Реферат
На тему: «Генетична регуляція розвитку»
Мутації і зміни, що відбуваються в онтогенезі
Якщо морфологія є прояв складного комплексу процесів розвитку, то ці процеси в свою чергу є проявом дії цілого сузір'я генів. Таке важливе припущення, покладене в основу цієї книги, і ми зібрали принаймні prima facie дані на користь того, що у Metazoa частина генома специфічно бере участь у регуляції онтогенезу і що характер еволюції цієї частини відрізняється від характеру еволюції структурних генів. До цих пір, однак, ми обмежувалися ізольованими приватними прикладами генного контролю морфогенезу і не намагалися відповісти на центральне питання: яким чином гени визначають процес розвитку? Тут ми в дуже прямому сенсі повертаємося до програми механіки розвитку, висунутої Ру (Roux), однак, замість того щоб видаляти клітини або інші структури зародка, з тим щоб визначити їх ролі в розвитку, як це робили представники класичної експериментальної ембріології, генетика розвитку використовує мутації як дуже тонкий скальпель, що дає можливість знищувати або змінювати окремі гени.
Генетична модель, за допомогою якої можна вивчати будь-яку систему, теоретично знаходиться під генетичним контролем, полягає в наступному. Для того щоб проаналізувати будь-який процес, в даному випадку онтогенез, дослідник виявляє мутації, які змінюють цей процес. Виявивши такі мутації, він проводить фенотипическое порівняння мутантних особин з нормальними. Це порівняння допомагає йому зрозуміти, як цей ген впливає на нормальний розвиток. Однак, перш ніж продовжити опис методу проведення такого порівняння, слід вказати, що вплив мутацій на онтогенез проявляється двома основними способами. Це, по-перше, дизруптивного зміни, за яких процес нормального розвитку порушується, що призводить до морфологічних аномалій (наприклад, до відсутності деяких структур). У найбільш різко вираженій формі такі мутації виявляються летальними. По-друге, це гомеозісние зміни, при яких під дією мутації розвиток відхиляється від норми, в результаті чого будь-яка структура даного організму заміщається гомологічним органом або кінцівкою. Ми відкладемо подальше обговорення мутацій цього другого типу до наступного розділу і займемося тут головним чином дизруптивного змінами.
Аналіз порушень, що викликаються будь-якої дизруптивного мутацією, лише в рідкісних випадках зводиться до простого порівняння кінцевого фенотипу гинучої особини з нормальним фенотипом, тому що розвиток - це складний і високоінтегрований процес. Величезна більшість відбуваються в ньому подій тісно пов'язане з іншими подіями і, по суті, залежить від них. Це особливо ясно виявляється в тому, що багато мутації мають плейотропних дією, тобто відсутність або зміна одного гена може зумовити кілька морфологічних змін. Прикладом служать зміни, які спостерігаються у людей з так званої аномалією Пельгера (Pg). Вона успадковується у людини як простий домінантний аутосомний ознака. У гетерозигот (Pg / +) немає жодних клінічних симптомів, але для їх нейтрофілів характерні аномально сегментовані ядра. У дорослої людини ядра поліморфноядерних нейтрофілів звичайно складаються з чотирьох або п'яти сегментів, у гетерозигот ж Pg / + ядра складаються всього з двох, рідше з трьох сегментів. Цей же ознака виявлений у кроликів, у яких він успадковується з того ж типу і подібним чином виявляється в картині крові. Схрещуючи гетерозиготних кроликів, можна отримати гомозиготних особин Pg / Pg. Ядра нейтрофілів у цих особин взагалі не розділені на сегменти, і такий генотип супроводжується низькою життєздатністю. Для небагатьох, хто вижив особин крім цієї особливості нейтрофілів характерна вкрай виражена карликовість з недорозвиненням кінцівок і грудної клітки. Тут варто поставити запитання: яка причинна залежність, якщо вона існує, між цими двома плейотропних порушеннями? Не виключена можливість, що обидва цих фенотипічних прояви являють собою насправді результат третього, поки ще невідомого порушення, викликаного алелем Pg.
Аналіз часу й місця дії генів
Методи, використовувані для визначення первинного місця дії гена, подібні з застосовуваними в класичній ембріології і, по суті, запозичені з неї. У своїй найпростішої формі ці методи полягають у пересадці органу чи шматочка тканини від мутантної особини нормальному реципієнту. Проводять також і реципрокні пересадки. Ця операція зазвичай проробляється до прояву того чи іншого мутантного ефекту. Потім можна визначити долю розвивається органу або тканини в їхньому новому оточенні. Якщо генетичний дефект розглянутого органу або тканини автономний для цієї структури, тобто якщо вона є первинним місцем дії даного гена, то слід очікувати, що мутантна тканина буде продукувати аномальний фенотип (навіть і у нормальної господаря). Експерименти подібного типу можна проводити на тканинах або органах, вирощуваних в культурі, приблизно таким же чином, експериментах зі спільного вирощування дерми та епідермісу миші, ящірки і курки, тільки замість з'єднання тканин від тварин різних видів з'єднують тканини або органи мутантних і немутантних особин. Створення мозаїчних особин проводилося в ще більш широких масштабах Мінц (Mintz) і її співробітниками. Цим дослідникам вдалося зрощувати in vitro цілих мишачих зародків на стадії морули. Таких «гібридних» зародків імплантують потім псевдобеременності самці. Що виходять в результаті миші, що відбуваються від чотирьох батьківських особин, складаються з суміші клітин двох різних генотипів, причому активні обидва генотипу. Цей метод можна також використовувати для аналізу автономності експресії мутантних генів, сращівая мутантних і нормальних зародків на стадії морули.
Слід згадати ще про один метод такого типу - про парабиозе. Він полягає в зрощуванні цілих тварин, а не просто органів або тканин. Необхідно вказати, однак, що при такому зрощенні не виходить дійсно інтегрованих мозаїчних особин. При всіх цих методах необхідно, щоб трансплантуються тканини, органи або зрощуються зародки були сумісні. У нижчих хребетних, таких як амфібії, це не становить серйозної проблеми, проте у ссавців додаткове ускладнення виникає у зв'язку з можливістю відторгнення трансплантата, так що слід спочатку переконатися в тому, що мутантна і нормальна особини імунологічно сумісні. Залишається привести ще два методи, специфічні для генетики розвитку та застосовуються майже виключно при роботі з Drosophila melanogaster. Це створення гінандроморфов та індукція мозаїчних особин шляхом мітотичної рекомбінації. Гінандроморфамі називають дорослих мух, тіло яких складається як з чоловічих, так і з жіночих тканин. Використовуючи тип дроблення, характерний для двокрилих, і їх особливу кільцеву Х-хромосому, таких мозаїчних особин можна постійно отримувати в лабораторних лініях. У нормі X-хромосома дрозофіли має форму палички, на одному кінці якої знаходиться центромера. Одна з мутантних форм цієї хромосоми являє собою замкнуте кільце. Кільце це має цікаву особливість: при декількох перших поділках дроблення воно нестабільно. Ця нестабільність може призвести, зокрема, до втрати кільцевої хромосоми одним з двох дочірніх ядер, що утворюються при першому розподілі дроблення. Якщо втрата відбувається на цій стадії, то в результаті подальших поділів дроблення створюється популяція ядер, одна половина яких містить кільцеву Х-хромосому, а інша не містить її. Якщо зигота, починаючи ділитися, являє собою гетерозиготну самку - палочка-Х/кольцо-Х, то після такої втрати половина її ядер виявиться жіночими і міститиме дві Х-хромосоми - кольцо-Х/палочка-Х, а інша половина - чоловічими і буде містити тільки одну Х-хромосому - паличка-Х / О (підлога у дрозофіли визначається співвідношенням Х-хромосом і аутосом, а не Y-хромосомою, як у ссавців). Після восьми синцитіальних поділів в яйці утворюється скупчення ядер. Це скупчення, однак, не являє собою випадкової суміші типів ХВ і XX. Ядра цих двох типів утворюють дві просторово розділені групи, розташування яких визначається площиною першого поділу дроблення. Тому, коли така популяція ядер мігрує до периферичної цитоплазмі, з тим щоб утворити клітинну бластодерму, вона мігрує у вигляді двох дотичних, але відокремлених груп чоловічих і жіночих ядер. Доросла муха, що розвивається з такого гінандро-морфного зародка, також буде мозаїчної. Як показано на рис. 7-3, кількість і розташування дорослої тканини чоловічої або жіночої природи не постійно. Це відбувається тому, що площина першого поділу дроблення розташовується випадковим чином по відношенню до осей яйця. Тому якщо площина перший дроблення ділить яйце по довгій осі на праву і ліву половини, то з нього розвинеться білатеральний гінандроморф. Варіації цього простого випадку приведуть до більшої чи меншою часткою чоловічої тканини в залежності від того, скільки ядер ХВ знаходиться в тих ділянках бластодерми, яким судилося сформувати дорослі тканини.
