Лабораторне заняття № 1

Виготовлення та аналіз мазків крові риби та миші

1. 
   1. Будова світлового мікроскопу
   

Неозброєним оком людина може побачити живі об’єкти, розміри яких більше 0,1 міліметра, що відповідає середній товщині волосини. Щоб побачити об’єкти менших розмірів, використовують спеціальні збільшувані прилади – лупу та мікроскопи. Основною складовою цих приладів є двоопуклі лінзи, які дозволяють збільшити уявне зображення предмета. Принцип роботи світлового або оптичного мікроскопу базується на заломленні світлових променів системою лінз окуляра та об’єктиву, які є компонентами оптичної частини мікроскопу.

З агалом, світловий мікроскоп складається з двох частин – механічної та оптичної. До механічної частини мікроскопа входить штатив, предметний столик і тубус (Рис. 1). Верхня частина штатива (тубусотримач) може рухатися за допомогою макро- і мікрогвинтів, призначених для грубого і точного фокусування. При обертанні гвинтів за годинниковою стрілкою тубус опускається в напрямку до препарату, при обертанні проти неї – від препарату. Предметний столик, на який поміщають препарат, може рухатися у взаємно перпендикулярних площинах за допомогою спеціальних гвинтів. В його центрі знаходиться отвір для освітлення препарату. На столику вмонтовані два затискачі для закріплення препарату.

Оптична частина мікроскопа складається з освітлювального апарату, об’єктивів і окуляра. До освітлювальної системи, яка знаходиться під предметним столиком, входять дзеркало і конденсор. Один бік дзеркала плоский, інший – увігнутий. Конденсор призначений для фокусування паралельних променів, які йдуть від джерела світла (лампи або сонячного світла), в площині препарату. Тому при роботі з конденсором слід користуватись тільки плоским дзеркалом. Для регулювання інтенсивності освітлення в конденсор вмонтована ірисова (пелюсткова) діафрагма, яка складається зі сталевих серпоподібних пластинок. Для отримання чіткішого зображення досліджуваного об’єкту важливо відрегулювати ступінь розкриття діафрагми. Зафарбовані препарати краще розглядати при майже повністю відкритій діафрагмі, незафарбовані – при зменшеному отворі діафрагми.

Об’єктив мікроскопа – це багатолінзова короткофокусна система. Зовнішня лінза, яка обернена до препарату плоским боком, називається фронтальною. Вона забезпечує збільшення. Інші лінзи об’єктива переважно відповідають за корекцію оптичних недоліків, які виникають під час дослідження препаратів. Об’єктиви бувають сухими та імерсійними. Під час роботи із сухими об’єктивами між фронтальною лінзою об’єктива і об’єктом дослідження знаходиться повітря. При роботі з імерсійною системою об’єктив занурюється у краплю рідкого однорідного середовища. У сухому об’єктиві частина світлових променів відхиляється і не потрапляє в око спостерігача через різницю між показниками заломлення скла (1,52) та повітря (1,0). Імерсія (від латинського immersio – занурювати) знижує різницю показника заломлення світла на межі з фронтальною лінзою, наближаючи його до показника заломлення скла. Наприклад, показник заломлення світла водою – 1,3, гліцерином – 1,47, а кедровою олією – 1,52, як у скла. Таким чином, використання імерсії дозволяє розглядати об’єкти на великих збільшеннях. Імерсійні об’єктиви мають на оправі чорне кільце або спеціальні позначення для водної чи олійної імерсії. На оправі також є позначення збільшення об’єктива. Крім того, кожен об’єктив характеризується певною величиною робочої відстані. У об’єктивів з малим збільшенням відстань від фронтальної лінзи об’єктива до препарату більша, ніж у об’єктивів із великим збільшенням. В залежності від цього необхідно пильно слідкувати яким гвинтом, макрометричним чи мікрометричним, слід користуватись при фокусуванні об’єктива. Розглядання препарату рекомендується починати з невеликого збільшення.

Основними технічними характеристиками мікроскопа є збільшення та роздільна здатність. Коефіцієнт збільшення мікроскопа визначається добутком величин збільшення окуляра та збільшення об’єктива. Теоретично мікроскоп може давати збільшення у 2000× та більше разів. Корисне збільшення, при якому ми можемо чітко бачити деталі об’єкта, зазвичай становить трохи більше за 1400×. При більших значеннях збільшення, розсіяння світла дрібними структурами всередині об’єкта призводить до розмивання зображення і втрати чіткості. Варто правильно підбирати об’єктиви та окуляри. Наприклад, для об’єктиву зі збільшенням 40× найкраще брати окуляр 15×, щоб отримати загальне збільшення в межах корисного. Які би при цьому сильніші окуляри не використовувались, виявити тонші структури не вдасться.

