Рисунок 3 – Зміна оптичної густини у ході лактатдегідрогеназної реакції
Аналогічним чином може проводитися кількісне визначення всіх речовин, що є субстратами дегідрогеназ (малат, лактат, сукцинат і т. д.).
Розглянута вище ЛДГ-реакція може бути індикаторною при визначенні активності АлАТ. У цій спряженій системі реакції відбуваються за схемою
АлАТ
α-аланін + α-кетоглутарат--------> піруват + α-глутамат,
ЛДГ
піруват + НАДН+Н+ ---------> лактат + НАД+.
Реакція супроводжується зниженням величини оптичної густини при 340 нм, швидкість якого пропорційна активності АлАТ. Аналогічним чином може бути визначена активність АсАТ, але індикаторним ферментом у цьому випадку буде малатдегідрогеназа.
На використанні глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ) як індикаторного ферменту базується найточніший метод із усіх існуючих методів визначення концентрації глюкози. Тут реакція відбувається за схемою
гексокіназа
глюкоза + АТФ ---------------> глюкозо-6-фосфат + АДФ
Г6ФДГ
глюкозо-6-фосфат + НАДФ+ ----------> 6-фосфоглюконат + + НАДФН+Н+.
Глюкоза за участі гексокінази фосфорилюється до глюкозо-6-фосфату, який за допомогою Г6ФДГ окиснюється до 6-фосфоглюконової кислоти. Ця реакція супроводжується накопиченням НАДФН+Н+ і, отже, зростанням оптичної густини при 340 нм.
Інший підхід до визначення глюкози базується на використанні спряженої системи глюкозооксидаза + + пероксидаза й більш широко відомий. За участі глюкозооксидази глюкоза окиснюється киснем повітря з утворенням перекису водню, кількість якого визначається за його здатністю за наявності пероксидази окиснювати діаміни з утворенням забарвлених продуктів:
глюкозооксидаза
глюкоза + О2 + Н2О -------------> глюконова кислота + Н2О2,
пероксидаза
Н2О2 + барвник ---------------> забарвлений продукт + Н2О.
Як барвники (індикатори) для пероксидазної реакції запропоновано цілу групу речовин: о-толуїдин, о-діанізидин, фенол+4-аміно-антипірин та ін.
Вважають, що реакція з 4-аміно-антипірином має перевагу, оскільки забарвлення, що розвивається, більш стабільне, ніж при використанні інших речовин.
Ця сама пероксидазна реакція за участі 4-аміно-антипірину, запропонована Тріндером, може бути використана для кількісного визначення холестеролу й тригліцеридів.
При визначенні холестеролу його ефіри гідролізуются холестеролестеразою до вільних жирних кислот і холестеролу, який під впливом холестеролоксидази окиснюється киснем повітря до ∆4-холестенону. Перекис водню, що утворюється при цьому, за наявності пероксидази окиснює речовини-індикатори з утворенням забарвлених сполук, інтенсивність забарвлення яких пропорційна вмісту холестеролу в досліджуваному зразку:
холестеролестераза
ефіри холестеролу ------------------> холестерол + R-COOH,
холестеролоксидаза
холестерол + O2 ----------------------> ∆4-холестенон + H2O2,
пероксидаза
2H2O2 + 4-аміно-антипірин + фенол -----> забарвлений продукт + 4H2O2.
Описаний метод визначення холестеролу є найточнішим серед існуючих. У реакції Лібермана-Бурхарда, рутинному методі визначення холестеролу, беруть участь й інші стероли, що призводить до завищених результатів. До інших переваг ферментативного методу необхідно віднести відсутність впливу домішок білірубіну й гемоглобіну, необхідності проводити тривалий гідроліз ефірів і екстракцію холестеролу, відсутність агресивних реагентів.
Ще складніша ферментна система може бути використана для визначення тригліцеридів. Тригліцериди розщеплюються ліпазою до жирних кислот і гліцеролу, який за участі гліцерокінази й АТФ фосфорилюється з утворенням гліцерол-3-фосфату. Гліцерол-3-фосфат за наявності гліцерофосфатоксидази окиснюється киснем повітря з утворенням фосфодіоксіацетону й перекису водню, який, у свою чергу, окиснює барвник із утворенням забарвленого комплексу, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації тригліцеридів у досліджуваному зразку.
ліпаза
тригліцерид + 3H2O ---------> гліцерол + 3R-COOH,
гліцерокіназа
гліцерин + АТФ -----------> гліцерол-3фосфат + АДФ,
гліцеролфосфатоксидаза
гліцерол-3фосфат + O2 -------> фосфодіоксіацетон + H2O2,
пероксидаза
H2O2 + 4-аміно-антипірин + 4-хлорфенол -----------> забарвлений комплекс + 2H2O + HCl.
