Структура і властивості мембранних ліпідів
Перш ніж перейти до біологічних мембран, слід детально проаналізувати структуру ліпідного бішару, а також термодинамічні принципи, що визначають його стабільність. Крім того, деякі ліпіди мимовільно утворюють структури, які не мають біслойную організації, і ці ліпіди, як вважають, відіграють особливу роль в мембранах. Ми розглянемо структуру і термодинаміку водно-ліпідних систем, приділяючи основну увагу тим характеристикам, які дозволяють глибше зрозуміти властивості біологічних мембран.
1. Рідкі кристали
За допомогою ренгтеноструктурного аналізу встановлена з високою роздільною здатністю просторова структура ряду мембранних ліпідів. До них відноситься лізофосфатіділхолін, дімірісто-ілфосфатідная кислота, димиристоилфосфатидилхолин, дилауроилфосфатидилэтаноламин, димиристоилфосфатилглицерол і цереброзидів. Кристали цих ліпідів містять дуже мало води, проте просторова структура ліпідів у них виявилася подібна до тієї, яку вони мають в повністю ги-дратірованном стані. На рис. представлена просторова структура деяких з цих мембранних ліпідів в кристалах. Атоми вуглецю залишку гліцеролу і відповідні атоми сфингозин виділені чорним кольором. На рис. вказані деякі структурні параметри, використовувані для опису конфор-мації ліпідів.
Розглянемо кристалічну структуру ділауроілфосфатіділ-етаноаміна і вкажемо найбільш характерні її особливості.
Площа, яка припадає на молекулу, складає 39 А 2.
Полярна головка в цілому орієнтована паралельно площині бішару. При цьому аміногрупа утворює водневий зв'язок з неетеріфіцірованних атомами кисню фосфатної групи сусідньої молекули. Залишок гліцеролу орієнтований перпендикулярно площині бішару.
-2 сначала идет параллельно поверхности бислоя, а после второго углеродного атома направляется в глубь бислоя.
-2 жирнокислотной цепи, максимально вытянуты, т. е. имеют полностью-ти/имс-конфигурацию.
Кристалічні структури фосфатидилхоліну і цереброзидів багато в чому подібні зі структурою фосфаріділетаноламіна, хоча і
мають ряд важливих відмінностей. Найбільш значне і явне з них полягає в нахилі ацильних ланцюгів, сильно вираженому в разі цереброзидів. Цей нахил пов'язаний з наявністю стеричних перешкод для упаковки молекул. Об'ємні полярні головки фосфат-ділхоліна і цереброзидів не дозволяють їм упаковуватися в порівняно прості структури, як у випадку ділауроілфосфатіділета-ноламіна. , необходимая для размещения этих головок, превышает величину 39 А 2 , приходящуюся на поперечное сечение ацильных цепей каждой молекулы.
Площа S, необхідна для розміщення цих головок, перевищує величину 39 А 2, що припадає на поперечний переріз ацильних ланцюгів кожної молекули. У разі цереброзидів ця проблема вирішується за рахунок нахилу ацильних ланцюгів по відношенню до площини бішару. У результаті істотно збільшується площа проекції поперечного перерізу ацильних ланцюгів на площину бішару. На рис. схематично показано, як завдяки нахилу ланцюгів зберігається взаємодія між ланцюгами сусідніх молекул і забезпечується розміщення об'ємних полярних груп. Жирнокислотний ланцюга димиристоилфосфатидилхолина відхиляються від нормалі до поверхні бішару всього на 12 °, тоді як у випадку цереброзидів це відхилення досягає 41 °. Проблема упаковки об'ємних полярних груп діацілфосфатіділхоліна може бути вирішена шляхом почергового зміщення сусідніх молекул уздовж нормалі до бішарі як схематично показано на рис. Л Є переконливі дані і про значне нахилі ланцюгів в гелевою фазі повністю гідратованих ліпідного бішару. Це наочний приклад того, як прості стеричні міркування, що враховують «форму» ліпідних молекул, виявляються дуже корисними при розгляді просторової структури ліпідів.У кристалах всіх вивчених ліпідів, за винятком фосфо-тідной кислоти, початкова ділянка 5 «-2-жирнокислотний ланцюга спрямований паралельно поверхні бішару. .
