Науково-дослідна роботу на тему:
«Ферменти. Амілолітичні ферменти»
Київ - 2020
Зміст:
Вступ
Огляд літератури
Методи досліджень та обладнання
Експериментальна частина
Висновок
Перелік використаної літератури
Вступ
Актуальність теми.
Мета і завдання дослідження
Практичне значення
Огляд літератури
Усі хімічні процеси, що відбуваються в живому організмі, прискорюються специфічними каталізаторами, які одержали назву ферментів, або ензимів.
З ферментами людина знайома дуже давно: зсідання молока при виготовленні сиру, хлібопечення, пивоварство, виноробство, виробництво спирту і цілий ряд технічних процесів базуються на дії ферментів.
Речовини, стійкі при звичайних умовах, в організмі під дією ферментів легко розщеплюються. Наприклад, вуглеводи, жири і білки за звичайних умов можуть знаходитися без помітних змін протягом тривалого часу. Для їх розщеплення поза організмом потрібна висока температура (кип'ятіння) і застосування сильних реагентів (концентровані мінеральні кислоти, луги). Процес розщеплення при цьому триває декілька діб, іноді навіть кілька тижнів. Потрапляючи в організм, ці речовини під впливом відповідних ферментів дуже швидко (протягом кількох годин) підлягають розщепленню з утворенням більш простих сполук.
За своєю природою всі ферменти - білки. Доказом білкової природи ферментів є ряд їх фізико-хімічних властивостей, характерних для білків. Ферменти так само, як і білки, у розчині знаходяться в колоїдному стані, є амфотерними електролітами. При додаванні нейтральних солей, особливо сульфату амонію, ферменти випадають в осад, тобто висолюються. Під впливом високої температури, сильних кислот і лугів, солей важких металів і інших чинників, що викликають денатурацію білків, ферменти денатурують і втрачають каталітичні властивості. Важливим доказом білкової природи ферментів є розщеплення їх пепсином і трипсином - ферментами, що розщеплюють білки.
Властивості ферментів
Ферменти - термолабільні сполуки. Це означає, що під дією високих температур вони денатурують. Спочатку при підвищенні температури активність їх різко знижується, потім зовсім припиняється. При 80°С ферменти руйнуються. Виняток становлять лише окремі ферменти, що витримують температуру 100°С і при цьому не руйнуються. За низьких температур (нижче 0°С) ферменти припиняють свою дію, але не руйнуються. Для більшості ферментів людини і ссавців оптимальною температурою дії є 37-40°С.
Таким чином, чутливість до температури - характерна властивість ферментів, що пояснюється їх білковою природою.
Кожний фермент проявляє свою максимальну дію при відповідній концентрації водневих іонів, тобто при певному значенні рН, яке одержало назву рН-оптимуму. Для більшості ферментів людини і ссавців оптимальне значення рН знаходиться в слабо-кислому або слабо-лужному середовищі. Проте відомі ферменти, що проявляють максимальну активність при рН=1,5-2,5 (наприклад, пепсин шлункового соку) і при рН=8,00 (наприклад, хімотрипсин дванадцятипалої кишки).
Зміна каталітичної активності ферменту за різних значень рН пояснюється в першу чергу зміною тієї просторової конфігурації, за якої проявляються його каталітичні властивості.
Однією з найважливіших особливостей, що відрізняє ферменти від інших каталізаторів, є висока специфічність їх дії. Вона полягає в тому, що кожний фермент діє на певну речовину (субстрат) або на декілька близьких за своєю хімічною структурою речовин. Залежно від того, може фермент каталізувати одну реакцію (діяти тільки на одну речовину) чи декілька (діяти на групу близьких за будовою речовин), розрізняють абсолютну і відносну специфічність. Прикладом абсолютно специфічного ферменту може бути фермент уреаза, який розщеплює сечовину на вуглекислий газ і аміак. Навіть на таку близьку до сечовини речовину, як тіосечовина, уреаза вже не діє. Більшість ферментів має відносну специфічність. До таких ферментів належать естерази, які розщеплюють ефірні зв'язки, протеолітичні ферменти травного каналу, що розщеплюють пептидні зв'язки в білкових молекулах, ліпази та ін.
