Вступ
Ферменти грають ключову роль в структурі і функціональності харчових продуктів за рахунок модифікації макромолекул у поживних речовинах.
Важливими є як ендогенні ферменти з сировини, так і екзогенні ферменти, що додані як допоміжні засоби для обробки.
У цій главі, насамперед, описується дія екзогенних ферментів, хоча дія ендогенних ферментів також обговорюється, якщо це допомагає зрозуміти дію доданих ферментів. Ферменти мають безліч різних впливів на текстуру і функціональність харчових продуктів. Описуються ефекти, коли додавання ферментів призводить до зміни або збільшення макромолекулярної взаємодії, а не ефекти, які ґрунтуються на зменшенні взаємодії. Наприклад, використання пектинолітичних ферментів для отримання прозорого яблучного соку не розглядається, оскільки пектинолітичні ферменти додаються для того, щоб забезпечити значне зниження макромолекулярної взаємодії.
Цей розділ в першу чергу описує приклади, де ферменти застосовуються безпосередньо в харчовому процесі, а не приклади, де ферменти використовуються для виробництва інгредієнтів з функціональними властивостями, наприклад, виробництва модифікованого крохмалю.
Важливість екзогенних ферментів у модифікації макромолекулярної взаємодії в різних харчових зонах істотно змінюється і залежить від ступеня переробки і структури продуктів. Використання доданих ферментів, очевидно, залежить від деякого ступеня обробки.
Крім того, додані ферменти в основному використовуються для модифікації макромолекулярних взаємодій, де такі взаємодії вже відіграють важливу роль у якості та функціональності немодифікованих продуктів. Хліб і молочні продукти, такі як сир і йогурт, дають набагато кращі можливості для ферментативної модифікації макромолекулярної взаємодії, ніж застосування напоїв, де в більшості випадків застосовуються ферменти для збільшення врожайності і полегшення обробки.
Випічка
Структура і функціональність хлібобулочних виробів полягає в макромолекулярній взаємодії, в якій важливу роль відіграють всі основні класи макромолекул, крохмалю, арабіноксилану, ліпідів і білка. Тому не дивно, що амілолітичні, ксиланолітичні, ліполітичні та білково-модифікуючі ферменти використовуються для поліпшення процесів тіста та якості хліба. Ферменти або додають у борошно перед випічкою, або додають разом з іншими інгредієнтами під час замісу тіста.
Амілолітичні ферменти і черствіння
Хліб поступово стає твердішим, сухішим і менш еластичним з часом. Щоб зрозуміти процес старіння, який називається черствіння, важливо спочатку подивитися на процеси, які відбуваються при желатинування крохмалю під час випічки. Амілоза і амілопектин гідратуються і втрачають кристалічність під час желатинування. Амілопектин, являє собою розгалужену амілоглюканову структуру в якій бічні гілки вирівнюються паралельно в нежелатинізованому крохмалі, втрачає це вирівнювання в менш організованому гідратованому желатинізованому крохмалі. Механізм черствіння добре описаний і викликаний, в першу чергу, послідовною агрегацією, що прогресує до кристалізації амілози і, що більше важливо, амілопектину, при якій бічні гілки амілопектину вирівнюються відносно основи. Крім того, в процесі старіння хліба відіграють роль зміни у клейковині, а також взаємодії крохмалю з іншими основними компонентами борошна (глютеном, арабіноксиланом і ліпідами).
Амілази використовуються для боротьби з черствінням протягом багатьох років. Амілази повинні бути відносно термостійкими, тому що крохмаль повинен желатинізувати, перш ніж ферменти зможуть модифікувати крохмаль. Желатинізація відбувається від 65 до 85°С при нормальних умовах випічки. Типові ендоамілази руйнують як амілозу, так і амілопектин, щоб хліб залишався м'яким, але еластичність не зберігається, і м'якиш, як правило, стає липким. Зовсім інший результат отримує мальтогенна екзоамілаза з Bacillus stearothermophilus, яка має незначну побічну активність ендоамілази. Цей фермент тепер користується широким використанням в хлібопекарській промисловості для отримання м'якості, в поєднанні з підтримуваною еластичністю, протягом 2-3 тижнів. Фермент зменшує черствіння хліба до дуже низького рівня. Цей ефект ще більше виражений у безглютеновом крохмальному хлібі, де було відмічено майже повне усунення черствіння; хороша демонстрація важливості ретроградації крохмалю при черствінні хліба. Основним механізмом мальтогенної екзоамілази є скорочення довжини бічних амілопектинів з нередукційного кінця шляхом виділення в основному мальтози і, в незначних кількостях олігомерів DP-3-7. Ретроградація амілопектину кукурудзи виявляється пропорційною довжині бічних гілок DP 16-30, тому ферментативне скорочення бічних гілок зменшить ретроградність. Основа амілопектину залишається по суті неушкодженою, що, швидше за все, є причиною збереженої еластичності м'якишу, тоді як амілоза зменшується до однорідної молекулярної маси близько 20 000. Розкладання амилози і амілопектину звичайною амілазою і солодовою амілазою Bacillus stearothermophilus ілюструється на малюнку 11.1.
