібнюють насіння за допомогою ступки і маточки. Свіжоприготовлену борошно (зазвичай 7 мг) наносять на поверхню газоамміачного датчика і змішують з невеликим обсягом буферного розчину (0,2 М Трис-HCl, рН 8,5, 0,1 мМ ЕДТА). Отриману таким способом пасту рівномірно розмазують по мембрані датчика і додають глутаровий альдегід, щоб зв'язати білки. У результаті виходить стабільний біокаталітичний шар. Градуювальні криві зазвичай отримують в буферному розчині, що містить Тріс-HCl і ЕДТА при 25 ° С. Біосенсори зберігають у тому ж розчині при кімнатній температурі.

Як видно з табл.3.7, основні характеристики сечовинного сенсора на основі бобової борошна краще, ніж у сенсора на основі виділеного ферменту. Більш того знайдено, що як каталізатор бобова борошно виявляє яскраво виражену селективність по відношенню до сечовини в присутності різноманітних речовин, які потенційно могли б заважати визначенню. Перевагами бобової борошна в порівнянні з ферментом є також низька вартість і більш зручні умови зберігання. Очищена уреаза щодо дорога і повинна зберігатися при температурі замерзання або більш низькою, тоді як бобова борошно істотно дешевше і непогано зберігається при кімнатній температурі. Таким чином, при конструюванні біосенсорів сечовини борошно з бобів канаваліі мечовидної є гарною заміною очищеної уреази.

2.3 Цістейповий біосенсор

Для конструювання біосенсорів можна ефективно використовувати й інші види рослинних матеріалів. Наприклад, для визначення цистеїну на поверхні амонійного датчика мобілізують модифіковані листя огірка. Взагалі листя рослин, мабуть, мають багато переваг як біокаталізатори завдяки своїй будові. Багато листя має багатошарову структуру, що включає воскове покриття (кутикулу) з зовнішньої сторони аркуша, шар епідермальних клітин (епідерміс) і примикає до нього губчастий проміжний шар; ті ж шари повторюються у зворотному порядку на іншій стороні аркуша. Кутикула володіє гідрофобними властивостями, однак проникна для газів. Газообмін здійснюється через невеликі отвори на поверхні листа, звані устьицами. Губчастий проміжний шар найбільш активний у метаболічних процесах з участю газів. Для отримання биокаталитических мембранних електродів зрізають кутикулу із зовнішнього або нижньої сторони листа і поміщають решту листа на газочутливого потенціометричний електрод так, щоб відкритий епідермальний шар знаходився в контакті з аналізованих розчином, а газопроникних воскова кутикула-з внутрішніми елементами сенсора.

Цей принцип був продемонстрований, зокрема, при розробці L-цистеїнових-го біосенсора з використанням огіркових листя й аміачного датчика [45]. У листі огірка міститься фермент L-цістеіндесульфгідролаза, що каталізує реакцію

Таким чином, в цистеїнових сенсорах можна використовувати електроди, чутливі або до NH3, або до H2S, хоча з хімічних міркувань перше переважно.

Методика виготовлення цистеїнових біосенсора досить проста. Огірки (Cucumis saturis) вирощують з насіння в грунті для розсади. У міру необхідності відриваю! зрілі листя і вимочують їх у воді протягом 45 хв. При вимочуванні кутикула розм'якшується і легко видаляється, оголюючи біохімічно активний епідерміс. Ця процедура необхідна, так як субстрат, L-цистеїн, насилу дифундує через восковий шар кутикули. Потім з листа вирізають диск потрібного розміру, поміщають його на торець газового датчика і закріплюють діалізної мембраною.

У фосфатному буферному розчині з рН 7,6 електродна функція такого біосенсора характеризується нахилом близько 35 мВ / РС в діапазоні від 10 "3 до 10" 5 М. Такий відносно низький нахил градуювальної кривої, поряд з досить великим часом відгуку, свідчить про необхідність подальшого вдосконалення цього біосенсора. Однак завдяки великому терміну служби сенсорів (до чотирьох тижнів) і винятково низької вартості листя та їх фрагменти як біокаталізатори цілком могли б конкурувати з іммобілізованими ферментами і клітинами.

