1. Хімічна структура, біохімічні властивості і ферменти бактерій
Клітина - універсальна одиниця живої матерії. За хімічним складом істотних відмінностей прокаріотичних та еукаріотичних клітин немає.
Хімічні елементи, що входять до складу живої матерії, можна розділити на три основні групи.
1. Біогенні хімічні елементи (С, О, N, H). На їх частку припадає 95% сухого залишку, в т.ч. 50% - C, 20% - O, 15% - N, 10% - H).
2. Макроелементи - P, S, Cl, K, Mg, Ca, Na. На них припадає близько 5%.
3. Мікроелементи-Fe, Cu, I, Co, Mo та ін На них припадають частки відсотка, однак вони мають важливе значення в обмінних процесах.
Хімічні елементи входять до складу різних речовин - води, білків, ліпідів, нейтральних жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Синтез сполук контролюється генами. Багато речовин бактеріальна клітина може отримувати ззовні - з навколишнього середовища або організму господаря.
Вода становить від 70 до 90% біомаси. Вміст води більше у капсульних бактерій, найменше - в суперечках.
Білки зустрічаються у всіх структурних елементах клітини. Білки можуть бути більш прості (протеїни) складні (протеїди), в чистому вигляді або у комплексі з ліпідами, цукрами. Виділяють структурні (структуроутворюючі) і функціональні (регуляторні) білки, до останніх відносяться ферменти.
До складу білків входять як звичайні для еукаріотів амінокислоти, так і оригінальні - діамінопімеліновая, D-аланін, D-глютанін, що входять до складу пептидогліканів та капсул деяких бактерій. Тільки у спорах знаходиться діпіколіновая кислота, з якою пов'язана висока резистентність суперечка. Джгутики побудовані з білка флагелліна, володіє скоротливою здатністю і вираженими антигенними властивостями. Пили (ворсинки) містять особливий білок - пилина.
Пептидний природи мають капсули представників роду Bacillus, збудника чуми, поверхневі антигени ряду бактерій, у тому числі стафілококів і стрептококів. Білок А - специфічний білок S.aureus - фактор, обусловлавлівающій ряд властивостей цього збудника. Білок М - специфічний білок гемолітичних стрептококів серогрупи А, дозволяє диференціювати серовар (близько 100), що має епідеміологічне значення.
Ряд білків містить зовнішня мембрана грамнегативних бактерій, з яких 3 - 4 мажорних (основних) і більше 10 - другорядних, що виконують різні функції. Серед мажорних білків - поріни, що утворюють дифузні пори, через які в клітку можуть проникати дрібні гідрофільні молекули.
Білки входять до складу пептидоглікану-біополімеру, що становить основу бактеріальної клітинної стінки. Він складається з остову (чергуються молекули двох аміноцукрів) і двох наборів пептидних ланцюжків - бокових і поперечних. Наявність двох типів зв'язків-глікозидних (між аміноцукрів) та пептидних, які з'єднують субодиниці пептидогліканів, надають цьому гетерополімеру структуру молекулярної мережі. Пептидоглікану-найбільш стійке з'єднання, яке утворює ригідну мішкоподібну макромолекулу, визначальну постійну форму бактерій і ряд їх властивостей.
1. Пептидогликан містить родо-і видоспецифічні антигенні детермінанти.
2. Він запускає класичний і альтернативний шляхи активації системи комплементу.
3. Пептидогликан гальмує фагоцитарну активність і міграцію макрофагів.
4. Він здатний ініціювати розвиток гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ).
5. Пептидогликан має протипухлинну дію.
6. Він має пірогенну дію, тобто викликає лихоманку.
З сполук білків з небілковими компонентами найбільше значення мають ліпопротеїди, глікопротеїди і нуклеопротеїни.
Дивовижне таїнство життя - синтез білка здійснюється в рибосомах. Існує два основних типи рибосом - 70S (S-константа седиментації, одиниця Сведберга) і 80S. Рибосоми першого типу зустрічаються лише у прокаріотів. Антибіотики не діють на синтез білка в рибосомах типу 80S, поширених у еукаріотів.
Ліпіди (головним чином форфоліпіди) містяться в цитоплазматичній мембрані (ліпідний бішар), в також в зовнішній мембрані грамнегативних бактерій. Є мікроорганізми, які містять велику кількість ліпідів (до 40% сухого залишку) - мікобактерії. До складу ліпідів входять різні жирні кислоти, вельми специфічні для різних груп мікроорганізмів. Їх визначення має в ряді випадків діагностичне значення, наприклад у анаеробів, мікобактерій.
У мікобактерій туберкульозу в складі ліпідів є ряд кислотостійких жирних кислот - фтіоновая, міколовая та ін Високий вміст ліпідів та їх склад визначають багато властивостей мікобактерій туберкульозу:
-Стійкість до кислот, лугів і спиртів;
-Важка окрашиваемость барвниками (використовують спеціальні методи забарвлення, частіше-за Цілем-Нільсену);
-Стійкість збудника до сонячної радіації та дезосредствам;
- Патогенність.
Тейхоєвих кислоти зустрічаються в клітинних стінках грампозитивних бактерій. Представляють собою водорозчинні лінійні полімери, що містять залишки гліцерину або рібола, пов'язані фосфодіефірних зв'язків. З тейхоєвих кислотами пов'язані головні поверхневі антигени ряду грампозитивних бактерій.