Амілоглікозидази і В-амілази повинні в основному зменшити довжину бічних гілок амілопектину, таких як мальтогенна амілаза. Однак ці ферменти не працюють так ефективно, як мальтогенна амілаза.
МАЛЮНОК 11.1
Деградація амілози та амілопектину за допомогою типової ендоамілази та малтогенної амілази Bacillus stearothermophilus.
Незрозуміло, чи можна це пояснити лише нижчою термостійкістю.
Було висловлено припущення, що крохмально-білкові взаємодії відіграють роль у ферментативному інгібуванні, оскільки зниження крохмалю може зменшити взаємодію між частинками крохмалю та білком. Також було обговорено, чи важливий розмір випущених мальтоолігомерів для отриманого інгібуючого ефекту. Показано, що додавання мальтоолігомерів (ДП 3-8) пригнічує рекристалізацію крохмалю в крохмальних гелях. Також було показано, що додавання мальтоолігомерів зменшує ретроградацію крохмалю в хлібі, але ефект більше залежить від кількості доданих олігомерів, ніж їх розмір. Навпаки, додавання різних олігомерів, включаючи мелізитозу і (1 → 3, 1→ 4) В-глюкан обрані тому, що вони не ферментовані дріжджами, і не впливають на швидкість черствіння.
Ксилазні ефекти
Ксиланази широко використовуються в хлібопекарській промисловості упродовж десятиліть. Вони використовуються як кондиціонери тіста для покращення технологічності тіста, підвищення стійкості до механічних навантажень на стадії тіста, збільшення об'єму хліба, поліпшення структури м'якиша і зниження черствіння.
Борошно містить як водорозчинний арабіноксилан (WE-AX), так і водонерозчинний арабіноксилан (WU-AX). Структурна різниця між ними не до кінця вивчена. Співвідношення арабіноза-ксилоза, як і вміст ферулової кислоти, надзвичайно схожі. Різниця в розчинності води може бути пов'язана зі структурою, розміром і розподілом більш-менш арабінозаміщених областей ксилану. Документально підтверджено, що WE-AX має позитивний, а WU-AX негативний вплив на продуктивність випічки. Прийнято вважати, що переважними ксиланазами для випічки є ксиланази з високим розчинним ефектом на WU-AX в порівнянні з активністю на WE-AX, і переважно з обмеженою деполімеризацією ксиланів.
Існує помітна різниця в специфіці різних ксиланаз для WU-AX в порівнянні з WE-AX, але причина цієї різниці недостатньо зрозуміла. Очевидно, важко пояснити специфічні відмінності, враховуючи, що структурні відмінності між WU-AX і WE-AX погано вивчені. Однак специфіка ксиланази для WU-AX може бути пов'язана з прив'язкою ксиланази до WU-AX.
Вплив частково деградованих ксиланів в процесі випічки вивчено лише частково Зміни WU - AX, які в гіршому випадку утворювали б фізичні бар'єри для розвитку клейковини, може бути частиною пояснення того, чому ксиланази працюють при випічці. Зміни WU - AX також знижує водозв'язуючу здатність ксилана, що призводить до перерозподілу води від ксилана до клейковини, що сприяє формуванню клейковини. Розчинення WU-AX також може бути важливим, оскільки кількість розчинного арабіноксилану збільшується, забезпечуючи посилений позитивний вплив WE-AX. Ефект пов'язаний з зміцненням рідкої плівки, яка оточує бульбашки вуглекислого газу під час бродіння тіста. Цей позитивний ефект може бути пояснений збільшенням в'язкості через утворення вторинного, слабшого ланцюга, що зміцнює ланцюг клейковини шляхом заплутування і, можливо, утворення диефірних містків. Запропонований механізм ксиланази проілюстровано на малюнку 11.2. Цей змінений ксилан відіграє функціональну роль, що підтверджується дослідженнями, які показують, що більші олігомери ксилану мають більший вплив на продуктивність випічки, ніж дрібні. Цей ефект не вивчений і, здається, викликаний іншими факторами, відмінними від окислювального желеутворення або зв'язування води.
Запропоновано можливі взаємодії між ксиланолігомерами, вивільненими під дією ксиланази, та глютеном, на основі збільшення кількості ксилану, зв'язаного з глютеном при використанні ксиланази. Але варіація кількості ксилану, з'єднаного з клейковиною, може просто бути ефектом варіації ефективності промивних процедур при приготуванні клейковини.
Зміцнення глютенового ланцюга: оксидази і трансглютамінази
Газові клітини в тісті оточені глютеновим ланцюгом, який разом з ліпідами та іншими білками на поверхні забезпечує стабільність зростаючих газових клітин під час бродіння. Хімічні окислювачі, такі як бромат, АДА (азодикарбонамід) та аскорбінова кислота, мають широке застосування у зміцненні глютенового ланцюга. Результат є стабільність тіста, збільшення об'єму хліба і поліпшення структури м'якишу.