Роздільна здатність мікроскопа – це найменша відстань між двома точками на препараті, які можна побачити окремо. Для людського ока роздільна здатність становить близько 0,2 мм. Якщо збільшення мікроскопа залежить від характеристик об’єктива та окуляра, то роздільна здатність – від характеристик об’єктива і конденсора.
1.2. Порядок роботи зі світловим мікроскопом
1. Підготувати мікроскоп до роботи. Протерти лінзи окуляра і об’єктива м’якою серветкою, яка не залишає ворси, розмістити лампу та мікроскоп так, щоб було зручно для роботи.

2. Підняти конденсор у максимальне верхнє положення, закрити ірисову діафрагму, вивести світлофільтр. Поставити у робоче положення об’єктив 8×.

3. Вийняти окуляр і, дивлячись через тубус у мікроскоп, встановити дзеркало так, щоб джерело світла було чітко видно в центрі поля зору.

4. Встановити окуляр, і, пересуваючи тубус мікроскопа за допомогою макрогвинта, знайти чітке зображення джерела світла. Ввести світлофільтр і відкрити ірисову діафрагму.

5. При роботі з об’єктивами 8×, 40× та 90× конденсор залишити у максимально верхньому положенні. Ступінь освітлення слід регулювати ірисовою діафрагмою.

6. Покласти предметне скло з препаратом на столик мікроскопа, затиснути його клемами.

7. При роботі з об’єктивом 40× спочатку знайти зображення об’єкта, користуючись об’єктивом 8× і прикриваючи ірисову діафрагму. Потім, не піднімаючи тубус мікроскопа, перевести в робоче положення об’єктив 40×, злегка відкрити діафрагму і знайти зображення об’єкта, користуючись макрометричним і мікрометричним гвинтами.

8. При роботі з об’єктивом 90× на препарат нанести краплю кедрової олії чи гліцерину. Відкрити повністю ірисову діафрагму.

9. Дивлячись збоку, обережно за допомогою макрогвинта опустити тубус мікроскопа так, щоб лінза об’єктива занурилась в імерсійну рідину і злегка торкнулась поверхні скла. Слід пам’ятати, що при різкому опусканні об’єктива можна розчавити фронтальну лінзу і вивести мікроскоп з ладу.

10. Дивлячись в окуляр, дуже повільно піднімати тубус за допомогою макрогвинта, доки в полі зору не з’явиться зображення досліджуваного об’єкта. Якщо зображення не знайдено, повторити операцію 9 і 10.

11. Поліпшити видимість препарату за допомогою мікрометричного гвинта.

12. Після завершення роботи зняти серветкою кедрову олію чи гліцерин з лінзи об’єктива 90×. Перевести мікроскоп на мале збільшення, дзеркало встановити у вертикальне положення.
1.3. Виготовлення та аналіз мазків крові риби та миші
До складу крові входить плазма та форменні елементи – еритроцити, лейкоцити, тромбоцити. Основну масу їх становлять еритроцити – червоні клітини крові. Газообмін є основною функцією еритроцитів, який здійснюється завдяки наявності в них дихального пігменту – гемоглобіну. В ссавців еритроцити без’ядерні, ядра зникають на ранній стадії їх розвитку в червоному кістковому мозку. Еритроцити ссавців мають форму двоввігнутих дисків і завдяки білку гемоглобіну мають червоний колір. У птахів, риб та рептилій еритроцити овальної форми, мають ядро, розмір їх значно більший. Середня тривалість життя еритроцитів складає 100-120 діб.

Кров’яні пластинки – тромбоцити – у крові ссавців є без’ядерними клітинами, а у птахів і всіх інших хребетних мають ядра. Тромбоцити утворюються в червоному кістковому мозку. Тромбоцити виділяють речовини (фактори згортання крові), які необхідні для ущільнення кров’яного згустку.

Лейкоцити – це безбарвні клітини, які захищають організм від хвороботворних мікробів. За розміром вони більші, ніж еритроцити, але їх менше в крові. Живуть лейкоцити від кількох годин до двох тижнів, а деякі форми можуть жити протягом місяців і років. У крові присутні дві групи лейкоцитів: гранулоцити та агранулоцити. В цитоплазмі гранулоцитів містяться гранули із захисними або гормоноподібними речовинами. Гранулоцити, в свою чергу, поділяють на базофіли, еозинофіли та нейтрофіли. Всі гранулоцити мають витягнуте ядро, яке, до того ж, може бути розділене на декілька частин (сегментів). До агранулоцитів належать моноцити та лімфоцити, які мають велике ядро, оточене шаром цитоплазми. Загальною функцією всіх лейкоцитів є захист організму від бактеріальних і вірусних інфекцій, паразитарних інвазій, підтримання тканинного гомеостазу та участь у регенерації тканин. Важливою функцією лейкоцитів є захист організму від проникнення хвороботворних мікроорганізмів. При пошкодженні шкіри лейкоцити направляються із судин у тканини до рани, де захоплюють бактерії і перетравлюють їх (фагоцитоз).