Вуглеводи зустрічаються частіше у вигляді полісахаридів, ктором можуть бути екзо-і ендоклеточнимі. Серед екзоклеточних полісахаридів виділяють каркасні (входять до складу капсул) та істинно Екзополісахариди (виходять у зовнішнє середовище). Серед бактеріальних полісахаридів багато хто знаходить медичне застосування. Декстран - полісахариди з великою молекулярною масою, з вигляду нагадують слиз. 6% розчин-кровозамінник поліглюкін. Декстранових гель сефадекса використовується в колонкової хроматографії як молекулярне сито. Ендоклеточние полісахариди - запасні поживні речовини клітини (крохмаль, глікоген та ін.)
Ліпополісахариди (ЛПС) - один з основних компонентів клітинної стінки грамнегативних бактерій, це з'єднання ліпіду з полисахаридом. ЛПС складається з комплексу: 1.Ліпід А.
2. Однакове для всіх грамнегативних бактерій полисахаридной ядро.
3. Термінальна сахароїдними ланцюжок (О - специфічна бічний ланцюг).
Синоніми ЛПС - ендотоксин, О - антиген.
ЛПС виконує дві основні функції - визначає антигенну специфічність і є одним з основних факторів патогенності. Це - ендотоксин, токсичні властивості якого проявляються переважно при руйнуванні бактеріальних клітин. Його токсичність визначається ліпідом А. ЛПС запускає синтез більше 20 біологічно активних речовин, що визначають патогенез ендотоксикозу, володіє пірогенним дією.
Нуклеїнові кислоти - ДНК і РНК. РНК (РНК) знаходяться головним чином у рибосомах (р-РНК-80 - 85%), т (транспортні) - РНК-10%, м (матричні) - РНК-1 - 2%, головним чином у одноланцюжковою формі. ДНК (дезоксирибонуклеїнової кислоти) може перебувати в ядерному апараті (хромосомна ДНК) або в цитоплазмі у спеціалізованих утвореннях - плазмідах - плазмідна (позахромосомних) ДНК. Мікроорганізми відрізняються за структурою нуклеїнових кислот, змісту азотистих основ. Генетичний код складається всього з чотирьох літер (підстав) - А (аденін), Т (тимін), Г (гуанін) і Ц (цитозин). Найбільш часто для характеристики мікроорганізмів використовують як таксономічний ознака процентне співвідношення Г / Ц, яке суттєво відрізняється у різних груп мікроорганізмів.
Мікроорганізми синтезують різні ферменти - специфічні білкові каталізатори. У бактерій виявлено ферменти 6 основних класів.
1. Оксидоредуктази - каталізують окисно-відновні реакції.
2. Трансферази - здійснюють реакції перенесення груп атомів.
3. Гідролази - осущесвляют гидролитическое розщеплення різних сполук.
4. Ліази - каталізують реакції відщеплення від субстрату хімічної групи негідролітіческім шляхом з утворенням подвійного зв'язку або приєднання хімічної групи до подвійних зв'язків.
5. Лігази або синтетази - забезпечують з'єднання двох молекул, поєднане з розщепленням пірофосфатная зв'язку в молекулі АТФ або аналогічного трифосфату.
6. Ізомерази - визначають просторове розташування груп елементів.
Відповідно до механізмами генетичного контролю у бактерій виділяють три групи ферментів:
- Конститутивний, синтез яких відбувається постійно;
- Індуцибельних, синтез яких індукується наявністю субстрату;
- Репрессібельние, синтез яких пригнічується надлишком продукту реакції.
Ферменти бактерій ділять на екзо-і ендоферменти. Екзоферментів виділяються в зовнішнє середовище, здійснюють процеси розщеплення високомолекулярних органічних сполук. Здатність до утворення екзоферментів багато в чому визначає інвазивність бактерій-здатність проникати через слизові, сполучнотканинні та інші тканинні бар'єри.
Приклади: гіалуронідаза розщеплює гіалуронову кислоту, що входить до складу міжклітинної речовини, що підвищує проникність тканин (клостридії, стрептококи, стафілококи та багато інших мікроорганізми); нейрамінідаза полегшує подолання шару слизу, проникнення всередину клітин і поширення в міжклітинному просторі (холерний вібріон, дифтерійна паличка, вірус грипу та багато інших). До цієї ж групи належать ензими, розкладають антибіотики.
У бактеріології для диференціації мікроорганізмів за біохімічними властивостями основне значення часто мають кінцеві продукти і результати дії ферментів. Відповідно до цього існує мікробіологічна (робоча) класифікація ферментів.
1.Сахаролітіческіе.
2.Протеолітіческіе.
3.Аутолітіческіе.
4.Окіслітельно - відновні.
5.Ферменти патогенності (вірулентності).
Ферментний склад клітини визначається геномом і є досить постійною ознакою. Знання біохімічних властивостей мікроорганізмів дозволяє ідентифікувати їх по набору ферментів. Основні продукти ферментирование вуглеводів і білків-кислота, газ, індол, сірководень, хоча реальний спектр для різних мікроорганізмів набагато більш великий.
Основні ферменти вірулентності - гіалуронідаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейрамінідаза, ДНК-аза. Визначення ферментів патогенності має значення при ідентифікації ряду мікроорганізмів і виявлення їх ролі в патології.