Серед ферментів є також і такі, що проявляють свою дію залежно від просторової конфігурації, тобто мають просторову специфічність. Так, ферменти, які окиснюють D-амінокислоти, не окиснюють їх L-форми. Слід підкреслити, що специфічність будь-якого ферменту завжди проявляється в чітко визначених умовах, зокрема, при певній концентрації іонів водню.
Ферменти прискорюють перебіг хімічних реакцій як убік розщеплення якоїсь речовини, так і вбік її синтезу, тобто діють в обох напрямках.
Крім температури і значення рН, на активність ферментів впливає ще цілий ряд чинників, серед яких велике значення має концентрація субстрату. За малих концентрацій субстрату реакція відбувається з малою швидкістю, з підвищенням концентрації швидкість реакції поступово зростає і за певних значень стає постійною. Відбувається процес так званого насичення ферменту субстратом. Подальше збільшення концентрації субстрату призводить до уповільнення реакції. Велике значення для швидкості реакції має і концентрація самого ферменту. За оптимальної концентрації речовини швидкість реакції прямо пропорційна концентрації ферменту в розчині.
На активність ферментів впливають хімічні сполуки, що знаходяться в реакційній системі. Одні з них підвищують активність ферментів і називаються активаторами. Ними можуть бути катіони металів і аніони кислот: Са2+, Mg2+ Мп2+, Со2+, С1- і ін. Активаторами ферментів можуть бути також органічні речовини. Наприклад, ліпаза підшлункової залози, яка розщеплює жири, активується жовчними кислотами. Відомі випадки, коли активність ферментів підвищується при додаванні до розчину невеликих кількостей білків, які самі по собі не мають властивостей ферментів.
Речовини, що знижують активність ферментів, називаються інгібіторами. Ними є, наприклад, катіони важких металів.
Класифікація та номенклатура ферментів
Висока специфічність дії ферментів зумовлює дуже велику їх кількість. Майже кожна реакція, що відбувається в живому організмі, здійснюється за участю специфічно пристосованого до неї ферменту або групи ферментів. На даний час відомо біля 2000 різних ферментів, і кількість їх продовжує збільшуватися.
Всі відомі реакції, що відбуваються в організмі, були поділені на шість основних типів. Відповідно до шести типів хімічних реакцій усі відомі ферменти діляться на шість класів:
1. Оксидоредуктази - ферменти, що каталізують окисно-відновні реакції, тобто перенесення електронів і атомів водню від однієї речовини (донатора) до іншої (акцептора). У результаті реакцій, що каталізуються оксидоредуктазами, клітини одержують хімічну енергію.
Оксидоредуктази - це складні ферменти. Кофакторами в їх складі можуть бути нікотинамідні коферменти (НАД і НАДФ), флавіннуклеотиди (ФМН і ФАД), залізопорфіринові комплекси (гем) і багато катіонів (Fe2+, Fe2+, Cu2+, Zn2+ і ін.). Зазначені кофактори спроможні виконувати роль акцепторів електронів і атомів водню і передавати їх іншим речовинам.
2. Трансферази - клас ферментів, що каталізують транспорт різноманітних хімічних груп від однієї речовини (донатора) до іншого (акцептора).
3. Гідролази - ферменти, що каталізують реакції розщеплення речовин за участю води. Каталітична активність цих ферментів залежить від наявності в їх каталітичному центрі HS-груп. Гідролази дуже поширені в природі і беруть участь в обміні вуглеводів, жирів, білків та інших сполук.
4. Ліази - ферменти, що каталізують реакції негідролітичного відщеплення певних груп з утворенням подвійних зв'язків або приєднання групи в місці подвійного зв'язку. Ці реакції здійснюються без використання енергії макроергичних сполук. Ліази, як правило - складні ферменти, що містять як кофактори фосфорні ефіри водорозчинних вітамінів.
5. Ізомерази - ферменти, що каталізують реакції внутрішньомолекулярного переміщення різних груп або реакції утворення ізомерів. Типовим прикладом ферментів цього класу є тріозофосфатізомераза. Даний фермент зворотно перетворює 3фосфогліцериновий альдегід у діоксіацетонфосфат.
6. Лігази (синтетази) - ферменти, за участю яких здійснюється приєднання одна до одної двох молекул із використанням енергії АТФ і утворенням нових зв'язків. Лігази називають ще синтетазами, оскільки вони є каталізаторами синтетичних реакцій. Це складні ферменти.
