Ім'я файлу: Методи вивчення нуклеотидних послідовностей. Галтуренко І.В. — к
Розширення: docx
Розмір: 29кб.
Дата: 02.11.2022
скачати
Розширення: docx
Розмір: 29кб.
Дата: 02.11.2022
скачати
Міжнародний класичний університет імені Пилипа Орлика
Кафедра охорони здоров’я
Реферат
З предмету: «Біологія з основи генетики»
На тему: «Методи вивчення нуклеотидних послідовностей»
Виконала: здобувачка вищої освіти
Групи МС 2325(в), специальності 223 «Медсестринство»
Галтуренко Ірина Володимирівна
Миколаїв 2022
Визначення нуклеотидних послідовностей в складі гомологічних генів (наприклад, генів глобине), кодують поліпептиди з подібним будовою і функцією в одного або різних організмів, показало,що найбільшим змінам в еволюції піддавалися інтрони, а не екзонів. У інтрони виявлені вставки, делеції та інші перебудови, в той час як послідовності екзонів виявляються значно більш консервативними. Зміни в нуклеотидних послідовностяхекзонів часто обумовлені лише окремими нуклеотидними замінами.
Визначення нуклеотидних послідовностей в складі гомологічних генів (наприклад, генів глобине), кодують поліпептиди з подібним будовою і функцією в одного або різних організмів,показало, що найбільшим змінам в еволюції піддавалися інтрони, а неекзони. У нітрон виявлені вставки, делеції та інші перебудови, в той час як послідовності екзонів виявляються значно більш консервативними. Зміни в нуклеотиднихпослідовностях екзонів часто обумовлені лише окремими нуклеотидними замінами.
Визначення нуклеотидних послідовностей в складі гомологічних генів (наприклад, генів глобине), кодують поліпептиди з подібним будовою і функцією в одного аборізних організмів, показало, що найбільшим змінам в еволюції піддавалися інтрони, а не екзонів. У нітрон виявлені вставки, делеції та інші перебудови, в той час як послідовності екзонів виявляються значно більш консервативними. Зміни внуклеотидних послідовностях екзонів часто обумовлені лише окремими нуклеотидними замінами.
Визначення нуклеотидної послідовності ДНК методом ферментативного копіювання із зупинкою подовження ланцюга, здійснюваного ДНК-полімеразою, - швидкий,відносно простий, недорогий і надійний метод. Крім того що нуклеотидних послідовність фрагмента ДНК є його вичерпною характеристикою на молекулярному рівні, вона дозволяє також ідентифікувати його кодирующую область, підібрати потенційніпраймери для ПЦP, Виявити мутаційні зміни в гені.
Визначення нуклеотидної послідовності ДНК може стати потужним методом визначення амінокислотної послідовності білків. Генетичний код є виродженим в тому сенсі, що більша частинаамінокислот описується більш ніж одним кодоном.
Зупинка синтезу ДНК після приєднання дідезоксінуклеотіда до кінця зростання ланцюга. Фосфоді-ефірна зв'язок між кінцевим дідезоксінуклеотідом і наступним нуклеотидом не може утворитися через відсутність З -гідроксильної групи. | Подовження праймера при синтезі ланцюга в присутності дідезок-сінуклеотідов. У кожній з чотирьох пробірок утворюється унікальний набір олігонуклеотидів різної довжини, що включають праймерной послідовність. При цьому утворюється і якесь числоповнорозмірних молекул ДНК. dNTP - дезоксінук-леозідтріфосфат. Для визначення нуклеотидної послідовності клонованих ДНК використовуються різні підходи.
Для визначення нуклеотидної послідовності протяжних клонованих сегментів спочатку підбираютьсинтетичний олігонук-леотідний праймер, комплементарний ділянці, сусідньому зі вставкою, і за допомогою Діде-зоксі-методу секвеніруют перші 250 - 300 нуклеотидів.