Мутації з материнським ефектом
У таких різних організмів, як морські їжаки і жаби, події, що відбуваються на ранніх стадіях дроблення, і, по суті, більша частина, якщо не весь розвиток, попереднє гаструляції, не залежать від генома зиготи. Інформацію, необхідну для виконання цих початкових і вирішальних етапів онтогенезу, визначає материнський геном при утворенні яйцеклітини. На прикладі закручування раковини у Limnaea, такий висновок підтверджується існуванням у широкого кола різних організмів так званих генів з материнським ефектом. Мутації цих генів передаються у спадок надзвичайно своєрідним способом. При схрещуванні двох особин, гетерозиготних по якому-небудь рецесивним ознакою, слід очікувати, що ця ознака проявиться у 25% нащадків. Однак у випадку материнських (mat) мутацій особини mat / mat розвиваються нормально. Більш того, чоловічі особини з таким генотипом фертильність і при схрещуванні з нормальними жіночими особинами дають нормальних нащадків. На відміну від цього гомозиготні самки дають аномальних нащадків. Це пояснюється тим, що у таких самок утворюються аномальні яйцеклітини, які не можуть завершити нормальний розвиток. Самка mat / mat виживає, тому що вона походить від гетерозиготною (mat / +) матері, здатної продукувати нормальні яйця. Хотілося б зробити висновок, що гени, що дають такі мутації, продукують якісь «морфогени», які утворюються в розвивається ооциті в якості «інструкції» для раннього розвитку. Проте можливо також, що яйце здатне розвиватися просто внаслідок якогось загального порушення метаболізму. Підходящим прикладом служить група з п'яти різних дефектів, успадкованих з материнського типу і обумовлених генами, локалізованими в Х-хромосомі Drosophila melanogaster: tin (cinnamon), dor (deep orange), amx (almondex), fu (fused) і r (rudimentary) . Всі ці ознаки, крім того що вони успадковуються за материнському типу, викликають у дорослих особин помітні морфологічні відхилення, за якими вони і отримали свої барвисті назви. Гемізиготність самці, що володіють будь-якої однієї з цих мутацій, життєздатні і фертильності, так само як і гетерозиготні самки. Схрещуючи мутантних самців з гетерозиготними самками, можна отримати гомозиготних самок, які при схрещуванні з мутантними самцями виявляються зовсім стерильними. Наприклад, самки dor / dor продукують яйця, розвиток яких припиняється на стадії гаструляції. Інші чотири мутації також викликають загибель зародків, але на кілька іншій стадії, ніж мутації dor. У характері успадкування всіх цих п'яти мутацій є ще одна аномальна особливість. Схрещуючи гомозиготних мутантних самок з нормальними самцями, можна отримати деяке число нащадків. Все це - гетерозиготні самки, що розвинулися з яєць, запліднених сперматозоїдом, який несе Х-хромосому. Жоден самець не виживає. Мабуть, присутність алеля дикого типу розглянутого гена може трохи знизити дефектність яйця, навіть якщо цей алель вноситься сперматозоїдом. Це, звичайно, має на увазі, що принаймні частина генома зиготи активна під час гаструляції.
Мутації, що зачіпають органогенез
Як ми переконалися вище, події, що відбуваються на ранніх стадіях розвитку, в значній мірі залежать від інформації, що поставляється материнським організмом. Однак приблизно до часу гаструляції важливу роль у подальшому розвитку починає грати генетична інформація самого зародка, і організм набуває можливість контролювати свою долю. Для морфогенетичних подій, наступних за формуванням бластодерми, необхідний синтез РНК і її трансляція в білок. Про необхідність генетичної інформації зародка можна також судити по великому числу мутацій, що впливають на події, що відбуваються після гаструляції, і вказують, таким чином, на існування генів, що регулюють ці події. У цих мутацій не спостерігається спадкування за материнському типу.
Як приклад можна скористатися локусом N (Notch) у Drosophila melanogaster. Notch-зчеплена зі статтю домінантна мутація, що є одночасно рецесивною деталлю. Гомозиготні самки (N / N) і гемізиготність самці (N / Y) гинуть на стадії зародка через приблизно 6 годин після запліднення. Цей час відповідає моменту, безпосередньо наступного за гаструляції, коли зародок виконав приблизно четверту частину ембріогенезу. Гістологічні та морфологічні дослідження, проведені Паулсона (Paulson) на цих зародках, показали, що вентральна і латеральна ектодерма, яка зазвичай дає початок епідермісу і нервовим клітинам, утворює тільки клітини, схожі на нейробласти, а епідермісу не утворює зовсім. Тому можна припускати, що локус Notch необхідний для диференціювання із зародкової ектодерми нервової тканини на противагу епідермальної. Виявилося, однак, що це дещо спрощене пояснення. Шелленберджер (Shellenbarger) і його співробітники виділили з локусу Notch температурочувствітельний аллель і охарактеризували його. Мухи, що містять цей алель, при температурі 22 ° С розвиваються нормально, тоді як при 29 ° С спостерігається описана вище загибель зародків. В експериментах із зрушеннями температур, подібних розглянутим на початку цієї глави для мутантів shibire, було встановлено, що до дефекту локусу Notch і недостатності продукту цього локусу зародок чутливий не тільки в цей ранній період ембріогенезу. За допомогою короткочасних підвищень температури були виявлені ще три періоди, коли мутантному організму життєво необхідна нормальна активність локусу Notch. Впливу неперміссівной температури на личинок другого або третього віку або на лялечок приводили до летального результату. Більш того, короткочасні впливу (pulses) в певні періоди третій личинкової стадії або на стадії лялечки викликали такі ж рубці на очах і дефекти щетинок, як у мутантів shibire. Тому, подібно shibire, мутація Notch має набагато більш широким дією, ніж можна було б очікувати на підставі її головного фенотипического прояви. Всі структури, на які вона діє, ектодермального походження, і в своїх подальших експериментах з гінандроморфамі Шелленберджеру вдалося показати, що спостерігаються морфологічні дефекти автономні і притаманні тільки ектодермальних клітинам. Таким чином, знову, як і у випадку мутацій shibire, створюється враження, що один і той самий продукт мутанта Notch необхідний різних клітин ектодермального походження протягом кількох дискретних періодів на всьому протязі розвитку. Слід також зазначити, що для завершення одного і того ж набору онтогенетичних подій необхідні два різних гена, Notch + і shibire +, і що відсутність того чи іншого з них призводить до дивно схожому комплексу порушень. У будинкової миші (Mus musculus) є один складний ген, Т-локус, який багато в чому схожий з тільки що описаної системою Notch. Перший аллель цього локусу був описаний як аутосомний домінантний алель, названий Brachyury (Т). У мишей, гетерозиготних по цьому гену, Т / +, хвости короткі. У гомозиготному стані (Т / Т) цей ген летальний і зародки гинуть внутрішньоутробно. Незабаром після виявлення цієї домінантною мутації було встановлено, що нащадки від схрещування гетерозигот (Т / +) з мишами дикого типу часто зовсім позбавлені хвоста. Виявилося, що ці безхвості миші - результат рецесивних алелей Т-локусу, часто зустрічаються в природних популяціях мишей. Отже, ці безхвості миші мали генотип T / t. Від схрещувань між такими гетерозиготними мишами T / t були отримані безхвості миші, що розмножуються в чистоті. Пізніше було показано, що це обумовлено «збалансованою системою леталей». Як виявилося, серед нащадків від схрещування гетерозигот летальними були не тільки гомозиготи Т / Т, чого слід було очікувати, але й гомозиготи t / t. Таким чином, виживали лише гетерозиготи T / t, які й давали наступне покоління. Ця інтригуюча ситуація була вивчена як генетично, так і ембріологічних в ряді витончених робіт Денна (Dunn), його учнів Беннета (Bennett) і Глюксон-Велша (Gluechsohn-Waelsch).