Про цю особливість розташування ланцюгів свідчили також результати ЯМР-дослі-джень фосфатіділетаноламінових і фосфатіділхолінових бішару, а також фосфоліпідів у мембранах Є. coli. Фізіологічна значимість цієї структурної особливості неясна. -2- жирнокислотной цепи равна 18 углеродным атомам, а средняя длина sn -1-цепи — 16. Проте зазначалося, що в яєчному фосфатидилхолін середня довжина sn -2 - жирнокислотний ланцюга дорівнює 18 вуглецевим атомам, а середня довжина sn-1-ланцюга - 16. Мабуть, це дозволяє компенсувати злам жирнокислотний ланцюга у другій позиції залишку глиця-рола так, що обидві ацильниє ланцюга виявляються зануреними в бішар на одну і ту ж глибину.Отже, можна відзначити п'ять основних особливостей кристалічної структури, які важливі при розгляді будови ліпідного бішару.
1. Всі вивчені структури мають ламеллярную організацію з такою ж розташуванням полярних і неполярних груп, як і в бішарі.
Деякі ліпіди, наприклад фосфатидилхоліну та церебро-Зіди, мають об'ємні полярні головки, через що виникають труднощі при упаковці молекул. Співвідношення між зазначеними молекулярними параметрами грає важливу роль при упаковці мембранних ліпідів не тільки в кристалах, але і в модельних мембранах, а також, ймовірно, і в біологічних мембранах.
Як правило, полярні головки ліпідних молекул розташовані в площині бішару, що сприяє утворенню міжмолекулярних водневих зв'язків.
Ацильниє ланцюга перебувають у цілком-трансконфігураціі.
У більшості случаев.ул-2-жирнокислотний ланцюга починають заглиблюватися в бішар тільки після атома С-2.
Ці структурні особливості характерні і для ламеллярной систем, утворених водно-ліпідними сумішами у фазі гелю та / або в рідкокристалічної фазі. Вивчення просторової будови ліпідів у кристалах має важливе значення при розгляді конформаційного стану ліпідів у біологічних мембранах.
2. Водно-ліпідні суміші
Суміші ліпідів з водою відрізняються вираженим поліморфізмом. Навіть індивідуальні очищені ліпіди в гідратованому стані можуть перебувати в кількох структурних модифікаціях. Яка із структур переважає, залежить від таких параметрів, як концентрація ліпіду, температура, тиск, іонна сила і рН. Особливо корисним при вивченні типів структурної організації водно-ліпідних систем виявився метод дифракції рентгенівських променів. При цьому найчастіше варіюють концентрацію ліпіду і температуру, а отримані дані представляють у вигляді фазової діаграми, яка показує, яку структуру система має в різних областях діаграми «температура - концентрація». Поряд з дифракцією рентгенівських променів для визначення фазових границь водно-ліпідних систем часто використовують диференційної скануючої калориметрії. Ці дослідження проводять зазвичай при високих концентраціях ліпіду, проте багато структур, виявлені при таких умовах, утворюються також в ліпідних дисперсіях при великому надлишку води.
Основні типи структурної організації водно-ліпідних систем схематично представлені на рис. 2.4.
Ламеллярной рідкокристалічна фаза, Вважають, що саме в цій фазі знаходиться основна маса ліпідів в біологічних мембранах. Як свідчать дані дифракції рентгенівських променів, для цієї фази характерно впорядковане розташування шаруватих структур при значній невпорядкованості ацильних ланцюгів.
Ламеллярной гелева фаза. Вона утворюється при низькій температурі тими ліпідами, які формують шаруваті структури. У цій фазі молекули упаковані більш щільно, а ацильниє ланцюга набагато більш впорядковані і знаходяться переважно в полнос-ма-трянс-конфігурації, як і в ліпідних кристалах. Оскільки ланцюга максимально витягнуті, товщина бішару у фазі гелю вище, ніж у рідкокристалічної фазі. Щільність фази гелю трохи вище щільності рідкокристалічної фази. У разі ліпідів, що мають об'ємні полярні головки, ацильниє ланцюга нахилені відносно поверхні бішару подібно до того, як це спостерігається в деяких ліпідних кристалах. Нахил ланцюгів зазвичай позначають штрихом Цікаво, що дисперсії фосфатидилхоліну в розчинах, що містять деякі спирти, у тому числі і гліцерин, утворюють незвичайну фазу гелю, в якій протилежні половини «бішару» своїми ацил-ними ланцюгами повністю проникають один в одного. Біологічна роль цього явища неясна.