Механізм аскорбінової кислоти можна пояснити окисленням аскорбінової кислоти до дегідроаскорбінової кислоти ендогенною аскорбатоксидазою, що пояснює, чому ця редукуюча добавка забезпечує ефект окислення. Дегідроаскорбінова кислота потім використовується для окислення метіоніну - що містить трипептид глутатіону глутатіондегідрогеназою (=дегідроазеорбінова кислота редуктаза) до зв'язку з дисульфідним містком. Існує два загальні пояснення дії окисленого глутатіону. Перше заключається в тому, що окислений глутатіон зводиться до глютайону, при утворенні дисульфідних містків в глютеновому ланцюгу, що надає глютену зміцнюючий ефект. Друге пояснення полягає в тому, що окислення глутатіону знижує рівень вільного глутатіону, який в іншому випадку може утворювати дисульфідні містки до глютену, що призводить до ослаблення структури глютену. Відсутність ефекту при випічці з сульфідгідрильною оксидазою, яка окислює глутатіон шляхом утворення дисульфідних містків, здається протилежним цим поширеним поясненням механізму окислення при випічці. Також було запропоновано, що бромат утворює дисульфідні містки або забезпечує дисульфідний обмін через сульфгідрильні проміжні речовини, але ефект випічки бромату сильніше, ніж з більшістю інших хімічних окислювачів, оскільки бромат дає кращу пружність при випіканні (збільшення об'єму під час випічки). Це можна пояснити температурною залежністю окислення бромату, даючи більш пізній і кращий час для окисного ефекту.
Глюкозооксидаза використовується для зміцнення глютену протягом багатьох років, але вона все ще використовується набагато менше, ніж хімічні окислювачі. Були описані інші оксидази, включаючи амінокислотну оксидазу, піранозну оксидазу та нову промислову оксидазу гексози. Глюкозооксидаза перетворює глюкозу в глюконо-бетта
лактон, утворюючи перекис водню; аналогічним чином, перекис водню утворюється іншими окислювачами. Пероксид водню, який утворюється, є активним інгредієнтом, що забезпечує бажаний ефект при випічці. Використання глюкозооксидази або гексооксидази як відомо дозволяє зменшити кількість вільних сульфгідрильних груп в тісті. Вплив на глютен непрямий, оскільки глюкозооксидаза має набагато сильніший вплив на вільні сульфідрилові групи у водорозчинній фракції, виділеній з муки, ніж на сульфгідрилові групи в глютені. Це вказує на дію через проміжні продукти, такі як глутатион або аскорбінова кислота.?????
Також відомо, що перекис водню перетинає ксилани через утворення полімерів ферулової кислоти під дією ендогенної пероксидази, внаслідок чого утворюється гідратований ланцюг, що пояснює, чому глюкозооксидаза дає сухе тісто. Ксилановий ланцюг може сприяти зміцнюючому ефекту за рахунок збільшення в'язкості тіста або, можливо, за рахунок взаємодії з глютеном. Цей подвійний вплив перекису водню як на глютеновий ланцюг, так і на кcилан проілюстровано на рисунку 11.3. Дія на ксилан через утворення ферулової кислоти полімерів може бути поясненням того, чому лактаза, також відома як поперечно зв'язувана ксилана, робить позитивний ефект при випічці. Оскільки як оксидази, так і ксиланази впливають на властивості ксилану, не дивно, що ксиланази та оксидази можуть бути вигідно використані в комбінації. Обидва дають об'ємний ефект, а глюкозооксидаза забезпечує сухість тісту, що протидіє схильності до липкості, викликаної ксиланазами.
Глюкозооксидазу іноді називають замінником бромату. Це є перебільшення, оскільки об'ємний ефект глюкозооксидази нижче, ніж бромату, хоча глюкозооксидаза чудово покращує еластичність тіста. Глюкозооксидаза є швидким окислювачем в порівнянні з броматом, що може пояснити різницю в ефективності.
Враховуючи загальний механізм дії оксидази, грунтований на генерації перекису водню, важко пояснити, чому гексозооксидаза з червоної водорості Chondus crispus описана як ефективніша, ніж широко використовувана глюкозооксидаза з Aspergillus niger, особливо тому, що кисень, швидше за все, є обмежуючим чинником для використання оксидази в дріжджовому ферментованому хлібі.
Трансглутаміназа, яка утворює недисульфідні ковалентні перехресні зв'язки в білках (детальніше розглядається в молочному розділі), також описується як глютен-зміцнюючий фермент для випічки. Трансглютаміназа дає підвищене зв'язування води в тісті, підвищена міцність м'якишу, а також структура м'якишу, яка порівнянна з ефектом аскорбінової кислоти. Ефект відрізняється від ефекту окислювачів, оскільки трансглютаміназа зазвичай не дає такого ж ефекту об'єму в хлібопекарстві. Цей інший тип зміцнення глютену особливо корисний для листкового тіста (круасанів), де фермент дає хороший об'ємний ефект і гарну шарувату структуру продукту. Ферментативне недисульфідне перехресне зв'язування, ймовірно, приверне більше уваги в майбутньому через недавнє відкриття, що дітірозинові зв'язки між молекулами глютену відіграють набагато більшу роль у формуванні глютенового ланцюга, ніж вважалося раніше, що дозволяє припустити те, що тирозиназа може бути потенційним ферментом, яка зміцнює глютен.