Кофактором багатьох із них є вітамін Н, або біотин.
Відповідно до нової номенклатури назви ферментів складаються з двох частин. Перша частина вказує на назву субстрату, друга - на природу хімічної реакції, яку здійснює фермент, із додаванням суфіксу -аза. Якщо фермент каталізує реакцію між двома субстратами, то в першій частині назви ферменту дають назви обох субстратів, розділених двома крапками, в другій — вказують тип хімічної реакції з додаванням суфіксу -аза.
Амілолітичні ферменти
Амілолітичні ферменти об'єднують велику групу ферментів, які здійснюють гідроліз переважно б-(1,4)-Глікозидних зв'язків амілози, амілопектину, глікогену та інших мальтоолігосахаридів. До групи амілолітичних ферментів відносяться наведені нижче і деякі інші ферменти:
КФ 3.2.1.1 б-амілаза
КФ 3.2.1.2 в-амілаза
КФ 3.2.1.3 Глюкоамілаза
КФ 3.2.1.41 Пуллуланаза
КФ 3.2.1.68 Ізоамілаза
КФ 3.2.1.20 б-глюкозидази
КФ 3.2.1.11 Декстраназа
КФ 2.4.1.19 Амілаза Bacillus macerans (циклодекстроглюканотрансфераза)
Амілази бувають двох типів: ендо-і екзоамілази. Чітко вираженої ендоамілазой є б-амілаза, здатна до розриву внутрішньомолекулярних зв'язків у полімерних ланцюгах субстрату. Глюкоамілаза і в-амілаза є екзоамілазами, тобто ферментами, що атакують субстрат з нередукуючого кінця.
Субстратами для дії амілаз є крохмаль, що складається з амілози і амілопектину, продукти часткового гідролізу крохмалю і глікоген. Крохмаль - рослинний полісахарид з дуже складною будовою. Цей двокомпонентний з'єднання, що складається з 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса (М. м.) коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю. Амілоза - це необертающийся полімер, в якому залишки глюкози Сполучених б-1,4-Глікозидний зв'язком; ступінь полімеризації близько 2000. У «аномальних» амілози з однією-двома б-1,6-зв'язками полімеризація може зрости до 6000. Амілоза практично не має відновлюючої здатності, тому що в кожній молекулі амілози є тільки один вільна альдегідна группа.
Реакції, що каталізуються амілазами, мають дві стадії: коротку передстаціонарну і тривалу - стаціонарну. Під час першої стадії ендоамілаза швидко зменшує молекулярну масу субстрату, утворюючи суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи.
б-амілаза (1,4-б-D-глюканглюканогідролаза) є ендоамілазою, що викликає гідролітичні розщеплення б-1,4-глікозидних зв'язків всередині полімерного субстрату. Це водорозчинний білок, що має властивості глобуліну і має молекулярну масу 45-60 кДа. Всі б-амілази відносяться до металоензимів, вміст у них Са коливається від 1 до 30 г-атом / 1 г-моль ферменту. Повне видалення Са приводить до інактивації ферменту. Глутамінова і аспарагінова кислоти становлять 25 мас. % Від маси білка. Залежно від виду мікроорганізму властивості б-амілаз можуть сильно відрізнятися не тільки за механізмом дії на субстрат і по кінцевим продуктам, але і за оптимальними умовами для прояву максимальної активності. Присутність в промислових препаратах протеїназ знижує каталітичну активність б-амілази. У результаті впливу б-амілази на перших стадіях в гідролізаті накопичуються декстрини, потім з'являються тетра- і тримальтоза, що не зафарбовуються йодом і які дуже повільно гідролізуються б-амілазою до ди- і моносахаридів.
в-амілаза (в -1,4-глюкан мальтогідролаза, КФ 3.2.1.2) - активний білок, що володіє влатсивостями альбуміну. Каталітичний центр ферменту має сульфгідрильні і карбоксильні групи і імідозольний цикл залишків гістидину. в-Амілаза - екзофермент кінцевої дії, що виявляє спорідненість до передостаннього в -1,4-зв'язку з нередукуючого кінця лінійного ділянки амілози і амілопектину.