2.4 Мітохондріальні біосенсори

Поряд з цільними фрагментами тканин ссавців в біосенсорах можна ефективно використовувати фракції тканинних клітин, іммобілізуя саме ті субклітинні компоненти, які мають найбільшу біокаталітичний активністю. Такий підхід може бути дуже плідним, якщо необхідно збільшити кількість іммобілізованого ферменту або поліпшити вибірковість сенсора, усуваючи заважають ферменти, які містяться в інших частинах клітини. Показано, що деякі субклітинні фракції можна використовувати як аналітичні реагенти. Так. для визначення тироксину можна використовувати мікросоми печінки щура [34]. Першою вдалою спробою створення біосенсора на основі субклітинні фракції був біосенсор для визначення глутаміну [8]. У цьому сенсорі мітохондріальну фракцію клітин кортекса нирки свині іммобілізований на газоамміачном датчику. Мітохондрії містять два ізоферменту глутамінази [15], активність яких і використовують в глутамінової біосенсори.

Мітохондріальну фракцію клітин нирки свині виділяють за стандартною методикою, що включає диференціальне центрифугування [26]. Отриману мітохондріальну фракцію мобілізують за допомогою звичайної діацетілцеллюлозной діалізної мембрани. Зібрані біосенсори поміщають в буферний розчин (0,120 М хлориду калію, 0,02 М Трис-хлориду, 0,04 М Трис-фосфату, 0,005 М сукцинату, 1 мкг / 1,5 мл ротеноном, 0,02% азиду натрію) з рН 8,5. Сенсори зберігають і використовують при кімнатній температурі.

Аналітичні характеристики мітохондріального електрода порівнянні з характеристиками тканинних і бактеріальних електродів і набагато перевершують отримані в системі з виділеним ферментом (табл.3.2). Селективність мітохондріального глутамінового біосенсора виявилася дуже високою [8].

Успіх у створенні мітохондріального біосенсора показує, що субклітинні матеріали можуть служити ефективними біокаталізаторами. Хоча це і не відноситься до розглянутого глутамінового біосенсори, субклітинні фракції можна використовувати для поліпшення чутливості і вибірковості біосенсора в тих випадках, коли цілісні фрагменти тканин не володіють необхідними властивостями.

2.5 Амперометричні біосенсори

Амперометричне детектування знаходить широке застосування при аналізі біологічних середовищ. В оптимальних умовах метод дозволяє визначати концентрації до 10 ~ 8-10 ~ 9 М, при цьому величина сигналу варіюється в межах трьох-чотирьох порядків. У зв'язку з біосенсорами має сенс розглянути основні особливості амперометрией та їх вплив на сигнал детектора.

Накладення різниці потенціалів між електродом порівняння і індикаторним електродом призводить до зростання струму, який у свою чергу залежить від концентрації аналізованих електроактивних частинок в розчині. Вимірюваний струм може бути безпосередньо пов'язаний зі швидкістю електрохімічної реакції, що протікає на індикаторному електроді. Важливо, однак, знайти і навчитися контролювати умови, від яких залежить, яка стадія лімітує швидкість всього електрохімічного процесу. Швидкість гетерогенного переносу електрона (/ ст), що протікає безпосередньо на електроді, можна контролювати, змінюючи прикладений потенціал у відповідності з рівнянням Бутлера - Фольмера [10]. Таким чином, у багатьох системах можна вибрати таке значення потенціалу, щоб струм не лімітував гетерогенним переносом електрона, навіть якщо цей процес незворотній. При виконанні цієї умови швидкість визначальною стадією може бути дифузія (массопере-ніс), адсорбція або хімічні реакції. Сумарний струм сенсора описується наступним виразом:

У нього входять два дифузійних члена iid і / ed, які визначаються швидкостями внутрішньої і зовнішньої дифузії відповідно. Останній пов'язаний з дифузією в об'ємі розчину аж до електрода або межі розділу мембрана / розчин. Внутрішня дифузія включає рух відповідних часток у мембрані або реакційному шарі. Сумарний струм визначається також перенесенням заряду або адсорбцією реагують частинок на мембрані або поверхні електрода (; '2 d). Переміщення частинок визначається речовини з розчину до сенсора може поєднуватися з хімічною реакцією, що протікає з кінцевою швидкістю (7к). Слід, однак, підкреслити, що члени рівняння (11.1) не є абсолютно незалежними один від одного.

