Полімеразна ланцюгова реакція і електрофорез

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Реферат на тему:
ПЛР-реакція та електрофорез
2009

ПЛР-реакція
Може виникнути необхідність збільшити кількість індивідуальної кДНК до її введення в плазміду з допомогою якогось процесу її відтворення. Такий процес розроблений і широко застосовується не тільки для вирішення цієї приватної завдання, але і у всіх випадках, коли необхідно помножити кількість певних фрагментів ДНК. Наприклад, фрагментів, що містять досліджуваний ген і його регуляторний оточення.
Процес цей отримав назву ПЛР-реакція, що розшифровується як полімеразна ланцюгова реакція. (В англійській назві PCR - polymerase chain reaction.) Мимоволі напрошується порівняння з реакцією атомного вибуху. І, мабуть, воно не позбавлене сенсу - наростання кількості потрібної ДНК відбувається надзвичайно швидко, навіть бурхливо.
Розглянемо цю реакцію для загального випадку - напрацювання безлічі копій якогось фрагмента ДНК, що містить в якійсь своїй частині, яка нас цікавить послідовність пар основ. Отже, припустимо, що нам відома послідовність нуклеотидів на досить великому протязі якоїсь ДНК і є підстави припускати, що всередині цієї послідовності лежить цікавий для нас ділянку. Розглянемо серію операцій, що ведуть до його виділенню і множення.
Спочатку в місцях, що лежать близько, але свідомо за межами даного нас ділянки ДНК, виберемо дві послідовності - по 20 пар нуклеотидів, що лежать по обидва боки від цієї ділянки. Виходячи з цих послідовностей синтезуємо хімічно два однониткових праймера на основі дезоксирибонуклеотидів. Перший - комплементарно до умовно «першої» нитки ДНК з її законна, другий - комплементарно до «другої» нитки з її законна. Очевидно, що праймери будуть різні.
Тепер додамо в буфер, де розчинено мала кількість вихідної ДНК обидва праймера у великому надлишку, нагріємо суміш до температури 94 °, а потім швидко охолодимо до 50 °. ДНК денатурируется при 94 °, її нитки розходяться. При 50 ° обидва праймера гинув-рідізіруются з вибраними для них ділянками однониткових ДНК. Це станеться швидко, тому що праймери є в надлишку і, крім того, внаслідок своєї малості вони рухливі і легко «знайдуть» свої посадочні місця. Ренатурацією ДНК відбувається повільно. За ті 2 хвилини, що буде продовжуватися цей етап, ДНК практично не ренатуріруется, а праймери встигнуть надійно гібрідізоваться з комплементарними для них ділянками обох ниток. Така ситуація відображена на малюнку 35 (1). Праймери, як зазвичай, сідають з 3 "-кінця матричної нитки ДНК і направляють рух майбутньої ДНК-полімерази до її 5'-кінця. Цей напрям вказано стрілками. Для зручності опису подальших подій, привласнимо праймера назви« лівий »(стрілка затемнена) і «правий» (стрілка не затемнена).
Тепер швидко піднімемо температуру суміші до 72 ° С. при цій температурі нитки ДНК свідомо не зійдуться, а праймери ще утримаються на своїх місцях. Внесемо в розчин ДНК-полімеразу. Взагалі-то кажучи, вона була з самого початку!
Але що це за фермент, який не денатурируется при 94 °, а при 72 ° зараз почне вести комплементарний синтез ДНК? На щастя, така ДНК-полімераза існує. Її називають «Taq ДНК-полімераза» і виділяють з дуже термофільних бактерій «Thermus aquaticus», чудово розмножуються при температурі 85 ° С.
