Полімеразна ланцюгова реакція

, где п — число прошедших циклов амплификации. У результаті відбувається експоненціальне збільшення кількості специфічного фрагмента приблизно за формулою 2 ^n, де п - число минулих циклів ампліфікації. Оскільки праймери фізично включаються в кінці продуктів забудови, вони детермінують сам продукт реакції - фрагмент ДНК, рівний по довжині відстані між 5'-кінцями праймерів на досліджуваній ділянці ДНК. Недавні експерименти показали, що процес ампліфікації йде набагато більш ефективно, якщо використовувати теплостійких ДНК-полімеразу, виділену з бактерії Ther mits . aquaticus. На відміну від термолабільного фрагмента Кльонова ДНК-полімерази I , использовавшегося ранее, Год-полимераза сохраняет свою активность после тепловой денатурации ДНК, и нет необходимости в замене фермента после каждого цикла. Є. coli, що використовувався раніше, Рік-полімераза зберігає свою активність після теплової денатурації ДНК, і немає необхідності в заміні ферменту після кожного циклу. Ще одна перевага нової полімерази полягає у більш високому температурному оптимумі детермінується нею реакції, що значно підвищує специфічність, кількісний вихід і можливу довжину синтезованих копій цікавить послідовності.

Ця робота описує ПЛР-ампліфікації з використанням ДНК-полімерази Taq і стратегію прямого секвенування продуктів ПЛР-ампліфікації.

1. Основні методики

1.1 Обладнання

Реакції зазвичай проводять у 0,5 - або 1,5 мл мікроцентріфужних пробірках Еппендорф. Обладнання для нагрівання й охолодження може бути зовсім простим і складатися всього лише з набору водяних бань з різною температурою води, або дуже складним і включати нагрівальний блок, керований мікропроцесором. Такий блок використовується для повністю автоматизованої реакції ампліфікації. Умов неавтоматичного проведення ПЛР можуть задовольняти як водяні лазні, так і масляні або повітряні нагрівальні блоки. Водяні і масляні лазні забезпечують більш швидкий теплообмін, ніж повітряні нагрівальні блоки, але не завжди забезпечують необхідну чистоту роботи.

Якщо говорити про нагрівальних блоках, то найкращі результати виходять при використанні алюмінієвих штативів з отвором по формі пробірок. Штативи з великими отворами, заповненими піском або м'якими скляними кульками, непридатні, оскільки такі наповнювачі володіють малою теплопровідністю і здатні підтримувати температуру не довше декількох циклів.

В даний час розроблено декілька автоматичних пристроїв для проведення ланцюгової реакції полімеризації за участю рік-полімерази. В одному з апаратів зразки з однієї водяній лазні в іншу переносить робот. В іншому - зразки поміщені в порожнину, в якій зміна холодної та гарячої води контролюється мікрокомп'ютером або простим таймером, сполученим з клапанами пристрою, що подає воду. Контрольований мікрокомп'ютером нагрівальний блок, спеціально розроблений для автоматизованої реакції, можна придбати у фірми Perkin - Cetus Elmer - Cetus . Instruments. Він складається з алюмінієвого штатива на 48 зразків, що нагрівається електрично, охолоджується рідиною і для якого можна запрограмувати будь-який профіль кривої нагріву. Дотримання необхідних умов дає можливість отримувати продукти ампліфікації еквівалентного якості і кількості при будь-якому способі проведення.

1.2 Компоненти реакції

. Буфер для ПЦР, использующий 7-полимеразу, содержит 50 мм KG , 10 мм Трис- HCl , рН 8,4, 2,5 мм MgCl ₂ и 100 мкг/мл желатины. Крім послідовності ДНК, яку необхідно ампліфікувати, суміш для ПЛР містить буфер, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, два праймера, специфічних у відношенні зв'язування з досліджуваним зразком, і теплостійких ДНК-полімеразу Taq. Буфер для ПЛР, який використовує 7-полімеразу, містить 50 мм KG, 10 мм Тріс-HCl, рН 8,4, 2,5 мм MgCl ₂ і 100 мкг / мл желатини. Желатину краще БСА, так як вона більш стійка до коагуляції на етапі денатурації і легко стерилізується автоклавуванням. Деякі методики для порушення вторинної структури ДНК передбачають використання 10%-ного диметилсульфоксиду, хоча з нашого досвіду це з'єднання в деякій мірі інгібує полімеразу і знижує вихід продукту ампліфікації. Якщо ДМСО все-таки застосовується, для зручності слід приготувати 10-кратний вихідний розчин і зберігати його при - 20 ° С.