Багато біосенсори працюють при постійному потенціалі, що істотно спрощує приладове оформлення. Однак при цьому завжди спостерігається фоновий струм, величина якого може бути значущою при низьких концентраціях визначається речовини. Корекція фонового струму і градуювання біосенсорів in vivo-дві серйозні проблеми, які вимагають надійного рішення. Коливання цих параметрів можуть бути обумовлені "отруєнням" електрода компонентами середовища. Погіршується також чутливість і час відгуку біосенсора. Якщо флуктуації базової лінії обумовлені коливаннями концентрацій ендогенних електроактивних заважають частинок, то можна використовувати двоелектродну (диференційну) систему. Цей підхід використовували при конструюванні глюкозного датчика, де один електрод покритий мембраною на основі глюкозооксидази, а інший-мембраною, що не містить ферменту. Передбачається, що електроактивні домішки однаковим чином дифундують через обидві мембрани [60]. У випадках, коли електрод забруднюється домішками з матриці або продуктом електрохімічної реакції, його піддають багатоімпульсному ступінчастою обробці при різних потенціалах [45, 52]. Цей спосіб дозволяє одночасно провести як обробку електрода (у тому числі видалення накопичилися на його поверхні плівок), так і установку базової лінії в області потенціалів, в якій відсутня електроліз. Застосовують також різні види імпульсної полярографії, вольтамперометрії (циклічну або з лінійною розгорткою потенціалу). Остання особливо корисна в двох випадках, описуваних нижче. Багато нейроактівние речовини окислюються при дуже близьких значеннях потенціалів, і тому їх важко розрізнити. Повна циклічна вольтамперограмма відображає розходження в хімічних властивостях продуктів електролізу. Вона може служити, з одного боку, для якісного аналізу, як "відбиток пальця" досліджуваної системи [56], а з іншого-для кількісного опису протікають в ній електрохімічних процесів. Нещодавно було показано [61], що представляють інтерес для біології органічні молекули можуть концентруватися на обробленій поверхні електрода. При лінійної розгортці потенціалу осад визначається речовини видаляється з поверхні, даючи чітко виражений пік.

Амперометрія є перспективним напрямком розвитку біосенсорів для застосування як in vivo, так і in vitro. Широкий динамічний діапазон концентрацій (104-105) дозволяє більш широко застосовувати її на практиці, ніж потенціометричне детектування. Проблема полягає лише в ефективному сполученні специфічних біохімічних реакцій з процесами, що зумовлюють відгук електрода. Такі сенсори можуть функціонувати у виключно неоднорідному середовищі та (у разі імплантуються сенсорів) при температурі 37 ° С.

3. Можливе використання біосенсорів, застосування біосенсорів в клінічній медицині

Біосенсор in vivo можна визначити як невеликий датчик зондового типу, який вводиться або прикріплюється до тіла для безперервного визначення (без додавання реагентів) концентрації речовин, що представляють інтерес для виявлення патології або терапії.