На тему: «Генетична регуляція розвитку»
Мутації і зміни, що відбуваються в онтогенезі
Якщо морфологія є прояв складного комплексу процесів розвитку, то ці процеси в свою чергу є проявом дії цілого сузір'я генів. Таке важливе припущення, покладене в основу цієї книги, і ми зібрали принаймні prima facie дані на користь того, що у Metazoa частина генома специфічно бере участь у регуляції онтогенезу і що характер еволюції цієї частини відрізняється від характеру еволюції структурних генів. До цих пір, однак, ми обмежувалися ізольованими приватними прикладами генного контролю морфогенезу і не намагалися відповісти на центральне питання: яким чином гени визначають процес розвитку? Тут ми в дуже прямому сенсі повертаємося до програми механіки розвитку, висунутої Ру (Roux), однак, замість того щоб видаляти клітини або інші структури зародка, з тим щоб визначити їх ролі в розвитку, як це робили представники класичної експериментальної ембріології, генетика розвитку використовує мутації як дуже тонкий скальпель, що дає можливість знищувати або змінювати окремі гени.
Генетична модель, за допомогою якої можна вивчати будь-яку систему, теоретично знаходиться під генетичним контролем, полягає в наступному. Для того щоб проаналізувати будь-який процес, в даному випадку онтогенез, дослідник виявляє мутації, які змінюють цей процес. Виявивши такі мутації, він проводить фенотипическое порівняння мутантних особин з нормальними. Це порівняння допомагає йому зрозуміти, як цей ген впливає на нормальний розвиток. Однак, перш ніж продовжити опис методу проведення такого порівняння, слід вказати, що вплив мутацій на онтогенез проявляється двома основними способами. Це, по-перше, дизруптивного зміни, за яких процес нормального розвитку порушується, що призводить до морфологічних аномалій (наприклад, до відсутності деяких структур). У найбільш різко вираженій формі такі мутації виявляються летальними. По-друге, це гомеозісние зміни, при яких під дією мутації розвиток відхиляється від норми, в результаті чого будь-яка структура даного організму заміщається гомологічним органом або кінцівкою. Ми відкладемо подальше обговорення мутацій цього другого типу до наступного розділу і займемося тут головним чином дизруптивного змінами.
Аналіз порушень, що викликаються будь-якої дизруптивного мутацією, лише в рідкісних випадках зводиться до простого порівняння кінцевого фенотипу гинучої особини з нормальним фенотипом, тому що розвиток - це складний і високоінтегрований процес. Величезна більшість відбуваються в ньому подій тісно пов'язане з іншими подіями і, по суті, залежить від них. Це особливо ясно виявляється в тому, що багато мутації мають плейотропних дією, тобто відсутність або зміна одного гена може зумовити кілька морфологічних змін. Прикладом служать зміни, які спостерігаються у людей з так званої аномалією Пельгера (Pg). Вона успадковується у людини як простий домінантний аутосомний ознака. У гетерозигот (Pg / +) немає жодних клінічних симптомів, але для їх нейтрофілів характерні аномально сегментовані ядра. У дорослої людини ядра поліморфноядерних нейтрофілів звичайно складаються з чотирьох або п'яти сегментів, у гетерозигот ж Pg / + ядра складаються всього з двох, рідше з трьох сегментів. Цей же ознака виявлений у кроликів, у яких він успадковується з того ж типу і подібним чином виявляється в картині крові. Схрещуючи гетерозиготних кроликів, можна отримати гомозиготних особин Pg / Pg. Ядра нейтрофілів у цих особин взагалі не розділені на сегменти, і такий генотип супроводжується низькою життєздатністю. Для небагатьох, хто вижив особин крім цієї особливості нейтрофілів характерна вкрай виражена карликовість з недорозвиненням кінцівок і грудної клітки. Тут варто поставити запитання: яка причинна залежність, якщо вона існує, між цими двома плейотропних порушеннями? Не виключена можливість, що обидва цих фенотипічних прояви являють собою насправді результат третього, поки ще невідомого порушення, викликаного алелем Pg.
Аналіз часу й місця дії генів
Методи, використовувані для визначення первинного місця дії гена, подібні з застосовуваними в класичній ембріології і, по суті, запозичені з неї. У своїй найпростішої формі ці методи полягають у пересадці органу чи шматочка тканини від мутантної особини нормальному реципієнту. Проводять також і реципрокні пересадки. Ця операція зазвичай проробляється до прояву того чи іншого мутантного ефекту. Потім можна визначити долю розвивається органу або тканини в їхньому новому оточенні. Якщо генетичний дефект розглянутого органу або тканини автономний для цієї структури, тобто якщо вона є первинним місцем дії даного гена, то слід очікувати, що мутантна тканина буде продукувати аномальний фенотип (навіть і у нормальної господаря). Експерименти подібного типу можна проводити на тканинах або органах, вирощуваних в культурі, приблизно таким же чином, експериментах зі спільного вирощування дерми та епідермісу миші, ящірки і курки, тільки замість з'єднання тканин від тварин різних видів з'єднують тканини або органи мутантних і немутантних особин. Створення мозаїчних особин проводилося в ще більш широких масштабах Мінц (Mintz) і її співробітниками. Цим дослідникам вдалося зрощувати in vitro цілих мишачих зародків на стадії морули. Таких «гібридних» зародків імплантують потім псевдобеременності самці. Що виходять в результаті миші, що відбуваються від чотирьох батьківських особин, складаються з суміші клітин двох різних генотипів, причому активні обидва генотипу. Цей метод можна також використовувати для аналізу автономності експресії мутантних генів, сращівая мутантних і нормальних зародків на стадії морули.
Слід згадати ще про один метод такого типу - про парабиозе. Він полягає в зрощуванні цілих тварин, а не просто органів або тканин. Необхідно вказати, однак, що при такому зрощенні не виходить дійсно інтегрованих мозаїчних особин. При всіх цих методах необхідно, щоб трансплантуються тканини, органи або зрощуються зародки були сумісні. У нижчих хребетних, таких як амфібії, це не становить серйозної проблеми, проте у ссавців додаткове ускладнення виникає у зв'язку з можливістю відторгнення трансплантата, так що слід спочатку переконатися в тому, що мутантна і нормальна особини імунологічно сумісні. Залишається привести ще два методи, специфічні для генетики розвитку та застосовуються майже виключно при роботі з Drosophila melanogaster. Це створення гінандроморфов та індукція мозаїчних особин шляхом мітотичної рекомбінації. Гінандроморфамі називають дорослих мух, тіло яких складається як з чоловічих, так і з жіночих тканин. Використовуючи тип дроблення, характерний для двокрилих, і їх особливу кільцеву Х-хромосому, таких мозаїчних особин можна постійно отримувати в лабораторних лініях. У нормі X-хромосома дрозофіли має форму палички, на одному кінці якої знаходиться центромера. Одна з мутантних форм цієї хромосоми являє собою замкнуте кільце. Кільце це має цікаву особливість: при декількох перших поділках дроблення воно нестабільно. Ця нестабільність може призвести, зокрема, до втрати кільцевої хромосоми одним з двох дочірніх ядер, що утворюються при першому розподілі дроблення. Якщо втрата відбувається на цій стадії, то в результаті подальших поділів дроблення створюється популяція ядер, одна половина яких містить кільцеву Х-хромосому, а інша не містить її. Якщо зигота, починаючи ділитися, являє собою гетерозиготну самку - палочка-Х/кольцо-Х, то після такої втрати половина її ядер виявиться жіночими і міститиме дві Х-хромосоми - кольцо-Х/палочка-Х, а інша половина - чоловічими і буде містити тільки одну Х-хромосому - паличка-Х / О (підлога у дрозофіли визначається співвідношенням Х-хромосом і аутосом, а не Y-хромосомою, як у ссавців). Після восьми синцитіальних поділів в яйці утворюється скупчення ядер. Це скупчення, однак, не являє собою випадкової суміші типів ХВ і XX. Ядра цих двох типів утворюють дві просторово розділені групи, розташування яких визначається площиною першого поділу дроблення. Тому, коли така популяція ядер мігрує до периферичної цитоплазмі, з тим щоб утворити клітинну бластодерму, вона мігрує у вигляді двох дотичних, але відокремлених груп чоловічих і жіночих ядер. Доросла муха, що розвивається з такого гінандро-морфного зародка, також буде мозаїчної. Як показано на рис. 7-3, кількість і розташування дорослої тканини чоловічої або жіночої природи не постійно. Це відбувається тому, що площина першого поділу дроблення розташовується випадковим чином по відношенню до осей яйця. Тому якщо площина перший дроблення ділить яйце по довгій осі на праву і ліву половини, то з нього розвинеться білатеральний гінандроморф. Варіації цього простого випадку приведуть до більшої чи меншою часткою чоловічої тканини в залежності від того, скільки ядер ХВ знаходиться в тих ділянках бластодерми, яким судилося сформувати дорослі тканини.
