На правах рукопису Євфратового Олена Сергіївна ПАТОГЕНЕТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ Субпопуляції лімфоцитів ПРИ Геморагічна лихоманка з нирковим синдромом 14.00.10 - Інфекційні хвороби 14.00.36 - Алергологія та імунологія АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук Санкт-Петербург - 1998 Робота виконана в Самарському Державному Медичному Університеті Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Рощупкін В.І. Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Подлевський А.Ф. доктор біологічних наук Полевщіков А.В. Провідна установа: Санкт-Петербурзький державний медичний університет імені академіка І. П. Павлова. Захист дисертації відбудеться "_______________" 1998 року в "___" годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 106.03.05 у Військово-медичної академії (194044, Санкт-Петербург, вул. Лебедєва, буд.6) З дисертацією можна ознайомитися у фундаментальній бібліотеці Військово- медичної академії. Автореферат розісланий "___" _______________ 1998 Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Ляшенко доктор медичних наук, професор Юрій Іванович ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ АКТУАЛЬНІСТЬ. Боротьба з вірусними інфекціями входить в розряд однієї з найбільш актуальних проблем сучасної медицини. Особливу категорію даних захворювань складають зоонозні інфекції, що мають певні ареали поширення в дикій природі. До їх числа відноситься геморагічна лихоманка з нирковим синдромом (ГЛПС) - ендемічна для Середньоволзька регіону захворювання, що викликається представниками роду хантавірусів і що виявляється у людини у формі гостро протікає інфекції з ознаками гострої ниркової недостатності (ГНН) і виражених геморагічних проявів (В. І. Рощупкин , А. А. Суздальцев, 1990). Враховуючи можливість важкого перебігу захворювання, що вражає найбільш працездатну вікову категорію населення, труднощі проведення інтенсивної терапії при корекції важкої ниркової недостатності, неоднозначний підхід до доцільності глюкокортикостероїдної терапії, обрана тема досліджень є актуальною. Основоположними у генезі гострої ниркової недостатності при ГЛПС в даний час визнані імунопатологічні механізми (В. І. Рощупкин, 1969; А. А. Суздальцев, Л. Н. Єланська, Л. Н. Новомлінцева, 1988; EJJoiken, J. Lahdevirta, J. Collan , 1978). Механізми ниркової недостатності при ГЛПС В. І. Рощупкин (1968 р.) у своїй гіпотезі аутоімунного ушкодження пояснив як прояви гуморальної імунної відповіді, спрямованого проти продуктів деструкції тканин, розвивається під дією вірусу. Дані про значення гуморального типу імунного реагування при ГЛПС підтверджуються результатами дослідження В-системи лімфоцитів, що дає значну динаміку в ході вказаної інфекції (О. А. Алексєєв, 1990; Ф. С. Жарський, 1987; RMLewis, HWLee, AFSee et al., 1991). Відомості про стан Т-клітинної відповіді при ГЛПС дуже мізерні і часом дослідження проводилися недостатньо досконалими методами (Л. Н. Новомлінцева, 1984; Ф. С. Жарський, О. А. Конєва, 1985; Q. Gao, XNWang, 1989; C . Huang, B. Jin, M. Wang et al., 1994). Є в науковій літературі та відомості про роль окремих субпопуляцій лімфоцитів / макрофагів крові в імунній відповіді при ГЛПС (Г. А. Мавзютова, 1996; M. Linderholm, L. Bjermer, P. Juto et al, 1993; A. Markotic, S. Rabatic, A. Gagro et al., 1998). Однак патогенетичний вплив даних клітин на тривалість і тяжкість перебігу інфекційного процесу, залежність від періоду захворювання не знайшло в них достатнього відображення, що підкреслює актуальність проведеного нами дослідження. У даній роботі основним об'єктом вивчення служать лімфоїдної-макрофагальні клітини крові хворих ГЛПС, а виконана вона з точки зору клініко-лабораторного імунологічного дослідження. Цей науковий напрямок - клінічна імунологія - надзвичайно бурхливо розвивається в останні роки і у нас в країні і за кордоном. Його актуальність підтверджується великою монографічним матеріалом, підкреслюється в роботах провідних імунологів останніх років (Р. В. Петров з співавт., 1982, Р. І. Сепиашвили з співавт., 1997, J. Brostoff et al., 1994, I. Roitt et al., 1996). Певну значимість проблеми надають методичні підходи до її виконання. В останні роки розроблені досить точні і високоспецифічні методи визначення кількісного складу субпопуляцій лімфоцитів / макрофагів у крові хворих з різними захворюваннями иммунопатологического генезу (Р. М. Хаитов з співавт., 1986, 1995, А. Н. Чередеев, Л. В. Ковальчук, 1997). Імунодіагностичні значення використання подібних сучасних методик при вірусних інфекціях, зокрема, ГЛПС, робить роботу актуальною в методичному плані. МЕТА РОБОТИ. Визначити імунодіагностичні та прогностичну значущість динаміки змін з боку субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів у крові хворих ГЛПС відповідно до періодів захворювання, ступенем його тяжкості і застосуванням глюкокортикостероїдні препаратів. ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ: Провести угруповання клінічних, клініко-лабораторних та біохімічних ознак у хворих ГЛПС відповідно до періодів і фазами захворювання, ступенем тяжкості і застосуванням глюкокортикостероїдні препаратів. Визначити загальний характер змін з боку субпопуляцій лімфоцитів / макрофагів крові при ГЛПС, а також можливість впливу статі і віку хворих на імунологічні показники. Визначити динаміку імунологічних зрушень, їх специфічність при ГЛПС і відповідність клінічними ознаками при легкій, середньотяжкій (із застосуванням і без застосування кортикостероїдних препаратів) і важкої (із застосуванням і без застосування кортикостероїдних препаратів) формах захворювання. Підтвердити імунодіагностичні значимість виявлених змін при ГЛПС залежно від періоду, ступеня тяжкості захворювання та особливостей лікування. Визначити прогностичні критерії динаміки змін імунного статусу для розвитку несприятливих та ускладнених форм перебігу ГЛПС. НАУКОВА НОВИЗНА. - Вперше проведено вивчення субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів у крові хворих ГЛПС шляхом детального аналізу його відповідності окремих періодах в перебігу захворювання; визначено закономірності динаміки імунологічних зрушень; - встановлена залежність динаміки імунологічних зрушень від ступеня тяжкості захворювання; - виявлено варіанти імунологічної перебудови організму хворого при ГЛПС відповідно до особливостей індивідуального імунного реагування; - визначено специфічні для ГЛПС імунодіагностичні ознаки; - розроблено імунодіагностичні критерії оцінки патогенезу ГЛПС у хворих з різним ступенем тяжкості захворювання і формою імунного реагування; - розроблено іммунопрогностіческіе критерії несприятливого перебігу і розвитку ускладнених форм ГЛПС; - розроблені імунологічні показання та протипоказання для призначення кортикостероїдних препаратів при важких формах ГЛПС. ПРАКТИЧНА ЗНАЧИМІСТЬ. 1. Обгрунтовано використання в лабораторній діагностиці при ГЛПС методів визначення субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів у крові хворих. 2. Встановлено імунодіагностичні критерії розвитку інфекційного процесу при ГЛПС відповідно до періодів, фазами і ступенем тяжкості захворювання. 3. Визначено критерії диференціальної діагностики ОПН вірусного та токсичного генезу. 4. Розроблені схеми імунопатогенезі для легкого, середньотяжкого і тяжкого перебігу ГЛПС. 5. Виявлено імунологічні показання та протипоказання для призначення кортикостероїдних препаратів при важких формах ГЛПС. Положення, що виносяться на захист: Кількісний склад та динаміка змін з боку субпопуляцій лімфоцитів / макрофагів у крові хворих ГЛПС можуть служити діагностичним і прогностичним критерієм розвитку різних клінічних форм ГЛПС. Оцінка кількісного складу та динаміки змін субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів крові при ГЛПС вимагає врахування індивідуальних особливостей імунного реагування організму хворого. Оцінка кількісного складу та динаміки змін з боку субпопуляцій лімфоцитів / макрофагів у крові хворих ГЛПС допомагає у виробленні показань і протипоказань до призначення кортикостероїдних препаратів. РЕАЛІЗАЦІЯ і апробації роботи За темою дисертації опубліковано 13 робіт, всі в центральній пресі. Матеріали досліджень були повідомлені на засіданні Обласної асоціації інфекціоністів (Самара, 1997р.), На 1-ій і 2-ий Національних конференціях Російської Асоціації алергології та клінічної імунології (Москва, 1997, 1998), на підсумковій науковій конференції професорсько-викладацького складу військово- медичного факультету СамГМУ (Самара, 1997р.), підсумковій річній конференції центральної науково-дослідної лабораторії СамГМУ (Самара, 1997р.), на III (Ізраїль, 1997) і IV (Сочі, 1998) Міжнародному конгресах з іммунореабілітологіі, на II республіканській науково- практичної конференції (Іжевськ, 1998). Матеріали роботи включені в навчальний матеріал для викладання курсу інфекційних хвороб та мікробіології з імунологією і вірусологією на відповідних кафедрах Самарського державного медичного університету (СамГМУ). Імунодіагностичні та прогностичні критерії, розроблені у процесі виконання роботи, використовуються в практиці клініки інфекційних хвороб СамГМУ і Самарського обласного діагностичного центру. Первинна апробація дисертації проведена на спільному засіданні кафедри інфекційних хвороб, мікробіології з курсом клінічної імунології та вірусології СамГМУ. ОБСЯГ І СТРУКТУРА РОБОТИ Дисертація представлена на 177 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу; огляду літератури; голови, присвяченій матеріалам та методам дослідження, 3 розділів власних спостережень; глави обговорення отриманих результатів; висновків; практичних рекомендацій і покажчика літератури. Робота ілюстрована 27 таблицями, 60 малюнками. Покажчик літератури включає 207 джерел, з них 99 вітчизняних і 108 іноземних. ЗМІСТ РОБОТИ Матеріали і методи дослідження Всього обстежено 180 осіб. Під спостереженням перебувало 125 хворих ГЛПС у віці від 15 до 68 років. Більшість хворих (76%) входили у вікову групу до 45 років. Серед обстеженого контингенту переважали чоловіки (83%). Окрему групу становили 11 пацієнтів з нирковою недостатністю неінфекційної (токсичної) природи (група зіставлення). До неї увійшли хворі з ОПН, що розвилася внаслідок інтоксикації сурогатами алкоголю та наркотичними речовинами, лікарськими препаратами та іншими токсичними продуктами. У контрольну групу входили 44 клінічно здорових донора відповідних вікових груп. Діагноз ГЛПС ставився на підставі характерної клінічної картини захворювання з урахуванням даних епіданамнезу і лабораторних досліджень. Серологічне підтвердження діагнозу ГЛПС за допомогою РНІФ в парних сироватках проведено вибірково у 70 хворих (56%). Захворювання протікало в легкій формі у 35% випадків, в среднетяжелой - у 35% і важкою - в 30%. У 12% хворих среднетяжелой формою і у 22% хворих на тяжку форму до складу комплексної терапії входили глюкокортикостероїдні препарати. Показаннями до призначення кортикостероїдів (КС) при ГЛПС вважалося перебіг захворювання із загрозою розвитку вираженої ниркової недостатності, тривалим олігуріческім періодом, розвитком інфекційно-токсичного шоку або вираженими менінгоенцефалітіческімі проявами (Г. С. Ковальський, Т. В. Ковальська, 1965, В.