У літературі багато сенсори описують як потенційно імплантуються, однак, хоча вони нерідко являють собою значні наукові досягнення, їх автори приділяють мало уваги клінічного підтвердження можливості безперервного моніторингу концентрації того чи іншого речовини. Будь-який in vivo біосенсор (до тих пір, поки вони не стануть в цілому нешкідливі) представляє ризик для пацієнта або добровольця. Тому, вибираючи речовина для безперервного моніторингу, важливо встановити критерії відбору. На нашу думку, передусім це має бути речовина, концентрація якого змінюється так швидко (як, наприклад, у випадку глюкози в крові або артеріального тиску кисню, /> АО2), що звичайний аналіз in vitro не дозволяє адекватно стежити за ходом цієї зміни методу за хвилину. По-друге, зміни концентрації повинні мати фізіологічний або клінічне значення. Загальна мета розвитку in vivo біосенсорів в медицині полягає в тому, щоб поліпшити контроль стану пацієнтів, і, якщо виходити з наведених вище міркувань, в даний час основними компонентами, для яких має сенс безперервний моніторинг, є містяться в крові гази, рН, глюкоза і калій.

У майбутньому, можливо, будуть розроблені системи із замкнутим контуром, в яких за допомогою біосенсорів будуть безупинно контролюватися рівні вмісту різних лікарських речовин у крові, а швидкості їх надходження з подаючого насоса будуть регулюватися за допомогою зворотного зв'язку, що дозволить підтримувати їх концентрації у вузькому терапевтичному діапазоні. Значний інтерес представляють і незамкнуті системи для контрольованого введення декількох лікарських препаратів [38, 45].

За певних обставин імплантуються біосенсори можуть бути також корисні для періодичного аналітичного контролю. Теоретично мініатюрні сенсори повинні забезпечувати: доступ в строго обмежені області в організмі; можливість проведення вимірів у малих обсягах фізіологічних рідин (наприклад, інтерстиціальної рідини) без їх витрачання чи видалення; швидке отримання результатів. Можна припустити, що ці достоїнства сенсорів можна було б успішно використовувати, наприклад, в ході хірургічної операції, для виявлення певних речовин безпосередньо в тканини або в посудині з відсмоктується з неї кров'ю. Це дозволило б локалізувати пухлину, гарантувати правильність видалення і навіть встановити її біохімічну природу.

3.1 Гази крові

У здорової людини парціальні тиску кисню і діоксиду вуглецю в артеріальній крові підтримуються в строго контрольованих межах (p. dO2 = = 12,6-13,3 кПа; /> аСО2 = 4,5-6,1 кПа). Однак при різних порушеннях і хворобливих станах, насамперед впливають на серцево-судинну і дихальну систему або регуляцію метаболізму (див. нижче), вимірювання РаО2 і РаСО7, якщо не вжити відповідних заходів щодо їх корегуванню, можуть призводити до серйозних, а іноді й фатальним клінічним наслідків.

Порушення, супроводжувані відхиленнями від норми газового складу крові:

Дихальна недостатність у дітей

Дихальна недостатність у дорослих

Хронічна закупорка легенів

Серцева недостатність

Вроджені вади серця

Операції на серці

Є три категорії пацієнтів, для яких доцільно запровадити безперервний моніторинг газового складу крові: недоношені новонароджені, пацієнти з гострою серцево-судинної або дихальної недостатністю (особливо потребують штучної вентиляції легенів) і, нарешті, пацієнти, котрі піддаються операції на відкритому серці.

3.2 Моніторинг калію

Калій має першорядне фізіологічне і патологічне значення. Це основний катіон, присутній всередині клітин. Він грає важливу роль у підтримці мембранного потенціалу електрично збудливих клітин, наприклад клітин серцевого м'яза або нервових тканин. У нормі концентрація К + в плазмі підтримується у вузькому діапазоні (3,8-5,5 ммоль / л), але цей тонкий баланс може порушуватися при багатьох захворюваннях, у тому числі хворобах нирок, надниркових залоз і шлунково-кишкового тракту, цукровому діабеті, а також лікарської терапії (наприклад, при використанні діуретиків). Зміна вмісту К + може істотно впливати на серцевий ритм: гіперкаліємія (найбільш серйозне порушення, пов'язане з калієм) викликає брадикардію, фібриляцію шлуночків і, у важких випадках, зупинку серця. Дійсно, безперервний моніторинг К +, очевидно, має найбільшу цінність для пацієнтів, що страждають серцевими захворюваннями (очевидно, зміни концентрації К + з-за хвороби нирок або діабету відбуваються не так швидко, щоб звичайного аналізу in vitro було недостатньо).