. В этом случае липидные молеку-
3. Гексагональна фаза I. У цьому випадку ліпідні молеку-ли формують циліндричні структури, поверхня яких утворена полярними головками і контактує з водою. Самі циліндри упаковуються з утворенням гексагональної решітки.
4. Гексагональна фаза II. Ліпіди також утворюють циліндри, але в цьому випадку полярні групи звернені всередину циліндра і формують водний канал. Упаковка самих циліндрів також є гексагональної.
Дуже важливо, що деякі ліпіди утворюють небіслойние структури. Дійсно, багато очищені мембранні ліпіди не утворюють стабільних бішару, а вважають за краще знаходиться в гектарі
сагональной фазі Ні. Як приклад можна згадати ненасичені фосфатидилетаноламін, а також такий гліколіпіди, як моногалактозилдиацилглицерол. Причини такої поведінки і його можлива біологічна значущість обговорюються в наступних розділах.
2.1 Гідратація ЛІПІДІВ
Параметри можна визначити за даними дифракції рентгенівських променів. Як правило, ті параметри, які залежать головним чином від довжини ацильних ланцюгів, майже не змінюються при збільшенні вмісту води в системі. Гідратація ліпідів відбувається в результаті зв'язування води з полярними головками. Процес гідратації активно вивчали методами 'Н-та 2 Н-ЯМР. Результати, отримані при вивченні фос-фатіділгліцерола, фосфатидилхоліну і фосфатидилетаноламін методом 2 Н-ЯМР, говорять про наявність гідратної оболонки з 11 - 16 молекул води на одну молекулу ліпіду. Ці молекули швидко обмінюються з молекулами води, що знаходяться в основному обсязі. Згідно з іншими вимірами, полярна головка фосфатидилетаноламін пов'язує менше води, ніж полярна головка фосфатидилхоліну. Було висловлено припущення, що у разі ненасичених фосфатидилетаноламін слабка гідратація сприяє утворенню неламеллярной гексагональної фази Ні.
Багато ліпіди набухають у воді. Ліпіди, які не несуть заряду або є в цілому електрично нейтральними, не набухають зовсім або набухають лише в обмеженій мірі до граничної товщини водної прошарку між ламелами. При надлишку води співіснують дві фази - мультіламеллярная ліпідна фаза і вода, що знаходиться в основному обсязі. Заряджені ліпіди схильні до необмеженого набухання і можуть включати воду між ламелами аж до граничної точки, коли утворюються дві фази - повністю гідратовані моноламелярние везикули, що знаходяться в рівновазі з водою в основному обсязі. Ступінь набухання і відносна стабільність мульти-і моноламеллярних структур визначаються електростатичними взаємодіями. При низькій іонній силі відбувається дестабілізація мультіламеллярних структур. Необмежена набухання може відбуватися і в тому випадку, коли в суміші ліпідів містить лише кілька відсотків заряджених ліпідів.
Поляризація молекул води поблизу полярних ліпідних головок призводить до сильного відштовхуванню при зближенні двох бішару. Ця «гідратаційна сила» утримує гідратовані бішару на відстані не менше 30 А один від одного. Саме вона створює основний енергетичний бар'єр, який слід подолати, намагаючись здійснити злиття мембран. Можливо, фосфатіділетаноламіновие везикули схильні до агрегації саме тому, що ступінь гідратації їх полярних головок відносно низька.
Дослідження, проведені методом ЕПР за допомогою спінових міток, здатних реагувати на полярність свого оточення на різній глибині від поверхні бішару, показують, що вода частково проникає в углеводородную область бішару, що знаходиться в рідкокристалічному стані. За даними нейтронного розсіювання, коли бішар знаходиться в стані гелю, вода не проникає глибше гліцеролового кістяка ліпідних молекул.
2.2 ФАЗОВІ ДІАГРАМИ Однокомпонентні водно-ліпідної СИСТЕМ
На рис. 2.5 представлена фазова діаграма в координатах температура-концентрація для двох поширених гликолипидов, виділених з рослин. Дігалактозілдіацілглі-церол утворює стабільну ламеллярную фазу. При низькому вмісті води є тільки гідратованих фаза, а при вмісті води 20% співіснують дві фази - мультіламеллярная гідратованих ліпідна фаза і вода основного обсягу. До необмеженому набухання ДГДГ не здатний.
