Зростання аксона

Зростання аксонів

Конус зростання, подовження аксона і роль актину

Кінчик зростаючого аксона подовжується, утворюючи конус росту. Рамон-і-Кахаль першим виявив, що конус росту є частиною аксона, відповідальної за навігацію і подовження його в напрямку кінцевої мети. Конус зростання подовжується і скорочується за рахунок широких платівок, званих ламмеліподіямі, і тонких, загострених випинань, званих філоподіямі Філоподій досягають розмірів у кілька десятків мікрометрів і можуть збільшуватися й скорочуватися, як би обмацуючи субстрат в усіх напрямках. Філоподій адгезується до певного субстрату і тягнуть конус росту в цьому напрямку.

Актин грає ключову роль в рухливості конуса росту (рис. 1). Як ламелліподіі, так і філоподій багаті філаментне актином і речовинами, які інгібують полімеризацію актину, такими як грибний токсин цітохалазін В, знерухомлені конуси росту. Випинання і ретракція ламелліподій і філоподій, а також рух вперед самого конуса росту, швидше за все, керується двома процесами: (1) полімеризацією і розбиранням Актинові філаментів і (2) залежною від міозину транслокацією Актинові філаментів геть від ведучого краю конуса росту. Обидва процеси використовують енергію гідролізу АТФ і можуть управлятися білками, що зв'язують актин. Кальцій, протеїнкінази та інші внутрішньоклітинні вторинні посередники управляють активністю актин-зв'язуючих білків. Наприклад, зупинка росту і ретракція конуса росту, два частих події в процесі росту аксонів, пов'язані з вхідним струмом кальцію і збільшенням частоти короткочасних підвищень концентрації кальцію в цитоплазмі клітини.

Рис. 1. Модель рухливості конусів зростання на основі актину. (А) Поперечний зріз (ліворуч) і вид зверху (праворуч) на конус росту в стаціонарній фазі. Міозин, пов'язаний з мікротрубочками, забезпечує рух Актинові філаментів в напрямку назад, в той час як у філаментах постійно відбувається процес полімеризації з боку ведучого краю конуса росту і деполімеризація в центрі. (В) Аналогічні зображення конуса росту під час зростання. Актинові філаменти иммобилизировать приєднанням до субстрату. Полімеризація актину в цьому випадку призводить до просування конуса росту, у той час як міозин забезпечує рух мікротрубочок вперед, просуваючи центральний домен конуса росту.

Молекули адгезії клітини та позаклітинного матриксу і зростання аксона

Молекули клітинної адгезії управляють зростанням аксона, забезпечуючи найбільш сприятливе оточення для витягування конуса росту. Клітинні молекули адгезії представляють собою трансмембранні або пов'язані з мембраною глікопротеїни, які характеризуються структурними мотивами своїх позаклітинних частин, які багато в чому гомологічних постійним доменам імуноглобулінів і фібронектину 3 типи (рис.2). являются клеточные молекулы адгезии (N-CAM), молекулы адгезии нейроглии САМ (NgCAM), TAG-1, MAG, и DCC ⁸³⁾ . Представниками надродини цих імуноглобулінів (Ig) є клітинні молекули адгезії (N-CAM), молекули адгезії нейроглії САМ (NgCAM), TAG-1, MAG, і DCC ^83). Ці молекули забезпечують адгезію клітин один до одного за допомогою гетерофільних зв'язків між різними надродини імуноглобулінів (наприклад, зв'язок між NrCAM і TAG-1). Додатково присутньої скрізь молекулою клітинної адгезії є молекула N-кадгеріна (N-cadherin, рис. 2), яка забезпечує кальцій-залежну адгезію між клітинами.

У культурі клітин експресія N-CAM і N-кадгеріна в клітинах призводить до їх агрегації, витягування аксонів у бік клітинних субстратів, але не субстратів позаклітинного матриксу, а також з'єднанню окремих зростаючих аксонів в пучки (фасцікули, fascicles). , FGF ). Стимуляція росту аксонів молекулами клітинної адгезії не забезпечується просто «липкостью» субстрату; вона управляється активацією рецепторів, пов'язаних з тіро1інкіназой, наприклад рецептора до фактору росту фібробластів (fibroblast growth factor, FGF).