Для визначення нуклеотидної послідовності в олігонуклеоті-дах їх гідролізували нуклеазами,як це буде описано далі, і потім ідентифікували продукти гідролізу. Для аналізу пуклеотідов, отриманих при гідролізіPНК рібонуклеазою TI, найбільш придатна панкреатичнаPНК-аза, і, навпаки, якщоPНК гідролізували панкреатичноїPНК-азой, для аналізуотриманих нуклеотидів використовували рибонуклеазу TI. В обох випадках кінцеві продукти гідролізу однакові: вони містять мононуклеотид Г, Ц і У і олігонуклеотиди з різним числом залишків А, мають на З - наприкінці Г, Ц, або У. Більшість цих продуктів можна розділити здопомогою електрофорезу при рН 3 5 (фіг.
Pезультати визначення нуклеотидної послідовності 16S рPНК дозволяють розглядати Archaeoglobus як форму, що займає проміжне положення між метаногенами і екстремальними термофіли, метаболізм яких пов'язаний звідновленням або окисленням молекулярної сірки.
Застосовувані для визначення нуклеотидної послідовностіPНК методи зводяться до контрольованого розщепленню нуклеїнових кислот різними ферментами і подальшого поділу продуктів гідролізу.
Схема визначення кінцевих груп. Методичні прийоми визначення нуклеотидної послідовності зводяться головним чином до контрольованого розщепленнюPНК різними по специфічності ферментами і хроматографічне розділення продуктів гідролізу. Аналізуючипродукти гідролізу на різних його стадіях і застосовуючи відповідні набори, гідроліз-щих ферментів, визначають склад кожного з таких фрагментів, відновлюють порядок з'єднання фрагментів один з одним і врешті-решт встановлюють послідовністьнуклеотидів у всій ланцюгаPНК-PНК, первинна структура - будова молекулPНК, при якому нуклеотиди послідовно з'єднані один з одним. Для розуміння первинної структуриPНК найбільш важлива природа межнуклеотидной зв'язку. Відомо, що лужний гідролізPНКсупроводжується, нейтралізацією лугу. Звідси випливає, що всі або частину фосфорнокислих груп бере участь в утворенні межнуклеотидной зв'язку. Під впливом азотистої кислоти азотисті основи в цільнійPНК дезамінується-ются, алеPНК при цьому не розщеплюється, щосвідчить про те, що аміногрупи підстав до утворення Межнуклеотидная зв'язок відношення не мають. Як показує спектрометричне титрування, освіти межнуклеотидной зв'язків не беруть участі кетогрупи гуаніну і урацилу. При ферментативномугідролізіPНК фосфодіестерази зміїної отрути утворюється суміш 5-монофосфатоввсех чотирьох нуклео-зідов. Це означає, що в освіті межнуклеотидной зв'язків залучені С-5 - атоми. При лужному ж гідролізі утворюється суміш нуклеозид-2 - і нуклеозид - З - монофос-фатів. Звідсиможна зробити висновок, що Межнуклеотидная зв'язку виникають при наявності фосфоефірних груп, що з'єднують С-5 - одного нуклеотиду з атомами С-2 С-3 сусіднього з ним нуклеотиду. Оскільки при гідролізіPНК фосфодіестерази селезінки утворюється моль нуклеозид-3 - фосфату, топрисутність в нативноїPНК фосфоефірних зв'язків (С-2) - (C-5 j виключається. На цій схемі буквами р і х позначені місця розривів фосфодіефірних зв'язків відповідно фосфодіестерази зміїної отрути та фосфодіестерази селезінки.
Направлене розщепленняполінуклеотіди ланцюгаPНК ферментомPНКазой Н. Існує два принципово різних підходи до визначення нуклеотидної послідовності ДНК.
До цих пір були розглянуті різні підходи до визначення нуклеотидних послідовностей. Pазнообразіеекспериментальних методик, якими при цьому користувалися, свідчить про великий інтерес до цієї області досліджень. У даній главі будуть описані багато з цих методик.
Міжнародна програма, метою якої є побудова генетичної та фізичноїкарт геному людини і визначення повної нуклеотидної послідовності ДНК.