І . Рощупкін, А. А. Суздальцев, 1995). При характеристиці окремих періодів хвороби ми керувалися класифікацією В. І. Рощупкина (1970), згідно з якою в перебігу хвороби виділялися наступні періоди: початковий (1-3 день хвороби), олігуріческій (з 2-4 по 8-11 день хвороби), поліуріческій (з 7-13 по 15-22 день хвороби) і реконвалесценції (до 30-35 дня від початку хвороби). Відповідно до згаданої класифікації, в олігуріческом періоді виділялася перша фаза (температура тіла висока, ниркові прояви помірно виражені) і друга, коли температура тіла найчастіше знижувалася, а прояви ниркового синдрому досягали максимуму. Тривалість першої (гарячкової) фази - з 2-3 по 6-7 дні хвороби, другий (безліхорадочний) - до 10-11 дня хвороби. У поліуріческом періоді виділялася перша фаза, що супроводжувалася високим рівнем сечовини і креатиніну сироватки крові, і другу (з 13-14 до 19-22 дня хвороби), коли в більшості випадків нормалізувався рівень сечовини і креатиніну, а виражена поліурія ще зберігалася. Оцінка ступеня тяжкості захворювання проводилася з урахуванням клінічних та біохімічних критеріїв (В. І. Рощупкин, 1969, Г. С. Ковальський, 1970). Для важкої форми ГЛПС характерні були високий ступінь уремії (сечовина вище 19 ммоль / л, креатинін вище 300 мкмоль / л), зниження добового діурезу менше 300 мл на добу, геморагічні прояви у вигляді кровотеч і гематом різної локалізації, макрогематурії, геморагічної висипки (У . І. Рощупкин, 1969; JVPether, G. Lloyd, 1993; B. Settergren, P. Juto, B. Trollfors et al., 1989). Не можна не відзначити, що існує ряд клінічних ознак, вже в ранні терміни хвороби чарують розвиток важких форм ГЛПС. До них відносяться болісні болі в попереку і животі; різке зниження гостроти зору на фоні сильного головного болю, сухості в роті і спраги; сильна блювота; виражений геморагічний синдром (А. А. Суздальцев, 1992), неврологічна симптоматика (OAAlexeyev, VGMorozov, 1995 ). Тахікардія і артеріальна гіпертензія (В. І. Рощупкин, А. А. Суздальцев, 1990) є також прогностично несприятливими. З лабораторних показників тяжкості захворювання слід відзначити виражений лейкоцитоз, масивну протеїнурію, ранні прояви уремії (А. А. Суздальцев, 1992; B. Settergren, P. Juto, B. Trollfors et al., 1989). Среднетяжелой форма характеризувалася помірними проявами уремії (сечовина від 8,5 до 19 ммоль / л, креатинін від 135 до 300 мкмоль / л) і геморагічного синдрому, діурез знаходився в межах від 300 до 900 мл на добу. Легкій формі відповідали нормальні показники сечовини і креатиніну, відсутність геморагічних проявів, незначне зниження добового діурезу. У всіх хворих велося динамічне спостереження за змінами показників загального аналізу крові і сечі, добового діурезу, проводилися проби за Зимницьким і Нечипоренко. У процесі спостереження за хворими особлива увага зверталася на наявність залишкових явищ у період реконвалесценції у вигляді стійкої артеріальної гіпертензії, тривалою гематурії, астеновегетативних проявів та інших клінічних та лабораторних ознак. Рівень сечовини в сироватці крові вивчався за допомогою кольорової реакції з діацетілмонооксіном (В. В. Меньшиков з співавт., 1987, CLCrocker, 1967, W. Marsh et al., 1965), визначення ж креатиніну в сироватці крові проводилося за кольоровою реакцією Яффе ( В. В. Меньшиков з співавт., 1987, R. Richerich, 1969). Всі, хто знаходилися під наглядом особи були піддані імунологічного тестування. З цією метою загальноприйнятим методом центрифугування в градієнті щільності фіколл-верографина (Pharmacia chemical, Uppsala, Sweden) проводилось виділення фракції лімфоцитів / макрофагів з периферичної крові. Вивчення субпопуляційного складу лімфоцитів крові об'єктів дослідження здійснювалося імуноферментним методом за допомогою діагностичного набору "Комплект моноклональних антитіл (МКА) для оцінки імунного статусу людини імуноферментним методом" (НВО "Діагнотех"). Були використані наступні МКА: DT-anti-CD3 (специфічність - зрілі Т-клітини); DT-anti-CD4 (Т-хелпери/індуктори); DT-anti-CD8 (супресорні / цитотоксичні Т-клітини); DT-anti- CD16 (NK-клітини, гранулоцити, макрофаги); DT-anti-CD22 (В-лімфоцити); DT-anti-HLA-DR (специфічність - мономорфная детермінанта антигенів гістосумісності II класу). Як коньюгата використовувався антімишіний імуноглобулін, мічений ферментом пероксидазою. Математична та статистична обробка отриманих даних здійснювалась на персональному комп'ютері IBM AT за допомогою пакета програм Microsoft Excel та пакету статистичних програм SPSS, а також оригінальних авторських програм. З метою комплексної оцінки субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів крові був застосований кореляційний і системний багатофакторний аналіз (М. В. Углова, Б. А. Углов, 1987). РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Показники субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів крові при ГЛПС. У процесі проведення досліджень було детально проаналізовано зміст основних субпопуляцій лімфоцитів / макрофагів у крові хворих ГЛПС, причому аналіз показників імунного статусу здійснювався у суворій відповідності з клінічними даними: враховувалися ступінь тяжкості, періоди і фази захворювання, проведення гормонотерапії (остання не використовувалася при легкому перебігу даної інфекції) . Динаміка загальної кількості лімфоцитів і моноцитів в крові хворих показала відносно малу діагностичну значимість даних показників при ГЛПС. Було також встановлено відсутність достовірної статевої та вікової залежності динаміки імунологічних параметрів при даному захворюванні. Більш інформативним виявився аналіз змісту окремих субпопуляцій серед лімфоїдної-макрофагальний клітин крові хворих ГЛПС. Динаміка показників для CD3-субпопуляції залежала від ступеня тяжкості та періоду розвитку ГЛПС. При легкому перебігу ГЛПС змін з боку CD3-субпопуляції не спостерігалося. При середньотяжкому перебігу захворювання в олігуріческій період реєструвалося