Реакції лімфоцитів на механічні та осмотичні впливу при водної депривації

М. З. Федорова, В.М. Левін

Критеріями, що характеризують стан білих клітин крові є показники їх функціональної активності і опірності різним чинникам. Причому, остання властивість часто буває більш інформативним показником, тому що пригнічення функцій може відбуватися при далеко зайшла деструкції клітин, що має незворотний характер [1]. Особливо важливе значення це положення має при аналізі механізмів адаптації організму до екстремальних факторів середовища.

Метою проведеного дослідження було вивчення реакцій лейкоцитів на механічні та осмотичні впливу в умовах дегідратації організму.

МЕТОДИКА

Досліди проведені на 48 безпородних білих щурах-самцях масою 370-420 р. Тварин експериментальних груп позбавляли води при вільному доступі до сухого корму [4]. Оцінку осмотичної стійкості, осморегуляторних і деформаційних реакцій вели на 3, 6 і 10 добу безводного змісту. Контролем служили інтактні тварини.

Для досліджень використовували суспензію лейкоцитів у фізіологічному розчині забуференной (розчин Дюльбекко), що складається на 95-98% з лімфоцитів. Осмотичну стійкість, регуляторні можливості і мембранний резерв вивчали, використовуючи комплексний метод, докладно описаний раніше [6]. Суть методу зводиться до наступного. Лейкоцити поміщали в розчини хлориду натрію різної концентрації (0,9%; 0,45%; 0,2%). Час експозиції в гіпотонічних розчинах становила 60 с та 1 ч. Дані щодо зміни морфометричних параметрів клітин після інкубації в 0,45% розчині використовували для оцінки регуляторних можливостей. Мембранний резерв визначали за змін площі поверхні лейкоцитів після 60-секундної інкубації в 0,2% розчині хлориду натрію. Розрахунки об'єму та площі поверхні за стандартними формулами для кулястих тіл вели на основі вимірювання діаметра 50-60 клітин, фіксованих глутарового альдегіду, поміщених на предметне скло і забарвлених АЗУР-еозином. Осмотічскую стійкість висловлювали числом (%) клітин збережених після годинної експозиції в 0,2% розчині хлориду натрію.

Для оцінки деформаційних властивостей за основу була взята методика Tran-Son-Tay R. з співавт. [7]. Капіляри, діаметром 4 мкм заповнювали ізоосмотичними буфером і з'єднували з манометром. Переміщення клітин до капіляру і в капілярі забезпечувалося постійним у всіх дослідах негативним тиском (100 мм рт. Ст.). Всі маніпуляції проводили в мікрокапіляри на предметному столику мікроскопа. Для спостережень і вимірів використовували об'єктив 40 ВІ і окуляр-мікрометр МОВ-1-15 *. Після реєстрації для кожної клітини первинних параметрів (діаметр лейкоцитів у вихідному стані, довжина і ширина деформованої клітини, час відновлення до вихідної форми) розраховували площу поверхні і об'єм спочивали, і деформованих лейкоцитів. Для кожної тварини було обраховані 40-60 клітин.

Всі отримані дані оброблені статистично. Достовірність відмінностей опрделялась за критерієм t Стьюдента.

Результати дослідження

Проведене дослідження показало, що до 3-ї доби дегідратації відбувалося істотне зменшення розмірів лейкоцитів крові. Надалі (6-10 добу) за рахунок включення регуляторних механізмів клітинний обсяг відновлювався до рівня інтактних тварин (табл. 1).

Помірна гіпоосмотіческая навантаження (60 з в 0,45% розчині хлориду натрію) призводила до достовірного збільшення обсягу лімфоцитів у контрольних тварин, а також на 6 і 10-а доба безводного змісту (18 ¸ 32%, р <0,01). На 3 добу дегідратації об'ємні зміни були незначні (12%, р> 0,05). Високий осмотичний градієнт (60 з в 0,2% розчині хлориду натрію) викликав достовірне збільшення розмірів клітин у всіх тварин (табл. 1). Однак, у контрольній групі зміни обсягу лімфоцитів були значно більше, ніж в експериментальних (54% проти 19 ¸ 32%, р <0,01). Збільшення площі поверхні в цих умовах становила: контрольна група - 33%, 3 добу дегідратації - 12%, 6 і 10 добу - 20%. Тобто мембранний резерв ефективніше використовувався лейкоцитами інтактних тварин.

Таблиця 1

Розміри лімфоцитів, інкубувати розчинах хлориду натрію різної осмолярності

Примітка. У таблиці представлені значення діаметра клітин (мкм). У дужках - обсяг лейкоцитів (мкм3). Зірочкою позначена достовірність відмінностей порівняно з параметрами клітин контрольних тварин (р <0.05), кружечком - достовірність внутрішньогрупових відмінностей з клітинами, інкубувати у фізіологічному розчині (р <0.05).

Кінетика об'єму клітин при збільшенні часу інкубації в 0,45% розчині хлориду натрію до 1 год була приблизно однаковою у тварин всіх груп (табл. 1). Діаметр лімфоцитів зменшувався на 8,4% (р <0,01) у інтактних тварин і 6,0 ¸ 6,5% (р <0,01) у тварин експериментальних груп. Реакції регуляторного зменшення обсягу приводили до відновлення вихідних параметрів клітин.