Рис. 2. Два класи молекул адгезії нервових клітин. (А) N-кадгерін сприяє гомофільной кальцій-залежної адгезії. (В) Члени надродини імуноглобулінів характеризуються численними повторами пов'язаних один з одним дисульфідними містками циклів, які гомологічних доменів, вперше описаним в постійної частини молекул імуноглобуліну. Багато хто з цих молекул клітинної адгезії також містять кілька доменів, схожих з повторами у фібронектину III типу (показано у вигляді прямокутників). У різних видів тварин є велика кількість гомологічних білків зі схожими іменами.

Рецептор FGF включає внутрішньоклітинний каскад, пов'язаний з фосфорилюванням тирозину, що призводить до подовження аксона. Білкова тірозінфосфатаза, фермент, що видаляє залишки фосфату з тирозину, також бере участь у регулюванні цих сигналів. Молекули адгезії позаклітинного матриксу, включаючи ламінін, фібронектину, тенасцін (Л, цітотактін), а також перлецан, теж є сприятливим субстратом для росту нервових відростків ⁸⁵ · ^{86 ).} Ці глікопротеїни з великою масою мають дві або більше подібні субодиниці, утримувані разом завдяки дисульфідними містками (рис. 2). Кожна субодиниця характеризується повторюваними структурними мотивами. Білки позаклітинного матриксу взаємодіють з клітинами через сімейство рецепторів, званих інтегринів. Було ідентифіковано велику кількість ізоформ субодиниць інтегринів. Кожна комбінація призводить до формування рецепторів з різними властивостями. Інтегріни забезпечують структурні зв'язки між білками позаклітинного матриксу і внутрішньоклітинним актіновим цитоскелетом, регулюючи форму клітини і її міграцію. Крім того, вони активують внутрішньоклітинні сигнальні шляхи, які управляють зростанням клітини, проліферацією і диференціюванням.

Дослідження за допомогою спеціальних блокуючих антитіл показують, що конуси росту рідко використовують тільки один субстрат для свого руху; кілька типів молекул адгезії клітини та позаклітинного матриксу можуть забезпечувати зростання нервових відростків у певних типів нейронів. Наприклад, для повного інгібування росту аксонів у бік шваннівською клітини необхідно застосовувати одночасно антитіла до Ll / NgCAM, N-кадгеріну і інтегринів. Один тип антитіл сам по собі не може перешкодити зростанню ^{аксона.}

Рис. 3. Білки позаклітинного матриксу, що опосередковують адгезію клітин до субстрату і відштовхування. указывает на расположения остатков цистеина, которые образуют дисульфидные мостики между цепочками. (А) Схематичне представлення доменної структури ланцюгів, що складається з фібронектину, ламініну (А ланцюг), перцелана і тенасціна-С, а також ділянок, до яких приєднуються клітини, колаген, гепарин, фібронектину, інтегрин, фібрин і альфа-дістроглікан. S вказує на розташування залишків цистеїну, які утворюють дисульфідні містки між ланцюжками. Тенасцін-С містить як зв'язують, так і відразливі домени; основний його ефект, однак, відштовхування клітин і конусів росту. (В) Молекули, зображені в певному масштабі. Все, крім перцелана, є олігопротеінамі, ланцюги зв'язані один з одним дисульфідними містками. Из Пунктирною лінією показаний гепарансульфат 90 і 170 нм завдовжки, пов'язаний з N термінальним доменом перцелана. (З Л ., 1992.) Engel Л., 1992.)