На відміну від б-амілази в-амілаза практично не гідролізують нативний крохмаль, тоді як клейстеризований крохмаль гідролізуєтся нею з утворенням мальтози в-конфігурації. Якщо гідролізу піддається амілоза, то гідроліз йде повністю до мальтози. Незначна кількість декстринів може здіснюватися при гідролізі «аномальної» амілози, тому що гідроліз в-амілазою йде тільки по лінійній ланцюга до б -1,6-зв'язків. Якщо субстратом для в-амілази служить амілопектин, то гідроліз йде в значно меншому ступені. в-Амілаза відщеплює фрагмент з нередукуючим кінцем ділянки від зовнішніх лінійних гілок, які мають по 20-26 глюкозних залишків, з утворенням 10-12 молекул мальтози. Гідроліз призупиняється на передостанній б -1,4-зв'язку, що межує з б -1,6-зв'язком. У гідролізаті накопичується 54-58% мальтози, решту становлять високомолекулярні декстрини, що містять значну кількість б -1 ,6-зв'язків - так звані в -декстрини.
в-амілази виявляють більшу стабільність у відсутність іонів Са2+. Молекулярна маса в-амілази рослин досить висока, вона складає від 50000 до 200000. Фермент може складатися з однієї або чотирьох субодиниць до 50 000 кожна. Фермент містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Вважається, що (в-амілазу має високу здатність до нескінченої атаки субстрату. Для амілози середньої молекулярні маси в одному при з'єднанні ферменту до субстрату можливо відчеплення до чотирьох залишків мальтози. При збільшенні молекулярної маси субстрату можлива і більша кількість місць атаки.
Продукт реакції - мальтоза - має в-конфігурацію. Гідроліз іде по лінійному ланцюзі тільки до б-1,6-зв'язків. При гідролізі крохмалю утворюється 54-58% мальтози і 42-46% високомолекулярних декстринів (в-декстринів). в-амілази виявляють більшу стабільність у відсутність іонів Са. Фермент може складатися з однієї або чотирьох субодиниць, містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Властивості в-амілаз залежать від джерел їх виділення. Для отримання мальтози з крохмалю використовують бактеріальні в-амілази.
Глюкоамілаза (1,4-б-D-глюканглюкогідролаза) широко розповсюджений в природі. Вона синтезується багатьма мікроорганізмами і утворюється в тканинах тварин. У літературі фермент відомий під різними назвами: амілоглюкозідаза, г-амілаза, лізосомальних б-глюкозидази, кисла мальтаза, матулаза, екзо-б-1 ,4-глюкозидази. Глюкоамілаза каталізує послідовне відщеплення кінцевих залишків б-D-глюкози з нередуцірующіх решт субстрату. Цей фермент проявляє екзогенний механізм впливу на субстрат. Багато глюкоамілази володіють також здатністю гідролізувати б-1 ,6-глюкозідние зв'язку. Однак це відбувається в тому випадку, коли за б-1 ,6-зв'язком слід б-1 ,4-зв'язок, тому декстран ними не гідролізується. Глюкоамілаза значно швидше гідролізують полімерний субстрат, ніж оліго-і дисахариди. Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди- і моносахаридів.
Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди-і моносахаридів. Угле ¬ водний компонент може бути цілісним фрагментом або ж розбитими на індивідуальні сполуки, які прикріплюються до білка через треонін і серин. Наприклад, у глюкоамілази A. niger їх 20. Більшість відомих глюкоамілаз має оптимум при рН 4,5-5,2, рідше - при 5,7-6,0, в основному для дріжджових глюкоамілаз.
Фермент пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогідролаза) раніше був відомий під назвами: R-фермент, гранична декстриназа або амілопектин-6-глюканогідролаза. Пуллуланаза, як і б-амілаза, є ендогенних ферментом, але на відміну від неї здатна невпорядковано гідролізувати б-1 ,6-зв'язку в пуллулані, амілопектину, глікогену та граничних декстрину, одержуваних при спільному впливі на крохмаль і глікоген б-і в - амілаз. Якщо між двома б-1 ,6-зв'язками розташовано більше трьох залишків глюкози, то розрив б-1 ,6-зв'язку йде значно повільніше, тому амілопектин гідролізується пуллуланазой гірше за інших розгалужених полісахаридів. Найбільш частим відщеплює фрагментом є мальтотріоза. Пуллуланази з різних джерел мають різні властивості[7].