Ліпази та стабілізація тіста
Застосування ліполітичних ферментів у хлібопеченні це нова технологія з швидко зростаючим використанням. Вплив ліполітичних ферментів у випічці залежить від специфічності ліпази по відношенню до основних класів ліпідів борошна; неполярні тригліцериди, полярні галактоліпіди та полярні фосфоліпіди. Типові тригліцеридні ліпази використовувалися протягом останнього десятиліття, щоб надати хлібу більшого об'єму і тоншого, м'якшого м'якиша Ступінь цих ефектів залежить від рецептури і типу борошна. Зовсім недавно було відкрито переваги використання нового класу ліпаз з одночасною активністю на тригліцериди, галактоліпіди та фосфоліпіди. Цей вид ліпази забезпечує більше збільшення обсягу, кращу стійкість до механічного впливу на тісто, а також тонку, рівномірну структуру м'якиша. Ці ефекти схожі на ті, що зазвичай використовують емульгатори DATEM (діацетильовані винні ефіри моногліцеридів) і SSL (натрій стеарол лактилацетат). У багатьох випадках цей тип ліпази можна використовувати для заміни емульгатору. Було показано, що збалансована активність відносно галактоліпідів і фосфоліпідів забезпечує найкращий ефект при низькому дозуванні ферменту, тоді як при перевазі ферментами одного з двох полярних ліпідних субстратів потрібно більш високі дозування.
Вважається, що ці ліпази мають широку специфічність, перетворюючи діацилгалактоліпіди (галактозилдигліцериди) в моноацилгалактоліпіди, фосфоліпіди в лізофосфоліпіди, а тригліцериди в ди- та моногліцериди.Більш сильні хлібопекарські властивості полярних ліпідів, що моноацилують, в порівнянні з диаельованими полярними ліпідами загальноприйняті і добре поєднуються з схожістю структури DATEM і SSL. Однак біофізичне пояснення впливу цих моноацильованих полярних ліпідів до кінця не вивчено. Цілком ймовірно, що змінений склад ліпідів надає ліпідному поверхневому шару між газовою і рідкою фазами нижчий поверхневий потенціал, забезпечуючи велику еластичність і стабілізацію для розширення газових клітин, що у свою чергу призводить до поліпшення утримання газу під час бродіння і випічки тіста. Крім того, ймовірно, що зміна білково-ліпідної взаємодії відіграє важливу роль, оскільки білки та білково-ліпідні взаємодії, як відомо, відіграють ключову роль у затримці газу. Білки містяться в мембранах в такій же кількості, як і ліпіди, де було виявлено співвідношення ліпідів і білків 1:1 (за масою). Як відомо полярні ліпіди, особливо лізохітин, покращують міжфазні властивості пуроіндолів які самі по собі чинять сильну тістостабілізуючу дію.
Молочні продукти
Незважаючи на те, що макромолекулярна взаємодія важлива для стабільності міцелія казеїну в молоці, для молока було описано дуже мало застосувань ферментів, що використовують макромолекулярну взаємодію. Більшість випадків застосувань ферментів, що включають макромолекулярну взаємодію, описані для сиру та йогурту, де казеїн необхідний для текстурних якостей продукту та де ефект ферментів часто взаємодіє з ефектами використовуваних культур. В цьому розділі обговорюється функціоналізація білків за допомогою протеаз, оскільки молочні білки є важливими харчовими інгредієнтами. Крім того, пряме використання протеаз в харчових процесах для отримання функціональних білків у складі харчового продукту, ймовірно, в першу чергу відкриває можливості для молочних продуктів.