На наведена фазова діаграма для діпальмітоілфос-фатіділхоліна. Цей ліпід існує в ламеллярной формі при самих різних умовах. При додаванні води він «набухає» до тих пір, поки між шарами не накопичиться максимально можливу кількість води. У цій точці утворюється двофазна система, що представляє собою суспензію мультіламеллярних ліпо-сом. Зверніть увагу, що між фазою гелю та рідкокристалічний ламеллярной фазою є ще одна фаза. Це так звана «рифлена» фаза. У цій фазі поверхню бішару на електронних мікрофотографіях має хвилеподібний вигляд. называется главным, а переход ц, -» Р^, — предпереходом.
Температурний фазовий перехід Р 0, - »L a називається головним, а перехід ц, -» Р ^, - предпереходом.Ліпіди, що мають об'ємні полярні головки, зазвичай зазнають предпереход, що свідчить про наявність фази, промужеточной між гелевою та рідкокристалічний. У Р а,-фазі діпальмітоілфосфатіділхо-ліна ацильниє ланцюга, ймовірно, нахилені, хоча спектри комбінаційного розсіювання говорять про те, що вони як і раніше, як і у фазі гелю, знаходяться переважно у цілком-трянс-конфігурації.
2.3 ДВА МЕТОДУ ВИВЧЕННЯ ЛІПІДНОГО Поліморфізм
Крім методу дифракції рентгенівських променів для характеристики властивостей ліпідних фаз використовували й інші методи. Один з них, що виявився особливо корисним, - це електронна мікроскопія заморожених сколів. Другий метод, 31 Р-ЯМР, був введений в дослідну практику дещо пізніше і знайшов застосування для виявлення небіслойних структур, які, як вважають, відіграють особливу роль у біологічних мембранах.
1. Електронна мікроскопія ліпідних фаз із застосуванням методу заморожування-травлення. Цей метод виявився дуже корисним при вивченні структурної організації різних ліпідних фаз. Приклади отримуваних при цьому електронних мікрофотографій наведено на рис. 2.7. Рідкокристалічна фаза на цих мікрофотографіях завжди виглядає як гладка поверхня, а Р ^ .- фаза - як рифлена. Гелі-вая фаза виглядає як гладка поверхня, але за певних умов приготування препарату має спіральну текстуру через виникнення випадкових дефектів в щільній упаковці. Гексагональна фаза, утворена такими лип ідамі, як ненасичений фосфатидилхолін, вияляется на мікрофотографіях після заморожування-травлення як стопка циліндрів. При приготуванні зразків ліпіди врівноважують в умовах, що підходять для формування потрібних структур, а потім швидко заморожують, щоб організація цих структур не встигла змінитися.
Електронно-мікроскопічні методи використовувалися також для вивчення «ліпідних частинок». Ці частинки нерідко спостерігаються у бінарних сумішах, якщо один з ліпідів схильний утворювати фазу Ні, а інший - біслойную структури. Ліпідні частки утворяться в чисто ліпідних зразках і тому відрізняються від «білкових частинок», які спостерігаються в біологічних мембранах і в реконструйованих білково-ліпід-них системах. Було висловлено припущення, що ліпідні частинки являють собою вивернуті міцели, розташовані всередині бішару, і що вони відіграють певну роль у біологічних процесах, полегшуючи злиття мембран або стабілізуючи їх на сильно викривлених ділянках, як, наприклад, в мем ^ Брані тилакоїдів. Однак чітких доказів біологічної ролі ліпідних часток поки не отримано.
2. Дослідження бішару методом п Р-ЯМР. Цей метод також використовується для структурної характеристики гідратованих-них ліпідів. Наприклад, фосфоліпіди в гексагональної фазі Ні дають спектри 31 Р-ЯМР, що різко відрізняються від спектрів фосфоліпідів у ламеллярной фазі. За допомогою цього методу досліджувався перехід ламеллярной фази в гексагональну в ліпідах і ліпідних сумішах. Недоліком методу є деяка невизначеність при інтерпретації спектрів у випадку ізотропного усереднення за рахунок відносно швидких рухів. Вважають, що такий спектр відповідає структурам типу «ліпідних часток», однак це пояснення не є єдино можливим. Як було показано, метод 31 Р-ЯМР дозволяє надійно встановити наявність гексагональної Ні-фази в чисто ліпідних дисперсіях, але у випадку біологічних мембран до подібних висновків слід ставитися з обережністю, особливо якщо вони не підтверджені іншими методами.