Отже, переходимо до етапу 2, де зображено процес матричного синтезу комплементарної нитки ДНК, що починається від праймера і продовжується без інших обмежень (що зазначено стрілою), крім обмеження тривалості цього етапу (3 хвилини). Ми будемо для простоти малюнка розглядати події, що починаються з копіювання тільки однієї нитки, хоча, звичайно, будуть копіюватися обидві. Вони абсолютно рівноправні, і на закінчення нашого аналізу треба буде просто подвоїти отриманий результат. Через 3 хвилини закінчується 2-й етап і температура знову стрибком піднімається до 94 °, а ще через одну хвилину швидко знижується до 50 °. Ця ситуація відображена на етапі 3. При 94 ° новосинтезованих нитка ДНК відокремилася від материнської нитки. (Останню, для ясності, я тут і скрізь далі зображую жирною лінією.) У складі новосинтезованих копії я більше не зображую «лівий» праймер, оскільки він був комплементарний материнської нитки ДНК і тому разом з ділянкою, синтезованим ДНК-полімеразою, увійшов до складу копії. Зате на цю копію з її 3'-кінця при 50 ° на призначений для нього ділянку (адже копія тотожна «другий» материнської нитки) вже сів «правий» праймер. На звільнену материнську нитку з її З *- кінця теж сів праймер - «лівий», але, звичайно, не той, що пішов з копією, а інший, точно такий же. Благо праймери є в надлишку.
На етапі 4 (при 72 °) показані два нових комплементарних синтезу. Той, що йде по материнській нитки, як і раніше, просторово не обмежений. А ось той синтез, що починається від правого праймера, що сидить на новосинтезованих копії закінчиться там, де в цій копії «захований» весь колишній «лівий» праймер - адже з нього ця копія починалася. В результаті тут вперше з'являється обраний для множення ділянка ДНК, обмежений двома праймерами, включаючи і їх самих. Це добре видно на етапі 5, коли після нагріву до 94 ° всі подвійні нитки розійшлися і на малюнку виявляються вже 4 одинарних нитки, на які, туди «де їм положено» село 4 праймера (два «лівих» і два «правих»). Етап 6 - синтез 4-х копій, які починаються від цих праймерів. У трьох випадках з чотирьох він обмежений довжиною потрібного відрізка ДНК. (Материнська нитка тут, як і всюди далі копіюється без обмеження справа.) Разом з освіченою на 4-му етапі і вже обрізаним з обох сторін ділянкою ми отримуємо 4 фрагменти початкової ДНК потрібного розміру. Це добре видно на етапі 7, де всі чотири пари ниток ДНК розійшлися і на них вже сидять 8 праймерів ...
Якщо у читача вистачило терпіння розібратися у всій цій «механіці», то він погодиться, що після синтезу на етапі 8 вийде вже 11 відрізків ДНК потрібної довжини. Зауважимо принагідно, що хоча ми розглядаємо «потомство» однієї тільки «першої» материнської нитки, серед отриманих відрізків будуть копії ділянок як «першою», так і «другий» материнської нитки, оскільки ми вже не один раз вели комплементарний матричний синтез.
Простежимо тепер закономірність, відображену в цифрах, що стоять праворуч від малюнка, близько зображень 3-го, 5-го, 7-го і 8-го етапів. Перед дужкою щоразу стоїть число одиночних ниток ДНК після нагрівання до 94 °. Легко помітити, що воно незмінно подвоюється. Що і слід було очікувати, оскільки на кожному з попередніх парних етапів всі наявні нитки ДНК так чи інакше копіюються.
Але ось що може здатися несподіваним, і в чому полягає вся суть ПЛР-реакції. Число фрагментів потрібного розміру, вказане в дужках, наростає незрівнянно швидше: 0-1-4-11 штук. Так буде і далі. Кожен укорочений відрізок буде копіюватися в тому ж розмірі. І кількість їх буде безупинно поповнюватися за рахунок не відразу укорочених відрізків ДНК. Через 30 циклів, подібних розглянутим (а кожен цикл - це два етапи) кількість ниток ДНК досягне величезної цифри. Притому практично всі вони вже будуть потрібної довжини - і виділення фрагмента, і його множення відбулося! Згадаймо, що у нас спочатку вважалося дві нитки. Таким чином написане число треба подвоїти.
Що це означає не в штуках, а у вагових одиницях? Можна підрахувати, що якщо був спочатку всього 10 молекул ДНК, довжиною в 1000 пар основ кожна, то в результаті 30-ти циклів ПЛР-реакції повинно вийти близько 2-х мікрограмів необхідного генетичного матеріалу. Для сучасних методів дослідження це досить значна кількість.