Ряд ферментів мікроорганізмів широко використовується в медицині і біології для отримання різних речовин (аутолітичних, протеолітичні), в генній інженерії (рестриктаз, лігази).
2. Фізіологія і принципи культивування мікроорганізмів
2.1 Метаболізм мікроорганізмів
Для росту і розмноження мікроорганізми потребують речовини, які використовуються для побудови структурних компонентів клітини і отримання енергії. Метаболізм (тобто обмін речовин і енергії) має дві складових - анаболізм і катаболізм. Анаболізм - синтез компонентів клітини (конструктивний обмін). Катаболізм - енергетичний обмін, пов'язаний з окислювально-відновними реакціями, розщепленням глюкози та інших органічних сполук, синтезом АТФ. Живильні речовини можуть надходити в клітину у розчинній вигляді (це характерно для бактерій) - осмотрофи, або у вигляді окремих частинок - фаготрофи.
Основним регулятором надходження речовин у бактеріальну клітину є цитоплазматична мембрана. Існує чотири основних механізми надходження речовин: - пасивна дифузія - за градієнтом концентрації, енергонезатратная, яка не має субстратної специфічності;
- Полегшена дифузія - за градієнтом концентрації, субстратспеціфічная, енергонезатратная, здійснюється за участю спеціалізованих білків пермеаз;
- Активний транспорт-проти градієнта концентрації, субстратспеціфічен (спеціальні зв'язуючі білки в комплексі з пермеаз), енерговитратний (за рахунок АТФ), речовини надходять у клітку в хімічно незміненому вигляді;
- Транслокація (перенесення груп) - проти градієнта концентрації, з допомогою фосфотрансферазной системи, енергозатратна, речовини (переважно цукру) надходять у клітку в форфорілірованном вигляді.
Основні хімічні елементи - органогени, необхідні для синтезу органічекіх сполук-вуглець, азот, водень, кисень.
Залежно від джерела споживаного вуглецю мікроби поділяють на аутотрофи (використовують CO2) і гетеротрофи (використовують готові органічні сполуки). Залежно від джерела енергії мікроорганізми ділять на фототрофи (енергію отримують за рахунок фотосинтезу - наприклад, ціанобактерії) і хемотрофи (енергія добувається за рахунок хімічних, окисно-відновних реакцій). Якщо при цьому донорами електронів є неорганічні сполуки, то це літотрофи, якщо органічні-органотрофи. Якщо бактеріальна клітина в змозі синтезувати всі необхідні для життєдіяльності речовини, то це прототрофи. Якщо бактерії мають потребу в додаткових речовинах (чинниках зростання), то це ауксотрофи. Основними факторами росту для труднокультівіруемих бактерій є пуринові і піримідинові підстави, вітаміни, деякі (звичайно незамінні) амінокислоти, кров'яні фактори (гемін) і ін
2.2 Дихання мікроорганізмів
Шляхом дихання мікроорганізми добувають енергію. Дихання - біологічний процес переносу електронів через дихальний ланцюг від донорів до акцепторів з утворенням АТФ. У залежності від того, що є кінцевим акцептором електронів, виділяють аеробне і анаеробне дихання. При аеробному диханні кінцевим акцептором електронів є молекулярний кисень (О 2), при анаеробному-зв'язаний кисень (-NO 3, = SO 4, = SO 3).
Приклади.
О 2
Аеробне дихання донор водню H 2 O
Анаеробне дихання
нітратне окислення NO 3
(Факультативні анаероби) донор водню N 2
сульфатне окислення SO 4
(Облігатні анаероби) донор водню H 2 S
За типом дихання виділяють чотири групи мікроорганізмів.
1. Облігатні (строгі) аероби. Їм необхідний молекулярний (атмосферне) кисень для дихання.
2. Мікроаерофіли потребують зменшеної концентрації (низькому парціальному тиску) вільного кисню. Для створення цих умов у газову суміш для культивування зазвичай додають CO 2, наприклад до 10 - відсоткової концентрації.
3. Факультативні анаероби можуть споживати глюкозу і розмножуватися в аеробних і анаеробних умовах. Серед них є мікроорганізми, толерантні до відносно високим (близьких до атмосферних) концентрацій молекулярного кисню - тобто аеротолерантние, а також мікроорганізми які здатні в певних умовах переключатися з анаеробного на аеробне дихання.
4. Суворі анаероби розмножуються тільки в анаеробних умовах тобто при дуже низьких концентраціях молекулярного кисню, який у великих концентраціях для них згубний. Біохімічно анаеробне дихання протікає по типу бродильних процесів, молекулярний кисень при цьому не використовується.
Аеробне дихання енергетично більш ефективно (синтезується більшу кількість АТФ).
У процесі аеробного дихання утворюються токсичні продукти окислення (H 2 O 2 - перекис водню,-О 2 - вільні кисневі радикали), від яких захищають специфічні ферменти, перш за все каталаза, пероксидаза, пероксіддісмутаза. У анаеробів ці ферменти відсутні, також як і система регуляції окислювально-відновного потенціалу (rH 2).
Основні методи створення анаеробних умов для культивування мікроорганізмів.