Нейтралізовані розчини трифосфато можна придбати у низки комерційних фірм. Витрати можуть бути значно знижені, якщо закуповувати ліофілізовані порошки і робити з них водні розчини. Перш ніж приступити до роботи, ці розчини необхідно нейтралізувати гідроокисом натрію і точно розвести, перевіривши концентрацію за УФ-поглинання. Для зберігання готують суміш всіх трифосфато і отриманий 8 мм розчин заморожують при - 20 ° С.

Праймери для ПЛР зазвичай мають довжину 20 нуклеотидів. Можна синтезувати і довші затравки, але вони рідко бувають необхідні. До 5'-кінця праймера можна приєднати послідовність, не комплементарную досліджуваного зразком. Такі послідовності включаються до дволанцюжкові продукти ПЛР, що забезпечує можливість введення сайтів рестрикції чи регуляторних елементів. Якщо про що підлягає ампліфікації послідовності є лише обмежена інформація, можна використовувати і більш короткі праймери з урахуванням поправки на зміну стабільності «посадки» праймера при температурі добудови. Препарати праймерів слід зберігати в концентрації 10 мкм в ТЕ-буфері при -20 ° С.

Підбір ефективних праймерів для ПЛР - процес емпіричний. Дотримання певних вимог збільшує ймовірність отримання праймерів, придатних для використання.

1. ~50% и случайным распределением оснований. Вибирайте праймери з вмістом GC ~ 50% і випадковим розподілом підстав. Слід уникати використання праймерів з протяжними поліпуріновимі, ​​поліпірімідіновимі або іншими неординарними послідовностями.

2. Уникайте послідовностей зі стійкими вторинними структурами. Для вивчення вторинної структури дуже корисні комп'ютерні програми, початково розроблені для аналізу вторинних структур РНК, і програми побудови дот-матриць гомології.

3. Перевірте затравки на комплементарність один одному. Очевидно, що праймери, отжигаются один з одним, не зможуть брати участь в ампліфікації цікавить послідовності.

Хоча більшість запалів з ​​більшою чи меншою ефективністю здатне працювати, бувають випадки, коли і синтезовані праймери абсолютно непридатні для ампліфікації бажаних послідовностей. Причина цього явища залишається поки невідомою. У багатьох випадках простий зсув послідовності затравки на кілька підстав «вгору» або «вниз» вирішує проблему.

7а-7-полімеразу можна придбати у низки фірм. Для реакції ПЛР зазвичай використовують фермент у концентрації 2 од. в 100 мкл реакційної суміші. Для ампліфікації зразків ДНК, які мають високої кінетичної складністю, наприклад, послідовностей геномної ДНК, оптимум концентрації Гад-полімерази зазвичай 1-4 од. на 100 мкл реакційної суміші. Збільшення кількості ферменту вище зазначеного рівня може призвести до зростання рівня неспецифічного синтезу і до зменшення виходу необхідного фрагмента.

1.3 Параметри температурних циклів

Полімеразна ланцюгова реакція передбачає інкубацію зразків при трьох температурах, що відповідають трьом етапам циклу ампліфікації, - денатурації, відпалу та добудову.

Зазвичай двухцепочечную ДНК денатурують шляхом короткочасного нагрівання зразка до 90-95 ° С, потім проводять відпал, охолоджуючи зразок до 40-60 ° С, і далі нагрівають до 70-75 ° С, щоб здійснити добудову відпалених запалів за допомогою 7а-7-полімерази . Час інкубації при 70-75 ^{С С} варіюють залежно від довжини ампліфікується послідовності. Тривалість температурного стрибка визначається типом обладнання, що використовується для нагріву та охолодження. За одним лише виключенням, швидкість зміни температури не має значення і для скорочення тривалості циклу практично завжди використовуються швидкі температурні скачки. Однак, щоб бути впевненим, що зразки все-таки нагрілися до необхідної температури, час стрибка слід визначити, проводячи заміри температури в контрольному експерименті ампліфікації. Термопара для виміру в мікронробах і цифровий багатофункціональний лічильник дуже корисні для цих цілей.