достовірне зниження показника лише в першу фазу (у 1,2 рази), якщо не застосовувалися КС-препарати, і в обидві фази (в 1,3 рази) - на тлі КС-терапії. При важкому перебігу ГЛПС число CD3 +-лімфоцитів зменшувалася в другу фазу незалежно від застосування гормонів (в 1,3 рази). CD4-субпопуляція найбільшою мірою проявляла залежність від періоду інфекційного процесу при ГЛПС. Зниження кількості Т-хелперних клітин спостерігалося в олігурію при всіх варіантах клінічного перебігу даного захворювання. Найбільш значним (в 1,2-1,8 рази) воно було при середньотяжких формах. Перехід захворювання в стадію поліурії супроводжувався підвищенням цього параметра до нормальних цифр у більшості випадків легких форм захворювання, при середньотяжкому перебігу останній залишався зниженим до закінчення поліуріческого періоду. Варіанти важкого перебігу ГЛПС поєднувалися з низькою кількістю CD4 +-клітин тільки в умовах гормонотерапії, тоді як у хворих, що не піддавалися КС-терапії, перехід в стадію реконвалесценції характеризувався підвищенням вмісту Т-хелперів в крові в 1,3 рази. Величина падіння рівня CD8 +-клітин виявлялася по-різному при захворюваннях різного ступеня тяжкості. Так, при легких і середньо варіантах перебігу зміни коригувалися у другу фазу поліурії. При важких формах вони були характерні, в основному, для олігурії (в 1,5 рази), а в стадію реконвалесценції в 1,6 рази перевищували нормативи. Особливо чітко ці зміни відмічалися у пацієнтів під час відсутності гормонотерапії. Середні показники числа CD22 +-клітин (неактивованих В-лімфоцитів) давали відхилення від нормальних величин, приблизно відповідне динаміці попереднього показника. Відмінність полягала в деякому запізнюванні нормалізації даних при легкому і середньотяжкому перебігу ГЛПС, в той час як при важких формах захворювання зміст СD22-позитивних клітин відповідало такому в контрольній групі вже в другу фазу поліуріческого періоду. Здатність клітин лімфоїдної-макрофагальної низки до експресії CD16 маркера також знижувалася при ГЛПС протягом олігуріческого і поліуріческого періодів при всіх формах захворювання, крім важкого перебігу, коли, починаючи з другої фази поліурії, цей показник перевищував за значенням такої у здорових осіб в 1,7 -2,3 рази. Динаміка вмісту HLA-DR +-клітин у крові при ГЛПС в значній мірі повторювала зміни з боку СD16-субпопуляції. Враховуючи той факт, що зміст окремих лімфоїдної-макрофагальний клітин крові змінювалося в ході ГЛПС в залежності від стадії захворювання, ступеня тяжкості інфекційного процесу та введення в схему лікування КС - препаратів, нами було проведено пошук такого принципу класифікації даних, який у поєднанні з кореляційним аналізом результатів дозволив би більш детально охарактеризувати участь окремих CD-субпопуляцій в реалізації імунної відповіді. З цією метою нами була проведена оцінка статистичної значущості кожного з показників вмісту CD-субпопуляцій в крові хворих ГЛПС. У олігуріческій період захворювання негативну кореляцію з характерними біохімічними ознаками ГЛПС - зростанням рівня сечовини та креатиніну сироватки крові, виявив тільки один імунологічний показник - число CD22 +-клітин у крові хворих. У результаті цієї та інших серій статистичних досліджень було вирішено провести угруповання показників вмісту CD-субпопуляцій в крові хворих ГЛПС відповідно трьом інтервалам значень для CD22 +-клітин за шкалою розподілу частот: низька (<21%), помірне (21-32%) та високу (> 32%) вміст CD22 +-лімфоцитів. Оскільки CD22-маркер експресується тільки неактивований В-клітинами, за вихідну гіпотезу було прийнято припущення про те, що низький вміст CD22 +-лімфоцитів свідчить про виражену активації цих клітин у ході імунного процесу, а висока, навпаки, про їх депресивному стані. Аналіз співвідношення імунологічних показників при легкому перебігу ГЛПС. При легкому перебігу ГЛПС (Рис.1) угруповання даних у відповідності до кількості CD22 +-клітин виявила набагато більше розбіжностей між показниками, ніж було зареєстровано по всій сукупності даних. Високих значень CD22 +-лімфоцитів в олігуріческом періоді при легкому перебігу ГЛПС ми не спостерігали. 
періоди захворювання періоди захворювання періоди захворювання Рис.1. Коефіцієнти відхилення для CD22 + (Ряд1), CD3 + (Ряд2), CD4 + (ряд3), CD8 + (Ряд4), CD16 + (Ряд5), HLA-DR + (Ряд6) клітин при легкому перебігу ГЛПС на тлі початково низького (А), помірного (Б ) змісту CD22 +-лімфоцитів в олігуріческом періоді і з підвищенням їх числа в поліуріческом (В) періоді. При низькому вмісті CD22 +-лімфоцитів (<21%) кількість CD3 +-клітин у олігуріческом періоді відповідало нормальним значенням (62,3 + 1,9%), а CD4-, CD8-і CD16-субпопуляції показували стабільно низькі значення (зменшувалися відповідно в 1,5; 1,6 і 1,9 раза). Ситуація змінювалася тільки в другій фазі поліуріческого періоду, коли CD8 +-лімфоцити давали негативну "пік" значень (в 1,8 рази), а число CD16 +-клітин починало різко зростати (на 77%). Це збігалося з ростом CD22 +-лімфоцитів, а також HLA-DR +-клітин. Очевидно, що підвищення числа клітин, що експресують HLA-DR маркер, пов'язано з двома останніми субпопуляціями. У клінічному перебігу захворювання в цих випадках ми жодного разу не відзначали відхилень від типового перебігу захворювання, характерного для ГЛПС легкого ступеня тяжкості: відновлення добового діурезу, зникнення больового синдрому наставало у звичайний термін (5-7 днів). При помірному змісті CD22 +-лімфоцитів в крові (21-32%) у олігуріческом періоді легких форм ГЛПС зазначалося стабільне зниження показників (CD8 + в 1,4 рази, CD16 + в 1,8 рази) без виражених змін в період поліурії. Однак у тих випадках легкого перебігу ГЛПС, коли в першу фазу поліуріческого періоду CD22 +-клітини давали