Сичужний фермент і згортання молока
Використання хімозину в сироварінні є відомим прикладом традиційного використання ферментів, де механізм полягає в модифікації макромолекулярної взаємодії казеїнів. Різні казеїни (
, 
, β and κ) в молоці організовані в міцелах, де к-казеїни розташовані в основному на поверхні міцел. K-казеїн складається з двох областей, гідрофобного пара-к-казеїну і гідрофільного глікозильованого глікомакропептиду. Глікомакропептид виступає з міцели казеїну в загальний розчин, де він зберігає казеїнові міцели в розчині. Хімозин відносно специфічно гідролізує амінокислоти фенілаланіну (phe105) і метіоніну(met106), що розташовані між пара-к-казеїном і глікомакропептидом. Після гідролізу пара-казеїн залишається в міцелі, тоді як глікомакропептид дифузує з міцели. В результаті, міцели поступово стають більш гідрофобними, що призводить до агрегації, в результаті чого утворюється гель. Механізм опосередкованого хімозином згортання міцелей казеїну проілюстровано на рисунку 11.4. Процес згортання молока залежить від декількох факторів, включаючи рН, іонну міцність і температуру. Наприклад, для згортання молока при звичайній температурі 30-35°C потрібно гідролізу 65% к-казеїну, тоді як 95% гідроліз необхідний при 15°C.Структура і каталітичний механізм хімозину і інших сичужних ферментів, включаючи мікробні сичужні ферменти з Mucor miehei (мукорний пепсин), Mucor pusillis і Endothia parasitica(ендотиапепсин), добре описані. Для отримання високого виходу сиру дуже важливо, щоб сичужний фермент мав високе співвідношення активності згортання молока і протеолітичної активності. Співвідношення для хімозину в 2 рази вище, ніж для мукорного пепсину і в 4 рази вище, ніж для ендотіапепсину, виміряний на препаратах з чистотою близько 90% на білковій основі. Внутрішня специфічна молочно - згортаюча активність сичужного ферменту Mucor rennet призводить до трохи нижчого виходу сиру. Наприклад, різниця в 0,055 кг сиру на 100 кг молока була отримана в ході пілотних експериментів. Однак промислові мікробні сичужні ферменти зокрема містять протеази, крім пепсину мукора, що може пояснити принаймні деякі відмінності при виході продукту.
Всі сичужні ферменти, включаючи хімозин, мають деяку протеолітичну активність, крім молочно-згортаючої активності, що важливо для дозрівання сиру, включаючи пом'якшення структкри казеїну, де хімозин в першу чергу має активність на
та β-казеїн. Сичужні ферменти діють разом з ендогенними протеазами молока як еластин і катепсин D, так і протеолітичні ферменти з заквасочних культур в процесі дозрівання. Сичужні ферменти найбільш важливі для дозрівання сортів сиру з низьким рівнем готовності, таких як чеддер, тому що сичужні ферменти менш термостійкі, ніж молочні протеази, і частково інактивовані в сортах сиру з високим рівнем готовності.Фосфоліпаза для підвищення виходу сиру
Ферментативні підходи до підвищення виходу сиру традиційно зосереджені на сичужних і білкових модифікуючих ферментах, таких як трансглютаміназа. Однак нещодавно був виявлений новий підхід, оскільки фосфоліпази були продемонстровані, щоб поліпшити вихід сиру. Обробка сирного молока або фракції сирного молока панкреатичною фосфоліпазою, з подальшим звичайним використанням заквасочної культури і сичужного ферменту, дає більш високий вихід сиру, і, зокрема, більш високий вміст жиру в сирі. Приклад наведено в таблиці 11.1. Крім того, спостерігається підвищена стабільність жиру в сирній оболонці, що проявляється в зменшенні маслянистості моцарели, яку використовують для начинки піци.
Вплив панкреатичної фосфоліпази на вихід сиру Моцарела
| | Вихід білка | Вихід жиру | Вихід сиру |
| Оброблений фосфоліпазою сир | 76,93% | 92,42% | 9,54% |
| Контроль | 75,26% | 88,90% | 9,08% |
Примітка: Крем обробляли панкреатичною фосфоліпазою протягом 30 хв при 50°С і стандартизували до 2,5% жиру з знежиреним молоком. Моцарела була вироблена в експериментальному масштабі в об'ємі 600 фунтів.
Джерело: данні з Novozymes, Begsvaerd, Данія, раніше не опубліковані.
Зниження жирності є важливим параметром якості сиру для піци. При використанні панкреатичної фосфолипази разом з лізофосфоліпазой з Aspergillus спостерігається виражений ефект. Було показано, що ця комбінація ферментів дає підвищений вихід білку і жиру, а також понижену жирність. Фермент може бути використаний, коли ферменти додаються разом зі стартовими культурами, що легше реалізувати промислово, ніж окремой обробкой вершків. Останнім часом такий же результат був отриманий тільки з використанням фосфоліпази.
Механізм дії фосфоліпази все ще не вивчений, але, оскільки як білок, так і вихід жиру збільшуються, а жирність знижується, можна припустити, що ефект пов'язаний з поліпшеною взаємодією між жировими міцеліями і міцеліями казеїну, а не ліпідно-ліпідною взаємодією або ефектом емульгації частково зруйнованих фосфоліпідів. Можливий вплив фосфоліпідів на взаємодію казеїну і ліпідів в сирі вивчений недостатньо добре. Однак відомо, що фосфатидилхолінові жирові глобули виключаються в сироватковій фракції під час приготування сиру.
Трансглютаміназа (TGase) модифікує білки через утворення ε-(γ-глутамін)-лізинові подвійні зв'язки, як показано на рисунку 11.5. Інші реакції транс-глутамінази, такі як дезамінування глутаміну, мають порівняно невелике значення для застосування в харчовій промисловості.