Ізоамілаза (глікоген-6-глюканогідролаза), або дебранчінг-фермент, гідроліз б-1 ,6-зв'язку в розгалужених полісахаридів, таких як амілопектин, глікоген, в-граничні декстрини. Відмінною особливістю ізоамілази в порівнянні з пуллуланазой є те, що вона не здатна гідролізувати пуллулан і слабко діє на граничні в-декстрини. Бактеріальна ізоамілаза розщеплює б-1 ,6-зв'язку в глікогенній повністю, а пуллуланаза діє на цей субстрат слабо. Ізоамілазу утворюють багато мікроорганізмів, такі як B. amyloliquefacie, Cytophaga, Streptomyces, Pseudomonas amyloderamosa, Saccharomyces cerevisiae та ін, ферменти яких мають здатність гідролізувати субстрат при рН від 3,5 до 6,5 і температурах від 25 до 53 ° С. Ізоамілаза не стабілізується кальцієм, за винятком ферменту з Cytophaga. Молекулярна маса ізоамілаз коливається від 90 до 120 кДа.
б-глюкозидази (б-D-глюкозідглюкогідролаза) має здатність гідролізувати б-1 ,4-зв'язку від нередуцірующего кінця субстрату з відщеплення залишку глюкози. Фермент проявляє найбільшу спорідненість до низькомолекулярним субстрату, легко гідролізують мальтозу, олігосахариди, а полісахариди гідролізують повільно або зовсім не гідролізують. б-глюкозидази об'єднує групу ферментів і має ряд інших назв: мальтаза, глюкоінвертаза, глюкозідосахараза. Властивості ферментів, які продукуються різними мікроорганізмами, можуть значно відрізнятися. Фермент має здатність до перенесення б-D-глюкозільних залишків на відповідні акцептори, часто з утворенням б-1 ,6-зв'язків.
Декстраназа (1,6-б-D-глюкан-6-глюканогідролаза) каталізує розщеплення б-1 ,6-зв'язків у бактеріальному полісахариди декстрану. Серед продуцентів декcтраназ слід зазначити B. subtilis, B. megaterium, Lactobacillus befidus, Streptococcus mutans, Bravibacterium fuscum, Pseudomonas UQM-733, різні грунтові бактерії, а також численні види мікроскопічних грибів роду Penicilium, Aspergillus і Fusarium. Декстранази мають молекулярну масу від 35 до 71 кДа; вони є слабокислими білками. Ізоелектричної точка для всіх грибних декстраназ лежить в діапазоні від 4,0 до 4,6. Для більшості бактеріальних декстраназ оптимальна температура каталітичної дії 35-37 ° С; для грибних продуцентів температура трохи вище - 55-60 ° С. Оптимальне значення рН коливається в залежності від виду продуцента від 4,4 до 7,5. За допомогою ендодекстраназ можна отримувати з декстрану кровозамінники необхідної молекулярної маси; їх також використовують у стоматології для зняття зубних бляшок, що складаються з декстраноподобних глюканов.
Амілаза B. Macerans [1,4-б-D-глюкан-4-б-(1,4-б-глюкану) трансфераза (ціклізуюча)] Ця унікальна амілаза, яка вперше була знайдена в культурі B. macerans. Вона циклізує частину ланцюга 1,4-б-глюкану шляхом утворення 1,4-б-глюкозідной зв'язку. При дії на крохмаль і аналогічні субстрати утворюються циклічні нередукуючі декстрини (декстрини Шардінгера) різних розмірів.
Фермент діє на лінійні полісахариди, гідролізуючи насамперед б-1 ,4-зв'язок, і потім переносить звільнився редукуючий кінець ланцюга на НРК. Фермент також здатний перебудовувати лінійну структуру мальтодекстрин без циклізації, може переносити залишки глюкози і мальтози на олігосахариди, тобто має за певних умов трансферазну активність і здатний ввести реакцію конденсації.
Методи досліджень та обладнання
Визначення амілолітичної активності ферментів залежно від дії різних факторів.