підвищення рівня, стабільність субпопуляційного складу різко порушувалася: наростало кількість CD4 + (в 1,4 рази), CD8 + (в 1,5 рази) і CD16 +-клітин (у 2,2 рази). Причому, якщо перші дві категорії лімфоцитів починали показувати нормальні значення, то CD16 +-клітини кількісно зростали настільки різко, що значно перекривали цей параметр у контрольній групі. Подібна динаміка імунологічних показників супроводжувалася несприятливими клінічними проявами: стійкою артеріальною гіпертензією, загостренням фонових ниркових захворювань, зростанням частоти залишкових явищ в період реконвалесценції. Враховуючи зазначені закономірності, нами було висловлено припущення про визначальну роль гуморальної імунної відповіді у випадках легкого перебігу захворювання: чим активніше клітини, які здійснюють цю форму імунної відповіді на ранніх стадіях захворювання, тим сприятливіші протягом ГЛПС. Аналіз кореляційних зв'язків між окремими субпопуляціями підтвердив це припущення. Дійсно, при легкому перебігу захворювання в олігуріческій період активну участь у кореляції набували CD22 +-лімфоцити, CD16 +-клітини, що корелюють з HLA-DR + (макрофагі!), а в першу фазу поліурії - ще і CD4 + - тобто всі клітини, відповідальні за гуморальний імунну відповідь. У другу фазу поліурії спостерігалася негативна кореляція CD16 +-клітин з CD3 + при відсутності у складі кореляційних пар HLA-DR +, що дає підставу припускати зростання активності природних кілерів - ЄК - (СD16 + поза зв'язку з HLA-DR +) на цій стадії інфекційного процесу. Таким чином, сукупність наведених вище клініко-лабораторних даних дозволила виділити два варіанти імунної перебудови організму при легкому перебігу ГЛПС, що впливають на його клінічну картину. Перший варіант: неускладнений перебіг, коли кількість CD22 +-клітин у крові не перевищувало 32% в олігуріческом періоді і залишалося на цьому рівні в поліуріческій період. При даному варіанті активність лімфоцитів, що визначають клітинну імунну відповідь, була невелика (щодо низький вміст CD8 + і CD16 +-клітин у крові). Наші спостереження дозволяють вважати, що даний варіант легкого перебігу ГЛПС протягом усього захворювання, супроводжується вираженими проявами гуморальної імунної відповіді. В якій мірі ці реакції можуть носити противірусний або аутоімунний характер, в даній роботі навряд чи можна довести. Зазначимо тільки, що кореляції між інтенсивністю зареєстрованих змін імунного статусу і величиною титрів специфічних антитіл до хантавірусів нами відзначено не було. Ця обставина більшою мірою свідчить на користь аутоімунного процесу. Другий варіант: відхилення від типового перебігу, коли початково невисока кількість CD22 +-клітин зростала в першу фазу поліуріческого періоду з наступним значним зростанням числа клітин, які несуть CD16-маркер в кореляції з HLA-DR +-клітинами. Ми припускаємо, що, починаючи з переходу в поліурію, інтенсивність гуморальної імунної відповіді зберігалася майже виключно за рахунок ефекторних механізмів елімінації антигенів за участю макрофагів, тим більше, що особливих змін з боку лімфоцитів, що беруть участь у клітинному імунній відповіді, ми тут не відзначали. У цілому гіпотетичні уявлення про взаємозв'язок клінічних особливостей легкого перебігу ГЛПС та імунологічних проявів даної форми захворювання представлені в схемі на Рис.2. (Стор.17) Аналіз співвідношення імунологічних показників при середньотяжкій формі ГЛПС. При середньотяжкому перебігу, також як і при легких формах ГЛПС , ми виділили два варіанти клінічного перебігу інфекційного процесу з відмінностями в імунопатогенезі, а основним імунологічним критерієм такої відмінності служила динаміка в кількості CD22 +-клітин. При цьому ми не стикалися з випадками високого змісту даної субпопуляції в крові хворих. Іншими словами, у схемі імунопатогенезі середньотяжкого перебігу ГЛПС також чітко проявляється залежність від індивідуальних особливостей імунного реагування організму хворого (Мал.3). 
періоди захворювання періоди захворювання періоди захворювання Рис.3. Коефіцієнти відхилення для CD22 + (Ряд1), CD3 + (Ряд2), CD4 + (ряд3), CD8 + (Ряд4), CD16 + (Ряд5), HLA-DR + (Ряд6) клітин при середньотяжкому перебігу ГЛПС на тлі початково низького (А), помірного (Б ) змісту CD22 +-лімфоцитів в олігуріческом періоді і з підвищенням їх числа в поліуріческом (В) періоді. Для низького змісту CD22 +-клітин (<21%) найбільш характерним було поєднання з низьким рівнем CD4 +-субпопуляції протягом олігуріческого періоду і першої фази поліурії (зменшення в 1,6 рази). Потім величини показника наростали і до періоду реконвалесценції досягали нормальних значень. Це зростання протягом другої фази поліурії і реконвалесценції збігався з вираженим зменшенням числа неактивованих В-лімфоцитів (CD22 +) (в 1,6 рази). Що стосується інших субпопуляцій, то вони демонстрували стабільне зниження. Таким чином, розвиток гуморальної імунної відповіді при середньотяжкому перебігу ГЛПС навіть у найбільш сприятливому варіанті як би запізнювалася в порівнянні з легкими формами хвороби. Особливістю імунологічної перебудови при даному варіанті перебігу ГЛПС служила і певна послідовність залучення лімфоцитів в клітинний імунну відповідь. У олігуріческом періоді найбільше відхилення убік зменшення показників виявляли СD16 +-клітини на тлі нормальних величин з боку клітин, що експресують НLА-DR маркер (тобто мова йде про ЄК, що не несуть цей маркер у складі рецептора). Зниження їх кількості реєструвалося не тільки при ГЛПС, але і при середньотяжких формах ОПН токсичної природи. Враховуючи цей факт, а також неспецифічний характер взаємодії ЄК з клітинними мішенями і здатність їх до участі як у реакціях противірусного захисту, так і в аутоімунних процесах, виникає