Були представлені усі можливі види застосування, найбільш суттєвими з яких є м'ясні та рибні продукти, хоча, також, був продемонстрований(представлений) ряд можливих застосувань у молочній промисловості. Казеїни є чудовими субстратами для TGase, в той час як зв'язування сироваткових білків є неповним, а β-лактоглобулін зв'язується тільки після денатурації.
TGase може бути використаний для підвищення функціональності білків в йогурті. Одним з варіантів застосування є йогурт з низьким вмістом жиру і середньою щільністю, де трансглутаміназа, що походить від Phytophora cactorum, забезпечує текстуру, яку можна порівняти з нежирним йогуртом при додаванні разом з культурою йогурту, див. Малюнок 11.6. Важливо використовувати низьку дозу TGase для отримання потрібної текстури, оскільки при більш високих дозах текстура стає занадто твердою і неакуратною. Як правило, гелі, отримані шляхом введення ковалентних зв'язків, еластичніші, забезпечуючи жуйність, в порівнянні з гелями, грунтованими на слабкіших фізичних зв'язках, які більшою мірою пов'язані з псевдопластичними і, отже, виглядають більше кремоподібними. Аналогічним застосуванням йогурту є зниження рівня синерезису для закваски, де модельна система з гелями закваски знежиреного молока продемонструвала, що TGase дає міцніший гель(поліпшена межа текучості) з тоншою мікроструктурою і пониженою водопроникністю. Підвищена міцність гелю йогурту добре співвідноситься з кількістю олігомерного казеїну, де хороша міцність на розрив досягається при використанні усього 25% олігомерного казеїну в порівнянні з 10% необробленого. Олігомерний казеїн дивно пов'язаний з найменшою можливою кількістю міжмолекулярних перехресних зв'язків (один для димера, два для тримера).
Описано кілька інших молочних застосувань, в тому числі застосування кислотостійкого молока, корисного для забезпечення підвищеної стабільності в змішаних молочно-сокових напоях при pH 4.5 до 5.0, для термостабільного молока, де обробка трансглутаміназою запобігає дисоціації κ- казеїну з казеїнової міцелли, для морозива та для приготування сиру. Трансглутаміназа може застосовуватися різними способами для приготування сиру. Повідомлялося про більш високий вихід сиру, додавши TGase перед етапом обробки сиру, після якого йде етап додавання сичужного ферменту. Ефект додавання трансглутамінази після термічної обробки залежить від температури, так як більш високі температури призводять до сильнішої реакції і потенційного небажаного тривалого часу різання. Цей температурний ефект може бути пов'язаний з частковою денатурацією білків кулястої сироватки, що робить їх сприйнятливими до перехресного зв'язування трансглутамінази. Проблема з більш тривалим часом різання може бути подолана, якщо трансглютаміназа додається через 10 хв після сичужного ферменту. Однак про використання TGase в промисловому виробництві сиру не повідомляється.
Протеази
Існує багато прикладів використання протеаз для зміни функціональних властивостей білків, включаючи молочні, зернові і соєві білки. Поліпшена емульгованість, поліпшене піноутворення, підвищена в'язкість і підвищене зв'язування води є одними з функціональних властивостей, які можуть бути отримані. Зазвичай використовується обмежений гідроліз з використанням протеаз, які володіють вузькою специфічністю. Ферментативна функціоналізація молочних білків найбільш детально описана для гідролізу трипсином і специфічними до глутамінової кислоти протеазами Staphylococcus aureus та Bacillus licheniformis. Функціоналізація молочних білків зв’язана з подібним розподіленням гідрофобних і заряджених амінокислот у молочних білках і, відповідно, заряду вздовж молочних білків. Тому, у результаті протеолізу можуть утворюватися пептиди з різним ступенем гідрофобності і пептиди з амфіполярною природою. На прикладі дослідження β-лактоглобуліну спостерігається те, що пептиди, які адсорбовані на межі розподілу вода-олія і, відповідно, важливих для емульгуючих властивостей відносно мало, але вище 2000 моль, і з почерговим розподілом гідрофобних груп від 3 до 5 амінокислот і груп з 2 або 3 заряджених амінокислот.
Крім того, міцність гелю залежить від співвідношення β-лактоглобуліна і α-лактальбуміна, причому чисті білки дають найбільш сильне желювання, а співвідношення β-лактоглобуліна і α-лактальбуміна 1:2 дає найгірші желюючі властивості. α-лактальбумін, модифікований протеазою Bacillus licheniformis, має дивовижну властивість: він утворює міцні гелі з порожнеч мікротрубочок діаметром 20 нм, мікротрубочок цитоскелета, що нагадують структуру. Протеаза V - 8 з Staphylococcus aurcus також специфічна до глутамінової кислоти і, як було показано, збільшує в'язкість казеїну, зокрема при значеннях pH вище 5,5, і підвищує розчинність казеїну, зокрема при pH від 4 до 5, де необроблені казеїни мають погану розчинність.