Насправді в таких підрахунках кінцевий вихід ДНК вийде значно завищеними, тому що Taq ДНК-полімеру через зношується, а після 30 циклів і зовсім перестає «працювати». Але ж можна внести нову порцію ферменту і запустити ще 30 циклів. (Зауважу принагідно, що Taq ДНК-полімераза не дуже «сувора». Після 30 циклів у середньому 1 нуклеотид з 400 виявляється включеним помилково.)
Зрозуміло, всі ці цикли здійснюються не вручну, а в спеціальному приладі, від якого, втім, потрібно не багато. Тільки дуже швидко з означеної вище програмі змінювати температуру дуже малого об'єму рідини (захищеної від випаровування тонким шаром мінерального масла). Що ж стосується тривалості 30-ти циклів, то навіть, якщо врахувати, що тривалість синтезу доводиться за вказаною вище причини поступово збільшувати від 3-х до 10-ти хвилин, то на один цикл прилад буде витрачати в середньому 12 хвилин. А на 30 циклів - 6 годин.
Від експериментатора потрібно тільки правильно скласти робочу суміш. Зрозуміло, якщо праймери вже вибрані і синтезовані в достатній кількості. Taq ДНК-полімераза і нуклеозидтрифосфат є у продажу. Напрацювання великої кількості певного гена за допомогою ПЛР-реакції часто називають «клонованій» цього гена. Описану тут ПЛР-реакцію з двома праймерами іноді називають «симетричною», на відміну від іншої теж ПЛР-реакції, але з одним початковим праймером, яку називають «асиметричною».
ПЛР-реакцію треба включити в описану там послідовність операцій між отриманням кДНК і включенням ДНК в плазміду. У цьому випадку послідовність 21-го нуклео-Тіда для праймерів доведеться вибирати не вільно, а точно по кінцях гена, що кодує наш білок. Ці обидва кінці можна встановити, як це було описано за допомогою ЧІП-методу. Для цього навіть не треба знати всю амінокислотну послідовність білка, а тільки кінцеві ділянки - по 7 амінокислот з кожного кінця. (Благо, як згадувалося, секвенування білка тепер можна починати з будь-якого кінця.) При синтезі кінцевого праймера треба тільки додати кінцевий кодон УГА, який не транскрибується в іРНК. Крім того до «зовнішнім» кінцях обох праймерів має сенс вже на цьому етапі додати невеликі послідовності нуклеотидів, які, не будучи комплементарні ні до якого ділянці гена, не будуть і гібрідізоваться. Але можуть утворити два «липких» кінця для подальшого включення розмноженої кДНК в розрізані плазміди. На рис. 35 ці додаткові послідовності зображені у вигляді «хвостиків» у праймерів. Нагадаю, що ця розмноження кДНК нам потрібна для того, щоб домогтися досить ефективного включення містять її плазмід в бактерію, яка, розмножуючись, буде напрацьовувати у великій кількості потрібний нам білок.
Весь повний комплекс заходів по множенню кількості індивідуального білка інший раз виявляється настільки ефективним, що чужорідний білок у цитоплазмі бактерій-реціпліентов з'являється в ході їх розмноження у вигляді гранул. Адже він чужий - і тому не витрачається в самій бактерії. Після лізису клітин гранули можна зібрати простим центрифугуванням. Для їх дисоціації доводиться використовувати обробку осаду лугом, детергентами та сечовиною. Білок денатурируется. Для його ренатурації доводиться вдаватися до розведення, діалізу від денатуруючих добавок, зміни рН та іонної сили середовища.
Справжність напрацьованого білка перевіряють за ферментативної активності, якщо він повинен такої володіти. Або ж по електрофорез - порівнянням з контрольним препаратом. Але надійніше - одним із імунологічних методів контролю, з якими ми познайомимося в свій час.

2. Електрофорез
Метод електрофорезу таїть у собі масу «підводних каменів», від чого сліпе копіювання описаних у науковій літературі прикладів його використання призводить, як правило, до плачевних результатів. Тому спробуємо розібратися в фізичні основи методу глибше ..