Як і в інших оглядах на цю тему, опис методів розділення побудовано за традиційною схемою: від порівняно простих з'єднань (азотистих основ, нуклеозидів і нуклео-тідов) довсе більш складним - олігонуклеотидів і різноманітним класамPНК і ДНК - У заключних розділах основну увагу приділено використанню хроматографії та електрофорезу при визначенні нуклеотидної послідовності і для поділу нуклеопротеїдів. Як правило, спочаткуописуються методи хроматографії, а потім - електрофорезу. Цей огляд не претендує на роль вичерпної монографії, він скоріше дає оцінку сучасному стану досліджень в даній області, акцентуючи увагу на досягненнях останніх кількох років. У багатьохвипадках наведено приклади використання конкретної методики з метою проілюструвати її можливості.
Методом виключення було знайдено, що третя група плям пов'язана з ділянкою ініціації синтетази. При визначенні нуклеотидної послідовності цихфрагментів було використано спостереження, що при розщепленні старих препаратівPНК фага R17 інтенсивність плям, відповідних ділянці ініціації білка оболонки, зменшувалася, тоді як інтенсивність плям, відповідних ділянкам ініціації двох інших білків,зростала. Припустили, що це відбувається внаслідок руйнування ділянки ініціації білка оболонки з одночасним підвищенням доступності ділянок ініціації синтетази і А-білка.
Ясно, що найбільш надійним доказом ідентичності структур продукту ізатравки стало б встановлення ідентичності нуклеотидних послідовностей в молекулах цих сполук. Однак, оскільки визначення нуклеотидних послідовностей довгих відрізків ДНК - все ще невирішена експериментальна задача, доводиться покладатися наменш прямі способи доказу. Корнбергом був розроблений новий підхід до цієї проблеми - так званий метод визначення частот найближчих сусідів. Метод найближчих сусідів полягає у визначенні абсолютної частоти, з якою кожен з цих дінуклеоті-довзустрічається в досліджуваному зразку ДНК.
Тому вихідна молекула ДНК попередньо фрагментируется. Це дозволяє після визначення нуклеотидної послідовності відповідних фрагментів реконструювати первинну структуру всієї ДНК.
Позиційно-кандидатних картування. Ідентифікація гена захворювання в тому випадку, коли продукт гена невідомий, але ген картірван в тому ж хромосомному районі, що і деякі функціональні гени і EST. З цих генів і EST відбирають кан-дідатние і визначають, які з нихвідповідають шуканого гену. Pабота над реалізацією програми Геном людини (HGP, Human Genome Project) офіційно почалася 1 жовтня 1990 р. в США і контролює її Міністерство енергетики (Department of Energy) спільно з Державними інститутами здоров'я (National Institutes of Health) США. Їїкінцева мета полягає у визначенні нуклеотидної послідовності всього генома людини.
На підставі даних, отриманих на першому етапі, синтезують новий праймер, перекривається з кінцем вже секвенувати ділянки, і використовують його для визначеннянуклеотидної послідовності наступної ділянки клонованої ДНК. Цю процедуру повторюють до тих пір, поки не секвеніруют весь сегмент.
Іншими словами, як сказано в одному з нормативних документів, то, що не є зумовленим, не може вважатисяочевидним. Тим не меншеPТО США дотримується існуючого підходу до патентування генів і нещодавно відхилив принаймні одну заявку на тій підставі, що методи, які використовувалися для визначення нуклеотидної послідовності гена, були рутинними іочевидними. Патентні повірені у свою чергу вважають, що патентоспроможність винаходу не залежить від того, яким чином воно було зроблено, а визначається тим, чи відповідає воно умовам патентоспроможності. Питання про те, чи є використання відомогоспособу отримання гена перешкодою до визнання такого гена неочевидним, слід вирішувати в судовому порядку. ОскількиPТО використовує прецедентний підхід до винесення рішень по біотехнологічним заявками, мабуть, не існує абсолютного стандарту для оцінкивідповідних винаходів, і суди швидше будуть грати інтегративну роль при розгляді питання про патентоспроможність генів.
Так, обробка АЗ ф5ТЗ ф5 ЦЗ ф фосфомоноестеразой дає відповідний три-заходів з вільною цис-глікольной групою. Повторення всьогопроцесу з динуклеотид дає гуанін і аденозин - З - фосфат. Крім визначення нуклеотидної послідовності, цей метод дозволяє також відрізняти 3 - 5-Межно-клеотідную зв'язок в динуклеотид від 2 - 5-зв'язку, так як при його застосуванні міграції фосфату не відбувається.