Незважаючи на явно сильний потенціал, ферментативна функціоналізація знайшла лише незначне комерційне використання; переважна більшість великого ринку молочних білків або немодифікована, або модифікована неферментативними способами. Однак, триптичні реакції знайшли застосування для низькоалергенних гідролізатів, оскільки ці гідролізати мають більше функціональних властивостей, ніж кислотні гідролізати. Приклади того, де принципи функціоналізації білка зі специфічними протеазами були використані шляхом застосування ферментів безпосередньо в харчових процесах, ще рідкісніші. Одним з прикладів є використання глутамічної протеази Bacillus lichemformis для поліпшення плавленості сиру моцарела з UF-концентрованого молока, де в іншому випадку взаємодія казеїну з білками сироватки знижує плавленість. Істотним недоліком є те, що сир стає занадто м'яким. Інший приклад - використання трансглютамінази в поєднанні з глютаміназою Bacillus licheniformis для приготування сиру з високою врожайністю.
Зв’язування м’яса за допомогою трансглутамінази
Найбільш важливою сферою застосування трансглутамінази є зв'язування м'яса, у тому числі в продуктах з риби і молюсків, а також в переробленому м'ясі. Комерційна трансглутаміназа з Streptoverticillum mobarence добре підходить для застосування в м'ясі, оскільки фермент нечутливий до кальцію, що важливо, оскільки кальційвмісні поліфосфати широко використовуються в м'ясній промисловості в якості єднальних речовин. Трансглутаміназа зазвичай використовується для реструктуризації м'яса з шматків, наприклад, малоцінних відрубів і обрізків, при температурі близько 5°C впродовж ночі. Трансглутаміназні продукти для зв'язування м'яса містять казеїнат, який, завдяки реакції трансглутамінази, діє як клей.
Аналогічним чином трансглутаміназа може використовуватися для виробництва рибних продуктів, включаючи сурімі(fish паста), яка стала першим промисловим застосуванням трансглутамінази. Звичайний процес включає наступні етапи: оброблення з сіллю, додавання крохмалю, додавання приправ і крижаної води, додавання трансглутамінази, оброблення, надання форми, схоплювання(наприклад, при 15°C впродовж 16 годин), варіння і справжнє охолодження. Трансглутаміназа покращує фізичні властивості гелю сурімі, включаючи міцність гелю. Було показано, що під час схоплювання утворюються міозинові зв'язки і що бажаний результат досягається при використанні всього 3 ммоль ε -(γ- глутамил) -лізинових зв'язків на 100 г гелю.
При переробці м'яса, наприклад, ковбаси, трансглутаміназу додають разом з іншими інгредієнтами після подрібнення, щоб каталізувати утворення поперечних зв'язків на стадії варіння для забезпечення різних поліпшених властивостей кінцевого продукту, включаючи підвищену стійкість до розриву. Трансглутаміназа створює тоншу мережеву структуру міозину в сирому ковбасному фарші, а також в кінцевому продукті, що корелює з поліпшеною міцністю гелю.
Переробка соків та овочем
Сік
Пектинолітичні ферменти, що часто містять декілька ферментних компонентів, широко використовуються у виробництві соків, де майже увесь прозорий яблучний сік обробляється ферментами. Пектинолітичні ферменти руйнують матеріал клітинних стінок рослин, забезпечуючи високий вихід соку і низьку в'язкість. Механізм можна охарактеризувати як зменшення макромолекулярної взаємодії. Такий підхід небажаний для каламутних яблучних соків, оскільки присутність часток, включаючи матеріали клітинної стінки, є необхідним, а функціональність макромолекул потрібно для утримання речовин в зваженому стані. При використанні промислових пектинолітичних ферментів для каламутного яблучного і грушевого соку використовується нижче дозування ферменту, щоб забезпечити лише часткову ферментацію матеріалу клітинної стінки рослини. Кращими промисловими ферментами для каламутного яблучного і грушевого соку, мабуть, являються пектинолітичні ферменти для мацерації(розділення клітин) овочів. Ефективніше рішення полягає у використанні переваги блокової структури пектину. Пектин складається з ділянок довгого лінійного гомогалактуронана, що чергуються з ділянками рамногалактуронана з гілками галактану і арабинана. Передбачається, що ці так звані "ворсисті ділянки" взаємодіють з іншими структурами клітинної стінки. Гомогалактуронан може бути вивільнений шляхом селективної деградації ворсистих ділянок за допомогою пектинолітичних ферментів, що специфічно діють на структури рамногалактуронана, як показано на малюнку 11.7. Використання ферментів, що руйнують волокнисті ділянки, продемонстровано на прикладі суміші рамногалактуронанази, рамногалактуронанацетилестерази і галактанази при переробці яблучного соку. В результаті ферментної обробки виходить каламутніший сік з підвищеною стабільністю помутніння, де помутніння утримуються в зваженому стані вивільненим високомолекулярним гомогалактуронаном(пектином). Подальше додавання полігалактуронанов і пектин-естерази, яка розкладає гомогалактуронан, усуває позитивний ефект, див. таблицю. 11.2.