Мутації з материнським ефектом
У таких різних організмів, як морські їжаки і жаби, події, що відбуваються на ранніх стадіях дроблення, і, по суті, більша частина, якщо не весь розвиток, попереднє гаструляції, не залежать від генома зиготи. Інформацію, необхідну для виконання цих початкових і вирішальних етапів онтогенезу, визначає материнський геном при утворенні яйцеклітини. На прикладі закручування раковини у Limnaea, такий висновок підтверджується існуванням у широкого кола різних організмів так званих генів з материнським ефектом. Мутації цих генів передаються у спадок надзвичайно своєрідним способом. При схрещуванні двох особин, гетерозиготних по якому-небудь рецесивним ознакою, слід очікувати, що ця ознака проявиться у 25% нащадків. Однак у випадку материнських (mat) мутацій особини mat / mat розвиваються нормально. Більш того, чоловічі особини з таким генотипом фертильність і при схрещуванні з нормальними жіночими особинами дають нормальних нащадків. На відміну від цього гомозиготні самки дають аномальних нащадків. Це пояснюється тим, що у таких самок утворюються аномальні яйцеклітини, які не можуть завершити нормальний розвиток. Самка mat / mat виживає, тому що вона походить від гетерозиготною (mat / +) матері, здатної продукувати нормальні яйця. Хотілося б зробити висновок, що гени, що дають такі мутації, продукують якісь «морфогени», які утворюються в розвивається ооциті в якості «інструкції» для раннього розвитку. Проте можливо також, що яйце здатне розвиватися просто внаслідок якогось загального порушення метаболізму. Підходящим прикладом служить група з п'яти різних дефектів, успадкованих з материнського типу і обумовлених генами, локалізованими в Х-хромосомі Drosophila melanogaster: tin (cinnamon), dor (deep orange), amx (almondex), fu (fused) і r (rudimentary) . Всі ці ознаки, крім того що вони успадковуються за материнському типу, викликають у дорослих особин помітні морфологічні відхилення, за якими вони і отримали свої барвисті назви. Гемізиготність самці, що володіють будь-якої однієї з цих мутацій, життєздатні і фертильності, так само як і гетерозиготні самки. Схрещуючи мутантних самців з гетерозиготними самками, можна отримати гомозиготних самок, які при схрещуванні з мутантними самцями виявляються зовсім стерильними. Наприклад, самки dor / dor продукують яйця, розвиток яких припиняється на стадії гаструляції. Інші чотири мутації також викликають загибель зародків, але на кілька іншій стадії, ніж мутації dor. У характері успадкування всіх цих п'яти мутацій є ще одна аномальна особливість. Схрещуючи гомозиготних мутантних самок з нормальними самцями, можна отримати деяке число нащадків. Все це - гетерозиготні самки, що розвинулися з яєць, запліднених сперматозоїдом, який несе Х-хромосому. Жоден самець не виживає. Мабуть, присутність алеля дикого типу розглянутого гена може трохи знизити дефектність яйця, навіть якщо цей алель вноситься сперматозоїдом. Це, звичайно, має на увазі, що принаймні частина генома зиготи активна під час гаструляції.
Мутації, що зачіпають органогенез
Як ми переконалися вище, події, що відбуваються на ранніх стадіях розвитку, в значній мірі залежать від інформації, що поставляється материнським організмом. Однак приблизно до часу гаструляції важливу роль у подальшому розвитку починає грати генетична інформація самого зародка, і організм набуває можливість контролювати свою долю. Для морфогенетичних подій, наступних за формуванням бластодерми, необхідний синтез РНК і її трансляція в білок. Про необхідність генетичної інформації зародка можна також судити по великому числу мутацій, що впливають на події, що відбуваються після гаструляції, і вказують, таким чином, на існування генів, що регулюють ці події. У цих мутацій не спостерігається спадкування за материнському типу.
Як приклад можна скористатися локусом N (Notch) у Drosophila melanogaster. Notch-зчеплена зі статтю домінантна мутація, що є одночасно рецесивною деталлю. Гомозиготні самки (N / N) і гемізиготність самці (N / Y) гинуть на стадії зародка через приблизно 6 годин після запліднення. Цей час відповідає моменту, безпосередньо наступного за гаструляції, коли зародок виконав приблизно четверту частину ембріогенезу. Гістологічні та морфологічні дослідження, проведені Паулсона (Paulson) на цих зародках, показали, що вентральна і латеральна ектодерма, яка зазвичай дає початок епідермісу і нервовим клітинам, утворює тільки клітини, схожі на нейробласти, а епідермісу не утворює зовсім. Тому можна припускати, що локус Notch необхідний для диференціювання із зародкової ектодерми нервової тканини на противагу епідермальної. Виявилося, однак, що це дещо спрощене пояснення. Шелленберджер (Shellenbarger) і його співробітники виділили з локусу Notch температурочувствітельний аллель і охарактеризували його. Мухи, що містять цей алель, при температурі 22 ° С розвиваються нормально, тоді як при 29 ° С спостерігається описана вище загибель зародків. В експериментах із зрушеннями температур, подібних розглянутим на початку цієї глави для мутантів shibire, було встановлено, що до дефекту локусу Notch і недостатності продукту цього локусу зародок чутливий не тільки в цей ранній період ембріогенезу. За допомогою короткочасних підвищень температури були виявлені ще три періоди, коли мутантному організму життєво необхідна нормальна активність локусу Notch. Впливу неперміссівной температури на личинок другого або третього віку або на лялечок приводили до летального результату. Більш того, короткочасні впливу (pulses) в певні періоди третій личинкової стадії або на стадії лялечки викликали такі ж рубці на очах і дефекти щетинок, як у мутантів shibire. Тому, подібно shibire, мутація Notch має набагато більш широким дією, ніж можна було б очікувати на підставі її головного фенотипического прояви. Всі структури, на які вона діє, ектодермального походження, і в своїх подальших експериментах з гінандроморфамі Шелленберджеру вдалося показати, що спостерігаються морфологічні дефекти автономні і притаманні тільки ектодермальних клітинам. Таким чином, знову, як і у випадку мутацій shibire, створюється враження, що один і той самий продукт мутанта Notch необхідний різних клітин ектодермального походження протягом кількох дискретних періодів на всьому протязі розвитку. Слід також зазначити, що для завершення одного і того ж набору онтогенетичних подій необхідні два різних гена, Notch + і shibire +, і що відсутність того чи іншого з них призводить до дивно схожому комплексу порушень. У будинкової миші (Mus musculus) є один складний ген, Т-локус, який багато в чому схожий з тільки що описаної системою Notch. Перший аллель цього локусу був описаний як аутосомний домінантний алель, названий Brachyury (Т). У мишей, гетерозиготних по цьому гену, Т / +, хвости короткі. У гомозиготному стані (Т / Т) цей ген летальний і зародки гинуть внутрішньоутробно. Незабаром після виявлення цієї домінантною мутації було встановлено, що нащадки від схрещування гетерозигот (Т / +) з мишами дикого типу часто зовсім позбавлені хвоста. Виявилося, що ці безхвості миші - результат рецесивних алелей Т-локусу, часто зустрічаються в природних популяціях мишей. Отже, ці безхвості миші мали генотип T / t. Від схрещувань між такими гетерозиготними мишами T / t були отримані безхвості миші, що розмножуються в чистоті. Пізніше було показано, що це обумовлено «збалансованою системою леталей». Як виявилося, серед нащадків від схрещування гетерозигот летальними були не тільки гомозиготи Т / Т, чого слід було очікувати, але й гомозиготи t / t. Таким чином, виживали лише гетерозиготи T / t, які й давали наступне покоління. Ця інтригуюча ситуація була вивчена як генетично, так і ембріологічних в ряді витончених робіт Денна (Dunn), його учнів Беннета (Bennett) і Глюксон-Велша (Gluechsohn-Waelsch).