ВНині проводяться дослідження первинних структур різних молекул ДНК. Відомі повні нуклеотидні послідовності ДНК ряду вірусів і плазмід. Зовсім недавно завершено визначення нуклеотидних послідовностей геномів двох прокаріотичнихорганізмів (Haemophilias influenzae і Mycoplasma genitalum) і з'явилися повідомлення про розшифровку геному першого еукаріотичного організму - дріжджів. Близькі до завершення аналогічні дослідження геному E. Дослідники активно працюють над повною розшифровкою генома людини.
Липкікінці ДНК фага і їх утворення з реплікативної форми під дією ендонуклеази. Зверніть увагу на вісь локальної приблизною симетрії другого порядку (місце розташування якої позначено жирною крапкою, яка служить специфічним ділянкою взаємодії зсиметричним димерних ферментом. Симетрично розташовані пари основ укладені в рамки. Точки mm відповідають цим точкам на генетичній карті (15 - 22. Вважають, що кільцева форма розкривається під дією ендонуклеази. Існування липких кінцівпідтверджується не тільки визначенням нуклеотидних послідовностей.
Основні труднощі у визначенні послідовності підстав в рибосомної, інформаційної та вірусноїPНК виникають внаслідок великого розміру їх молекул. Довжина ланцюгів цих молекулколивається від 1300 ланок уPНК вірусу-сателіта вірусу некрозу тютюну, 1500 ланок у 16 ??S рибосомноїPНК до 6000 і більше ланок у віруснихPНК. Якщо це співставити із приблизно 75 ланками у тPНК і 120 ланками у 5SPНК, то стає ясно, що визначення нуклеотиднихпослідовностей у таких великих молекул у порівнянні з більш короткими в 1О - 20 разів більш трудомістке. Складання повних і точних нуклеотидних переліків на підставі гідролізу високомолекулярнихPНК специфічними нуклеазами навіть за допомогою найбільш ефективного вНині методу перекриваються послідовностей є складним завданням.
Завдяки рестріктірующім ен-донуклеазам, багато з яких в даний час виробляються фірмами і надходять у продаж, стало можливим цілеспрямоване розрізанняі картування хромосом; ці ферменти стали також необхідним інструментом при визначенні нуклеотидних послідовностей ДНК.
Ця область біохімії розвивається із запаморочливою швидкістю. Pїдко проходить місяць без того, щоб в біохімії не з'явилосяповідомлення про якому-небудь великому досягненні або відкритті. За розшифровкою генетичного коду на початку 60 - х років послідувала нескінченна низка захоплюючих відкриттів і узагальнень великого масштабу. Серед них визначення нуклеотидних послідовностей багатьохгенів, штучний синтез генів, з'єднання генів у нових поєднаннях, вбудовування генів одних видів в клітини інших видів і отримання за допомогою таких змінених клітин продуцентів багатьох нових білків, корисних для тих чи інших цілей.
ДНК (бактеріофага фХ174);сталося це в 1977 р. Сенгер та його колеги розробили дуже витончену процедуру-метод термінації ланцюгів, або, як його ще називають, плюс-мінуоьсістему. Незалежно від них Алан Максам і Уолтер Гілберт з США запропонували дещо інший підхід, що отримав назву хімічногометоду. В обох підходах використовуються фрагменти, отримані при розщепленні вихідної ДНК за допомогою рестріктірую-щих ендонуклеаз. У доповненні 27 - 1 описані принципи методу визначення нуклеотидної послідовності, розробленого Максама і Гілберта.
Вонизабезпечують: 1) вбудовування чужорідної ДНК у вектор; 2) вирізання клонованої послідовності з вектора. Іншими словами, після вбудовування фрагмента ДНК в певний сайт цей фрагмент можна вирізати після клонування тієї ж самої рест-ріктазой, оскільки накінцях вбудованої нук-леотідной послідовності є два аналогічних сайту рестрикції. Іноді вихідний сайт рестрикції модифікується, тоді вирізання клонованого фрагмента утруднюється. Вирізаний фрагмент ДНК можна вбудовувати в вектори, призначенідля визначення нуклеотидної послідовності ДНК, або в вектори, спеціально сконструйовані для забезпечення високого рівня експресії (транскрипції і трансляції) клонованого гена.