Амілази каталізують гідроліз високомолекулярних полісахаридів крохмалю і глікогену. Найважливішим джерелом амілаз є злакові, які містять їх як у непророщеному, так і у пророщеному зерні. В останньому випадку амілази проявляють високу активність. Широко застосовуються амілази у крохмалепатоковому, спиртовому, пивоварному і хлібопекарському виробництвах як головні ферменти, що каталізують процеси розщеплення крохмалю й утворення цукрів, що можуть зброджуватись. Амілолітичну активність характеризує здатність ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом. Метод характеризує активність α-амілази, але при наявності в препараті β–амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів. За одиницю амілолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, що каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не 44 забарвлюються йодом, за 1 год при температурі 30°С у чітко визначених умовах. Амілолітичну здатність (АЗ) препарату виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи в 1 мл розчину. При такому способі вираження АЗ безпосередньо показує скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до нездатних забарвлюватись йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).
Мета роботи: засвоїти методику визначення амілолітичної здатності ферментного препарату.
Завдання на виконання роботи: визначити амілолітичну здатність ферментного препарату за швидкістю гідролізу крохмалю до декстринів. Апаратура: водяна баня; секундомір.
Лабораторний посуд: мірні колби; піпетки; пробірки; скляні палички.
Матеріали і реактиви: 1,0%-ий розчин розчинного картопляного крохмалю (наважку беруть з такого розрахунку, щоб в 100 мл розчину був 1 г сухого крохмалю, кількісно переводять її у велику склянку з киплячою водою, кип’ятять 2 хв. й охолоджують, весь час перемішуючи розчин скляною паличкою. Охолоджений крохмаль переносять у мірну колбу того об’єму, із розрахунку на який взята наважка крохмалю, додають буферний розчин у кількості 10 мл на 100 мл розчину і доводять до позначки дистильованою водою. Розчин крохмалю готують у день аналізу); буферний розчин: змішують рівні об’єми нормальних розчинів оцтової кислоти (58 мл льодяної оцтової кислоти в 1 л дистильованої води) та натрій оцтовокислого (82 г CH3COONa або 136,1 г CH3COONa 3H2O в 1 л води), рН = 4,7; основний розчин йоду (1,4 г кристалічного йоду і 4,4 г калій йодистого розчиняють у малому об’ємі води і доводять об’єм розчину до 100 мл, зберігають у темному місці); робочий розчин йоду готують в день аналізу (20 мл основного розчину йоду доводять дистильованою водою до 100 мл і на кожні 100 мл робочого розчину додають 4 г йодистого калію); розчин технічного амілосубтиліну (1:1000). Принцип методу ґрунтується на гідролізі 1,0%–го буферного розчину крохмалю під впливом амілолітичних ферментів. Кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до декстринів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату.
Хід роботи. У конічну колбу місткістю 50-100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0 %-го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою 30°C (±0,2°C). Загальний об’єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, то об’єм, якого не достає, доповнюємо дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.
Через 10 хв витримування в бані у колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішування і точно за секундоміром відмічають час. За початок реакції беруть час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хв.(або частіше) після початку реакції скляною паличкою відбирають краплину рідини і на білій порцеляновій пластинці з’єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.
Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане давати зміну забарвлення при з’єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с).
Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, можна встановити від 3 до 20 хв., але надійніші результати отримують у межах від 5 до 12 хв.
Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв., то визначення повторюють з меншою кількістю розчину ферменту, наприклад – 2 мл. В цьому разі пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 8 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1 г в 200 або 500 мл).
Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв., то готують розчин більшої концентрації, наприклад 1:50 чи 1:100, а рідину можна не розбавляти зовсім.
У разі зникнення забарвлення з межах 3-5 хв. проби відбирають кожна 15 с; 5-10 хв. – кожні 30 с.; а понад 10 хв. – кожну хвилину.
Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.
Розрахунок АЗ проводять за формулою:Де 0,2 – кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 – коефіцієнт перерахунку на 1 год; а – кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш, грами повітряно-сухої речовини або мілілітри рідинних об’єктів; t – час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв..; 1 – перерахунок на 1 г повітряно-сухого препарату або 1 мл розчину.
Висновок
Список використаної літератури
http://repository.ldufk.edu.ua/bitstream/34606048/23484/1/Лекція%208.%20Ферменти.pdf
https://www.slideshare.net/cit-cit/7-75014619
http://repository.ldufk.edu.ua/bitstream/34606048/15571/1/8_FERMENTY.pdf
https://studfile.net/preview/7397389/page:2/