Метод 31 Р-ЯМР виявився вельми корисним при визначенні орієнтації і динамічної поведінки полярних головок фосфоліпідів, а також структурних збурень, вносяться до бішар мембранними білками.
2.4. Орієнтацію полярних ГОЛІВОК ЛІПІДІВ У Біслі
Дані ряду методів свідчать про те, що в ламелляр-них водно-фосфоліпідних дисперсіях, як і в ліпідних кристалах, полярні головки ліпідів у цілому орієнтовані паралельно площині бішару. У разі фосфатидилхолін така орієнтація властива як гелевою, так і рідкокристалічною фазам, судячи з результатів досліджень методами дифракції нейтронів і рентгенівських променів. Про це ж свідчать і дані, отримані методом 2 Н-ЯМР, хоча при цьому не виключаються й інші інтерпретації. Наявні дані вказують на те, що просторове розташування полярних головок фосфо-тіділгліцеріна, сфінгоміеліна і фосфатидилсерин така сама. Дослідження методом 2 Н-ЯМР інтактних фібробластів миші та виділених з них мембран також показали, що полярні головки як фосфатидилхоліну, так і фосфатидилетаноламін орієнтовані паралельно поверхні мембран. , полярная головка ориентирована примерно под углом 30° к поверхности мембраны, что облегчает связывание отрицательно заряженных фосфатных групп с катионами.
Проте за даними дифракції нейтронів у фосфатіділгліцерола, виділеного з Є. coli, полярна головка орієнтована приблизно під кутом 30 ° до поверхні мембрани, що полегшує зв'язування негативно заряджених фосфатних груп з катіонами.На орієнтацію і динаміку полярних головок ліпідних молекул впливає освіта міжмолекулярних водневих зв'язків на поверхні мембрани. Донорами і акцепторами при Освіті цих зв'язків можуть служити такі ліпіди, як фосфатидилсерин, фосфатидилетаноламін і різні гліколіпіди. Дослідження, проведені на модельних мембранних системах, показують, що водневі зв'язки між полярними головками зберігаються навіть в умовах гідратації мембранної поверхні, однак поки невідомо, як освіта цих зв'язків може позначитися на структурі біологічних мембран.
2.5. КОНФІГУРАЦІЯ І УПАКОВКА ацильної КІЛ У Біслі
Розглянемо спочатку насичені вуглеводневі ланцюги. У них можливе вільне обертання навколо кожної С-С-зв'язку, що характеризується енергетичним мінімумом, особливо чітким у разі ньюменовской проекції. Найбільш стабільна транс-конфігурація, при цьому висота енергетичного бар'єра для переходу через заслоненний конфігурацію в гош-форму складає за оцінками 3,5 ккал / моль. / wwc -конфигурации цепь максимально вытянута и не меняет своего направления, тогда как в гош-конформации ее направление меняется.
У повністю m / wwc-конфігурації ланцюг максимально витягнута і не змінює свого призначення, тоді як у гош-конформації її напрямок змінюється. Послідовність гош-транс-гош для трьох суміжних С-С-зв'язків призводить до появи в ланцюзі зламу, в результаті чого ділянки ланцюга вище і нижче місця зламу виявляються значно зміщеними один щодо одного. / Ош-конфігурація в залежності від напрямку обертання при переході від Q + или g ". Кинки типа g до С4 позначається як g + або g ". Кінкі типу g + ~ или g ~ tg + tg ~ або g ~ tg + призводять до мінімального зрушенню ланцюга. /ис-конфигурации. Майже всі подвійні зв'язки в мембранних ліпідах знаходяться в J / ис-конфігурації. Як і у випадку гош-конфігурації, це призводить до зміни загального напрямку ланцюга. Наявність у вуглеводневих ланцюгах Кінко, подвійних ^ ис-зв'язків,ціклопропанових груп та інших особливостей призводить до збільшення площі поперечного перерізу ланцюга, оскільки це може мати важливі наслідки для пакування ліпідів в бішарі. При цьому стеричні вимоги до упаковки вуглеводневих ланцюгів і полярних головок такі ж, як і в ліпідних крастал-лах. Ці принципи будуть обговорюватися в розд. 2.3 при аналізі форми міцел.