Цей метод визначення тригліцеридів найбільш специфічний, виключно точний і надзвичайно простий у виконанні.
На цей час розроблена ціла група ферментативних методів визначення сечової кислоти. Першим етапом цих методів є розщеплення сечової кислоти уриказою до алантоїну, вуглекислоти й перекису водню:
уриказа
сечова кислота + 2H2O + O2 ------> алантоїн + CO2 + H2O2.
Пероксид водню, що утворився, може бути визначений різними способами:
- за реакцією з 4-аміно-антипірином або іншим аналогічним барвником;
- перетворенням метанолу за участі каталази у формальдегід, який визначається спеціальними методами;
- окисненням перекисом етанолу в ацетатальдегід, який потім відновлюється НАДН (оптичний тест Варбурга).
Слід відзначити високу специфічність усіх ферментативних методів визначення сечової кислоти порівняно з рутинними фосфорно-вольфрамовими методами, оскільки, крім сечової кислоти, фосфорно-вольфрамову кислоту відновлюють аскорбінова кислота, тирозин, триптофан, цистин, цистеїн та ін.
Ще більшу кількість методів запропоновано для ферментативного визначення сечовини. Першим етапом усіх цих методів є розщеплення сечовини уреазою до аміаку та вуглекислоти:
уреаза
сечовина + Н2O ----------> 2NН4+ + CО2.
Визначення іонів амонію може бути здійснене різними способами:
- класичною бертолетовою реакцією;
- модифікованою бертолетовою реакцією із саліцилатом натрію;
- за допомогою оптичного тесту Варбурга.
В останньому випадку індикаторною є реакція
глутаматдегідрогеназа
NН4+ +α-кетоглутарат + НАДН+Н+ --> глутамат + НАД+ +
+ 2Н2О.
Усі ці методи високоспецифічні, оскільки для уреази сечовина є єдиним фізіологічним субстратом, але найточнішим є метод із оптичним тестом Варбурга.
На сьогодні розробляється новий напрям у використанні ферментів: ферментативні методи визначення електролітів (К+, Nа+, Сl+). Ці методи базуються на здатності електролітів виявляти активуючу дію на активність деяких ферментів.
8.2. Основні принципи визначення активності ферментів у сироватці крові. Одиниці активності ферментів. Недоліки ферментного аналізу
Ферменти, як і всі білки, є відносно нестійкими речовинами. Вони легко піддаються денатурації й інактивації, тому, працюючи з ферментами (ферментативні набори для визначення субстратів або активності ферментів, зразки біологічного матеріалу, що містять ферменти), слід дотримуватися загальних правил.
1. Не можна сильно струшувати розчини ферментів і допускати утворення піни при їх перемішуванні, оскільки ферменти при цьому можуть інактивуватися в результаті дії на них кисню повітря.
2. Розчинені, ліофільно висушені реагенти, контрольні матеріали й контрольні сироватки, що містять ферменти, перед використанням необхідно витримати при кімнатній температурі впродовж часу, зазначеного в інструкції, щоб фермент набув конформаційно активного стану. Необхідно суворо дотримуватися умов ферментативної реакції (час і температура інкубації, співвідношення реагент/сироватка).
3. Час початку й закінчення ферментативної реакції слід фіксувати для кожної окремої проби. Початком реакції вважається момент додавання в реакційну суміш сироватки крові, а також реагенту, який дає кольорову реакцію, якщо реакція двостадійна. Для кінетичних методів, коли аналіз у декількох пробах проводять послідовно, час початку реакції та рівні проміжки часу між фотометруваннями слід точно фіксувати за секундоміром для кожної окремої проби. Оскільки визначення, як правило, проводять у декількох пробах, сироватку в реакційну суміш у паралельних пробах слід вносити через чітко фіксовані за секундоміром проміжки часу, наприклад, через 30 с або 1 хв. Початком реакції вважається внесення сироватки в першу пробу із серії. Після закінчення часу реакції слід із таким самим інтервалом зупиняти реакцію в паралельних пробах, тобто вносити реагент, наприклад луг, з інтервалом 30 с або 1 хв відповідно. Таким чином, час реакції буде фіксований для кожної окремої проби. Винятком із цього правила можуть бути лише методи, в яких час ферментативної реакції становить 1 год, тоді припущене відхилення в часі між пробами, які визначають паралельно, матиме незначний вплив на кінцевий результат.