припущення про те, що в ранні періоди ГЛПС ці клітини є учасниками механізмів аутоімунного ушкодження в нирках. Починаючи з олігурії і в першу фазу поліуріческого періоду, спостерігалося зниження рівня СD4 +-лімфоцитів. На тлі відсутності в цей період динаміки з боку клітин, що відповідають за гуморальну імунну відповідь, можна думати про участь у клітинних реакціях Тh1, які відносяться до категорії СD4 +. Ці клітини разом з СD16 субпопуляцією з високим ступенем достовірності корелюють з рівнем сечовини і креатиніну в олігуріческом періоді ГЛПС. З другої фази поліуріческого періоду домінуючу роль у клітинних реакціях, судячи по динаміці і великій кількості кореляційних зв'язків, займали СD8 +-клітини (цитотоксичні Т-лімфоцити). Зміни з боку цих клітин при середньотяжких формах відносяться до числа специфічних ознак для ГЛПС, тому що, по-перше, показують високу кореляційну взаємозв'язок з рівнем сечовини при даному захворюванні, а по-друге, також як і СD22 +-лімфоцити, не знижуються при ОПН іншої етіології. Помірне зміст СD22 +-клітин (21-32%) у крові хворих на середньотяжкі формами ГЛПС змінювало імунологічний фон при даному захворюванні в бік ще більшого переважання клітинних імунних реакцій. Останні досягали максимуму розвитку за участю всіх зацікавлених субпопуляцій (СD4 +, СD8 +, СD16 +) ще в першу фазу олігуріческого періоду. СD22 +-лімфоцити практично не мали динаміки і показували досить стабільний рівень протягом усього захворювання, з усіх ознак гуморальної імунної відповіді можна вказати лише на деяку кореляцію в динаміці НLА-DR + і СD16 + клітин (макрофагів) протягом першої фази поліуріческого періоду. Переважання клітинної імунної відповіді ми пов'язували з великою різноманітністю клінічних проявів та розвитком ускладнень в перебігу ГЛПС: з 25 осіб, віднесених до зазначеної підгрупу, тільки в одного не було встановлено будь-яких особливостей у порівнянні з групою хворих із середньотяжким перебігом ГЛПС на тлі початково низького змісту СD22 +-клітин. В інших випадках мали місце явища менінгізму, більш виражені і тривалі прояви інтоксикації (головний біль, нудота, блювота, астеновегетативні порушення) і больового синдрому (інтенсивні болі в попереку і животі), артеріальна гіпертензія, відставання нормалізації лабораторних показників. У рамках даної групи хворих доцільно виділити категорію з 4 осіб, у яких у другу фазу поліуріческого періоду спостерігалося стійке зростання рівня СD22 +-лімфоцитів вище 32%. Всі ці пацієнти мали особливості в перебігу захворювання у вигляді вираженого геморагічного синдрому (петехіальний висип, носові кровотечі, субсклеральние гематоми та ін), а один з них ще й у вигляді загрози розвитку гострої серцево-судинної недостатності (стійке зниження артеріального тиску протягом всього періоду олігурії). Найбільш значні зміни в иммунограмме виявлялися у вигляді інтенсивного зростання показників вмісту СD8 + і СD16 +-клітин у крові (відповідно на 156 і 149%), починаючи з другої фази поліуріческого періоду. Відзначено чітку відповідність динаміки цих показників, якому супроводжувало збільшення з боку СD4 + і НLА-DR +-клітин. Відповідність цих імунологічних ознак певними клінічними змін дозволяє нам із тією чи іншою мірою достовірності інтерпретувати їх як дуже різко виражену форму клітинної імунної відповіді, що протікає в судинному руслі за участю цитотоксичних Т-лімфоцитів і ЄК. Отже, середньотяжкий протягом ГЛПС з іммунопатогенетіческой точки зору (схема на Рис.4) (стор.18) відрізняється від легкого перебігу переважанням механізмів клітинної імунної відповіді. Варіант підвищення числа СD22 +-клітин не стільки в олігурію, скільки в поліуріческій період ми трактували як переважання клітинних реакцій, що протікають в судинному руслі. Контроль частки специфічних (Tctl - опосередкованих) або неспецифічних (ЄК - опосередкованих) механізмів у цьому процесі доцільно здійснювати, орієнтуючись на кількість СD8 +-клітин у крові хворих, яке за сприятливого перебігу захворювання або стабільно залишається на низьких цифрах, або проявляє динаміку до зниження. Аналіз співвідношення імунологічних показників при важкій формі ГЛПС. Важкі форми ГЛПС показали більшу різноманітність як клінічних, так і відповідних їм імунопатологічних варіантів перебігу захворювання. Тут також велика діагностична роль такого критерію як рівень у крові СD22 +-лімфоцитів, причому останній показник набуває не тільки діагностичну, але і прогностичну значимість, оскільки ще в олігуріческій період дозволяє припустити можливість розвитку різноманітних ускладнень, в тому числі і загрожують життю хворого (інфекційно-токсичний шок, кровотечі різної локалізації, затяжна анурія). Про це свідчить той факт, що кількість СD22 +-лімфоцитів виявляло високу кореляційну взаємозв'язок з найважливішим біохімічним критерієм ступеня тяжкості цього захворювання - рівнем креатиніну сироватки крові. Ця кореляція носила негативний характер, тобто низькі рівні вказаних кліток поєднувалися з найбільш високими біохімічними показниками і відображали адекватність імунної відповіді на високу ступінь тяжкості патологічного процесу. Низький вміст СD22 +-клітин (<21%) в крові (Рис.5) у олігуріческій період при важкому перебігу ГЛПС, як і при інших формах захворювання, було прогностично найбільш сприятливим (неускладненим) з клінічної точки зору. Воно супроводжувалося неухильним зростанням числа HLA-DR +-клітин, яке досягало максимуму до першої фази поліурії. 