Управління ростом аксона

Аксони нервових клітин можуть досягати 1 метра і більше в довжину, утворюючи синапси в певному місці на чітко визначеній клітці в області, де є велика кількість інших потенційних клітин-мішеней. Дві основні теорії, що стосуються того, яким чином встановлюється така специфічність у синаптичних зв'язках під час розвитку, були запропоновані в першій чверті двадцятого століття. Згідно з однією, нейрони та їх мішені заздалегідь запрограмовані на утворення певних синаптичних зв'язків. Інша теорія вважає, що спочатку зв'язку встановлюються більш-менш випадково, а потім частина з них реорганізовується завдяки впливам на нейрони з боку клітин-мішеней, у результаті чого відбувається усунення помилкових синапсів і загибель неправильно з'єднаних клітин. Експериментальні докази, отримані до теперішнього часу, говорять на користь того, що зростання аксонів та освіта синаптичних зв'язків є селективним процесом; аксон направляється строго до своєї мети завдяки певним сигналами у своєму оточенні.

Навігація аксона, що залежить і не залежить від клітини-мішені

Які позаклітинні сигнали управляють конусом росту? Рамон-і-Кахаль спочатку запропонував хемоаттрактантную модель управління аксонів, згідно з якою конуси росту аксонів слідують за градієнтом концентрації деяких молекул, вироблюваних клітинами-мішенями. Такий механізм можливий для зростання аксона, коли відстань між тілом нейрона і його мішенню дуже коротке. Наприклад, Лумсден і Девіс вивчали зростання аксонів з ганглія трійчастого нерва, розташованого в голові миші, в сусідні епітеліальні тканини, відстань до яких становило менше 1 мм (ці аксони в кінцевому рахунку утворювали сенсорну іннервацію вібрис, Якщо розвивається ганглій трійчастого нерва містився в культуру поблизу експлантантов з декількох периферичних тканин, нервові відростки росли з ганглія у напрямку власної клітини-мішені, ігноруючи інші тканини. експлантатів епітелію тканини-мішені надавали подібну дію на ріст аксонів тільки в тому випадку, якщо вони бралися у ембріона в період становлення іннервації.

На противагу цьому, здатність аксонів спінальних мотонейронів рости в напрямку кінцівок не залежить від наявності м'язової клітини-мішені. Це було показано шляхом видалення в ранньому періоді соміт, з якого розвивається мускулатура кінцівок. Аксони мотонейронів направляються нормально зі спинного мозку, вростають в кінцівку і утворюють певний патерн м'язових нервів, навіть за відсутності м'язи. Таким чином, фактори, які управляють зростанням аксонів мотонейронів до певної мішені на кінцівки, не виділяються м'язами, з якими аксони в кінцевому підсумку утворюють зв'язку.

Рис. 4. Конуси зростання периферичних нейронів використовують клітини-орієнтири для навігації в кінцівках коника. (А) У нормальному ембріоні аксони Ti1 нейрона зустрічають на своєму шляху в центральну нервову систему серію клітин-орієнтирів: клітини Fl, F2 і дві клітини СТ1. (В) Якщо СТ1 клітку вбити на ранній стадії розвитку, нейрон Ti1 утворює кілька аксональних гілочок з точки, де знаходиться F2, і конуси росту направляються в неправильному напрямку.

Навігація по клітках-орієнтирів (guidepost cells)

Коли дистанція від нейрона до його цілі складає більше ніж кілька сотень мікрон, його шлях позначений спеціальними проміжними цілями. Наприклад, конус росту, що йде від сенсорної клітини кінцівок у розвивається коника, робить кілька різких поворотів на своєму шляху в ЦНС (рис. 4). Ці повороти відбуваються в той момент, коли конус росту стосується так званих клітин-орієнтирів (guidepost cells). Така поведінка вказує на наявність взаємодії з клітинами-орієнтирами, відповідальними за перенаправлення конусів росту. Цими клітинами чаші всього є незрілі нейрони. Ці взаємодії можна продемонструвати за допомогою видалення клітин-орієнтирів променем лазера до того, як їх досягне конус росту. У цьому випадку не відбувається відповідного зміни в траєкторії руху конуса росту.