Звичайно тривалість зміни температур для 100 мкл реакційної суміші в 1,5 мл пробірках і водяних лазнях, налаштованих на 72 °, 93 ^о і 55 ° С, наступна:

1) 72 ° - 93 ° С-1 хв,

2) 93 - 55 ° С-1 хв,

3) 55 - 72 ° С - 45 с.

Час стрибка для таких самих зразків, але в нагрівальному блоці з формованими отворами зазвичай більше, принаймні, в два рази. Недостатній прогрів на етапі денатурації - одна з найбільш поширених причин невдач під час проведення реакції ПЛР вручну. Як правило, розділення кіл відбувається, якщо реакційна суміш нагріта вище 90 ° С. Щоб гарантувати поділ, слід довести температуру суміші до 93 ° С. Як тільки цей рубіж досягнутий, зразок можна охолоджувати до температури відпалу затравки. Довга денатурація не є необхідною, більше того, саме нетривалий вплив підвищених температур забезпечує підтримання високої активності ферменту протягом всієї реакції ампліфікації. Щоб запобігти втраті вологи за рахунок випаровування з поверхні реакційної суміші, можна нашарувати на неї 50 мкл мінерального масла.

- nap . Температура проведення відпалу залежить від довжини затравки і вмісту в ній GC - nap. - nap подбор температуры хорошо начинать с 50-60°С. Для типової затравки довжиною 20 нуклеотидів і 50%-вим змістом GC - nap підбір температури добре починати з 50-60 ° С. Через велику молярного надлишку затравки в реакційній суміші гібридизація відбувається майже миттєво і не потрібно довгої інкубації при температурі відпалу. Іноді виявляється можливим отжигать початку і при 72 ° С, тобто при температурі добудови. При цьому значно спрощується вся процедура: вона зводиться до двухтемпературному циклу.

У деяких випадках, коли доступне тільки 12-15-нуклеотидні затравки, потрібна температура відпалу 40 ° С. Однак затравки такої довжини не утримуються на матриці при температурі добудови 72 ° С. Подолати ці труднощі можна наступним чином. Використовуючи часткову ферментативну активність полімерази при низьких температурах, можна подовжити затравки на кілька нуклеотидів і тим самим стабілізувати їх. Це досягається або за рахунок проміжної інкубації протягом декількох хвилин при 55-60 ° С або шляхом повільного нагрівання від 40 до 72 ° С.

Температура добудови праймера 72 ° С дуже близька до температури, при якій ДНК-полімераза Taq проявляє максимальну активність. Як уже зазначено, тривалість інкубації при 72 ° С залежить від довжини ампліфікується ділянки ДНК. Вважається, що Га-полімераза синтезує послідовність довжиною 1000 нуклеотидів за 1 хв, однак можна випробувати і більш короткий час інкубації. Етап подовження затравки можна зовсім виключити, якщо досліджувана послідовність має довжину, що не перевищує 150 нуклеотидів. При нагріванні між етапами відпалу і денатурації зразки будуть перебувати в діапазоні температур 70-75 ° С декілька секунд, що достатньо для повної добудови відпалений затравки.

2. Ампліфікація геномної послідовності «вручну»

Методика, описана в цьому розділі, призначена для проведення ампліфікації однокопійной послідовності ДНК довжиною до 500 п. н. Деталі її можуть бути змінені у відповідності з цілями експерименту. и 2,5 единиц Гад-полимеразы. Реакційна суміш в обсязі 100 мкл включає 1 мкг геномної ДНК людини, 1-кратний сольовий буфер, 1 мм кожного праймера, 0,2 мм кожного dNTP і 2,5 одиниць Гад-полімерази. У наведеному приватному прикладі район, а також за допомогою гібридизації з олігонуклеотидно пробами. Тепер для цього розроблено метод секвенування ампліфікованої ДНК без попереднього її клонування.

Пряме секвенування має дві важливі переваги перед традиційним клонуванням фрагментів ПЛР в плазмідних та вірусних геномах.

