В. Б. Соловйов, М. Т. Генгін
ПРАКТИКУМ З Ензимологія
Навчально-методичний посібник
Пенза
2007
Друкується за рішенням редакційно-видавничої ради Пензенського державного педагогічного університету ім. В. Г. Бєлінського
УДК 577.1
Соловйов В. Б. Практикум з ензимології: навчально-методичний посібник / В. Б. Соловйов, М. Т. Генгін. - Пенза, 2007. - 52 с.
Навчально-методичний посібник призначений для студентів, що навчаються за спеціальністю «Біохімія».
© Соловйов В. Б., 2007
© Генгін М. Т., 2007
© ПДПУ ім. В. Г. Бєлінського, 2007
Введення
Даний посібник призначений для ознайомлення студентів як з класичними методами дослідження ферментів, так і з сучасними, високочутливими аналітичними методами, що використовують ферменти як інструменти досліджень. Посібник складається з п'яти розділів:
1. Методи визначення активності ферментів.
2. Вивчення кінетичних параметрів ферментативних реакцій.
3. Методи виділення і очищення ферментів.
4. Вивчення субклітинному локалізації ферментів.
5. Використання ферментів в якості аналітичних реагентів.
Всі розділи «Практикуму» мають самостійні завдання, проте вимоги, які пред'являються до студентів, залишаються однаковими. Кожна запропонована робота представляє собою невелике експериментальне дослідження. При виконанні будь-якої з них студент повинен самостійно підготувати всі потрібні розчини, освоїти необхідні методи дослідження, провести експеримент і оформити результати у вигляді звіту, ілюструючи отримані дані таблицями та графіками.
Рівень використовуваних методичних прийомів відповідає вимогам сучасної науки. При необхідності в описі роботи наводяться короткі теоретичні відомості. Всі роботи, включені до «Практикум», неодноразово виконувалися студентами.
Всі зауваження та побажання будуть прийняті авторами з вдячністю.
Робота 1. Титрометричним визначення активності каталази
Обладнання і реактиви: кипляча водяна лазня; піпетки на 5, 10, 20 і 25 мл; циліндри вимірювальні з носиком на 10 і 25 мл; колба мірна на 100 мл; колби конічні на 200 мл; ступка з товкачиком порцелянові; перманганат калію (0 , 1 н); сірчана кислота (10%); карбонат натрію; пероксид водню (0,1 н); свіжий рослинний матеріал (картопля або морква).
2 г сирої картоплі (або моркви) розтирають в ступці, поступово додаючи 2-3 мл води. Для зменшення кислої реакції додають на кінчику шпателя карбонат натрію до припинення виділення бульбашок вуглекислого газу. Розтерту масу кількісно переносять у мірну колбу і доводять водою до об'єму 100 мл. Суміш залишають стояти протягом 30 хвилин, після чого її фільтрують. Далі визначають активність за схемою (2 досвідчених проби і 2 контрольних):
Досвід і контроль титрують 0,1 н. розчином перманганату калію (до утворення стійкого протягом приблизно 1 хв блідо-рожевого забарвлення). Відзначають кількість розчину перманганату калію, який пішов на титрування залишився (після ферментативного розкладання) пероксиду водню у дослідній колбі і на титрування всього пероксиду водню у контрольній. По різниці між досвідченим і контрольним титруванням знаходять кількість перманганату, еквівалентну кількості розкладеного ферментом пероксиду водню.
Розрахунок ведуть у відповідності з рівнянням реакції:
5H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 → 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 + 8H 2 O,
згідно з яким 1 мл 0,1 н розчину перманганату калію відповідає 1,7 мг пероксиду водню.