Поруч дослідників розроблені катетерних калійселектівние сенсори або на основі звичайного потенціометричного іоноселективного електрода з використанням валиномицин в якості іонофора [55, 58], або твердотільних приладів типу іоноселектівних польових транзисторів (ІСПТ), покритих іоноселективних мембраною [34].

Одне з найбільш цікавих і корисних додатків К +-сенсорів описано в роботі [58]. Два пацієнти піддавалися черезшкірної пластичної операції транспазушних судин серця з використанням катетерного балона Грюнзіга для розширення коронарної артерії (ця нова методика була розроблена, щоб уникнути серйозного хірургічного втручання при необхідності розширити звужені кровоносні судини). Калієвий електрод вводили цим пацієнтам в коронарний синус (до якого надходить кров, що циркулює через серцевий м'яз). Було проведено три послідовних роздування балонного катетера протягом 20 с з інтервалами в 80 с. У ході ангіопластіческой оклюзії пацієнти не відчували болі в грудях; на електрокардіограмі, які реєструються на поверхні тіла, помітних змін також не було. При роздуванні балона не спостерігалося змін концентрації К + у коронарному синусі, але через 4,5 с після спускання балона рівень К + тимчасово підвищувався на 0,3 ммоль / л вище базової лінії (4,0 ммоль / л). Цей ефект інтерпретували як відмивання від К + з міокардіальних клітин, що відбувається через кілька секунд після ішемії. Якщо рівень вмісту К + у коронарному синусі дійсно може служити для раннього виявлення міокардіальної ішемії, то постійно знаходяться в синусі К +-електроди можуть бути корисні при лікуванні пацієнтів після гострого інфаркту міокарда або хірургічної операції на коронарної артерії.

3.3 Глюкоза

Відносне або повна відсутність інсуліну у хворих діабетом призводить до того, що концентрація глюкози в крові перевищує допустимі в нормі вузькі межі (близько 3,5-5 міль / л натще). Близько 20% діабетиків, які в основному хворіють у віці близько 30 років, страждають від повного або майже повного руйнування виробляють інсулін клітин підшлункової залози (острівці Лангерганса). Діабет цього типу називають інсулін-залежним, або діабет I типу. Для життя хворих на діабет цього типу необхідно заповнення інсуліну. Зазвичай інсулін вводять підшкірною ін'єкцією. І хоча такі ін'єкції зберігають життя і значною мірою запобігають симптоми гострої гіперглікемії, вони все ж не можуть підтримувати рівень глюкози в крові на недіабетичній (контрольному) рівні. Іноді вміст глюкози падає до дуже низьких величин (гіпоглікемія), що супроводжується неприємними проявами та небезпечної втратою свідомості; часто, проте, воно настільки високо, що, як серйозно вважають, робить досить суттєві і тривалі впливу на тканини в очах, нервах, нирках і кровоносних судинах.

Тому протягом останніх кількох років вживалися інтенсивні заходи до поліпшення діабетичного контролю. Один з важливих підходів у цій сфері полягає в контрольованому вливання інсуліну з портативного насоса "з незамкнутим контуром" [41, 42], що фактично є імітацією секреції інсуліну у здорових людей. Ці прилади можуть підтримувати глікемію майже в нормі щонайменше протягом декількох ліг, проте при самих різних обставин, наприклад після інтенсивного тренування, в ході випадкової хвороби або менструації, є небезпека втрати контролю. Логічний розвиток цих систем - "замикання контуру" та встановлення зворотного зв'язку, що управляє швидкістю вливання інсуліну, за допомогою імплантується глюкозного сенсора. У кінцевому підсумку така штучна підшлункова залоза може стати цілком імплантується, але цей напрямок перебуває поки на самій ранній стадії розвитку, тому, перш ніж прогрес стане реальністю, необхідно вирішити безліч технологічних, біологічних і етичних проблем.