У результаті генетичних досліджень знову отриманих ліній, збалансованих за леталей, було встановлено, що схрещування між безхвостим мишами, які отримали свій рецесивний алель t від різних популяцій, часто давали нормальних нащадків. Зокрема, від схрещування T / t a x T / t b були отримані нормальні і безхвості нащадки в співвідношенні 2:1. Можна показати, що нащадки з нормальними хвостами мають генотип t a / t b. Таким чином, цей генотип був не тільки нелетальної, але й нормальним морфологічно. Ще одна особливість цього локусу була виявлена при схрещуваннях між самими лініями, збалансованими по літав ям. Зазвичай схрещування гетерозиготи T / t a з такою ж гетерозигот дає тільки безхвостих нащадків. Однак зрідка (1:500 - 1:1000) серед нащадків зустрічаються миші з нормальними хвостами. Ці нормальні миші майже завжди виходять в результаті рідкісної генетичної рекомбінації у 17-й хромосомі, в ділянці, відповідному локусу Т або примикає до нього. Можна показати, що наявність хвоста у цих реком-бінантних нащадків обумовлено тим, що одночасно з рекомбінацією відбулося перетворення початкового алелі t a в новий алель t x, який комплементарний аллелю t a таким же чином, як деякі t-алелі, що відбуваються від мишей дикого типу, комплементарні один одного. Різниця, звичайно, полягає в тому, що t x в даному випадку безпосередньо пов'язаний з t a своїм походженням. Було показано, що таке перетворення одного алеля t в інші комплементарні типи відбувається з більшістю виділених рецесивів. Деякі виникають при цьому алелі, наприклад t x, можуть у свою чергу за допомогою того ж механізму перетворитися в іншій комплементарний аллель, наприклад t y. Таке перетворення одного рецесивного алеля t в іншій приводить до утворення ряду поступово переходять один в іншій алелів, а в кінцевому результаті до створення так званих t viable, або t v, алелів. Всі ці останні алелі нелетальних, і безхвостий фенотип експресується тільки у разі гетерозигот Т / t v; у особин t v / t v хвости нормальні. Ще один клас рецесивних t-мутацій - це полулеталі, життєздатність яких коливається від 2 до 51% нормальної. Як і повністю летальні алелі, вони шляхом поступових перетворень дають t v-типи. Комплементарні схрещування (T / t a x T / t b) всіх як природних, так і отриманих експериментально рецесивних алелей показали, що 111 існуючих мутацій розпадаються на 8 окремих груп, причому жодна з них не комплементарна Т-алелей. Кількість членів у всіх групах різна - від одного в групі (t w73 до 66 у групі алелів t v. З п'яти домінантних Т-мутацій одна була викликана впливом рентгенівських променів, а всі інші мутації, виявлені в цьому локусі, мабуть, виникли спонтанно.
Ми розглянули кілька особливостей цього складного ряду генетичних дефектів, пов'язаних між собою або тим, що вони комплементарні і визначаються сусідніми локусами, або тим, що вони відбуваються один від одного. Перейдемо тепер до ембріологічним особливостям експресії складного локусу.
Кожна з восьми комплементарних груп обумовлює різного роду дефекти, які у період від ранніх до пізніх стадій розвитку зародка. Морфологічні прояви цих дефектів представлені на рис. 7-10 і 7-11. Найбільш ранні дефекти виявлені у зародків, гомозиготних по аллелю t 12. Запліднення і ділення зиготи призводять до утворення кулястої маси клітин, званої морули. Перша ознака клітинної диференціювання у мишей спостерігається при переході від цієї морули до наступної стадії - бластоцисти, що складається з трофобласта (трофектодерми) і внутрішньої клітинної маси. Гомозиготні t 12-зародки не досягають цієї стадії і недиференційовані «морули» гинуть, не імплантіруясь в стінку матки, на відміну від нормальних зародків, які роблять це приблизно на 4-й день після запліднення. Крім того, t 12-клітини, мабуть, автономні у своєму летальний дії. Химери, що містять ембріональні клітини t 12 і нормальні ембріональні клітини, летальні, і їхній розвиток не заходить далі тієї стадії, на якій гинуть зародки t 12. Тому мутація t 12, мабуть, зачіпає локус, необхідний для першого кроку в диференціювання мишачого зародка - виникнення трофобласта, з якого в кінцевому підсумку формуються хоріон і інші характерні для всіх плацентарних ссавців позазародкові оболонки, які утворюються з зиготи.
Мутації, що впливають на розвиток певних органів
У той час як локус Т надає, мабуть, самі різноманітні дії на весь розвиток ектодерми, існують мутації, що викликають більш специфічні дефекти. Прикладом служить мутація cardiac lethal (с) у аксолотля Ambystoma mexicanum. Ця мутація була вперше виявлена і досліджена Хемфрі (Humphrey). Хемфрі встановив, що мутація з успадковується як простий аутосомний рецесивна ознака, так що при схрещуванні двох гетерозиготних особин (з / +) 25% нащадків гине на ранніх стадіях личинкових, незабаром після вилуплення. Ці мутантні особини плавають, як нормальні личинки, але вони роздуті переповнює їх рідиною, а травна система і зябра у них недорозвинені. Первинна причина цих дефектів - порушення розвитку серця і його нездатність до скорочень. Тому у мутантних личинок відсутній кровообіг, а дихають вони, ймовірно, шляхом дифузії через шкіру, що дає їм можливість проіснувати лише протягом обмеженого періоду часу. Як показав Хемфрі шляхом зрощування нормального і мутантного зародків, це порушення розвитку серця носить автономний характер.
У мутантного і нормального зародків, узятих до закладки серця, видаляли по шматочку тканини з бічних поверхонь тіла. Потім зародків з'єднували за місцем рани і давали їм зростися. У тих випадках, коли такі зрощені особини завершували розвиток, було встановлено, що нормальний партнер послаблював роздутість і інші дефекти зародка с / с, даючи йому можливість вижити. Проте серце мутантного партнера назавжди залишалося простий трубкою, нездатною до скорочень, і кровообіг мутанта цілком забезпечував нормальний партнер. Встановлено, що у хребетних багато органів, у тому числі серце, розвиваються в результаті певних індукційних взаємодій, що відбуваються під час розвитку. Зокрема, Джекобсон і Дункан (Jacobson, Duncan) показали, що у хвостатих амфібій розвиток серця з мезодермальних зачатків індукується головним ділянкою ентодерми. Причиною того, що особинам с / з не вдається утворити серце, може бути нездатність головного ділянки ентодерми індукувати цей процес або ж нездатність серцевої мезодерми реагувати на індуктор. Для того щоб з'ясувати, яка з цих двох причин викликає порушення розвитку, Хемфрі пересаджував нормальну серцеву мезодерму с / с-реципієнтам, а мезодерму с / с-мутантів - нормальним реципієнтам. Виявилося, що мезодерма с / с здатна утворити скорочувалося серце під індукційним впливом нормального головного ділянки ентодерми, тоді як мутантні зародки не можуть забезпечити розвиток нормального серця. Ці результати можна інтерпретувати як вказівку на відсутність індукційної активності головного ділянки ентодерми у мутанта с / с. Проте можливо також, що мутантні особини активно пригнічують формування серця. Експерименти, проведені Леманскі (Lemanski) і його співробітниками, роблять останнє припущення менш імовірним. Ці автори вирощували in vitro мезодермальні зачатки серця мутантних і нормальних зародків. У використаних ними умовах в нормальної серцевої мезодерми відбувалися сильні скорочення, а в мутантної їх не було. Якщо вважати, що скорочення мутантної тканини придушувалися in situ, то вирощування in vitro повинно було зняти цей вплив. Більш того, при спільному культивуванні мезодерми мутанта з / с і головного ділянки ентодерми нормального зародка в мутантної тканини починалися скорочення; це показує, що мутантна мезодерма здатна нормально реагувати на відповідне індукційне вплив. Таким чином, ген «cardiac lethal», очевидно, обумовлює нездатність головного ділянки ентодерми забезпечити індукційний сигнал, який запускає диференціювання серця з його мезодермального зачатка.
Загибель клітин у процесі нормального розвитку
Дегенерація вольфові проток у процесі розвитку особин жіночої статі і мюллерових каналів у особин чоловічої статі - приклади наявності структур, які спочатку розвиваються, а потім піддаються некрозу. Ці процеси, подібно до всіх інших аналізованих тут онтогенетическим подіям, знаходяться під контролем генів. Специфічним прикладом служить розвиток кінцівок у чотириногих. У курчати нирки кінцівок закладаються у вигляді латеральних потовщень соматоплеври приблизно на 55-й годині розвитку. Ці нирки виростають з тіла зародка у вигляді виступів, покритих ектодерми і заповнених мезодермальной тканиною. У міру продовження зростання починають проступати контури кінцівки, будь то крило або нога. Процес формування контурів супроводжується відмиранням клітин в ряді мезодермальних ділянок кінцівки. На ранніх стадіях утворення нирки кінцівки ділянки некрозу можна виявити за допомогою деяких прижиттєвих барвників; такі ділянки є і на передньому, і на задньому краях нирки, там, де вона з'єднується зі стінкою тіла, а також у центрі нирки. Ці три ділянки називаються відповідно передній і задній некротичними зонами і темними плямами. Передня і задня зони забезпечують формування контурів проксимальних областей кінцівки, а темна пляма - відділення великої гомілкової кістки від малої в нозі і променевої від ліктьовий - в крилі. Те, що відбувається на більш пізніх стадіях розвитку кінцівки поділ пальців супроводжується некрозом міжпальцевих ділянок.