1. Цю процедуру простіше стандартизувати, так як її проводять in и она не зависит от живых систем. vitro і вона не залежить від живих систем. 2. Метод більш швидкий і надійний, оскільки в нормі достатньо проаналізувати єдину послідовність для кожного зразка. Якщо ж ми маємо справу з клонованими ПЛР-послідовностями, то для одного зразка їх потрібно проаналізувати декілька, щоб відрізнити мутації, що відбулися у вихідній геномної послідовності, від випадкових помилок при добудові ДНК-полімеразою в реакції ПЦР.і таких артефактів полімеразної реакції, як освіта мозаїчних алелів внаслідок рекомбінації in . vitro.

Простота, з якою можна отримати чіткі надійні дані, не вдаючись до клонування в бактеріях, визначається 1) здатністю ПЛР-запалів ампліфікувати тільки цікавлять послідовності і 2) способом отримання зразка, прийнятного для секвеніруют-вання. Для прямого секвенування продуктів ПЛР цілком придатний хімічний метод. Ми розглянемо тут тільки найбільш поширений метод Сенгера, що використовує нуклеотиди-термінатори полімеразної реакції. Специфічність ПЛР-запалів в принципі визначає гомогенність ампліфікується послідовностей. В ідеалі, в результаті реакції експоненціально нарощується тільки цікавить послідовність. Однак у реальних умовах багато праймери амплифицируют також різні сторонні послідовності. Підвищуючи температуру відпалу в полімеразної реакції, це ускладнення вдається подолати. До того ж для усунення труднощів, пов'язаних із властивостями конкретної ампліфікується послідовності, можна застосувати попереднє очищення цікавить послідовності електрофорезом в гелі або використовувати денатуруючих градієнтний гель.

У кінцевому рахунку, якщо ці ускладнення ніяк більше не вдається подолати, можна при секвенування використовувати внутрішні праймери, отжигаются тільки на цікавій послідовності.

Ще одна незручність, викликане прямим секвенуванням продуктів ПЛР, обумовлено здатністю двох ланцюгів ампліфікованої фрагмента до швидкої реассоціаціі, що заважає отжигу секвенаціонного праймера на комплементарної послідовності або блокує реакцію добудови комплексу запал - матриця. Усунути цю перешкоду можна, застосовуючи один з варіантів стандартного методу секвенування дволанцюжкової ДНК або модифікуючи ПЛР з метою отримання одноланцюгових продуктів.

3.1 Секвестрованіе дволанцюжкові зразків

Для приготування дволанцюжкові зразків, що використовуються при секвенування, виберіть одну з двох методик.

1. , перенесите в лед, нейтрализуйте реакцию, после чего быстро осадите ДНК- Растворите ДНК в буфере, содержащем секвенационный праймер, при необходимой температуре отжига. Денатурує зразок NaOH, перенесіть в лід, нейтралізуйте реакцію, після чого швидко обложили ДНК-Розчиніть ДНК у буфері, що містить секвенаціонний праймер, при необхідній температурі відпалу.

2. Денатурує зразок нагріванням, потім швидко перенесіть в спиртову лазню, охолоджену до температури сухого льоду, уповільнивши таким чином процес реассоціаціі ланцюгів. Додайте секвенаціонний праймер і нагрійте до необхідної температури відпалу.

Для секвенування дволанцюжкові плазмідних ДНК підходять обидва способи. Секвенувати продукти ПЛР по цих інструкцій набагато важче, тому що короткі лінійні фрагменти ДНК більш схильні до реассоціаціі, ніж дволанцюжкові кільцеві плазміди.

3.2 Секвенування одноланцюгових фрагментів ДНК

Труднощі, пов'язані з реассоціаціей ланцюгів фрагмента, можна подолати, якщо приготувати одноланцюгові зразки ДНК шляхом розділення ланцюгів в гелі або синтезувати їх у самої реакції ПЛР. Для розділення ланцюгів фрагментів довжиною не менше 500 п. н. можуть бути з успіхом використані відповідні агарозного гелі. У випадку більш коротких фрагментів такий підхід не є ефективним. Проте нещодавно ми розробили метод, що дозволяє синтезувати одноланцюгові ДНК в ході реакції ПЛР.

Ця процедура передбачає використання нееквівалентних кількостей двох праймерів для ампліфікації, що дозволяє синтезувати за перші 20-25 циклів двухцепочечную ДНК і за наступні 5-10 циклів в умовах нестачі одної зі праймерів - одноланцюжкову ДНК.