Приклад розрахунку: з 1,25 г моркви приготовлена витяжка каталази об'ємом 100 мл: на титрування дослідної проби витрачено 15,5 мл, контрольної 30,2 мл 0,1 н розчину перманганату калію. Кількість розкладеного пероксиду водню в пробі еквівалентно (30,2 - 15,5) 14,7 мл 0,1 н. розчину перманганату калію і, отже, так само (14,7 ∙ 1,7) 24,99 мг. Значить, в 1 г сирої моркви міститься кількість каталази, здатне розкласти
Зміст звіту
1. Розрахуйте вміст каталази в досліджуваному матеріалі.
2. Напишіть систематичне назва даного ферменту, його код за систематичного каталогу і опишіть його біологічну роль.
Робота 2. Фотометричне визначення активності трипсину
Обладнання і реактиви: пробірки, піпетки на 10 мл, паранітроанілін, 100 мкМ розчин бензоїл-аргінін-пара-нітроаніліда (БАПНА) у фосфатному буфері *, розчин трипсину (10 мкг / мл) *, 1 н HCl, 0,0025 н HCl , ацетон.
* Приготування розчину БАПНА. 43,5 мг препарату суспендують в 1 мл ацетону, після цього додають приблизно 80 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,6). Суміш нагрівають на водяній бані при температурі 75-80 ° С до повного розчинення препарату, потім доводять об'єм до 100 мл. Розчин можна зберігати протягом місяця в темному місці.
** Приготування розчину трипсину. 3 мг ферменту розчиняють в 3 мл 0,0025 н HCl, виходить матковий розчин. Робочий розчин готують шляхом стократного розведення маточного розчину дистильованою водою (500 мкл маточного розчину трипсину поміщають у мірну колбу на 50 мл, доводять дистильованою водою до мітки).
1. Для розрахунку питомої активності препарату ферменту будують калібрувальний графік по пара-нітроанілін (п-НА). Для цього в 11 пробірках готують розчини п-НА різних концентрацій шляхом змішування 100 мкМ розчину п-НА та дистильованої води за наступною схемою.
У пробах визначають величину оптичної щільності на фотоелектроколориметри КФК-3 (або КФК-2) при 364 нм і будують графік залежності величини оптичної щільності від концентрації п-НА.
2. Для визначення активності препарату трипсину беруть 6 пробірок - 3 досвідчених і 3 контрольних. Активність ферменту визначають за наступною схемою.
Реакційну суміш переливають у кювети і вимірюють оптичну щільність при 364 нм. Питому активність ферменту виражають в мкМ п-НА, відщепленим 1 мкг трипсину за 1 хв, по калібрувальної кривої.
Зміст звіту
1. Калібрувальний графік по пара-нітроанілін:
2. Розрахуйте активність ферменту.
3. Напишіть рекомендований систематичне назва даного ферменту, його код за систематичного каталогу і опишіть його біологічну роль.
Робота 3. Флюоріметріческое визначення активності фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази
Обладнання і реактиви: пробірки, автоматична піпетка, гомогенізатор, набір для визначення фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази (ФМСФ-КП): відкалібрована по спирту піпетка на 10 мкл, піпетка на 2 мл, скляна лійка, циліндр на 250 мл з притертою пробкою, гомогенізатор, 50 мМ натрій-ацетатний буфер з 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовий розчин ФМСФ *, розчин данс-фен-лей-арг (DNS-FLR) **, 1 н HCl, хлороформ, печінку тварини, реактив Фоліна, реактиви А і В для методу Лоурі.
* Приготування розчину ФМСФ (25 мМ): 22 мг ФМСФ розчиняють в 5 мл двічі перегнанного етилового спирту.
** Приготування розчину DNS-FLR: До 1 мг DNS-FLR дозатором додають 50 мкл метанолу, а потім - 7,5 мл натрій-ацетатного буфера рН = 5,6.
200 мг печінки гомогенізують на льоду в 10 мл буфера. Гомогенат зберігають на льоду. Пробірки кожної паралелі (3 досвідчених і 3 контрольних) поміщають, попередньо підписавши, в один штатив. Розкопують реактиви за наступною схемою.