Синаптичні взаємодії з клітинами-орієнтирами

У деяких випадках аксони утворюють короткочасні синаптичні контакти з клітинами-орієнтирами під час розвитку. У розвиненому гіпокампі, наприклад, аксони з енторінальной кори спочатку утворюють синапси з тимчасовою популяцією нейронів, клітинами Кахаля-Ретціуса. Пізніше, у міру появи гранулярних клітин і їх дозрівання, енторінальние аксони залишають клітини Кахаля-Ретціуса і утворюють зв'язки з дендрита гранулярних клітин. Після цього клітини Кахаля-Ретціуса зникають. В іншому прикладі аксони нейронів з ядра ЛКТ в зоровій системі ссавців досягають розвивається корковую платівку раніше, ніж утворюються їхні синаптичні мішені - пірамідні клітини шару 4. Тому аксони ядра ЛКТ утворюють синапси з нейронами подпластінкі, які утворюються в ранньому ембріогенезі. Нейрони подпластінкі лежать під розвивається корковою платівкою, і їм призначено зникнути незабаром після народження. Через кілька тижнів, коли пірамідні клітини шару 4 досягають свого місця розташування в корі, аксони з ЛКТ розривають свої зв'язки з нейронами подпластінкі і направляються в кору, щоб утворити зв'язку, характерні для дорослої тварини. Якщо нейрони подпластінкі видалити в ранньому періоді розвитку місцевої аплікацією нейротоксинів, аксони ядра ЛКТ проростають за межі розвивається зорової кори і не можуть утворити синаптичних зв'язків зі своїми мішенями.

Механізми управління аксонів

Молекули, які управляють конусом росту, діють чотирма основними шляхами: як атрактанти або репеленти, на короткій або довгій дистанції.

Деякі коротко-дистантних сигнали управління аксоном забезпечуються за допомогою контакту конуса росту з клітинної поверхнею або з білками адгезії позаклітинного матриксу, які були описані раніше в цьому розділі як промотори зростання аксона. Молекули адгезії та їх рецептори можуть також відігравати провідну роль у зв'язуванні окремих аксонів в пучки (так звана фасцикуляций). Характер зростання аксона і іннервація клітини-мішені in vivo і в культурі клітин порушувалася при зміні активності специфічних молекул адгезії або їх рецепторів, в генетичних експериментах з виключенням певних генів, а також при додаванні певних типів антитіл.

Інше вплив молекул позаклітинного матриксу на зростаючий аксон показано в експериментах на окремих клітинах, виділених з ЦНС п'явки і ростуть в культурі. Субстрати, які містять тенасцін або ламіннн, сприяють не тільки швидкого утворення нервових відростків у нейронів п'явки, але також впливають на характер росту цих відростків і на розподіл кальцієвих каналів у клітині. Різні нейрони по-різному відповідають на певні молекули позаклітинного матриксу. Таким чином, виникає економна схема, коли кілька молекул адгезії можуть забезпечувати різноманітні ефекти.

Рис. 5. Молекули позаклітинного матриксу визначають патерн зростання нервових відростків в культурі нейронів п'явки. Одиночний нейрон вирощений в клітинній культурі на субстраті певного патерну. З лівого боку край чашки був покритий конканаваліном A (Con A), а з правого боку екстрактом, що містить позаклітинний матрикс (ЄСМ) з гліальних капсул гангліїв п'явки.

Всі молекули адгезії або сприяють зростанню, або ні. Управління ростом аксона на великій відстані включає в себе рух аксона уздовж градієнта концентрації розчинної фактора.

Навігація конусів зростання в спинному мозку

Хороший приклад різноманітності механізмів і молекул, які використовують конуси росту для навігації до своїх клітин-мішеней, становлять аксони комісуральних інтернейронов спинного мозку хребетних У ранньому періоді розвитку коміссурал'ние інтернейрони, які лежать в дорзальной частини спинного мозку, «випускають» аксони, які починають рости в вентральному напрямі, перетинаючи середню лінію, і потім ростуть уздовж спинного мозку у напрямку до своїх синаптическим мішенях (рис. 6).