1. Фізичний-відкачування повітря, запровадження спеціальної газової суміші безкисневому (частіше-N 2 - 85%, CO 2 - 10%, H 2 - 5%).
2. Хімічний - застосовують хімічні поглиначі кисню.
3. Біологічний - спільне культивування суворих аеробів і анаеробів (аероби поглинають кисень і створюють умови для розмноження анаеробів).
4. Змішаний - використовують кілька різних підходів.
Необхідно відзначити, що створення оптимальних умов для строгих анаеробів - дуже складне завдання. Дуже непросто забезпечити постійне підтримання безкисневих умов культивування, необхідні спеціальні середовища без вмісту розчиненого кисню, підтримка необхідного окисно-відновного потенціалу поживних середовищ, взяття і доставка, посів матеріалу в анаеробних умовах.
Існує ряд прийомів, які забезпечують більш відповідні умови для анаеробів-попереднє кип'ятіння поживних середовищ, посів у глибокий стовпчик агару, заливка середовищ вазеліновим маслом для скорочення доступу кисню, використання герметичних флаконів і пробірок, шприців та лабораторного посуду з інертним газом, використання щільно закриваються ексикаторі із запаленою свічкою. Використовуються спеціальні прилади для створення анаеробних умов - анаеростати. Проте в даний час найбільш простим і ефективним обладнанням для створення анаеробних і мікроаерофільних умов є система "Газпак" зі спеціальними газорегенерірующімі пакетами, які діють за принципом витіснення атмосферного повітря газовими сумішами в герметично закритих ємкостях.
Основні принципи культивування мікроорганізмів на поживних середовищах.
1.Використання всіх необхідних для відповідних мікробів поживних компонентів.
2.Оптімальние температура, рН, rH 2, концентрація іонів, ступінь насичення киснем, газовий склад і тиск.
Мікроорганізми культивують на живильних середовищах при оптимальній температурі в термостатах, що забезпечують умови інкубації.
За температурним оптимуму зростання виділяють три основні групи мікроорганізмів.
1.Псіхрофіли-ростуть при температурах нижче +20 градусів Цельсія.
2.Мезофіли-ростуть в діапозоні температур від 20 до 45 градусів (часто оптимум-при 37 градусах С).
3.Термофіли-ростуть при температурах вище плюс 45 градусів.
2.3 Коротка характеристика поживних середовищ
За консистенцією виділяють рідкі, щільні (1,5-3% агару) і напіврідкі (0,3 - 0,7% агару) середовища.
Агар - полісахарид складного складу з морських водоростей, основний затверджувач для щільних (твердих) середовищ. В якості універсального джерела вуглецю і азоту застосовують пептони - продукти ферментації білків пепсином, різні гідролізати-м'ясний, рибний, казеїновий, дріжджової та ін
За призначенням середовища поділяють на ряд груп:
- Універсальні (прості), придатні для різних невимогливих мікроорганізмів (м'ясо - пептонний бульйон - МПБ, м'ясо - пептонний агар-МПА);
- Спеціальні - середовища для мікроорганізмів, не ростуть на універсальних середовищах (середа Мак-Коя на туляремію, середа Левенштейна-Иенсена для збудника туберкульозу);
- Диференціально - діагностичні - для диференціації мікроорганізмів за ферментативної активності та культуральними властивостями (середовища Ендо, Плоскірєва, Левіна, Гіссен);
- Селективні (елективні) - для виділення певних видів мікроорганізмів і пригнічення росту супутніх - пептонний вода, селенітовим середовище, середовище Мюллера.
За походженням середовища ділять на природні, напівсинтетичні та синтетичні.
2.4 Ріст і розмноження мікроорганізмів
Бактеріальні клітини розмножуються внаслідок поділу. Основні стадії розмноження мікробів у рідкому середовищі в стаціонарних умовах:
- Лаг-фаза (початкова стадія адаптації з повільним темпом приросту біомаси бактерій);
- Експонентна (геометричного росту) фаза з різким зростанням чисельності популяції мікроорганізмів (2 в степеіі n);
- Стаціонарна фаза (фаза рівноваги розмноження і загибелі мікробних клітин);
- Стадія загибелі - зменшення чисельності популяції у зв'язку зі зменшенням і відсутністю умов для розмноження мікроорганізмів (дефіцит поживних речовин, зміна рH, rH 2, концентрації іонів та інших умов культивування).
Дана динаміка є характерною для періодичних культур з поступовим виснаженням запасу поживних речовин і накопиченням метаболітів.
Якщо у живильному середовищі створюють умови для підтримання мікробної популяції в експоненційної фазі - це хемостатние (безперервні) культури.
Характер росту бактерій на щільних і рідких поживних середовищах: суцільний ріст, утворення колоній, осад, плівка, помутніння.
Чиста культура - популяція одного виду мікроорганізмів.
Основні принципи отримання чистих культур: механічне роз'єднання, розсіювання, серійні розведення, використання елективних середовищ, особливих умов культивування (з урахуванням стійкості деяких мікробів до певних температур, кислот, лугів, парціальному тиску кисню, рН і мн.др).
Клітина - універсальна одиниця живої матерії. За хімічним складом істотних відмінностей прокаріотичних та еукаріотичних клітин немає.
Хімічні елементи, що входять до складу живої матерії, можна розділити на три основні групи.