2.1 Введення в метод електрофорезу
Уявімо собі два ємних судини, з'єднаних між собою тонкою і довгою скляною трубочкою, на зразок букви М. Нехай судини і трубочка заповнені слабким розчином кухонної солі. У судини опустимо електроди - зволікання, з'єднані з клемами джерела постійної напруги. Наприклад, нехай зволікання з правого судини приєднана до клеми «-», а з лівого - до клеми "+". Це будуть, відповідно, наші катод і анод. Включимо напругу. Міліамперметр джерела покаже, що в замкнутій ланцюга протікає якийсь струм. Він тече через сольовий розчин, зокрема і вздовж трубочки. Вона-то нас і цікавить. Вдумаймося в те, що в ній буде відбуватися. Ніяких інших розчинених речовин в трубочці немає. Електричний струм обумовлений виключно рухом двох іонів - негативними іонами Сl і позитивними Na +. Перші рухаються вліво, до анода, другі - вправо, до катода.
Чи слід побоюватися, що запас іонів С1 - і Na + в трубочці з часом виснажиться? Ні. Тому що з резервуара катода в трубочку будуть входити іони Сl -, а з резервуара анода - іони Na +, підтримуючи незмінною концентрацію обох іонів в ній. У всякому разі так буде продовжуватися до тих пір, поки не вичерпаються або хоча б істотно зміняться запаси цих іонів у самих резервуарах. Ми до цього доводити не будемо.
Задамося тепер наївним запитанням: а що змушує який-небудь конкретний іон (нехай С1 -), що знаходиться в трубочці, рухатися вліво у напрямку до анода? Відповідь очевидна _ електричне поле. А конкретніше?
Раз по трубочці тече електричний струм, значить вона грає роль провідника і, отже, на неї подається певне «напруження». Ну а звідки, запитаємо себе, якийсь індивідуальний іон С1 -, що знаходиться в середині трубки «знає», що до її кінців прикладена напруга? Але якщо вже до кінців будь-якого провідника прикладена напруга, то в цьому провіднику на всій його довжині негайно утворюється електричне поле. Воно буде тим інтенсивніше (сильніше), чим більше напруження і коротше трубочка. Величину інтенсивності електричного поля в будь-якій точці однорідного провідника визначають як Е = V / 1, де V _ напругу, яка подається на провідник, а 1 - його довжина. Цю величину називають «напруженістю» електричного поля в даній точці провідника. Одиницею напруженості, очевидно, є В / см.
Величину напруженості поля і «відчуває» будь-іон, що знаходиться в цій точці, вона змушує його рухатися до відповідного електрода. В однорідному провіднику напруженість поля однакова в будь-якій точці. Підкреслимо, що напруженість поля не залежить (практично) від знаходяться в трубочці в малих кількостях речовин, хоча б теж іонів. Її визначають основні носії струму, даному випадку іони С1 - і Na +. Але самі ці «сторонні» речовини, якщо вони теж іони, будуть в повній мірі відчувати вплив електричного поля.
Сила, що діє на будь-який іон дорівнює добутку величини його заряду на напруженість поля. У нашій трубочці вона постійна і ми могли б очікувати на основі законів механіки, що всі іони рухаються рівноприскореному. Цього не відбувається через опір, який чинить такого руху навколишнє середовище, в даному випадку вода. У результаті кожен заряджений іон буде «пробиватися», мігрувати до свого аноду досить повільно і з постійною швидкістю, оскільки сила тертя збільшується зі збільшенням швидкості міграції до тих пір, поки вона не зрівняється із силою, що веде іон до його електроду. У різних іонів ця швидкість може бути різною, оскільки сила тертя залежить ще й від розміру іона. Взагалі, швидкість міграції іона буде тим більше, чим більше його заряд і напруженість електричного поля і чим менше розмір іона. Іони С1 - і Na + приблизно однакової величини і тому мігрують в різних напрямках, але з приблизно однаковою швидкістю. Зовсім інша справа, якщо б замість NaCI ми розчинили у воді знайомий нам Тріс-НСl буфер. Нам відомо, що при початковій концентрації Тріс = 0,1 M і додаванні в його водний розчин НС1 до 0,05 М (при рН8) приблизно половина молекул Tpіca перетворюються в іони Тріс + і точно таку ж кількість в розчині з'являється іонів С1 -. Іон Тріс + в 3 рази важче і в кілька разів більше, ніж іон С1 -. Відповідно він буде повільніше мігрувати в електричному полі. А отже, основними носіями струму в цьому випадку будуть іони С1 - (хоча свій невеликий внесок дадуть і іони Тріс +). Більш того, якщо б ми взагалі яким-небудь чином «перегородили дорогу» іонів Тріс +, то весь струм переносили б тільки іони С1 - (подібно електронам у металевому провіднику). Напруженість поля встановиться та інші заряджені речовини зможуть рухатися в цьому полі у відповідності зі своїми зарядами і розмірами. Можна сказати, що напруженість поля визначається основними носіями заряду - вони створюють реальний опір провідника, отже і величину напруги від джерела струму, що припадає на його частку. А тим самим і напруженість поля, якщо довжина провідника (трубочки) незмінна і він однорідний.