Після закінчення реакції в кожну пробірку додають 1,5 мл хлороформу і інтенсивно струшують штатив на протязі 60 сек. Потім пробірки поміщають в центрифуги і центрифугують їх 10 хв при 1000 об / хв для поділу фаз. Відбирають хлороформний фракцію і вимірюють величину флюоресценції на флюоріметре (λ ех = 360 нм, λ ем = 530 нм). Кількість білка в пробі визначають за Лоурі (див. примітка 1) Активність ФМСФ-КН розраховують як різницю флюоресценції проб не містять ФМСФ і проб, які містять ФМСФ, і виражають у нМ продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка. Формула для розрахунку активності:
а =
Зміст звіту
1. Розрахуйте активність ферменту в досліджуваному матеріалі.
2. Опишіть фермент і його ймовірну біологічну роль. Напишіть передбачуваний систематичний код ферменту.
Робота 4. Визначення кінетичних параметрів реакції гідролізу трипсином бензоїл-аргінін-пара-нітроаніліда методами Лайнуйвера-Берк і Ейзенталя-Корніш-Боудена. Визначення типу інгібування трипсину високомолекулярним інгібітором трипсину з бичачого легкого
Обладнання і реактиви: пробірки, піпетки на 10 мл, розчини БАПНА наступних концентрацій: 1 мМ, 0,75 мМ, 0,5 мМ, 0,25 мМ, 0,125 мМ, розчин трипсину (10 мкг / мл), розчин інгібітора трипсину * (10 мкг / мл), 1 н HCl.
* Приготування розчину інгібітора: 1 мг інгібітору розчиняють в 1 мл 0,0025 н HCl. Робочий розчин готують безпосередньо перед досвідом шляхом стократного розведення вихідного розчину дистильованою водою.
Для визначення V max і К м даної реакції, а також типу інгібування трипсину будують графік залежності швидкості реакції від концентрації субстрату без інгібітора і в присутності інгібітора (у системах координат Лайнуйвера-Берка і Ейзенталя-Корніш-Боудена). Для кожної концентрації субстрату виставляють по 4 пробірки: 2 дослідних і 2 контрольних. Схема визначення активності трипсину.
Активність ферменту в присутності інгібітора визначають за схемою.
Вимірюють оптичну щільність при 364 нм. Питому активність ферменту виражають в мкМ п-НА, відщепленим 1 мкг трипсину за 1 хв, по калібрувальної кривої. Графіки залежності будують на міліметровому папері.
Зміст звіту
1. Розрахуйте кінетичні параметри та визначте тип інгібування способом Лайнуйвера-Берк.
2. Розрахуйте кінетичні параметри та визначте тип інгібування способом Ейзенталя і Корніш-Боудена.
Робота 5. Вивчення вплив температури і рН середовища на активність трипсину
Обладнання і реактиви: пробірки, піпетки на 10 мл, дві водяні лазні, 1 мМ розчини БАПНА в 0,05 М фосфатному буфері з наступними значеннями рН: 9, 7.6, 6, 5, розчин трипсину (10 мкг / мл), 1 н HCl.
1. Для вивчення впливу рН середовища на активність трипсину користуються розчинами БАПНА з різними значеннями рН, по 2 досвіду і 2 контролю в кожній паралелі. Активність визначають за схемою.
Вимірюють оптичну щільність при 364 нм. Питому активність ферменту виражають в мкМ п-НА, відщепленим 1 мкг трипсину за 1 хв, по калібрувальної кривої. Будують графік залежності активності трипсину від рН середовища.
2. Для вивчення впливу температури середовища на активність трипсину користуються цією ж схемою, використовуючи розчин БАПНА зі значенням рН = 7,6, але пробірки інкубують:
а) при кімнатній температурі;
б) при 4 ° С (Інкубувати в холодильнику. Використовувати попередньо охолоджені розчини!);
в) на водяній бані при t = 55 ° С;
г) на водяній бані при t = 75 ° С.