У крові риб представлені всі типи клітин, що беруть участь в імунних реакціях у вищих хребетних. На відміну від ссавців, у риб немає кісткового мозку, тому у них в периферійній крові присутні бластні форми лейкоцитів: мієлобласти, промієлоцити, мієлоцити та метамієлоцити.

Одним з етапів дослідження лейкоцитів та інших клітин крові є морфологічне дослідження. Воно включає низку особливостей клітини: величину і форму клітини, забарвлення гранул і цитоплазми, форму ядра та деякі інші характеристики. Такому дослідженню піддаються зафарбовані мазки периферійної крові, препарати кісткового мозку, лімфатичних вузлів, селезінки тощо.

Мета даної роботи – порівняти лейкоцити теплокровних та холоднокровних тварин. Для мікроскопічного аналізу лейкоцитів необхідно приготувати мазки периферійної крові риб та мишей. Для виявлення характеристик клітин, про які вказано вище, мазки потрібно пофарбувати. В даній роботі пропонується дуже простий метод фарбування – за Паппенгеймом-Крюковим. Метод ґрунтується на специфічному зафарбовуванні різних частин клітини барвником еозином, змішаним з метиленовим синім та азуром Б. Ядро, яке містить нуклеїнові кислоти, зафарбовується у темно-фіолетовий колір метиленовою синькою та азуром Б. Цитоплазма клітин зафарбовується у світло-блакитний колір метиленовою синькою або у світло-рожевий – метиленовим синім та еозином. Еозинофільні гранули фарбуються у яскраво-рожевий колір еозином, а базофільні – метиленовою синькою та азуром Б у темно-синій або фіолетовий колір. Еозинофільні гранули містять білки, тоді як у базофільних переважає гістамін – гормоноподібна сполука, яка походить від амінокислоти гістидину.
Реактиви:

- суміш еозину та метиленового синього (фарба Май-Грюнвальда);

- суміш азуру Б та еозину (фарба Романовського).
Хід роботи

1. 
   Предметні скельця попередньо знежирити у 96% розчині етилового спирту або суміші Нікіфірова (етанол:діетиловий ефір у співвідношенні 1:1).
   
2. 
   Приготувати мазки периферійної крові риб та мишей (рис. 1). Для цього невелику краплю крові (

3. 
   Фарбування мазків здійснити за Паппенгеймом-Крюковим. Для цього близько 1 мл фарби Май-Грюнвальда помістити на мазок, покриваючи його повністю. Через 40 хв фарбу змити водою. Після цього на мазок потрібно рівномірно нанести 1 мл фарби Романовського, покриваючи нею предметне скло повністю. Через 20 хв фарбу змити водою, мазки висушити.
   
4. 
   Цитологічний аналіз провести під світловим мікроскопом використовуючи імерсійний об’єктив при загальному збільшенні ×1000. Результати аналізу приготовлених мазків крові мишей та риб занести в таблицю 1.
   

5. 
   Для кожного мазка проаналізувати відносний вміст всіх видів лейкоцитів (таблиця 2). В результаті такого підрахунку отримаємо лейкоцитарну формулу – кількісне співвідношення всіх видів лейкоцитів периферійної крові. Для цього на пофарбованому мазку потрібно підрахувати 200 лейкоцитів з наступним обчисленням їх відсоткового співвідношення.
   

Гранулоцити					Агранулоцити
Базофіли	Еозино­філи	Нейтрофіли			Лімфоцити	Моноцити
		Метамі-єлоцити	Паличко-­ядерні	Сегмен- то­ядерні
0–1	0,5–5	0–1	1–6	47–72	18–37	3–11

1. 
   Чисте знежирене предметне скло провести через верхню частину полум’я пальника.
   
2. 
   На середину скла за допомогою скляної палички нанести краплю води.
   
3. 
   Прожареною бактеріологічною петлею чи піпеткою внести в неї досліджувану культуру бактерій і розподілити рівномірно на площі 1-2 см².
   
4. 
   Препарат висушити, тримаючи скло високо над полум’ям.
   