Багато методів, включаючи дифракцію рентгенівських променів і нейтронів, спектроскопію КР та ІЧ-спектрометрію, вказують, що у фазі гелю насичені вуглеводневі ланцюги фосфоліпідів знаходяться переважно у цілком-гпрднс-конфігурації. 2
. Мінімальна площа поперечного перерізу молекули діа-Цильни фосфолипида дорівнює близько 38 A 2. Приблизно таку площу займає полярна головка фосфатіділетанола-міна, тому насичені фосфатидилетаноламін в гелевою фазі упаковуються так, що ацильниє ланцюга розташовуються перпендикулярно площини бішару, як і в ліпідних кристалах. У випадку ж кристалів фосфатидилхоліну мінімальна площа, яка припадає на одну полярну голівку, становить приблизно 50 А два. Тому дипальмитоилфосфатидилхолин в гелевою фазі може упаковуватися так, як фосфатидилетаноламін. У цьому випадку ацильниє ланцюга дипальмитоилфосфатидилхолина відхиляються на 30 ° від нормалі до бішар, завдяки чому їх поперечний переріз збільшується і досягається відповідність розміру полярної голівки. При цьому вуглеводневі ланцюги зберігають полнос-ма-транс-конфігурацію. У рідкокристалічної фазі поява в ланцюзі гош-конформерів збільшує ефективне поперечне січі-ня ланцюгів щонайменше до 50 А 2 у розрахунку на молекулу діаціль-ного фосфолипида, а у водних дисперсіях ефективна площа, яка припадає на молекулу фосфолипида, становить зазвичай 60 - 70 А 2. Отже, в рідкокристалічної фазі вуглеводневі ланцюги не нахилені до площини бішару, оскільки в цих условіях.полярние головки ліпідних молекул досить віддалені одне від одного, і щоб заповнити простір між сусідніми головками і перекинути між ними містки, потрібні вода і інші полярні молекули. Судячи за даними 2 Н-ЯМР, товщина вуглеводневої області дипальмитоилфосфатидилхолинового бішару в рідкокристалічному стані становить 35, а не 45 А, як слід було очікувати, якщо б ланцюга перебували у цілком-/ я / * 7 "с-конфіругаціі і були орієнтовані вздовж нормалі до бі-шару. Товщина бішару зменшується за рахунок наявності до ланцюгах гош-конформерів, що призводять до разупорядоченності ланцюгів, причому самі ланцюга в цілому розтягнуті і розташовані перпендикулярно поверхні бішару, а не скручені в спіраль. На рис. 2.12 наведена лінійна залежність товщини рідкокристалічного бішару в діацілфосфатіділхолінових везикулах від довжини ацильних ланцюгів, побудована за даними розсіяння рентгенівських променів.
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ гідрофобних областей бішару
Для отримання детальної картини будови внутрішній області бішару особливо корисними виявилися два методи: Н-ЯМР та ІЧ-і КР-спектроскопія. Застосування * Н-13 С-ЯМР для дослідження мембран і водно-ліпідних систем утруднено, оскільки для отримання придатних для дослідження малих везикул або мембранних фрагментів необхідна попередня фрагментація мембранного препарату за допомогою ультразвуку. Втім, якщо обертати зразок під магічним кутом, то необхідність у такій обробці відпадає, і це відкриває нові можливості для більш широкого застосування останніх методологічних досягнень ЯМР при вивченні модельних і біологічних мембран.
Застосування методів 2 Н-ЯМР та коливальної спектроскопії не супроводжується збуреннями бішару, оскільки в цих методах не використовуються зонди, які могли б спотворити структуру оточуючих їх ліпідів. Нижче наведено короткий опис цих методів та зведення результатів, отриманих при вивченні конфігурації ацильних ланцюгів.
Спектроскопія комбінаційного розсіювання
Лазерна спектроскопія комбінаційного розсіювання була дуже корисною для вивчення фізичного стану модельних і біологічних мембран. Цей метод заснований на вимірюванні різниці енергії падаючого світла і світла, розсіяного за рахунок коливальних рухів. Тип коливань і їх інтенсивність дуже сильно залежать від фізичного стану ліпідів, тому спектри фосфоліпідів у фазі гелю і рідкокристалічному стані істотно розрізняються. Особливо корисні для реєстрації цих відмінностей валентні коливання зв'язку С-С. Наприклад, поява гош-конформерів при плавленні вуглеводневих ланцюгів призводить до збільшення інтенсивності смуги при 1080 см -1. Цей метод показує, що деяка частка гош-конформерів зберігається і в стані гелю до тих пір, поки температура не знизиться до дуже низьких значень, близько - 200 ° С. Зауважимо, що коливання часто охоплюють всю молекулу, так що кількісна інтерпретація спектрів з точки зору аналізу впливу окремих коіформацій є непростим завданням.