1. Біогенні хімічні елементи (С, О, N, H). На їх частку припадає 95% сухого залишку, в т.ч. 50% - C, 20% - O, 15% - N, 10% - H).
2. Макроелементи - P, S, Cl, K, Mg, Ca, Na. На них припадає близько 5%.
3. Мікроелементи-Fe, Cu, I, Co, Mo та ін На них припадають частки відсотка, однак вони мають важливе значення в обмінних процесах.
Хімічні елементи входять до складу різних речовин - води, білків, ліпідів, нейтральних жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Синтез сполук контролюється генами. Багато речовин бактеріальна клітина може отримувати ззовні - з навколишнього середовища або організму господаря.
Вода становить від 70 до 90% біомаси. Вміст води більше у капсульних бактерій, найменше - в суперечках.
Білки зустрічаються у всіх структурних елементах клітини. Білки можуть бути більш прості (протеїни) складні (протеїди), в чистому вигляді або у комплексі з ліпідами, цукрами. Виділяють структурні (структуроутворюючі) і функціональні (регуляторні) білки, до останніх відносяться ферменти.
До складу білків входять як звичайні для еукаріотів амінокислоти, так і оригінальні - діамінопімеліновая, D-аланін, D-глютанін, що входять до складу пептидогліканів та капсул деяких бактерій. Тільки у спорах знаходиться діпіколіновая кислота, з якою пов'язана висока резистентність суперечка. Джгутики побудовані з білка флагелліна, володіє скоротливою здатністю і вираженими антигенними властивостями. Пили (ворсинки) містять особливий білок - пилина.
Пептидний природи мають капсули представників роду Bacillus, збудника чуми, поверхневі антигени ряду бактерій, у тому числі стафілококів і стрептококів. Білок А - специфічний білок S.aureus - фактор, обусловлавлівающій ряд властивостей цього збудника. Білок М - специфічний білок гемолітичних стрептококів серогрупи А, дозволяє диференціювати серовар (близько 100), що має епідеміологічне значення.
Ряд білків містить зовнішня мембрана грамнегативних бактерій, з яких 3 - 4 мажорних (основних) і більше 10 - другорядних, що виконують різні функції. Серед мажорних білків - поріни, що утворюють дифузні пори, через які в клітку можуть проникати дрібні гідрофільні молекули.
Білки входять до складу пептидоглікану-біополімеру, що становить основу бактеріальної клітинної стінки. Він складається з остову (чергуються молекули двох аміноцукрів) і двох наборів пептидних ланцюжків - бокових і поперечних. Наявність двох типів зв'язків-глікозидних (між аміноцукрів) та пептидних, які з'єднують субодиниці пептидогліканів, надають цьому гетерополімеру структуру молекулярної мережі. Пептидоглікану-найбільш стійке з'єднання, яке утворює ригідну мішкоподібну макромолекулу, визначальну постійну форму бактерій і ряд їх властивостей.
1. Пептидогликан містить родо-і видоспецифічні антигенні детермінанти.
2. Він запускає класичний і альтернативний шляхи активації системи комплементу.
3. Пептидогликан гальмує фагоцитарну активність і міграцію макрофагів.
4. Він здатний ініціювати розвиток гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ).
5. Пептидогликан має протипухлинну дію.
6. Він має пірогенну дію, тобто викликає лихоманку.
З сполук білків з небілковими компонентами найбільше значення мають ліпопротеїди, глікопротеїди і нуклеопротеїни.
Дивовижне таїнство життя - синтез білка здійснюється в рибосомах. Існує два основних типи рибосом - 70S (S-константа седиментації, одиниця Сведберга) і 80S. Рибосоми першого типу зустрічаються лише у прокаріотів. Антибіотики не діють на синтез білка в рибосомах типу 80S, поширених у еукаріотів.
Ліпіди (головним чином форфоліпіди) містяться в цитоплазматичній мембрані (ліпідний бішар), в також в зовнішній мембрані грамнегативних бактерій. Є мікроорганізми, які містять велику кількість ліпідів (до 40% сухого залишку) - мікобактерії. До складу ліпідів входять різні жирні кислоти, вельми специфічні для різних груп мікроорганізмів. Їх визначення має в ряді випадків діагностичне значення, наприклад у анаеробів, мікобактерій.
У мікобактерій туберкульозу в складі ліпідів є ряд кислотостійких жирних кислот - фтіоновая, міколовая та ін Високий вміст ліпідів та їх склад визначають багато властивостей мікобактерій туберкульозу:
-Стійкість до кислот, лугів і спиртів;
-Важка окрашиваемость барвниками (використовують спеціальні методи забарвлення, частіше-за Цілем-Нільсену);
-Стійкість збудника до сонячної радіації та дезосредствам;
- Патогенність.
Тейхоєвих кислоти зустрічаються в клітинних стінках грампозитивних бактерій. Представляють собою водорозчинні лінійні полімери, що містять залишки гліцерину або рібола, пов'язані фосфодіефірних зв'язків. З тейхоєвих кислотами пов'язані головні поверхневі антигени ряду грампозитивних бактерій.