Між тим імплантуються глюкозні сенсори, не пов'язані з насосами, все ще мають значні переваги, якщо необхідно дати тривожний сигнал про гіпоглікемії, попередити насувається гіперглікемію або кетоацидоз і взагалі отримувати безперервну інформацію про вміст глюкози в крові, що дасть можливість пацієнтові самому скорегувати й відрегулювати інсулінову терапію.

Можливі застосування біосенсорів.

Якщо визначити біосенсори як ідеальні прилади, придатні для імплантації, дозволяють проводити безперервне спостереження, унікально чутливі і вільні від перешкод, то люмінесцентні методи ще повинні розвиватися і розвиватися. Абсолютно ясно, проте, що як методи трансляції малих концентрацій біологічних сполук в легко оброблюваний сигнал, вони заслуговують на увагу.

Потенційні можливості цих методів великі, особливо якщо врахувати, що вони володіють достатньою чутливістю і не вимагають попереднього розділення проби. Існуюче апаратурне оформлення цих методів в цілому є традиційним в тому сенсі, що підготовлений зразок поміщають у клітинку або кювету, яку при детектуванні випромінюваного світла ставлять перед вакуумним фотоумножителем. Недавні розробки в цій галузі дозволяють припускати, що в недалекому майбутньому буде налагоджений серійний випуск нових, більш зручних приладів.

Моделлю для багатьох приладів на основі описаних реакцій може служити розглянуте нижче пристрій, в якому використовується оптичне волокно діаметром ~ 3,3 мм [12]. У цьому приладі, вимірюють концентрацію пероксиду водню в буферному розчині, пероксидазу мобілізують в прозорому поліакриламідному гелі і вводять люмінол як в гель, так і в розчин. За допомогою фотопомножувача, вміщеного на іншому кінці волокна довжиною 61 см, можна детектувати концентрації до 10 ~ 6М. Вказується, що на відміну від інших ферментних електродів немає необхідності в тому, щоб продукт ферментативної реакції дифундувати до поверхні електрода. Таким чином, час відгуку приладу дуже мало, близько 4 с. При цьому, однак, виникає проблема, пов'язана з тим, що сигнал лімітується масопереносу. Використання світловода простої форми дозволяє зробити конструкцію приладів зручною і працездатною [4]. Так що ця ідея заслуговує на увагу. При реалізації такого підходу основні проблеми, мабуть, пов'язані з іммобілізацією ферменту. У разі імуносенсором, звичайно, виникають труднощі, що обумовлюються вкрай низькою швидкістю встановлення рівноваги при зв'язуванні ліганда з антитілом. Тим не менше завдяки високій чутливості детектування світла і незалежності від процесів на електроді подальші дослідження в цій області представляються перспективними. Розвитку аналітичних приладів на основі біолюмінесценції перешкоджає складність отримання люциферази. Однак останні обнадійливі успіхи в цій галузі, зокрема клонування бактеріальної люциферази [3] і фотопротеіна екоріна [7], дозволяють сподіватися, що такої проблеми більше не існує. Тепер можна вважати, що рідкість даного організму не буде надалі стримувати спроби розробки на його основі нових аналітичних методів.

Як і у випадку будь-яких приладів, заснованих на використанні ферментів, виникає питання про стійкість. Вже накопичений досить великий досвід по використанню люциферази, іммобілізованих на різних підкладках. Препарати люциферази світляка поки ще недостатньо стійкі для застосування в біосенсорах, однак стійкість бактеріальної люциферази постійно поліпшується у міру появи кращих методів іммобілізації. Тепер бактеріальну люциферази можна використовувати в декількох сотнях циклів, вважаючи при цьому, що фермент не змінився в порівнянні з вихідним. Чи зможе на практиці цей фермент служити так довго, як мало хто відомі "довгожителі", залишається предметом подальшого дослідження.