Зазвичай зразки являють собою суспензію ліпідів у концентрації близько 1 мг / мл. Мембрани, що містять хромофори або флуоресціюючі домішки, непридатні для вивчення. Фонова флуоресценція робить неможливим вимір щодо слабких сигналів комбінаційного розсіяння, а поглинання хромофорами лазерного випромінювання призводить до нагрівання
Інфрачервона спектроскопія
Цей метод також заснований на реєстрації коливальних спектрів молекул, але до недавнього часу його застосування для вивчення біологічних об'єктів було обмеженим через неможливість роботи з водними суспензіями. Після розробки сучасних ІЧ-спектрометрів з фур'є-перетворенням багато з цих проблем були вирішені. В даний час опубліковано чимало робіт з вивчення ліпідних дисперсій і біологічних мембран методом фур'є-ІЧ-спектроскопії. Переваги цього методу перед спектроскопією КР полягають у його значно більш високої чутливості, а також у тому, що флуоресціюючі домішки або хромофори не заважають вимірам. Як і у випадку спектроскопії КР, фур'є-ІЧ-спектри чутливі до змін поліморфи-ио-фазового стану ліпідів. Тому фур'є-ІК-спектроскопія використовувалася для вивчення предпереходов в фосфатидилхолін-вих бішару, головного фазового переходу гель-рідкий кристал, а також переходу яєчного фосфатидилетаноламін з ламеллярной фази в гексагональну НЦ-фазу.
Зміна коіформаціі ліпідних ланцюгів супроводжується частотним зрушенням смуг поглинання груп СНД, причому ці зміни корелюють зі зміною частки гош-коіформеров в ланцюгах. Наприклад, у присутності холестеролу число гош-коіформеров в ді-пальмитоилфосфатидилхолине при температурах вище температури головного фазового переходу знижується, що узгоджується зі змінами впорядкованості бішару, виміряної методом 2 Н-ЯМР. Вбудовування в бішар інтегрального мембранного білка надає зовсім інший ефект: кількість гош-кон-Формер у рідкокристалічної фазі практично не змінюється, але збільшується їх вміст у фазі гелю, оскільки білки заважають ацильниє ланцюгах упаковуватися у цілком-транс-конфігурації-ції.
Більш детальну картину будови гідрофобної області ліпідного бішару вдалося одержати з допомогою методу 2 Н-ЯМР. Атоми водню в певних місцях ліпідної молекули можна вибірково замінити дейтерієм. Це порівняно м'я-
кий спосіб зондування мембран, і вважається, що він, як правило, не вносить збурень в їх структуру. Спектри деяких дейтерированного димиристоилфосфатидилхолинов представлені на рис. , называемое квадрупольным расщеплением, зависит от усредненной по времени ориентации вектора С— D -связи по отношению к нормали к бислою.
Відстань між двома піками Avq, зване квадрупольні розщепленням, залежить від усередненої за часом орієнтації вектора С-D-зв'язку по відношенню до нормалі до Біслі. Усереднену за часом орієнтацію можна виразити через параметр впорядкованості наступним чином:2 0) отражает усреднение ориентации по времени, a
де <cos 2 0) відображає усереднення орієнтації по часу, a Scd є параметром впорядкованості зв'язку. Необхідно підкреслити, що результат вимірювання є величиною, усередненої по всіх молекул.При хаотичної орієнтації. Цей параметр описує усереднену орієнтацію даного сегмента ацильної ланцюга:
мовляв = _ -
2 Scd -Параметр впорядкованості, одержаний за допомогою методу 2 Н-ЯМР, відображає усереднену орієнтацію і мало що говорить про динаміку системи і про характер рухів.
-связи по отношению к внешнему магнитному полю.