Динаміка осмотичної стійкості лімфоцитів на різних стадіях зневоднення організму відрізнялася від фазних змін обсягу. Зі збільшенням термінів водної депривації осмотична стійкість лейкоцитів зростала, досягаючи достовірних відмінностей порівняно з контролем до 10 діб (контроль - 70 ± 7%; 3 доби дегідратації-69 ± 5,5%; 6 добу - 76 ± 5,9%; 10 добу - 95 ± 2,2%).

Вивчення деформаційних реакцій лейкоцитів проводилося на живих клітинах, поміщених в ізотонічную середу. Незважаючи на те, що глутаровий альдегід вважається фіксатором, яке зберігає прижиттєве стан клітини [3], морфометричні показники, заміряні для оцінки осморегуляторних реакцій виявилися нижчими, ніж отримані в даних дослідах. Значення діаметра лімфоцитів до деформації були 7,0-7,5 мкм. Відмінності результатів вимірювань можливо викликані впливом імерсійної середовища (сольовий розчин) і матеріалом мікрокамери при вивченні деформабельності, або глутарового альдегіду при оцінці об'ємних змін до гіпотонічних розчинах. Незважаючи на наявні відмінності абсолютних значень первинних параметрів, динаміка їх змін дозволяє оцінити опірність лейкоцитів механічних впливів і зіставити з даними по осморегуляції.

Таблиця 2

Деформаційні зміни і час відновлення вихідної форми лейкоцитів на різних стадіях зневоднення організму

Примітка. Р1 - вихідна площа поверхні клітин; Р2 - площа поверхні деформованих клітин; V1-вихідний об'єм клітин; V2 - об'єм деформованих клітин, Т - час відновлення вихідної форми лейкоцитів. Зірочкою позначена достовірність відмінностей порівняно з контрольною групою (р <0,01); кружечком - внутрішньогрупові відмінності у порівнянні з вихідними показниками (р <0,01).

Деформація клітин при проходженні через мікрокапіляр за рахунок додатку зовнішніх сил здійснювалася при постійному обсязі і збільшенні площі поверхні (табл. 2). Використовуваний при цьому "мембранний резерв" був фактично однаковим у тварин всіх груп і складав 32-35%. Зазначеного вище зменшення обсягу циркулюючих клітин на 3 добу дегідратації цією методикою не виявлено. Важливим показником, що дає судити про функціональний стан клітин є час відновлення вихідної форми після деформації. Динаміка цієї характеристики відображена в табл. 2. Порівняльна оцінка використання "мембранного резерву" при деформації лейкоцитів і при набуханні в середовищах з низькою осмолярністю показала, що в контрольній групі він використовується приблизно в тому ж "кількості" (35% і 33%). У тварин експериментальних груп перетворення клітин з сферичних в циліндричні йде за рахунок такого ж "резерву" мембрани, що і у інтактних тварин, а об'ємні зміни в гіпотонічних розчинах виражені значно слабше.

Обговорення результатів

Аналіз отриманих даних дозволив встановити, що при дії на лейкоцити інтактних тварин осмотичних і механічних чинників включаються ауторегуляторние механізми. Вони обумовлюють ефективне використання пластичних властивостей цитоплазматичної мембрани, інших клітинних структур і швидке відновлення геометричної форми. Останнє має важливе функціональне значення, тому що клітинний обсяг виконує роль вторинного посередника у регуляції відносної ефективності анаболізму і катаболізму [5]. Водна депривація вже на першому етапі (3 добу) веде до ослаблення реактивності вивченою клітинної системи, про що свідчать менші зміни обсягу в гіпотонічних середовищах. Тривалий безводну утримання тварин супроводжується дезінтеграцією механізмів клітинної ауторегуляції. При однакових з інтактними тваринами вихідних параметрах клітини і динаміці об'ємних змін, вираженість останніх значно нижче. Паралельно зростає осмотична стійкість і час відновлення до вихідної форми після деформації. Поясненням цих фактів можуть служити дані про індукції в клітці синтезу білків, що збільшують стійкість до різних факторів. При цьому підвищується в'язкість цитоплазми аж до її желатинізації. В основі гелеутворення лежить полімеризація актину та освіта тривимірної мережі [1,2]. Желатинизация цитоплазми є паранекротіческім зрушенням, але на оборотних стадіях пошкодження фізіологічні функції залишаються на високому рівні [1].

Список літератури

[1] Александров В.Я. Реактивність клітин і білки. Наука. Л. 1985.

[2] Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифічний адаптаційний синдром клітинної системи. Наука. Л. 1987.

[3] Дуглас С.Д., Куї П.Г. Дослідження фагоцитозу в клінічній практиці. Медицина. М. 1983.

[4] Купріянов В.В., Магомедов М.А., Тихомиров А.М. Стан мікроциркуляторного русла брижі при експериментальній дегідратації. Арх. Анат. 77 (8): 5-13. 1979.

[5] Орлов С.Н., Новіков К.Н. Регулювання об'єму клітин: механізми, пов'язані клітинні реакції і патофизиологическое значення. Фізіолого. журн. ім. І. М. Сєченова. 82 (8-9): 1-15. 1996.

[6] Федорова М.З., Левін В.М. Метод комплексного дослідження геометрії, площі поверхні, резервних можливостей мембрани і осморегуляції лейкоцитів крові. Клинич. лабор. діагн. (11): 44-46. 1997.

[7] Tran-Son-Tay R., Needham D., Yeung A., Hochmuth RM Time-dependent recovery of passive neutrophils after large deformation. Biophys. J. Biophisical Society. 60: 856-866. 1991.