Вуглеводи зустрічаються частіше у вигляді полісахаридів, ктором можуть бути екзо-і ендоклеточнимі. Серед екзоклеточних полісахаридів виділяють каркасні (входять до складу капсул) та істинно Екзополісахариди (виходять у зовнішнє середовище). Серед бактеріальних полісахаридів багато хто знаходить медичне застосування. Декстран - полісахариди з великою молекулярною масою, з вигляду нагадують слиз. 6% розчин-кровозамінник поліглюкін. Декстранових гель сефадекса використовується в колонкової хроматографії як молекулярне сито. Ендоклеточние полісахариди - запасні поживні речовини клітини (крохмаль, глікоген та ін.)
Ліпополісахариди (ЛПС) - один з основних компонентів клітинної стінки грамнегативних бактерій, це з'єднання ліпіду з полисахаридом. ЛПС складається з комплексу: 1.Ліпід А.
2. Однакове для всіх грамнегативних бактерій полисахаридной ядро.
3. Термінальна сахароїдними ланцюжок (О - специфічна бічний ланцюг).
Синоніми ЛПС - ендотоксин, О - антиген.
ЛПС виконує дві основні функції - визначає антигенну специфічність і є одним з основних факторів патогенності. Це - ендотоксин, токсичні властивості якого проявляються переважно при руйнуванні бактеріальних клітин. Його токсичність визначається ліпідом А. ЛПС запускає синтез більше 20 біологічно активних речовин, що визначають патогенез ендотоксикозу, володіє пірогенним дією.
Нуклеїнові кислоти - ДНК і РНК. РНК (РНК) знаходяться головним чином у рибосомах (р-РНК-80 - 85%), т (транспортні) - РНК-10%, м (матричні) - РНК-1 - 2%, головним чином у одноланцюжковою формі. ДНК (дезоксирибонуклеїнової кислоти) може перебувати в ядерному апараті (хромосомна ДНК) або в цитоплазмі у спеціалізованих утвореннях - плазмідах - плазмідна (позахромосомних) ДНК. Мікроорганізми відрізняються за структурою нуклеїнових кислот, змісту азотистих основ. Генетичний код складається всього з чотирьох літер (підстав) - А (аденін), Т (тимін), Г (гуанін) і Ц (цитозин). Найбільш часто для характеристики мікроорганізмів використовують як таксономічний ознака процентне співвідношення Г / Ц, яке суттєво відрізняється у різних груп мікроорганізмів.
Мікроорганізми синтезують різні ферменти - специфічні білкові каталізатори. У бактерій виявлено ферменти 6 основних класів.
1. Оксидоредуктази - каталізують окисно-відновні реакції.
2. Трансферази - здійснюють реакції перенесення груп атомів.
3. Гідролази - осущесвляют гидролитическое розщеплення різних сполук.
4. Ліази - каталізують реакції відщеплення від субстрату хімічної групи негідролітіческім шляхом з утворенням подвійного зв'язку або приєднання хімічної групи до подвійних зв'язків.
5. Лігази або синтетази - забезпечують з'єднання двох молекул, поєднане з розщепленням пірофосфатная зв'язку в молекулі АТФ або аналогічного трифосфату.
6. Ізомерази - визначають просторове розташування груп елементів.
Відповідно до механізмами генетичного контролю у бактерій виділяють три групи ферментів:
- Конститутивний, синтез яких відбувається постійно;
- Індуцибельних, синтез яких індукується наявністю субстрату;
- Репрессібельние, синтез яких пригнічується надлишком продукту реакції.
Ферменти бактерій ділять на екзо-і ендоферменти. Екзоферментів виділяються в зовнішнє середовище, здійснюють процеси розщеплення високомолекулярних органічних сполук. Здатність до утворення екзоферментів багато в чому визначає інвазивність бактерій-здатність проникати через слизові, сполучнотканинні та інші тканинні бар'єри.
Приклади: гіалуронідаза розщеплює гіалуронову кислоту, що входить до складу міжклітинної речовини, що підвищує проникність тканин (клостридії, стрептококи, стафілококи та багато інших мікроорганізми); нейрамінідаза полегшує подолання шару слизу, проникнення всередину клітин і поширення в міжклітинному просторі (холерний вібріон, дифтерійна паличка, вірус грипу та багато інших). До цієї ж групи належать ензими, розкладають антибіотики.
У бактеріології для диференціації мікроорганізмів за біохімічними властивостями основне значення часто мають кінцеві продукти і результати дії ферментів. Відповідно до цього існує мікробіологічна (робоча) класифікація ферментів.
1.Сахаролітіческіе.
2.Протеолітіческіе.
3.Аутолітіческіе.
4.Окіслітельно - відновні.
5.Ферменти патогенності (вірулентності).
Ферментний склад клітини визначається геномом і є досить постійною ознакою. Знання біохімічних властивостей мікроорганізмів дозволяє ідентифікувати їх по набору ферментів. Основні продукти ферментирование вуглеводів і білків-кислота, газ, індол, сірководень, хоча реальний спектр для різних мікроорганізмів набагато більш великий.
Основні ферменти вірулентності - гіалуронідаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейрамінідаза, ДНК-аза. Визначення ферментів патогенності має значення при ідентифікації ряду мікроорганізмів і виявлення їх ролі в патології.
Ряд ферментів мікроорганізмів широко використовується в медицині і біології для отримання різних речовин (аутолітичних, протеолітичні), в генній інженерії (рестриктаз, лігази).