4. Перед початком ферментативної реакції температуру робочого реагенту необхідно довести до значення, зазначеного в інструкції, і забезпечити підтримання цієї температури впродовж усього часу аналізу. Часто для цього використовують водяну баню.
5. Не можна змінювати співвідношення робочий реагент/сироватка кров, а також розбавляти робочий реагент із метою економії, оскільки при цьому умови реакції (концентрація буфера, активаторів і т. д.) відхиляться від оптимальних, що призведе до змін результатів аналізу як у разі визначення активності ферментів, так і у разі визначення аналітів ферментативними методами.
6. Якщо концентрація ферменту або іншого аналіту в біологічній рідині перевищує верхню межу концентрації, яка може бути визначена за допомогою даного набору, то досліджувану пробу необхідно розбавити точно відповідно до рекомендацій, викладених у інструкції до набору. Для отримання точних і відтворюваних результатів іноді пробу взагалі не рекомендується розбавляти, оскільки активність деяких ферментів, наприклад АлАТ і АсАТ, непропорційно зменшується при розбавленні. Однак не завжди лінійна область визначення набору дозволяє охопити весь діапазон лінійних концентрацій речовини, яку визначають. Тоді необхідно намагатися розбавляти пробу мінімально, бажано в 2–3 рази (особливо при визначенні активності ферментів) і не більше, ніж зазначено в інструкції. Зрозуміло, для розведення не можна використовувати маленькі аліквоти (10–20 мкл); щоб зменшити помилку розведення, краще взяти хоча б 100 мкл проби.
7. Фотометрування слід проводити у зазначеному в інструкції діапазоні довжин хвиль та кюветі з певною довжиною оптичного шляху.
8. При побудові калібрувальних графіків необхідно робити не менше 4–5 паралельних визначень кожного стандартного зразка зазначеної в інструкції концентрації. Будувати калібрувальну криву слід для кожної серії набору, а також при зміні фотометричного обладнання.
9. Калібрувальну пробу, що використовується для розрахунку активності ферменту, необхідно ставити для кожної серії аналізів у чотирьох паралелях.
10. Для миття посуду можна використовувати тільки мийні засоби, що не містять біодобавки, оскільки до їх складу входять протеази, які навіть у слідових кількостях можуть зруйнувати ферменти в реакційній суміші.
11. Необхідно стежити за якістю дистильованої води, що використовується в процесі аналізу. Надлишок деяких іонів, що входять до її складу, може інгібувати ферменти.
12. Для отримання достовірних результатів дуже важливим є преаналітичний етап. На цьому етапі велике значення мають процедура взяття крові в пацієнта, транспортування в лабораторію, пробопідготовка та зберігання проби до аналізу. Невміле взяття крові може призвести до помилкових результатів. Як приклад можна навести такі чинники долабораторного етапу, які можуть істотно вплинути на результати визначення активності ферментів. Так, тривалий венозний стаз може призвести до гіпоксії та збільшення проникності мембран клітин крові, що позначиться на активності ряду ферментів. Інший негативний чинник – гемоліз; при тривалому стоянні крові активні радикали кисню та дефіцит субстратів призводять до ушкодження мембран еритроцитів. Гемоліз, вивільнення ферментів із лейкоцитів і тромбоцитів можуть помітно вплинути на активність ЛДГ, АсАТ, АлАТ, кислої фосфатази в сироватці крові. ЛДГ і кисла фосфатаза наявні у високих концентраціях у тромбоцитах, тому активність цих ферментів у сироватці вища, ніж у плазмі. При згортанні крові в сироватці з’являються ферменти з тромбоцитів, зокрема кисла фосфатаза, тому при роботі з сироваткою рекомендується щонайшвидше відділити її від згустка. Механічні ушкодження клітин крові (наприклад, унаслідок випускання крові зі шприца в пробірку під тиском або інтенсивного струшування при перемішуванні) також можуть позначитися на результатах визначення активності ферментів. Зберігання сироватки також несприятливо позначається на результатах визначення активності багатьох ферментів (вони занижуються), тому слід вимірювати активність ферментів у сироватці в день узяття крові в пацієнта. Тривале зберігання крові приводить до активації протеолізу.