Сондерс і Фаллон (Saunders, Fallen), вивчаючи задню некротичну зону (ЗНЗ) нирки крила курчати, виявили кілька цікавих особливостей цієї групи клітин. Максимальної протяжності ЗНЗ досягає на 96-й годині розвитку; до цього часу гине 1500-2000 клітин. Ці клітини фагоцитуються популяцією з майже 150 макрофагів. Якщо мезодерму проспективної ЗНЗ витягти з нирки крила за 40 год до того, як стає помітним некроз, і пересадити її на бічну поверхню тіла реципієнта, вона все одно гине і то в ті ж терміни. Терміни некротизації і загибелі закладені в самих клітинах ЗНЗ і не залежать від віку реципієнта. Однак мезодермальні клітини, які знаходяться в нирці кінцівки, яка примикає до експлантірованной ЗНЗ, не гинуть. Тому можна думати, що клітини ЗНЗ володіють механізмом, що отримав назву «внутрішній годинник смерті». Цей годинник запускають механізм загибелі клітин на дуже ранніх стадіях розвитку кінцівки, після чого клітини йдуть за визначеним ним шляху. Хід цього годинника, проте, до деякої міри звернемо. Якщо ЗНЗ пересадити на дорсальную поверхня нирки крила, то її клітини не гинуть. Причину цього вивчали, вирощуючи клітини ЗНЗ разом з різними іншими фрагментами мезодерми. Вирощування мезодерми з ЗНЗ з соматичною мезодермою призводить до такого ж результату, як пересадка її in vitro на бічну поверхню зародка-реципієнта: клітини ЗНЗ гинуть в належні терміни. Якщо, проте, ЗНЗ культивувати з дорсальной мезодермою крила, то вона не гине. Створюється враження, що мезодерма з ненекротіческой області крила захищає ЗНЗ від загибелі, зупиняючи «годинник смерті». Це було підтверджено експериментами, в яких клітини ЗНЗ спочатку пересаджували на дорсальную поверхня нирки крила, а потім позбавляли їх захисних впливів дорсальной мезодерми крила, видаляючи їх з місця пересадки через різні терміни після того, як за «годинах смерті» вони повинні були б загинути. Будучи видалені з місця пересадки, ці клітини гинули; виживали тільки ті з них, яких утримували in vitro в умовах захисту не менше 6 днів. До цього часу «годинник» зовсім зупинялися і клітини ЗНЗ виживали, навіть за відсутності дорсальной мезодерми крила. Таким чином, загибель клітин, що відбувається в проксимальних частинах крила, являє собою результат дії двох чинників: якихось незалежних від решти організму клітинних годин, що запускаються в певній групі клітин, і місця розташування цих клітин відносно решти мезодерми кінцівки. Аналіз загибелі клітин у міжпальцевих ділянках дозволив виявити ще один рівень регуляції. Загибель клітин у цих ділянках лапи качки невелика, і в результаті між другим, третім і четвертим пальцями утворюються перетинки. У проміжку між першим і другим пальцями, де відбувається некроз, перетинки немає. Сондерс і Фаллон створювали химери, з'єднуючи мезодерму з нирки ноги качки з ектодерми курчати і навпаки. Такі гібридні нирки ноги вони пересаджували потім на бічну поверхню тіла курячого зародка, який служив реципієнтом, і спостерігали за некрозом міжпальцевих клітин. В обох випадках картина некрозу відповідала тому, що характерно для качки. Звідси можна зробити висновок, що качина ектодерма, подібно мезодерми дорсальній поверхні крила, може пригнічувати некроз, спостережуваний зазвичай при розвитку ноги курчати. Однак ектодерма курячого зародка не індукує некроз в качиної мезодерма. Можливо, тому, що регулювання некрозу в міжпальцевих ділянках відбувається таким же чином, як у ЗНЗ; тобто що це автономна особливість межпальцевой мезодерми, яка може проявитися або не проявитися в залежності від середовища, в якій опиняться презумптівние некротичні клітини.
Гени, що вступають у дію на більш пізніх стадіях розвитку і в процесі росту
Ясно, що мутації генів, безпосередньо визначають морфогенетичні шляху, особливо тих генів, які діють на ранніх стадіях, можуть викликати надзвичайно різкі зміни розвитку. Однак існують також гени, що діють на більш пізніх стадіях, і, хоча ці гени впливають на загальну морфологію даного організму, воно в багатьох випадках не тягне за собою явних шкідливих наслідків. До таких генам відносяться гени, які контролюють особливості росту організму після становлення загальної морфології і органогенезу. Вони були виявлені за експресією мутацій, які впливають на дію гормонів, що призводить до гігантизму або карликовості. Зміни форми (наприклад, відносних розмірів кінцівок) можуть бути результатом змін характеру росту, що викликаються плейотропних ефектів, які супроводжують основний гормональний ефект мутації. Зміни такого типу безсумнівно приводили до еволюційних змін, проте подібні пізні зміни розвитку не викликали корінних перебудов морфології. Незважаючи ні на що, карликовий слон - це все-таки безсумнівно слон. Відома, проте, одна мутація, що змінює розміри організму, яка демонструє пластичність процесу розвитку і заслуговує тому особливої уваги. Це - мутація gt (giant) у Drosophila melanogaster. Цей зчеплений з підлогою рецесивна ознака був вперше виявлений Бріджесом (Bridges) і Габерчевскі (Gaberchevsky) в 1928 р. Весь процес розвитку дрозофіли - від запліднення до досягнення статевої зрілості - зазвичай займає 10 днів. У мутантів gt цей процес триває на 2-5 днів довше. Утворені при цьому особини морфологічно не відрізняються від звичайних мух, але вони вдвічі більші. Спосіб виникнення цієї зміни становить значний інтерес. Розвиток мух gt протікає нормально протягом усього ембріонального періоду і аж до наближення личинок до кінця третього віку. Однак у той момент, коли нормальні особини заляльковуються і починають метаморфоз, особини gt продовжують залишатися в личинковому стані. Саме на личинкових стадіях і на початку стадії лялечки відбувається проліферація імагінальних дисків - клітин, призначених для формування тканин дорослої мухи, а від числа цих клітин залежать розміри імаго. У личинок gt протягом цього розтягнутого періоду личинкового розвитку, мабуть, відбувається щонайменше одне додаткове клітинний розподіл. Про це можна судити тому, що ті клітини личинки, які політенні (наприклад, клітини слинних залоз), беруть участь принаймні в одному, а іноді й у двох додаткових циклах синтезу ДНК. Личинки gt після цього 2-5-денного додаткового періоду росту утворюють лялечку, яка приблизно вдвічі більші за звичайну. Потім відбувається метаморфоз і після дещо видовженою стадії лялечки з'являється на світ морфологічно нормальна доросла особина подвійного розміру. Отже, комаха здатна регулювати свій розвиток, так що, незважаючи на явну додаткову проліферацію, передуючу диференціювання, ніяких додаткових елементів (органів) не утворюється. В еволюції ранніх подій онтогенезу у покривників і нижчих хордових. У цих організмів число і терміни поділів дроблення змінювалися в залежності від відносного значення личинкової стадії в різних видів.
Це призвело до того, що у різних видів частка маси раннього зародка, що бере участь в утворенні спеціалізованих личинкових органів, різна. Звідси випливає, що дві абсолютно різні морфогенетичні системи здатні узгоджено зробити великі зміни і створити цілком інтегрований організм. До інших генів, що діють в кінці розвитку, відносяться гени, що регулюють розподіл продукуються пігментів по поверхні тіла і їх кількість; ефекти мінливості цих генів абсолютно очевидні в природних популяціях більшості організмів. Хоча такого роду зміни безсумнівно мають важливе значення для процесів відбору, а тим самим і для еволюції, вони, ймовірно, несуттєві для морфологічних змін per se.
Наш основний принцип полягає в тому, що онтогенез знаходиться під контролем генів. Як було показано, цей контроль здійснюється на декількох рівнях. За допомогою мутацій, успадкованих з материнського типу, можна продемонструвати генетичну регуляцію організації яєць у таких видів, як дрозофіла, у якої ранній розвиток має мозаїчний характер. Інші мутації, такі як tailless у миші або cardiac і eyeless у аксолотля, вказують на існування генетичного контролю, що діє на наступних стадіях розвитку, точно так само як для належного функціонування каскадних онтогенетичних подій, що призводять до диференціювання основних зародкових листків, необхідна специфічна генетична інформація, а для органогенезу - відповідні індукційні взаємодії. Нарешті, генетичні зміни можуть змінювати події, що відбуваються на пізніх стадіях розвитку, в тому числі процеси росту і пігментацію, а тим самим і дефінітивних форму дорослого організму. Еволюційний процес може відбирати зміни експресії генів, що грають важливу роль в розвитку, і створювати таким чином нові морфогенетичні шляху. Необхідно, проте, підкреслити відмінність між генами цього класу і природою мутацій (змін експресії), важливих для еволюційного зміни. Велика частина обговорювали у цій главі мутацій має різко вираженими і згубними ефектами. Їх значення полягає в тому, що вони дозволяють виявити генетичні елементи, що лежать в основі деяких процесів розвитку. У морфологічної ж еволюції, цілком ймовірно, беруть участь мутації, які мають менш ясно вираженим ефектом. Всі мутації, які змінюють строки або тривалість подій або силу взаємодій, будуть приводити до еволюційної модифікації шляхів розвитку. Для становлення структури і для морфогенезу вирішальне значення мають також гени і мутаційні зміни зовсім іншого типу. Їм присвячені інші глави.