Особливе значення має той факт, що локальне магнітне поле, в якому знаходиться конкретний атом дейтерію, залежить від орієнтації С-D-зв'язку по відношенню до зовнішнього магнітного поля. -связи в бислое в целом, происходят с достаточно большой скоростью, так что любой атом дейтерия воспринимает единое усредненное магнитное окружение. Коливальні та обертальні рухи молекули, які впливають на орієнтацію С-D-зв'язку в бішарі в цілому, відбуваються з досить великою швидкістю, так що будь-який атом дейтерію сприймає єдине усереднене магнітне оточення. Це оточення залежить від сусідніх атомів, а також від обмежень руху по типу та амплітуді. У цьому відношенні метод 2 Н-ЯМР відрізняється від КР-та ІЧ-спектроскопії, оскільки переходи транс-і гош-відбуваються з набагато меншою частотою, ніж різниця частот коливальних смуг, що відповідають цим формам. Тому ІК-та КР-спектри дають картину, яку можна назвати моментальної фотографією вкладу транс-і гош-ротамеров в спектральні параметри. Для вимірювання параметрів впорядкованості застосовують і інші методи, зокрема спектроскопію ЕПР і флуоресенцентную спектроскопію.На рис. -1-пальмитоильного остатка. наведено параметри впорядкованості, визначені за даними 2 Н-ЯМР для декількох селективно дейтерированного-них фосфоліпідів, в яких атом дейтерію включений у певні метиленові групи sn-1-пальмітоільного залишку. Досліджувалися як ліпідного бішару, так і природні мембрани, що знаходяться в рідкокристалічному стані, оскільки у разі фази гелю спектри дуже уширяется через щільної упаковки ліпідів і тому не піддаються аналізу. Ці дані дозволяють зробити два висновки.
Параметр впорядкованості досить постійний на ділянці від С-2 і до приблизно С-8 або С-10. Метиленові групи в середній частині бішару значно більше разупорядочени, ніж групи поблизу його поверхні.
Для синтетичних ліпідів різних типів, включаючи фосфат-ділхолін, фосфатидилсерин і сфінгоміелін, а також для біологічних мембран, містять дейтерированного зонди, отриманий однаковий профіль параметра впорядкованості. Таким чином, характер впорядкованості бішару мало залежить від хімічної будови ліпіду і від складу мембрани, якщо бішар знаходиться в рідкокристалічному стані.
Кількісний аналіз цих даних можна провести на основі молекулярного моделювання з методів статистичної механіки. Наприклад, наведені результати узгоджуються з наявністю в кожному ланцюзі діпаль-мітоілфосфатіділхоліна чотирьох або п'яти гош-ротамеров при дуже малому вмісті Кінкі. Оскільки кожна ланцюг закріплена у поверхні бішару, ділянка ланцюга поблизу поверхні найбільш впорядкований. Зверніть увагу, що бішар - це висококооператівная система. Ацильної ланцюг не може змінити свій напрямок без компенсаційних змін сусідніх кіл. Тому група суміжних сегментів ланцюга повинна рухатися кооперативно. Відхилення орієнтації сегментів ланцюга від нормалі до бішар будуть посилюватися у міру переходу від поверхні бішару до його центральної області. Тому разупорядочен-ність максимальна в середині бішару, де рухливість ланцюгів така ж, як у рідкому парафіні. Дані інших методів також показують, що молекулярна рухливість максимальна в центрі бішару. Але необхідно зазначити, що невпорядкованість - це статистичний параметр, який нічого не говорить про характер руху. Так, можна мати сильно невпорядковану структуру, яка в той же час володіє малою рухливістю.
Дифракція нейтронів
Селективно дейтерированного фосфоліпіди можна також дослідити методом дифракції нейтронів. Якщо рентгенівські промені розсіюються на електронах, то нейтрони - на ядрах атомів. Розсіюючі властивості 'Н і 2 Н сильно відрізняються, що дозволяє виявляти дейтерированного області по кривій щільності розсіяння. Наприклад, судячи з даних дифракції нейтронів, атом С-5 знаходиться на відстані 15 А від центру діпальмітоілфосфатіділ-холінового бішару у фазі гелю; це відповідає повністю витягнутій транс-конфігурації ланцюгів. 2 O Використовуючи D 2 O як розчинник, можна визначити локалізацію води у фазі гелю; отримані дані показують, що вода проникає до області локалізації гліцерольних залишків. За допомогою розсіювання нейтронів можна визначити також локалізацію іонів, таких, як Са 2 +.