У більшості випадків метою такого перенесення є створення новогопродукту або отримання вже відомого продукту в промислових масштабах. I ми познайомимо читача з концепціями молекулярної біотехнології і тими мікроорганізмами, які в ній використовуються, з основами молекулярної біології і методологією рекомбінантних ДНК. Будутьописані такі методи, як хімічний синтез генів, полімеразна ланцюгова реакція (ПЦ?), визначення нуклеотидної послідовності (секвенування) ДНК. Крім успішного клонування потрібного гена дуже важливо забезпечити його правильне функціонування в організмінового господаря, тому ми зупинимося також на способах оптимізації роботи клонованих генів у про - та еукаріотичних системах. В цілому матеріал, викладений у першій частині, служить фундаментом, який дозволяє зрозуміти різні аспекти конкретних застосуваньмолекулярної біотехнології.
Термостабільна ДНК полімераза T. Кленівський фрагмент ДНК полімерази I включає ддНТФ, і усереднене співвідношення дНТФ /ддНТФ для цього ферменту становить 3000 разів. Інший фермент, виділений із бактеріофага Т7 і після певноїмодифікації названий секвеназой, характеризується вкрай низькою вибірковістю по відношенню до типу включаються нуклеотидів, і для нього усереднене співвідношення дНТФ /ддНТФ складає всього близько 3 причому розкид за різними ддНТФ не дуже значний. Завдяки цим своїм властивостям, (а також деяким іншим не розглянутим тут якостям), даний фермент вельми зручний для визначення нуклеотидних послідовностей ДНК і широко використовується.
Полімеразна ланцюгова реакція, проведена за допомогою специфічних олігонуклеотидних праймерів і термостабільної ДНК полімерази дозволяє вибірково ампліфикувати певні ділянки ген% ма мало не в мільярд разів. Сфера застосування методу полі-меразной ланцюгової реакції дуже широка. Після такої виборчої ампліфікації з'являється можливість проводити подальші аналізи з цим фрагментом ДНК, не вдаючись до дорогого і трудомісткого методу молекулярного клонування. Крім виключно наукового застосування для напрацювання певних ділянок геному для їх подальшого вивчення цей метод використовується в медичних дослідженнях при діагностиці небезпечних інфекцій, спадкової патології, схильності до окремих захворювань, при виявленні точкових мутацій, а також при генетичному картуванні, генетичного поліморфізму, клітинному я гуморальному відповіді на захворювання та ін Крім цього, використання термостабільної ДНК полімерази для визначення нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК ферментативним методом по Сенгер дозволяє проводити секвені-ючий реакції при підвищеній температурі, що знімає вплив вторинної структури і дає можливість секвенування GC-багатих ділянок. Використовуючи специфічні праймери, можливо секвеніруют-вать окремі ділянки ДНК, минаючи етап клонування.
Якщо ж періодат повністю видалити до проведення реакції елімінування, то утворюється суміш вільного заснування та підстави, все ще зв'язаного глікозидної зв'язком. У той же час при кислотної обробці цієї суміші виділяється стехіометричне кількість вільного підстави. Для реакції - елімінування був запропонований ряд амінів; деякі з них перераховані в табл. 6.1. У таблиці наведено також виходи на стадії елімінування при дії амінів на олігонукле - отиде або нуклеїнову кислоту, оброблену періодатом. З таблиці випливає, що ця реакція протікає найбільш повно в можливо більш м'яких умовах, якщо в якості аміну використовують анілін. Хоча в разі олігонуклеотидів ефективними виявляються більш жорсткі умови, для визначення нуклеотидної послідовності в високомолекулярноїPНК, наприкладPНК вірусу тютюнової мозаїки, переважні більш м'які умови.
Використана література:
1. Медична енциклопедія. – М., 1996.
2. Основи генетики. – К., 2000.
3. Біологія: Навч. посіб. / За ред. та пер. з рос. В. О. Мотузного. — 3тє вид., випр. і допов. — К.: Вища шк., 2002. — 622 с.: іл.