13. Слід точно дотримуватися умов зберігання ферментативних наборів і їх компонентів, оскільки ферменти – термолабільні каталізатори. Так, амілаза, ліпаза, ЛАП, ГГТП, ХЕ, кисла фосфатаза стійкі при зберіганні, стабільність інших ферментів варіює. Багато ферментів можна зберігати в замороженому стані і у вигляді ліофілізатів без втрати активності, проте деякі ферменти чутливі до процедури заморожування, їх можна заморожувати тільки після додавання стабілізаторів. Це пов’язано з тим, що вода при кристалізації викликає незворотні зміни у водневих зв’язках білка. Наприклад, уреаза при заморожуванні частково або повністю інактивується. Особливо чутливі до процедури заморожування ферменти, що складаються з декількох субодиниць. Не допускається при зберіганні кілька разів заморожувати та розморожувати проби.
14. Слід регулярно перевіряти правильність і відтворюваність результатів аналізу з контрольних сироваток, які атестовані відповідними методами.
При оцінці отриманих результатів необхідно враховувати фізіологічні коливання активності ферментів. Так, існують деякі вікові відмінності у ферментних показниках. У новонароджених та у ранньому дитячому віці активність більшості ферментів дещо вища, ніж у дорослих. У людей похилого віку активність АсАТ, АлАТ, МДГ та деяких інших ферментів характеризується більш високими показниками. Емоційне навантаження, м’язова робота викликають невеликі зсуви активності ферментів. Так, у нетренованих людей тривале фізичне навантаження приводить до помітного коливання активності АсАТ, ЛДГ, МДГ, альдолази і особливо КК. Вагітність також виявляє певний вплив на активність ряду ферментів: у останні тижні відзначається невелике підвищення АсАТ, КК і ЛДГ. Арилсульфатаза, ЛАП, β-глюкуронідаза і гістаміназа при вагітності також змінюють свою активність, яка нормалізується через декілька днів після пологів.
Крім того, ферментні показники можуть зазнавати індивідуальних коливань, що пов’язані з генетичними особливостями, характером харчування, професією, способом життя людини та ін.
Під кількістю ферменту розуміють концентрацію специфічного білка, а під активністю – його здатність прискорювати перебіг біохімічної реакції. Для більшості ферментів з визначеної активності можна судити і про їх кількість. Але є й такі ферменти, специфічні зміни яких відображає лише масова концентрація, наприклад, креатинкіназа та її ізофермент MB.
Комісія з ферментів Міжнародного біохімічного союзу встановила, що одиницю каталітичної активності ферменту можна визначити як кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв за оптимальних умов. Ця одиниця називається міжнародною одиницею, MО, або IU (International Unit). У системі СІ одиницею каталітичної активності ферменту є катал (кат), який відповідає кількості ферменту, що перетворює 1 моль субстрату за 1 с при оптимальних умовах. При цьому об’ємна активність ферменту виражається як МО/л або кат/л, або кат/м3 і має назву концентрації каталітичної активності, або каталітичної концентрації, на відміну від питомої активності, яка виражається в МО/мг білка. У разі визначення масової концентрації ферменту, наприклад, креатинкінази MB, її виражають у мкг/л, використовуючи імунохімічні методи (радіоімунологічний аналіз або імуноензимометричні тести).
Активність ферментів in vivo та in vitro залежить не тільки від їх концентрації, але також від наявності активаторів та інгібіторів. Деякі чинники, пов’язані з проведенням аналізів, можуть впливати in vitro на активність ферменту. Тому в різних лабораторіях можуть бути одержані різні результати під час вимірювань активності одного й того ж ферменту в однакових, здавалося б, одиницях. Подібним же чином у різних лабораторіях можуть надавати різного діагностичного значення кількісним співвідношенням активності одного ферменту до такої іншого. Важливими чинниками вважають природу використаних субстратів, буферних розчинів і температуру проб. Оскільки у визначенні «міжнародних одиниць» ці чинники не враховуються, результати, одержані в різних лабораторіях і виражені в однакових, здавалося б, одиницях, можуть бути безпосередньо незіставними. Тому при інтерпретації результатів визначення активності ферментів їх необхідно порівнювати з одержаними в цій самій лабораторії даними про діапазон нормальних варіацій.
Тестові завдання для контролю засвоєння матеріалу
При якому з перелічених станів не збільшується загальна активність КК та КК-МВ?
A. Інфаркті міокарда.
B. Операціях на серці.
C. Міокардиті.
D. Мікроінфаркті.
E. Стенокардії.
Літня людина пройшла медичне обстеження. Єдине виявлене відхилення від норми — підвищена активність ЛФ сироватки — 2,6 ммоль/(год·л). Причиною підвищеної активності ферменту може бути усе перелічене, крім:
A. Доброякісної гіпертрофії передміхурової залози.
B. Остеомаляції.
C. Ураження кісток при хворобі Педжета.
D. Метастазів пухлини в печінку.
E. Метастазів у кістки.