Ми розглянули кілька особливостей цього складного ряду генетичних дефектів, пов'язаних між собою або тим, що вони комплементарні і визначаються сусідніми локусами, або тим, що вони відбуваються один від одного. Перейдемо тепер до ембріологічним особливостям експресії складного локусу.
Кожна з восьми комплементарних груп обумовлює різного роду дефекти, які у період від ранніх до пізніх стадій розвитку зародка. Морфологічні прояви цих дефектів представлені на рис. 7-10 і 7-11. Найбільш ранні дефекти виявлені у зародків, гомозиготних по аллелю t 12. Запліднення і ділення зиготи призводять до утворення кулястої маси клітин, званої морули. Перша ознака клітинної диференціювання у мишей спостерігається при переході від цієї морули до наступної стадії - бластоцисти, що складається з трофобласта (трофектодерми) і внутрішньої клітинної маси. Гомозиготні t 12-зародки не досягають цієї стадії і недиференційовані «морули» гинуть, не імплантіруясь в стінку матки, на відміну від нормальних зародків, які роблять це приблизно на 4-й день після запліднення. Крім того, t 12-клітини, мабуть, автономні у своєму летальний дії. Химери, що містять ембріональні клітини t 12 і нормальні ембріональні клітини, летальні, і їхній розвиток не заходить далі тієї стадії, на якій гинуть зародки t 12. Тому мутація t 12, мабуть, зачіпає локус, необхідний для першого кроку в диференціювання мишачого зародка - виникнення трофобласта, з якого в кінцевому підсумку формуються хоріон і інші характерні для всіх плацентарних ссавців позазародкові оболонки, які утворюються з зиготи.
Мутації, що впливають на розвиток певних органів
У той час як локус Т надає, мабуть, самі різноманітні дії на весь розвиток ектодерми, існують мутації, що викликають більш специфічні дефекти. Прикладом служить мутація cardiac lethal (с) у аксолотля Ambystoma mexicanum. Ця мутація була вперше виявлена і досліджена Хемфрі (Humphrey). Хемфрі встановив, що мутація з успадковується як простий аутосомний рецесивна ознака, так що при схрещуванні двох гетерозиготних особин (з / +) 25% нащадків гине на ранніх стадіях личинкових, незабаром після вилуплення. Ці мутантні особини плавають, як нормальні личинки, але вони роздуті переповнює їх рідиною, а травна система і зябра у них недорозвинені. Первинна причина цих дефектів - порушення розвитку серця і його нездатність до скорочень. Тому у мутантних личинок відсутній кровообіг, а дихають вони, ймовірно, шляхом дифузії через шкіру, що дає їм можливість проіснувати лише протягом обмеженого періоду часу. Як показав Хемфрі шляхом зрощування нормального і мутантного зародків, це порушення розвитку серця носить автономний характер.
У мутантного і нормального зародків, узятих до закладки серця, видаляли по шматочку тканини з бічних поверхонь тіла. Потім зародків з'єднували за місцем рани і давали їм зростися. У тих випадках, коли такі зрощені особини завершували розвиток, було встановлено, що нормальний партнер послаблював роздутість і інші дефекти зародка с / с, даючи йому можливість вижити. Проте серце мутантного партнера назавжди залишалося простий трубкою, нездатною до скорочень, і кровообіг мутанта цілком забезпечував нормальний партнер. Встановлено, що у хребетних багато органів, у тому числі серце, розвиваються в результаті певних індукційних взаємодій, що відбуваються під час розвитку. Зокрема, Джекобсон і Дункан (Jacobson, Duncan) показали, що у хвостатих амфібій розвиток серця з мезодермальних зачатків індукується головним ділянкою ентодерми. Причиною того, що особинам с / з не вдається утворити серце, може бути нездатність головного ділянки ентодерми індукувати цей процес або ж нездатність серцевої мезодерми реагувати на індуктор. Для того щоб з'ясувати, яка з цих двох причин викликає порушення розвитку, Хемфрі пересаджував нормальну серцеву мезодерму с / с-реципієнтам, а мезодерму с / с-мутантів - нормальним реципієнтам. Виявилося, що мезодерма с / с здатна утворити скорочувалося серце під індукційним впливом нормального головного ділянки ентодерми, тоді як мутантні зародки не можуть забезпечити розвиток нормального серця. Ці результати можна інтерпретувати як вказівку на відсутність індукційної активності головного ділянки ентодерми у мутанта с / с. Проте можливо також, що мутантні особини активно пригнічують формування серця. Експерименти, проведені Леманскі (Lemanski) і його співробітниками, роблять останнє припущення менш імовірним. Ці автори вирощували in vitro мезодермальні зачатки серця мутантних і нормальних зародків. У використаних ними умовах в нормальної серцевої мезодерми відбувалися сильні скорочення, а в мутантної їх не було. Якщо вважати, що скорочення мутантної тканини придушувалися in situ, то вирощування in vitro повинно було зняти цей вплив. Більш того, при спільному культивуванні мезодерми мутанта з / с і головного ділянки ентодерми нормального зародка в мутантної тканини починалися скорочення; це показує, що мутантна мезодерма здатна нормально реагувати на відповідне індукційне вплив. Таким чином, ген «cardiac lethal», очевидно, обумовлює нездатність головного ділянки ентодерми забезпечити індукційний сигнал, який запускає диференціювання серця з його мезодермального зачатка.
Загибель клітин у процесі нормального розвитку
Дегенерація вольфові проток у процесі розвитку особин жіночої статі і мюллерових каналів у особин чоловічої статі - приклади наявності структур, які спочатку розвиваються, а потім піддаються некрозу. Ці процеси, подібно до всіх інших аналізованих тут онтогенетическим подіям, знаходяться під контролем генів. Специфічним прикладом служить розвиток кінцівок у чотириногих. У курчати нирки кінцівок закладаються у вигляді латеральних потовщень соматоплеври приблизно на 55-й годині розвитку. Ці нирки виростають з тіла зародка у вигляді виступів, покритих ектодерми і заповнених мезодермальной тканиною. У міру продовження зростання починають проступати контури кінцівки, будь то крило або нога. Процес формування контурів супроводжується відмиранням клітин в ряді мезодермальних ділянок кінцівки. На ранніх стадіях утворення нирки кінцівки ділянки некрозу можна виявити за допомогою деяких прижиттєвих барвників; такі ділянки є і на передньому, і на задньому краях нирки, там, де вона з'єднується зі стінкою тіла, а також у центрі нирки. Ці три ділянки називаються відповідно передній і задній некротичними зонами і темними плямами. Передня і задня зони забезпечують формування контурів проксимальних областей кінцівки, а темна пляма - відділення великої гомілкової кістки від малої в нозі і променевої від ліктьовий - в крилі. Те, що відбувається на більш пізніх стадіях розвитку кінцівки поділ пальців супроводжується некрозом міжпальцевих ділянок.