періоди захворювання періоди захворювання періоди захворювання Рис.5. Коефіцієнти відхилення для CD22 + (Ряд1), CD3 + (Ряд2), CD4 + (ряд3), CD8 + (Ряд4), CD16 + (Ряд5), HLA-DR + (Ряд6) клітин при важкому перебігу ГЛПС на тлі початково низького (А), помірного (Б ) і високого (В) змісту CD22 +-лімфоцитів в олігуріческом періоді. Потім їх кількість різко падав у другу фазу поліуріческого періоду (у 1,4 рази) і знову різко збільшувалося в період реконвалесценції (в 1,8 рази). Проведені дослідження показали, що описане падіння експресії HLA-DR маркера в другу фазу поліурії могло бути обумовлено підйомом числа природних кілерів (ЄК) в крові, про що свідчить збіг негативного "піку" HLA-DR +-клітин і позитивного "піку" CD16 + (підвищення в 2,3 рази). При помірному змісті CD22 +-лімфоцитів (21-32%) у крові хворих з важким перебігом ГЛПС деяке зниження числа HLA-DR +-клітин у другу фазу олігуріческого - першу фазу поліуріческого періодів поєднувалося з падінням кількості CD4 +-клітин (в 1,2 рази) . У цей же період відмічався низький вміст у крові CD8 + (в 1,3 рази) і CD16 + (в 1,7 рази) субпопуляцій. Перші до періоду реконвалесценції приходили за значеннями до норми, а другі, починаючи з другої фази поліуріческого періоду, давали дуже різкий підйом і в реконвалесценцію в 1,5 рази перевищували значення в контрольній групі. Зміни в иммунограмме свідчили про слабо вираженому гуморальному відповіді на тлі поступового наростання клітинних механізмів та їх переходa в судинне русло (збільшення числа клітин в крові). Клінічно зазначалося ускладнений перебіг інфекції при явищах інфекційно-токсичного шоку різного ступеня вираженості (26,7% хворих - 4 особи). Незважаючи на це у даних хворих зміна окремих періодів і фаз захворювання відбувалося в звичайні терміни і воно мало успішний результат. На відміну від легкого і середньотяжкого перебігу ГЛПС при важких формах вже у другу фазу олігуріческого періоду реєструвалися високі значення CD22 +-клітин (> 32%) і помітне їх панування (до 72%) на наступних стадіях захворювання. На практичних же прикладах було продемонстровано переважання клінічно несприятливих форм перебігу ГЛПС при даному варіанті імунної перебудови в ході захворювання: набагато більш виражені ниркові, геморагічні та інфекційно-токсичні порушення, зростання частоти залишкових явищ в реконвалесценцію. Високий вміст СD22 +-лімфоцитів в олігуріческом періоді супроводжувалося значним запізненням специфічних реакцій, а на перше місце виступали неспецифічні захисні механізми за участю СD16-субпопуляції. Особлива роль CD16 +-клітин при важкому перебігу ГЛПС і високому ЗМІСТ CD22 +-лімфоцитів виявлялася в різких підйомах перших в олігурію (у 2 рази) та період реконвалесценції (в 2,3 рази), а також спадом (в 1,7 рази) у першу фазу поліурії. Ці коливання не відповідали змінам з боку HLA-DR +-клітин, тобто, найімовірніше, були пов'язані з динамікою ЄК, не експресують HLA-DR маркер. Таким чином, при важкому перебігу прогноз розвитку ускладнень пов'язаний не тільки з СD22-субпопуляцією, але і вимагає обов'язкового обліку числа клітин, що відповідають за клітинні реакції (схема на Рис.6) (стор.19). Щоб встановити, якою мірою ці спостереження специфічні для ГЛПС, було проведено зіставлення субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів у другу фазу олігуріческого періоду ГЛПС, коли максимально проявляється ОПН, з варіантами розвитку цього стану в умовах токсичного ураження нирок. Порівняльний аналіз важких форм гострої ниркової недостатності вірусного та токсичного генезу показав, що відмінності відзначаються за кількісним складом всіх субпопуляцій, крім СD16 +-клітин, однак, ступінь таких відмінностей неоднозначна. Особливо велике невідповідність у кількості СD22 +-клітин, зниження яких при ГЛПС таке, що різниця між показниками при ОПН різної етіології збільшується до 60%. 
Рис.7. Діаграма відповідності інтегральних показників для субпопуляцій лімфоцитів / макрофагів процентному змісту CD22 +-клітин у крові хворих у олігуріческом (А) і поліуріческом (Б) періодах важкого перебігу ГЛПС без застосування (Ряд1) і із застосуванням (Ряд2) кортикостероїдних препаратів. Враховуючи той факт, що 70% обстежених нами хворих з важким перебігом ГЛПС отримували в ході лікування КС-препарати, а також результати клінічних спостережень, що показали, що в ряді випадків застосування гормонів поєднується з подовженням термінів захворювання, більшою вираженістю геморагічних проявів і зростанням частоти залишкових явищ в період реконвалесценції, ми визнали доцільною вироблення чітких діагностичних критеріїв для призначення гормонів. Для цього ми з допомогою системного багатофакторного аналізу провели зіставлення інтегральних показників субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів у крові хворих на тяжкі форми ГЛПС, отримували і не отримували кортикостероїди (Рис.7). Вплив останніх на інтегральні показники не залежало від періоду захворювання, а виявлялося в найбільшою мірою тільки при дуже низькому (9-14%) і дуже високому (36% і вище) вмісті CD22 +-клітин у крові, посилюючи їх. Оскільки високий вміст клітин, експерессірующіх CD22 маркер (неактивованих В-лімфоцитів), ми визнали клінічно несприятливою ознакою, то, відповідно до даних системного багатофакторного аналізу, ми припустили, що в тих випадках, коли процес активації цих клітин внаслідок тих чи інших причин ослаблений (число CD22 +-лімфоцитів перевищує 36%), призначення кортикостероїдних препаратів ще більше посилює імунодепресію і призводить до розвитку несприятливого перебігу захворювання. В И В О Д И Динамічне визначення субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів при ГЛПС має імунодіагностичні і прогностичну цінність і відображає характер імунологічних зрушень відповідно періодам і ступеня тяжкості захворювання. Характер зміни субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів при ГЛПС не залежить від статі і віку хворого, а його ведучим критерієм виступає число СD22 +-лімофцітов в крові в олігуріческій період, а також динаміка останніх у період поліурії. З точки зору визначення субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів при ГЛПС виділення двох фаз протягом олігуріческого і поліуріческого періодів захворювання слід вважати доцільним. Одним з критеріїв розмежування на фази можуть служити імунологічні параметри. При легкій, середньо-і важкій формах захворювання можливе існування кількох варіантів розвитку імунної відповіді, що впливають на клінічний прогноз несприятливого перебігу ГЛПС. При легкій формі ГЛПС імунологічним критерієм найбільш сприятливого клінічного перебігу захворювання служить стабільне зниження числа СD22 +-лімфоцитів в крові протягом всього захворювання. При середньотяжкій формі ГЛПС імунологічні критерії неускладненого перебігу захворювання включають стабільне зниження числа СD22 +-клітин протягом усього захворювання, а також відсутність динаміки в бік підвищення числа СD8 +-лімфоцитів, починаючи з другої фази поліуріческого періоду. При важкій формі ГЛПС прогностично сприятливими імунологічними критеріями розвитку інфекційного процесу поряд зі стабільним зниженням кількості СD22 +-лімфоцитів протягом олігуріческого періоду може бути паралельне зниження числа СD16 +-клітин. Динаміка з боку зазначених субпопуляцій в бік зростання понад нормативних значень на будь-якій стадії захворювання є прогностичною ознакою підвищення тяжкості процесу і розвитку ускладнень. Застосування кортикостероїдних препаратів, як правило, знижує показники субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів. Виняток становлять важкі форми ГЛПС на тлі нормального або підвищеного вмісту СD22 +-клітин, коли викликаний гормонами зростання імунологічних показників супроводжується підвищенням ризику розвитку ускладнень. ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ У практику лабораторно-діагностичних досліджень при ГЛПС доцільно включати визначення субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів крові з використанням моноклональних антитіл до CD і HLA-DR маркерами цих клітин. При проведенні иммунодиагностики ГЛПС і визначенні показань до призначення кортикостероїдних препаратів необхідно враховувати індивідуальні особливості субпопуляційного складу лімфоцитів / макрофагів у крові хворих. При цьому доцільно використовувати кількість CD22 +-клітин як провідний прогностичний критерій можливості розвитку ускладнень в перебігу ГЛПС. При проведенні диференціальної діагностики ОПН як клінічного ознаки ГЛПС або токсичної природи доцільно враховувати факт вираженого зниження рівня з боку СD22 і CD8 субпопуляцій як специфічних ознак ГЛПС. При проведенні иммунодиагностики ГЛПС доцільно орієнтуватися на схему залучення окремих субпопуляцій лімфоцитів / макрофагів в інфекційний процес на різних стадіях його розвитку та залежно від ступеня тяжкості захворювання, запропоновану в даній роботі. При призначенні кортикостероїдних препаратів у випадках тяжкого перебігу ГЛПС доцільно враховувати, що нормальне або високий вміст CD22 +-клітин є прогностично несприятливою ознакою. СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Імунологічні критерії реабілітації при геморагічної лихоманки з нирковим синдромом / тези доповіді / International Journal of Immunorehabilitation. Moscow. -1994 .- № 2.-Р.170. (Співавт. І. П. Балмасова, В. І. Рощупкин). Імуно-прогностичні критерії перебігу геморагічної лихоманки з нирковим синдромом (ГЛПС) / стаття / Сучасні проблеми алергології, клінічної імунології та імунофармакологів. Збірник праць. Москва. -1997.-с.314. (Співавт. В. І. Рощупкин, В. Г. Морозов). Marcers of large granular lymphocites (LGL) under the influence of epenephrine in vitro / тези / Immunology Letters.-Vol.56 .- № 1-3.-1997.-P.100.-/P.2.03.10 / (OVLavrov ). Зміни клітинної імунної відповіді при гострій нирковій недостатності різної природи / тези / International Journal of Immunorehabilitation. Moscow. -1997 .- № 4.-р.6. (Співавт. В. І. Рощупкин, В. Г. Морозов). Імунодіагностичні аспекти навантажувальних тестів з біогенними амінами / тези / International Journal of Immunorehabilitation. Moscow. -1997 .- № 4.-р.6. (Співавт. І. П. Балмасова, О. В. Лавров). Immunodiagnostic aspects of loading tests with biogenic amines / тези / International Journal of Immunorehabilitation. Moscow. -1997 .- № 5.-P.76. (IPBalmasova, OVLavrov). The changes of cell immune response in acute renal deficiency of viral etiology / тези / International Journal of Immunorehabilitation. Moscow. -1997 .- № 5.-Р.85. (VIRoshchupkin, VGMorozov). The role of renal insufficience in immunodedivssion mechanisms in haemorrhagic fever with renal syndrome / тези / The Immunologist. -1997.-Suppl.1.-P.65. (VIRoshchupkin, VGMorozov). The influence of macrophages on biogenic amines immunomoduling effects in vitro / тези / Le medecin Biopatologiste .- № 43-44. Paris 1997.-P.60. (OVLavrov, MFIvanov). A major outbreak of hemorrhagic fever with renal syndrome in the Samara region, European Russia / стаття / Infection. -1998.-Vol.26 .- № 5.-in divss (OAAlexeyev, AASuzdaltsev, VNVerhovtsev). Імунні механізми в патогенезі геморагічної лихоманки з нирковим синдромом / стаття / Терапевтичний архів.-1998 .- у пресі (О. А. Алексєєв, А. А. Суздальцев). CD-субпопуляції лімфоцитів і тяжкість перебігу геморагічної лихоманки з нирковим синдромом (ГЛПС) / тези / Актуальні проблеми пріродноочагових інфекцій. Збірник матеріалів. Іжевськ. - 1998.-С.99-100. CD-субпопуляції лімфоцитів і тяжкість перебігу геморагічної лихоманки з нирковим синдромом (ГЛПС) / тези / Сучасні проблеми алергології, клінічної імунології та імунофармакологів. Збірник праць. Москва. -1998.-С.412. (Співавт. В. І. Рощупкин).