Ще одна проблема, що виникає при використанні хемілюмінесцента і біолюмінесценції в сенсорах, пов'язана з необхідністю поповнення реагенту. Коль скоро ми хочемо використати такі переваги емісії світла, як простота детектування і висока чутливість, то в конструкції приладу необхідно передбачити і можливість додавання реагенту. Слід розуміти, що розглядається явище передбачає необоротне окислення субстрату-люціферіна у разі біолюмінесценції і легко доступною невеликий органічної молекули в хемілюмінесценції. Для багатьох описаних у цій главі реакцій вдається зробити так, щоб їх швидкість залежала тільки від концентрації визначуваної речовини. В даний час єдиний спосіб досягнення цього полягає у введенні надлишку люминесцирующей з'єднання. У звичайному аналізі таке "буферірованіе" самим реагентом не представляє проблеми, але потрібно проявити чимало винахідливості, щоб добитися того ж ефекту в межах обмеженого робочого об'єму сенсора. Якщо, проте, допустити, що концентрація визначуваної речовини не надто відрізняється від нижньої межі діапазону визначених концентрацій (це припущення цілком узгоджується з винятковою чутливістю методу), то неважко знайти прийнятну конструкцію приладу. Цікавим прикладом довготривалого забезпечення природного люмінесцентної системи люціферіном є сам світляк. Цей організм з'являється з лялечки з усім запасом люціферіна, яка необхідна на час (близько одного місяця) майже безперервного імпульсного світіння ночами! Враховуючи, що потреба фотопомножувачів в фотонах істотно нижче інтенсивності спалаху світляка, можна було б оцінити тривалість роботи сенсора. До такої оцінки не можна дати точну відповідь на це питання, однак у кращих випадках тривалість роботи сенсора не надто відрізняється від терміну служби ферментів, використовуваних в існуючих біосенсорах. Хемілюмінесцірующіе з'єднання можуть функціонувати у вигляді твердих тіл або паст; можна передбачити і утримують їх напівпроникні мембрани в поєднанні з відповідним чином зміненими сполуками.

ВИСНОВОК

Комерційному майбутньому біосенсорів, передбачали, може загрожувати цілий ряд непередбачених ускладнень, у тому числі погані відгуки про товар, посилена конкуренція, відсутність потреби, технічні труднощі, законодавчі або патентні проблеми, поганий маркетинг або збут, поганий дизайн товару. Шлях до комерційного успіху біосенсора лежить через аналіз ринку, глибоке розуміння потенційних переваг, фінансову підтримку, всеосяжний маркетинг і збут, цілеспрямованість. За умови вдалих комерційних рішень потенціал цих приладів дійсно дуже великий. Однак комерційне просування біосенсорів - це область докладання зусиль не для тих, хто згоден зі старим висловом Кромвеля про те, що йде далі за всіх не знає, куди веде дорога

В останні роки біосенсори привертають значну увагу як гідні наступники цілого ряду аналітичних методів контролю, що використовувалися в клінічних лабораторіях, ветеринарії та харчової промисловості. Дійсно, потенційні програми сенсорної техніки настільки широкі, що можна лише відзначити деякі найбільш важливі тенденції, що проявилися при розповсюдженні та збуті цих приладів за останні кілька років.

Список використаної літератури

1. Біосенсори: основи та застосування / За ред. Д. Тернера. М.: Світ, 1992.

2. Грін М., Стаут У., Тейлор Д. Біологія: В 3 т. / За ред. Р. Сопер. М.: Світ, 1996.

3. Євдокимов Ю.М. Біосенсори на основі одноланцюгових і дволанцюжкові нуклеїнових кислот / / Сенсорні системи. 1998. Т.12. Вип.1. С.5-21.

4. Решетілов О.М. Моделі біосенсорів на основі потенціометричних і амперометричних перетворювачів для використання в медицині, біотехнології, моніторингу об'єктів навколишнього середовища (огляд) / /

5. Прикладна біохімія та мікробіологія. 1996. Т.32. № 11. С.78-93.

6. Сафронова О.Г., Хімченко В.І., Штарк М.Б. Тканинні та клітинні біосенсори. Можливості клінічного застосування (огляд) / / Медична техніка. 1995. № 6. С.39-46