У цитрусовому соку пектин є джерелом дестабілізації соку у присутності ендогенної або доданою пектинметилестеразою. Пектин-естераза деметоксилює пектин, даючи низькометоксикуючий пектин, який з'єднується з полівалентними катіонами, утворюючи нерозчинні пектати. Цього можна уникнути за допомогою пектинолітичних ферментних препаратів з високим співвідношенням полігалактуронази і естерази пектину, оскільки ферментні продукти руйнують деметоксильовані ділянки пектину, які інакше зв'язували б полівалентні катіони, такі як кальцій.
Обробка овочем
При виробництві джемів і подібних продуктів пектин зазвичай додають в якості желюючого агента, де високометоксильований пектин утворює гель при високій концентрації цукру, а низькометоксильований пектин(НМП) утворює гель у присутності кальцію, даючи рельєфну пектатну структуру, що часто називається структурою яєчної коробки. Альтернативою додаванню НМП є реакція пектинметилестерази безпосередньо на пектиновмісний фруктовий матеріал. Цей принцип був використаний в традиційній східній кулінарії, де плоди Ficus awkeotsang використовуються для формування гелю. Було показано, що це відбувається в результаті реакції ендогенної пектинметилестерази з пектином та плодів. Отриманий таким чином низкометоксильований пектин утворює гель за рахунок природного вмісту кальцію.
Такий же желюючий ефект можна отримати при додаванні пектину Aspergillus він додається до таких фруктів, як полуниця і апельсини. Деметоксилювання пектину пектин-естеразой типу Apergillus призводить до випадкового деметоксилювання, як в комерційній НМП. Це відрізняється від блочно-послідовного метоксилювання, отриманого за допомогою рослинних пектинових естераз, що ще більше підходить для гелеутворення, опосередкованого кальцієм. Желюючий ефект залежить від наявності пектину в плодах і може бути посилений додаванням ферментів, які руйнують інші структури клітинної стінки, окрім гомогалактуронана, вивільняючи більше гомогалактуронана (див. таблицю 11.3).Здатність рамногалактуроназу, що містить, і галактаназу ферментної суміші збільшувати доступність пектину може бути порівнянна з хмаростабілізуючим ефектом цих ферментів при переробці яблук, як описано вище. Такі комбінації ферментів, ймовірно, занадто складні для промисловост, але добре підходять для демонстрації принципу.
Застосування естерази пектину Aspergillus для томатів, включаючи томатну пасту, не призводить до такої реакції желювання, як у більшості інших фруктів, а швидше до реакції згущування, що сприятливо для кетчупа. Різний ефект в томатах може бути пояснений кількістю вільного пектину в пюре плодів, де значна кількість вільного пектину є присутньою в пюре апельсинів і тільки невелика кількість вільного пектину виявлена в пюре томатів, де велика частина пектину пов'язана з ізолятами((Новозим, Багсваерд, Данія, неопублікована інформація).
Застосування пектинової естерази на шматочки (скибочки) рослинних тканин
часто призводить до утворення більш твердої структури, яка більш стійка до замерзання і механічних впливів. Це може бути використано для поліпшення цілісності фруктових шматочків, що використовуються в, наприклад, йогурт або начинку для пирога. Механізм цієї зміцнюючої реакції пояснюється утворенням зв'язків кальцію між деметоксильованим пектином. Ефект може бути посилений додаванням кальцію. Ефект пектинової естерази добре видно в мікрографах тканин, забарвлених пектиновою плямою у вигляді товстішого пектинового шару в клітинних стінках. Аналогічну реакцію можна отримати з ендогенними пектиновими естеразами, де активність в деяких випадках може бути індукована термообробкою.
Висновок
Приклади показують, що ферменти можуть використовуватися для отримання поліпшених якостей продукту шляхом зміни макромолекул в їжі. Такі види застосування ферментів можливі в основному для продуктів харчування, в яких макромолекулярні взаємодії дуже важливі для якості харчових продуктів.
Використання ферментів в харчовій промисловості збільшується упродовж десятиліть, і відсоток застосування ферментів, грунтованих на макромолекулярній взаємодії, також росте, останніми роками на основі ширшого використання ферментів в хлібопеченні і застосування трансглутамінази для декількох цілей. Зростання ферментативних удосконалень макромолекулярної взаємодії, швидше за все, продовжиться, де серед рушійних сил будуть застосування фосфоліпази для випічки і сироваріння, а також нова оксидаза для випічки. Розвитку сприяє ширше використання генної інженерії, що полегшує виробництво ферментних продуктів потрібної чистоти щоб уникнути небажаної ферментації макромолекул. Зростання залежатиме від прийняття споживачами генної і білкової інженерії. Іншим обмежуючим чинником є вартість розробки складніших продуктів, наприклад, ферментного продукту для каламутного яблучного соку, де для підтримки розробки потрібний значний ринок. Проте, незважаючи на ці обмеження, очікується, що використання ферментів для вишуканої зміни макромолекулярної взаємодії буде рости.