2. Фізіологія і принципи культивування мікроорганізмів
2.1 Метаболізм мікроорганізмів
Для росту і розмноження мікроорганізми потребують речовини, які використовуються для побудови структурних компонентів клітини і отримання енергії. Метаболізм (тобто обмін речовин і енергії) має дві складових - анаболізм і катаболізм. Анаболізм - синтез компонентів клітини (конструктивний обмін). Катаболізм - енергетичний обмін, пов'язаний з окислювально-відновними реакціями, розщепленням глюкози та інших органічних сполук, синтезом АТФ. Живильні речовини можуть надходити в клітину у розчинній вигляді (це характерно для бактерій) - осмотрофи, або у вигляді окремих частинок - фаготрофи.
Основним регулятором надходження речовин у бактеріальну клітину є цитоплазматична мембрана. Існує чотири основних механізми надходження речовин: - пасивна дифузія - за градієнтом концентрації, енергонезатратная, яка не має субстратної специфічності;
- Полегшена дифузія - за градієнтом концентрації, субстратспеціфічная, енергонезатратная, здійснюється за участю спеціалізованих білків пермеаз;
- Активний транспорт-проти градієнта концентрації, субстратспеціфічен (спеціальні зв'язуючі білки в комплексі з пермеаз), енерговитратний (за рахунок АТФ), речовини надходять у клітку в хімічно незміненому вигляді;
- Транслокація (перенесення груп) - проти градієнта концентрації, з допомогою фосфотрансферазной системи, енергозатратна, речовини (переважно цукру) надходять у клітку в форфорілірованном вигляді.
Основні хімічні елементи - органогени, необхідні для синтезу органічекіх сполук-вуглець, азот, водень, кисень.
Залежно від джерела споживаного вуглецю мікроби поділяють на аутотрофи (використовують CO2) і гетеротрофи (використовують готові органічні сполуки). Залежно від джерела енергії мікроорганізми ділять на фототрофи (енергію отримують за рахунок фотосинтезу - наприклад, ціанобактерії) і хемотрофи (енергія добувається за рахунок хімічних, окисно-відновних реакцій). Якщо при цьому донорами електронів є неорганічні сполуки, то це літотрофи, якщо органічні-органотрофи. Якщо бактеріальна клітина в змозі синтезувати всі необхідні для життєдіяльності речовини, то це прототрофи. Якщо бактерії мають потребу в додаткових речовинах (чинниках зростання), то це ауксотрофи. Основними факторами росту для труднокультівіруемих бактерій є пуринові і піримідинові підстави, вітаміни, деякі (звичайно незамінні) амінокислоти, кров'яні фактори (гемін) і ін
2.2 Дихання мікроорганізмів
Шляхом дихання мікроорганізми добувають енергію. Дихання - біологічний процес переносу електронів через дихальний ланцюг від донорів до акцепторів з утворенням АТФ. У залежності від того, що є кінцевим акцептором електронів, виділяють аеробне і анаеробне дихання. При аеробному диханні кінцевим акцептором електронів є молекулярний кисень (О 2), при анаеробному-зв'язаний кисень (-NO 3, = SO 4, = SO 3).
Приклади.
Аеробне дихання донор водню H 2 O
Анаеробне дихання
(Облігатні анаероби) донор водню H 2 S
За типом дихання виділяють чотири групи мікроорганізмів.
1. Облігатні (строгі) аероби. Їм необхідний молекулярний (атмосферне) кисень для дихання.
2. Мікроаерофіли потребують зменшеної концентрації (низькому парціальному тиску) вільного кисню. Для створення цих умов у газову суміш для культивування зазвичай додають CO 2, наприклад до 10 - відсоткової концентрації.
3. Факультативні анаероби можуть споживати глюкозу і розмножуватися в аеробних і анаеробних умовах. Серед них є мікроорганізми, толерантні до відносно високим (близьких до атмосферних) концентрацій молекулярного кисню - тобто аеротолерантние, а також мікроорганізми які здатні в певних умовах переключатися з анаеробного на аеробне дихання.
4. Суворі анаероби розмножуються тільки в анаеробних умовах тобто при дуже низьких концентраціях молекулярного кисню, який у великих концентраціях для них згубний. Біохімічно анаеробне дихання протікає по типу бродильних процесів, молекулярний кисень при цьому не використовується.
Аеробне дихання енергетично більш ефективно (синтезується більшу кількість АТФ).
У процесі аеробного дихання утворюються токсичні продукти окислення (H 2 O 2 - перекис водню,-О 2 - вільні кисневі радикали), від яких захищають специфічні ферменти, перш за все каталаза, пероксидаза, пероксіддісмутаза. У анаеробів ці ферменти відсутні, також як і система регуляції окислювально-відновного потенціалу (rH 2).
Основні методи створення анаеробних умов для культивування мікроорганізмів.
1. Фізичний-відкачування повітря, запровадження спеціальної газової суміші безкисневому (частіше-N 2 - 85%, CO 2 - 10%, H 2 - 5%).
2. Хімічний - застосовують хімічні поглиначі кисню.
3. Біологічний - спільне культивування суворих аеробів і анаеробів (аероби поглинають кисень і створюють умови для розмноження анаеробів).
4. Змішаний - використовують кілька різних підходів.