5. 
   Зафіксувати препарат, тобто вбити мікроорганізми і забезпечити їх прилипання до поверхні скла. Для цього скло з препаратом провести тричі через верхню частину полум’я пальника (термічна фіксація).
   
6. 
   Фіксований препарат залити кількома краплями барвника (фуксин основний або метиленовий синій). Розподілити барвник по всій поверхні мазка. Фарбувати препарат фуксином протягом 1-2 хв, а метиленовою синькою – 3-5 хв. Потім фарбу злити, препарат добре промити дистильованою водою.
   
7. 
   Скло з країв протерти серветкою, препарат висушити. Нанести на сухий препарат краплю кедрової олії і розглядати препарат під мікроскопом (об’єктив 90×).
   

З авдання:

1. 
   Невелику кількість сухих дріжджів розчинити у дистильованій воді.
   
2. 
   Внести по краплі отриманої суспензії дріжджів на два предметні скельця. Одне предметне скло із нанесеною суспензією дріжджів нагріти над полум’ям спиртівки.
   
3. 
   На обидва скельця внести по 1 краплі 0,23%-го розчину метиленового синього. Витримати 5 хв.
   
4. 
   Накрити краплі суспензій покривними скельцями. Надлишок рідини відтягнути смужкою фільтрувального паперу.
   
5. 
   Розглянути препарати при збільшенні об’єктиву спочатку 8×, а потім 40×.
   

1. 
   Біуретова реакція (на виявлення пептидного зв’язку)
   

1. 
   У 2 пробірки налити по 1 мл досліджуваних зразків.
   
2. 
   Додати по 2 мл 10% NaOH.
   
3. 
   Додати по 0,1 мл 2% розчину сульфату міді (ІІ).
   
4. 
   Результати спостережень занести до таблиці 3.
   

2. 
   Нінгідринова реакція (на виявлення альфа-амінокислот)
   

1. 
   У 2 пробірки внести по 1 мл досліджуваних зразків.
   
2. 
   Додати по 1 мл 0,5% розчину нінгідрину.
   
3. 
   Суміш кип’ятити 1-2 хвилини.
   
4. 
   Результати спостережень занести до таблиці 3.
   

3. 
   Ксантопротеїнова реакція (на виявлення ароматичних амінокислот)
   

1. 
   У 2 пробірки внести по 1 мл досліджуваних зразків.
   
2. 
   Додати по 0,5 мл концентрованої HNO₃.
   
3. 
   Обережно нагріти на водяній бані.
   
4. 
   Охолодити та додати по 2 мл 10 % розчину NaOH.
   
5. 
   Результати спостережень занести до таблиці 3.
   

4. 
   Реакція Паулі (на виявлення амінокислот гістидину та тирозину)
   

1. 
   У 2 пробірки налити по 0,25 мл 1% розчину сульфанілової кислоти.
   
2. 
   Додати по 0,5 мл 0,5% розчину NaNO₂.
   
3. 
   Вміст пробірок струсити і швидко додати по 0,5 мл досліджуваних зразків.
   
4. 
   Перемішати та додати по 0,5 мл 10% розчину Na₂CO₃.
   
5. 
   Результати спостережень занести до таблиці 3.
   

5. 
   Реакція Фоля (на виявлення сірковмісних амінокислот)
   

1. 
   У дві пробірки налити по 1 мл досліджуваних зразків.
   
2. 
   Додати у всі пробірки по 1 мл 30% розчину NaOH.
   
3. 
   Додати у всі пробірки по три краплі 5% розчину ацетату свинцю.
   
4. 
   Нагрівати впродовж трьох хвилин на водяній бані.
   
5. 
   Результати спостережень занести в таблицю 3.
   

1. 
   У колбу додати 2 мл фільтрату та 0,5 мл 10% розчину HCl.
   
2. 
   Титрувати ДХФІФ до рожевого забарвлення, що зберігається протягом 30 сек.
   
3. 
   Вміст аскорбінової кислоти у досліджуваних продуктах визначають за формулою:
   

1. 
   У колбу для титрування додати 1 мл екстракту чаю.
   
2. 
   Додати 12 мл дистильованої води та 1 мл розчину індигокарміну. Після доливання індигокарміну вміст колби набуває інтенсивного синього забарвлення.
   
3. 
   Ретельно перемішуючи рідину в колбі, вміст титрувати 0,1 н розчином KMnO₄ до появи жовтого забарвлення через перехідні відтінки – від синього до зеленого і зеленувато-жовтого.
   
4. 
   Провести титрування контрольної проби. До 13 мл води у колбі додати 1 мл розчину індигокарміну та титрувати 0,1 н. розчином KMnO₄ як описано вище.