2.2 Електрофорез білків (загальні положення)
Тепер припустимо, що за допомогою піпетки з відігнути кінцем ми ввели в початок трубочки, заповненої Тріс-НСl буфером суміш різних молекул білка. Ми знаємо, що кожна молекула білка може бути позитивно або негативно заряджена. Цей заряд визначається як сума електричних зарядів бічних груп амінокислот: основних (лізин, аргінін, гістидин) і кислих (аспарагінова і глутамінова кислоти), що лежать на поверхні білка. Бічні групи, заховані усередині білкової глобули, свого внеску в сумарний заряд білка не дають, тому що не стикаються з водою і тому не іонізовані.
Почнемо розгляд з найбільш поширених кислих білків, тобто таких, чиї сумарні заряди негативні, хоча ступінь їх кислотності, напевно, буде різною - вона залежить від співвідношення числа заряджених груп різних знаків на поверхні.
Під дією того ж самого електричного поля такі білки, подібно іону Сl - будуть мігрувати в бік анода. Вони теж будуть випробовувати опір своєму руху і напевно більше, ніж іон С1 - в силу своїх розмірів і необхідності розсовувати лежать на їхньому шляху молекули води.
Коли електричні сили, що тягнуть молекули білків до анода, стануть рівними силам опору (останні тим більше, чим швидше рух), швидкості міграції білків теж стануть постійними і, швидше за все, різними в різних білків. Ці швидкості будуть пропорційні величинам сумарних зарядів кожного з білків і, зрозуміло, напруженості загального для них усіх електричного поля. Напруженість поля залежить від електропровідності буфера, тобто концентрації основних носіїв струму (у нашому прикладі - іонів С1 -). Присутність білків, незважаючи на їх заряди, істотного впливу на електропровідність розчину мати не має на увазі малості їх кількості. Зате величини зарядів білків (а значить і швидкості їх міграції) будуть дуже істотно залежати не тільки від їхньої природи, але і від величини рН розчину, створюваного буфером. Власне кажучи, саме заради того, щоб мати можливість керувати зарядами білків, ми замінили в нашому розчині сіль на буфер. Створюване їм рН треба вибрати не так, щоб всі білки отримали максимально можливий негативний заряд (наприклад, у сильно лужному буфері). Це невигідно. Всі білки будуть рухатися з максимальними швидкостями, не сильно відрізняються один від одного. Вигідно вибрати помірно лужне середовище і зіграти, таким чином, на відмінності співвідношень основних і кислих бічних груп амінокислот на поверхні різних білків. Іншими словами, добиватися максимального відмінності сил, що діють на різні білки - тоді на своєму шляху уздовж трубки вони розійдуться найбільш явним чином. (Зазвичай для кислих білків вибирають величину рН8-8, 5, а для лужних, - гістонів, білків рибосом, - використовують буфери з рН4-5. Ці останні білки будуть мігрувати до катода.)
Про те, як ми будемо виявляти і трактувати розбіжність білків в гелі мова попереду. А поки продовжимо розмову про вибір буфера. Вище йшла мова про вибір його рН. А як вибрати концентрацію буфера? Чим вона вища, тим більше, як кажуть, «місткість» буфера - його здатність утримувати рН розчину від різких змін при внесенні до нього кислот і лугів. Але ж ми, начебто, не збираємося їх вносити? Виявляється вносимо! З самими білками.