Сондерс і Фаллон (Saunders, Fallen), вивчаючи задню некротичну зону (ЗНЗ) нирки крила курчати, виявили кілька цікавих особливостей цієї групи клітин. Максимальної протяжності ЗНЗ досягає на 96-й годині розвитку; до цього часу гине 1500-2000 клітин. Ці клітини фагоцитуються популяцією з майже 150 макрофагів. Якщо мезодерму проспективної ЗНЗ витягти з нирки крила за 40 год до того, як стає помітним некроз, і пересадити її на бічну поверхню тіла реципієнта, вона все одно гине і то в ті ж терміни. Терміни некротизації і загибелі закладені в самих клітинах ЗНЗ і не залежать від віку реципієнта. Однак мезодермальні клітини, які знаходяться в нирці кінцівки, яка примикає до експлантірованной ЗНЗ, не гинуть. Тому можна думати, що клітини ЗНЗ володіють механізмом, що отримав назву «внутрішній годинник смерті». Цей годинник запускають механізм загибелі клітин на дуже ранніх стадіях розвитку кінцівки, після чого клітини йдуть за визначеним ним шляху. Хід цього годинника, проте, до деякої міри звернемо. Якщо ЗНЗ пересадити на дорсальную поверхня нирки крила, то її клітини не гинуть. Причину цього вивчали, вирощуючи клітини ЗНЗ разом з різними іншими фрагментами мезодерми. Вирощування мезодерми з ЗНЗ з соматичною мезодермою призводить до такого ж результату, як пересадка її in vitro на бічну поверхню зародка-реципієнта: клітини ЗНЗ гинуть в належні терміни. Якщо, проте, ЗНЗ культивувати з дорсальной мезодермою крила, то вона не гине. Створюється враження, що мезодерма з ненекротіческой області крила захищає ЗНЗ від загибелі, зупиняючи «годинник смерті». Це було підтверджено експериментами, в яких клітини ЗНЗ спочатку пересаджували на дорсальную поверхня нирки крила, а потім позбавляли їх захисних впливів дорсальной мезодерми крила, видаляючи їх з місця пересадки через різні терміни після того, як за «годинах смерті» вони повинні були б загинути. Будучи видалені з місця пересадки, ці клітини гинули; виживали тільки ті з них, яких утримували in vitro в умовах захисту не менше 6 днів. До цього часу «годинник» зовсім зупинялися і клітини ЗНЗ виживали, навіть за відсутності дорсальной мезодерми крила. Таким чином, загибель клітин, що відбувається в проксимальних частинах крила, являє собою результат дії двох чинників: якихось незалежних від решти організму клітинних годин, що запускаються в певній групі клітин, і місця розташування цих клітин відносно решти мезодерми кінцівки. Аналіз загибелі клітин у міжпальцевих ділянках дозволив виявити ще один рівень регуляції. Загибель клітин у цих ділянках лапи качки невелика, і в результаті між другим, третім і четвертим пальцями утворюються перетинки. У проміжку між першим і другим пальцями, де відбувається некроз, перетинки немає. Сондерс і Фаллон створювали химери, з'єднуючи мезодерму з нирки ноги качки з ектодерми курчати і навпаки. Такі гібридні нирки ноги вони пересаджували потім на бічну поверхню тіла курячого зародка, який служив реципієнтом, і спостерігали за некрозом міжпальцевих клітин. В обох випадках картина некрозу відповідала тому, що характерно для качки. Звідси можна зробити висновок, що качина ектодерма, подібно мезодерми дорсальній поверхні крила, може пригнічувати некроз, спостережуваний зазвичай при розвитку ноги курчати. Однак ектодерма курячого зародка не індукує некроз в качиної мезодерма. Можливо, тому, що регулювання некрозу в міжпальцевих ділянках відбувається таким же чином, як у ЗНЗ; тобто що це автономна особливість межпальцевой мезодерми, яка може проявитися або не проявитися в залежності від середовища, в якій опиняться презумптівние некротичні клітини.
Гени, що вступають у дію на більш пізніх стадіях розвитку і в процесі росту
Ясно, що мутації генів, безпосередньо визначають морфогенетичні шляху, особливо тих генів, які діють на ранніх стадіях, можуть викликати надзвичайно різкі зміни розвитку. Однак існують також гени, що діють на більш пізніх стадіях, і, хоча ці гени впливають на загальну морфологію даного організму, воно в багатьох випадках не тягне за собою явних шкідливих наслідків. До таких генам відносяться гени, які контролюють особливості росту організму після становлення загальної морфології і органогенезу. Вони були виявлені за експресією мутацій, які впливають на дію гормонів, що призводить до гігантизму або карликовості. Зміни форми (наприклад, відносних розмірів кінцівок) можуть бути результатом змін характеру росту, що викликаються плейотропних ефектів, які супроводжують основний гормональний ефект мутації. Зміни такого типу безсумнівно приводили до еволюційних змін, проте подібні пізні зміни розвитку не викликали корінних перебудов морфології. Незважаючи ні на що, карликовий слон - це все-таки безсумнівно слон. Відома, проте, одна мутація, що змінює розміри організму, яка демонструє пластичність процесу розвитку і заслуговує тому особливої уваги. Це - мутація gt (giant) у Drosophila melanogaster. Цей зчеплений з підлогою рецесивна ознака був вперше виявлений Бріджесом (Bridges) і Габерчевскі (Gaberchevsky) в 1928 р. Весь процес розвитку дрозофіли - від запліднення до досягнення статевої зрілості - зазвичай займає 10 днів. У мутантів gt цей процес триває на 2-5 днів довше. Утворені при цьому особини морфологічно не відрізняються від звичайних мух, але вони вдвічі більші. Спосіб виникнення цієї зміни становить значний інтерес. Розвиток мух gt протікає нормально протягом усього ембріонального періоду і аж до наближення личинок до кінця третього віку. Однак у той момент, коли нормальні особини заляльковуються і починають метаморфоз, особини gt продовжують залишатися в личинковому стані. Саме на личинкових стадіях і на початку стадії лялечки відбувається проліферація імагінальних дисків - клітин, призначених для формування тканин дорослої мухи, а від числа цих клітин залежать розміри імаго. У личинок gt протягом цього розтягнутого періоду личинкового розвитку, мабуть, відбувається щонайменше одне додаткове клітинний розподіл. Про це можна судити тому, що ті клітини личинки, які політенні (наприклад, клітини слинних залоз), беруть участь принаймні в одному, а іноді й у двох додаткових циклах синтезу ДНК. Личинки gt після цього 2-5-денного додаткового періоду росту утворюють лялечку, яка приблизно вдвічі більші за звичайну. Потім відбувається метаморфоз і після дещо видовженою стадії лялечки з'являється на світ морфологічно нормальна доросла особина подвійного розміру. Отже, комаха здатна регулювати свій розвиток, так що, незважаючи на явну додаткову проліферацію, передуючу диференціювання, ніяких додаткових елементів (органів) не утворюється. В еволюції ранніх подій онтогенезу у покривників і нижчих хордових. У цих організмів число і терміни поділів дроблення змінювалися в залежності від відносного значення личинкової стадії в різних видів.
Це призвело до того, що у різних видів частка маси раннього зародка, що бере участь в утворенні спеціалізованих личинкових органів, різна. Звідси випливає, що дві абсолютно різні морфогенетичні системи здатні узгоджено зробити великі зміни і створити цілком інтегрований організм. До інших генів, що діють в кінці розвитку, відносяться гени, що регулюють розподіл продукуються пігментів по поверхні тіла і їх кількість; ефекти мінливості цих генів абсолютно очевидні в природних популяціях більшості організмів. Хоча такого роду зміни безсумнівно мають важливе значення для процесів відбору, а тим самим і для еволюції, вони, ймовірно, несуттєві для морфологічних змін per se.
Наш основний принцип полягає в тому, що онтогенез знаходиться під контролем генів. Як було показано, цей контроль здійснюється на декількох рівнях. За допомогою мутацій, успадкованих з материнського типу, можна продемонструвати генетичну регуляцію організації яєць у таких видів, як дрозофіла, у якої ранній розвиток має мозаїчний характер. Інші мутації, такі як tailless у миші або cardiac і eyeless у аксолотля, вказують на існування генетичного контролю, що діє на наступних стадіях розвитку, точно так само як для належного функціонування каскадних онтогенетичних подій, що призводять до диференціювання основних зародкових листків, необхідна специфічна генетична інформація, а для органогенезу - відповідні індукційні взаємодії. Нарешті, генетичні зміни можуть змінювати події, що відбуваються на пізніх стадіях розвитку, в тому числі процеси росту і пігментацію, а тим самим і дефінітивних форму дорослого організму. Еволюційний процес може відбирати зміни експресії генів, що грають важливу роль в розвитку, і створювати таким чином нові морфогенетичні шляху. Необхідно, проте, підкреслити відмінність між генами цього класу і природою мутацій (змін експресії), важливих для еволюційного зміни. Велика частина обговорювали у цій главі мутацій має різко вираженими і згубними ефектами. Їх значення полягає в тому, що вони дозволяють виявити генетичні елементи, що лежать в основі деяких процесів розвитку. У морфологічної ж еволюції, цілком ймовірно, беруть участь мутації, які мають менш ясно вираженим ефектом. Всі мутації, які змінюють строки або тривалість подій або силу взаємодій, будуть приводити до еволюційної модифікації шляхів розвитку. Для становлення структури і для морфогенезу вирішальне значення мають також гени і мутаційні зміни зовсім іншого типу. Їм присвячені інші глави.