Рис. 4, А демонструє накопичення дцДНК і оцДНК в ході звичайної ампліфікації геномної послідовності, що використовує вихідне співвідношення запалів 50:0,5 пмоль в 100 мкл реакційної суміші. Як і очікувалося, кількість дцДНК зростає експоненціально до моменту практичного зникнення з реакційної суміші одного з праймерів, після чого кількість цієї ДНК наростає дуже повільно. Фракція оцДНК з'являється, починаючи з 25-го циклу, з моменту, коли запас лімітуючої затравки майже повністю вичерпано. Після короткої початкової стадії швидкого зростання оцДНК накопичується лінійно, чого слід очікувати в присутності одного праймера.

Різні співвідношення праймерів дадуть в принципі схожу картину освіти оцДНК. Різні нерівні відносини 50:5, 50:0,5, 50:0,05 дають за 30 циклів полімеразної реакції кількість оцДНК, що перевищує кількість синтезованої дцДНК. Як правило, співвідношення 50:0,5 дозволяє отримати після 30 циклів ПЛР 1-5 пмоль оцДНК. Освічена оцДНК може бути потім секвенований з використанням лімітує праймера ПЛР або внутрішнього праймера за звичайною схемою хімічної або ензиматичного методики секвенування. Синтезовані фрагменти будуть мати гомогенний 5'-кінець і в різному ступені усічений 3'-кінець внаслідок передчасної термінами синтезу. Однак при використанні деяких секвенаціонних запалів тільки повна оцДНК. може служити зразком для секвенування.

1. Проведіть реакцію ПЛР за вже описаною методикою, змінивши лише кількості використовуваних праймерів на 50 пмоль і 0,5 пмоль в 100 мкл реакційної суміші. Проведіть 30 - 35 циклів реакції. Якщо необхідно секвенувати обидві ланцюга, приготуйте також зразок із зворотним співвідношенням обсягу використовуваних запалів.

2. 30 и для удаления избытка dNTP и компонентов буфера отцентрнфугируйте при 5000 об/мин в роторе с фиксированным наклоном пробирок. Після завершення ПЛР змішайте 100 мкл реакційної суміші з 2 мл дистильованої води, заповніть цією сумішшю мікроконцентратор Centricon 30 і для видалення надлишку dNTP і компонентів буфера отцентрнфугіруйте при 5000 об / хв в роторі з фіксованим нахилом пробірок.

3. Висушіть 10 з 40 мкл концентрату і розчиніть в 10 мкл секвенаціонного буфера, який містить 1 пмоль секвенаціонного праймера.

4. Прогрійте суміш праймер - матриця при 65 ° С протягом 2 хв, потім залиште охолоджуватися до 30 ° С протягом 20 хв.

5. , 2 мкл смеси для включения метки, разведенной в соотношении 1/100, 0,5 мкл dATP , 10 мкКи/мкл, 2 мкл ДНК-полимеразы Т7. Додайте 1 мкл 100 мМ DDT, 2 мкл суміші для включення мітки, розведеної у співвідношенні 1 / 100, 0,5 мкл dATP, 10 мкКі / мкл, 2 мкл ДНК-полімерази Т7.

6. Внесіть 3,5 мкл приготовленої суміші в кожну з 4 пробірок, що містять 2,5 мкл суміші дідезоксірібонуклеозідов, і інкубують 5 хв при 37 ° С.

Зупиніть реакцію додаванням 4 мкл 95%-ного формамідом, 20 мм ЕДТА; прогрійте протягом 2 хв при 75 ° С і нанесіть на секвенаціонний гель.

Висновок

ПЛР відкриває можливість швидкого синтезу мільйонів копій індивідуальної послідовності ДНК, що значно спрощує подальший її аналіз.

Оскільки в результаті ланцюгової ампліфікації утворюються ідентичні фрагменти специфічною ДНК, відразу ж може бути здійснено клонування або секвенування продуктів реакції. Матрицею для ПЛР-ампліфікації можуть служити як геномна ДНК, так і кДНК, синтезована шляхом зворотної транскрипції РНК-Чутливість методу дозволяє виявити і ампліфікувати єдину молекулу ДНК-Прі автоматизації ПЛР та наявності нерадіоактивних матеріалів для мічення ДНК полнмеразная ланцюгова реакція обіцяє стати в майбутньому стандартної молекулярно -біологічної процедурою. Можна припустити, що велика буде і її роль в діагностиці спадкових та інфекційних захворювань.