Повернемося тепер до білків в електрофорезі. Ми їх вносили в трубочку, очевидно, вже розчиненими в обраному для них буфері. Розчин цей був більш-менш розбавленим. У ході електрофорезу білки, як ми побачимо нижче, будуть збиратися у вузькі зони, де концентрація кожного з них виявиться набагато вище ніж спочатку. Ось там-то ємності буфера може не вистачити, рН розчину може змінитися. За ним зміниться і сумарний заряд білка, а отже і швидкість міграції білкової зони. Усунути цю небезпеку, на перший погляд, легко. Досить у кілька разів збільшити концентрацію буфера. Але це буде означати, наприклад для Тріс-НСl буфера, таке ж збільшення концентрації іонів С1 -. А значить і збільшення сили струму і, як наслідок, посилення розігріву рідини в трубочці. У результаті чого виникнуть спотворення картини розділення білків. Хоча б тому, що температура рідини в центрі трубочки буде вище, ніж у її стінок. Але ж можна зменшити напругу на клемах джерела. Але це призведе до падіння напруженості поля і відповідному уповільнення міграції білків. Що небажано через дифузного розмивання областей (смуг) міграції. У порядку компромісу вибирають звичайно молярность буфера в межах 0,1-0,2 М.
Небажана ситуація може легко виникнути і в тому випадку, коли рН робочого буфера обрана поблизу кордону буферної області (див. гл. 2, § 1). Тут буферна ємність мала за визначенням. І тому вищеописаний ефект зміни рН в зоні концентрації білка може бути особливо небезпечний.
Цілком можливо, що зіткнувшись з такими труднощами експериментатору доведеться відмовитися від спочатку обраного буфера і замінити його на інший, з менш рухливими іонами.
Я не збираюся наводити тут практичні рецепти. Мені тільки хотілося показати, що вибір буфера для електрофорезу справа тонка, вимагає вдумливої ​​оцінки даної конкретної ситуації.
Тепер звернемося до іншої сторони проблеми. До цих пір ми розглядали тільки рівновагу електричних сил, що діють на білки і сил тертя в рідині. Розмір частинок в цьому випадку може позначатися двояко. З одного боку буде збільшуватися сила тертя у водному середовищі, але, з іншого боку, може збільшитися і сумарний електричний заряд на поверхні білкової глобули. Спробуємо відмінність розмірів різних білків використовувати більш певним чином. Для цього створимо крім тертя об рідина ще й додаткове тертя - безпосередньо пов'язане з розмірами мігруючих молекул білка. Створимо штучні перепони для міграції у вигляді просторової сітки, осередки якої будуть сумірні з розмірами білків. Ця сітка повинна бути утворена волокнами, які надійно змочує вода, якщо ми будемо працювати у водних розчинах. У цьому випадку буфер буде заповнювати комірки сітки цілком. Добре б, щоб у нашому розпорядженні була можливість вибирати розміри порожнин або пор цієї сітки - залежно від діапазону розмірів білків, які ми збираємося розділяти. Очевидно, що всі молекули білків повинні мати можливість проходити через пори, ні в якому разі не застрявати в них. Але проходячи, вони повинні постійно стикатися з утворюючими пори нитками, що буде гальмувати їх міграцію в електричному полі. І чим більший білки, тим частіше їм доведеться відчувати ці зіткнення, тим «важче« і повільніше вони будуть мігрувати. Найдрібніші білки, навпаки, будуть проходити через пори ледь торкаючись їх ниток. Швидкість міграції для білків різної величини, знову-таки, встановиться постійною, оскільки статистично постійним буде ефект зіткнення з нитками - він залежить тільки від співвідношення розмірів молекул білка і пор. Ми отримуємо потужний засіб розділення білків за їх розмірами.
Таким чином, вибираючи пористість сітки і оцінюючи результати поділу білків доведеться брати до уваги не тільки їх масу, але і конфігурацію. Мало того, доведеться враховувати і жорсткість (щільність упаковки) білкової молекули. Пухкі глобулярні (і особливо фібрилярні) білки можуть деформуватися при взаємодії з сіткою і тим самим полегшувати собі міграцію між її нитками.