Аксони комісуральних нейронів спочатку залучаються до вентральної середньої лінії білком нетрін-1, розчинною хемоаттрактантов, утвореним спеціальними клітинами базальної пластинки, що лежать уздовж середньої лінії спинного мозку (мал. 23.24А) ^111). Нетрін-1 взаємодіє з рецепторами, які експресуються комісуральними нейронами, званим DCC (який вже згадувався раніше через свого взаємодії з молекулами клітинної адгезії. Існування розчинної фактора, що утворюється в базальній платівці, який здатний притягати (attract) аксони комісуральних нейронів, було вперше показано при культивуванні шматочків дорзальной частини спинного мозку ізольовано, або разом з шматочками базальної пластинки (рис. ^7). Аксони комісуральних нейронів ростуть чітко у напрямку до базальної платівці, навіть якщо експлантатів знаходяться один від одного на відстані кількох сотень мікрон. Ця дистанція занадто велика для того, щоб її пройшов філоподій конуса росту і вимагає розчинної фактора. Такий фактор, нетрін-1, що входить у сімейство секреторних білків, характеризується подібністю доменів з N-кінцевими доменами 7 ланцюга ламініну-1 (рис. 7А). Гомологи нетріна також грають роль у зростанні аксонів у дрозофіли і С. elegans.

Далі аксони комісуральних нейрона перетинають вентральну середню лінію, що вони роблять тільки одного разу, таким чином залишаючись на контралатеральной стороні (рис. 7В, С). Це перетин полегшується взаємодіями між двома адгезивними молекулами клітинної поверхні: TAG-1, яка експресується на поверхні аксона спайкового нейрона, і NrCAM, які експресуються на клітинах базальної пластинки. Після перетину середньої лінії експресія TAG-1 в аксонах інгібується сигналами від клітин базальної пластинки, під дією яких у аксонах починає синтезуватися протеїн, званий robo. Robo представляє собою рецептор для іншого білка, званого slit, який вивільняється клітинами базальної пластинки. Взаємодія між slit і robo відштовхує конуси росту комісуральних интернейронов. Втрата атракції до TAG-1-NrCAM контакту і придбання коротко-дистантного відразливого взаємодії slit-robo попереджають можливе повторне перетин аксоном середньої лінії.

Рис. 8. Роль нетріна та його рецепторів у атракції і відштовхуванні на великій відстані. (А) N-кінцева амінокислотна частина секреторного білка нетріна складається з доменів VI і V, які гомологічних доменів амінокислотного кінця 7 ланцюга ламініну. Домен V містить три ECG-повтору. С-кінцевий домен цього ланцюга не має гомології з ламінін. (В) Рецептори нетріна мають позаклітинний домен, одноразово перетинає мембрану, і внутрішньоклітинний домен. Позаклітинний домен сімейства DCC рецепторів нетріна має чотири іммуноглобулінових домену (Ig) і шість повторів фібронектину III (FN III). DCC і їх гомологи також можуть грати роль молекул адгезії. Сімейство рецепторів до нетріну UNC-5 має два іммуноглобулінових домену та два домени, гомологічних тромбоспондину 1-го типу (TSP I), які розташовані внеклеточно, а також довгу цитоплазматичну послідовність. (С) мікрофотографії шматочків дорзального спинного мозку ембріонів щура (зверху на кожній з панелей), культивованих разом з шматочками тканини базальноі пластинки (зліва), разом з CDS клітинами, секрету ючий ми рекомбінантний нетрін 1 (у центрі), і з контрольними COS клітинами (праворуч). Нижня платівка і нетрін 1 обидва здатні викликати значний і спрямований зростання пучків комісуральних аксонів з дорзаль ської області спинного мозку.

Slit і нетрін-1 також дифундують з базальної пластинки для відштовхування конусів росту мотонейронів. Такі відразливі взаємодії направляють аксони мотонейронів геть від спинного мозку в напрямку периферії (ріс.6D)

Література:

SK 1995. McConnell, SK 1995. Constructing the cerebral cortex: Neurogenesis and fate determination. Neuron 1 травень: 761-768.
В . К . Mueller, В. К. 1999. Growth cone guidance: First steps towards a deeper understanding. Annu. Rev. Neurosci. 22: 351-388.
OLeary, DD, and Wilkinson, DG 1999. Eph receptors and heparins in neural development. Curr. Opin. Neurobiol. 9: 65-73.
Oppenheim, RW 1991. Cell death during development of the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 14: 453-501.