Необхідно відзначити, що створення оптимальних умов для строгих анаеробів - дуже складне завдання. Дуже непросто забезпечити постійне підтримання безкисневих умов культивування, необхідні спеціальні середовища без вмісту розчиненого кисню, підтримка необхідного окисно-відновного потенціалу поживних середовищ, взяття і доставка, посів матеріалу в анаеробних умовах.
Існує ряд прийомів, які забезпечують більш відповідні умови для анаеробів-попереднє кип'ятіння поживних середовищ, посів у глибокий стовпчик агару, заливка середовищ вазеліновим маслом для скорочення доступу кисню, використання герметичних флаконів і пробірок, шприців та лабораторного посуду з інертним газом, використання щільно закриваються ексикаторі із запаленою свічкою. Використовуються спеціальні прилади для створення анаеробних умов - анаеростати. Проте в даний час найбільш простим і ефективним обладнанням для створення анаеробних і мікроаерофільних умов є система "Газпак" зі спеціальними газорегенерірующімі пакетами, які діють за принципом витіснення атмосферного повітря газовими сумішами в герметично закритих ємкостях.
Основні принципи культивування мікроорганізмів на поживних середовищах.
1.Використання всіх необхідних для відповідних мікробів поживних компонентів.
2.Оптімальние температура, рН, rH 2, концентрація іонів, ступінь насичення киснем, газовий склад і тиск.
Мікроорганізми культивують на живильних середовищах при оптимальній температурі в термостатах, що забезпечують умови інкубації.
За температурним оптимуму зростання виділяють три основні групи мікроорганізмів.
1.Псіхрофіли-ростуть при температурах нижче +20 градусів Цельсія.
2.Мезофіли-ростуть в діапозоні температур від 20 до 45 градусів (часто оптимум-при 37 градусах С).
3.Термофіли-ростуть при температурах вище плюс 45 градусів.
2.3 Коротка характеристика поживних середовищ
За консистенцією виділяють рідкі, щільні (1,5-3% агару) і напіврідкі (0,3 - 0,7% агару) середовища.
Агар - полісахарид складного складу з морських водоростей, основний затверджувач для щільних (твердих) середовищ. В якості універсального джерела вуглецю і азоту застосовують пептони - продукти ферментації білків пепсином, різні гідролізати-м'ясний, рибний, казеїновий, дріжджової та ін
За призначенням середовища поділяють на ряд груп:
- Універсальні (прості), придатні для різних невимогливих мікроорганізмів (м'ясо - пептонний бульйон - МПБ, м'ясо - пептонний агар-МПА);
- Спеціальні - середовища для мікроорганізмів, не ростуть на універсальних середовищах (середа Мак-Коя на туляремію, середа Левенштейна-Иенсена для збудника туберкульозу);
- Диференціально - діагностичні - для диференціації мікроорганізмів за ферментативної активності та культуральними властивостями (середовища Ендо, Плоскірєва, Левіна, Гіссен);
- Селективні (елективні) - для виділення певних видів мікроорганізмів і пригнічення росту супутніх - пептонний вода, селенітовим середовище, середовище Мюллера.
За походженням середовища ділять на природні, напівсинтетичні та синтетичні.
2.4 Ріст і розмноження мікроорганізмів
Бактеріальні клітини розмножуються внаслідок поділу. Основні стадії розмноження мікробів у рідкому середовищі в стаціонарних умовах:
- Лаг-фаза (початкова стадія адаптації з повільним темпом приросту біомаси бактерій);
- Експонентна (геометричного росту) фаза з різким зростанням чисельності популяції мікроорганізмів (2 в степеіі n);
- Стаціонарна фаза (фаза рівноваги розмноження і загибелі мікробних клітин);
- Стадія загибелі - зменшення чисельності популяції у зв'язку зі зменшенням і відсутністю умов для розмноження мікроорганізмів (дефіцит поживних речовин, зміна рH, rH 2, концентрації іонів та інших умов культивування).
Дана динаміка є характерною для періодичних культур з поступовим виснаженням запасу поживних речовин і накопиченням метаболітів.
Якщо у живильному середовищі створюють умови для підтримання мікробної популяції в експоненційної фазі - це хемостатние (безперервні) культури.
Характер росту бактерій на щільних і рідких поживних середовищах: суцільний ріст, утворення колоній, осад, плівка, помутніння.
Чиста культура - популяція одного виду мікроорганізмів.
Основні принципи отримання чистих культур: механічне роз'єднання, розсіювання, серійні розведення, використання елективних середовищ, особливих умов культивування (з урахуванням стійкості деяких мікробів до певних температур, кислот, лугів, парціальному тиску кисню, рН і мн.др).
Література:
1. Бухарін О.В. «Персистенція патогенних бактерій», 1999.
2. Галактионов В.Г. «Імунологія», 1998.
3. Гущин І.С. «Алергічне запалення і його фармакологічний контроль», 1998.
4. Змушко К.І. «Клінічна імунологія», 2001.
5. Медуніцін Н.В. «Вакцінологіі», 1999.
1. Бухарін О.В. «Персистенція патогенних бактерій», 1999.
2. Галактионов В.Г. «Імунологія», 1998.
3. Гущин І.С. «Алергічне запалення і його фармакологічний контроль», 1998.
4. Змушко К.І. «Клінічна імунологія», 2001.
5. Медуніцін Н.В. «Вакцінологіі», 1999.