Але що ж це за сітка, яку ми хочемо створити? І як це зробити? Швидше за все це буде гель, подібний харчового желе, яке отримують дуже невеликою добавкою желатину до фруктового соку, або щось схоже на вже знайомий нам агар. Перш, ніж поговорити про це гелі докладніше, відзначимо, що завдяки силам змочування рідина з гелю з досить дрібними порами не буде витікати, навіть якщо вона складе 95% його маси. А це означає, що заповнивши нашу трубочку гелем, ми можемо поставити її вертикально, як це показано на рис. 36. До речі сказати, так і виглядали перші приборчики для електрофорезу.

Рис. 36
Вертикальне розташування трубочки з гелем відразу виявляє одну істотну перевагу. Тепер препарат вихідної суміші білків можна наносити тонким рівним шаром на верхню поверхню гелю. У результаті чого і поділені під час міграції в електричному полі білки будуть рухатися вниз у вигляді тонких дисків. (Кожен зі своєю швидкістю, поступово розташовуючись на всій довжині трубочки.)
Зрозуміло, буфери верхнього та нижнього резервуарів повинні змочувати обидва торці гелю в трубочці. Тому гель не повинен заповнювати трубочку до самого верху, залишаючи місце для нанесення препарату. У вихідну білкову суміш (теж розчинену в буфері) можна додати 5-10% сахарози або гліцерину. У такому вигляді її можна вносити в трубочку піпеткою з відтягнутим поліетиленовим наконечником, обережно подслаівая під буфер, що знаходиться в трубочці.
У ході електрофорезу зони розчинених білків залишаються невидимими. Для спостереження за процесом розділення в вихідний препарат додають 0,01% барвника, молекули якого несуть на собі електричний заряд того ж знака, що і фракціоніруемие білки, але не взаємодіють з ними. Барвник в електричному полі переміщується вздовж трубочки у вигляді забарвленої смужки. Його підбирають таким чином, щоб швидкість його міграції була трохи більше, ніж швидкість найбільш рухливих молекул білка. Коли пофарбована смужка доходить до кінця трубочки електрофорез припиняють. В якості негативно зарядженого барвника широко використовують «бромфенолового синій». Для електрофорезу лужних, позитивно заряджених білків - «Метиловий зелений» або «піронін».
Після закінчення електрофорезу стовпчик гелю витягують з трубочки, фіксують у кінцевому положенні міграції та білки забарвлюють - прямо в гелі. До методів такої фіксації і забарвлення ми ще повернемося, а зараз треба буде познайомитися з природою самого гелю, використовуваного для фракціонування білків.

Література
1 Курашвілі Л.В., Ковальов К.В. Атерогенні ліпопротеїди у хворих з абдомінальною патологією. Науково-практічеекая конференція, присвячена 140-річчю обласної лікарні ім.Н.Н. Бурденка і на честь 110-річчя з дня народження академіка М.М. Бурденка. Тез.докладов. - Пенза. 1986. - С.101-102.
2 Курашвілі Л.В. , Устинова Т.І. Лабораторні тести в діагностиці гіпоксичних соотояній. Наукові читання в частину пам'яті академіка М.М. Бурденко). - Пенза, 1988. С.148-150.
3 Курашвілі Л.В., Волков А.С., Прокаєва П.А. Коефіцієнт атерогевності і холестерин у діагностиці порушень ліпідного обміну. VI Наукові читання пам'яті академіка М.М. Бурденка. - Пенза, 1988. - С.165-166.
4 Курашвілі Л.В., Савченко Р.П. Метаболізм ліпідів у хворих у термінальній стадії хронічної ниркової недостатності / / Казанський медичний журнал. - 1990. - Т. XXI. - N 5. - С.338-340.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Реферат
51.9кб. | скачати


Схожі роботи:
Полімеразна ланцюгова реакція 2
Полімеразна ланцюгова реакція
Ланцюгова реакція реформ 60 70 х років XIX століття в історичній літературі
Ланцюгова реакція реформ 60-70-х років XIX століття в історичній літературі
Електрофорез
Медикаментозний електрофорез
Електрофорез і електроосмос
Пульс-електрофорез і методи роботи з великими молекулами ДНК
Виявлення одиничних нуклеотидних замін в ДНК розщеплення РНКаз і денатуруючих градієнтний гель-електрофорез
© Усі права захищені
написати до нас