Зміст звіту
1. Графік залежності активності трипсину від рН середовища.
2. Графік залежності активності трипсину від температури.
Робота 6. Визначення константи інгібування трипсину високомолекулярним інгібітором трипсину з бичачого легкого методом Діксона
Обладнання і реактиви: пробірки, піпетки на 10 мл, 1 мМ розчин БАПНА, розчин трипсину (10 мкг / мл), розчини інгібітора трипсину наступних концентрацій: 10 мкг / мл, 5 мкг / мл, 2,5 мкг / мл, 1 мкг / мл *, 1 н HCl.
* Приготування розчинів інгібітора: 1 мг інгібітору розчиняють в 1 мл 0,0025 н HCl. Отримують матковий розчин з концентрацією 1 мг / мл. Робочі розчини готують безпосередньо перед досвідом шляхом розведення маточного розчину в необхідному співвідношенні дистильованою водою.
Визначають активність трипсину за різних концентраціях субстрату і інгібітору. Для кожної концентрації інгібітора виставляють по 4 пробірки: 2 дослідних і 2 контрольних. Схема визначення активності трипсину.
Вимірюють оптичну щільність при 364 нм. Питому активність ферменту виражають в мкМ п-НА, відщепленим 1 мкг трипсину за 1 хв, по калібрувальної кривої. Графіки залежності зворотної швидкості від концентрації інгібітора і залежності s / v від концентрації інгібітора будують на міліметровому папері.
Зміст звіту
1. Визначте константу інгібування методом Діксона.
Робота 7. Часткова очищення ФМСФ-КП з печінки щурів фракціонуванням сульфатом амонію
Обладнання і реактиви: пробірки, автоматична піпетка, гомогенізатор, скляні стакани на 50 і 100 мл, набір для визначення фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази (ФМСФ-КП): відкалібрована по спирту піпетка на 10 мкл, піпетка на 2 мл, скляна лійка, циліндр на 250 мл з притертою пробкою, гомогенізатор, 50 мМ натрій-ацетатний буфер з 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовий розчин ФМСФ, розчин данс-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, кристалічний сульфат амонію, набір розчинів для визначення білка за Лоурі, печінку тварини.
4 г печінки тваринного гомогенізують на льоду в 20 мл буфера. Гомогенат центрифугують 10 хв при 1000 об / хв для видалення плівок. У пробірку відбирають 200 мкл центрифугованих гомогенату і додають 3,8 мл буфера. Перешивають і поміщають на лід, надалі використовуючи для визначення активності і кількості білка в гомогенаті. ПРАКТИКУМ З Ензимологія
Навчально-методичний посібник
Пенза
2007
Друкується за рішенням редакційно-видавничої ради Пензенського державного педагогічного університету ім. В. Г. Бєлінського
УДК 577.1
Соловйов В. Б. Практикум з ензимології: навчально-методичний посібник / В. Б. Соловйов, М. Т. Генгін. - Пенза, 2007. - 52 с.
Навчально-методичний посібник призначений для студентів, що навчаються за спеціальністю «Біохімія».
© Соловйов В. Б., 2007
© Генгін М. Т., 2007
© ПДПУ ім. В. Г. Бєлінського, 2007
Введення
Даний посібник призначений для ознайомлення студентів як з класичними методами дослідження ферментів, так і з сучасними, високочутливими аналітичними методами, що використовують ферменти як інструменти досліджень. Посібник складається з п'яти розділів:
1. Методи визначення активності ферментів.
2. Вивчення кінетичних параметрів ферментативних реакцій.
3. Методи виділення і очищення ферментів.
4. Вивчення субклітинному локалізації ферментів.
5. Використання ферментів в якості аналітичних реагентів.
Всі розділи «Практикуму» мають самостійні завдання, проте вимоги, які пред'являються до студентів, залишаються однаковими. Кожна запропонована робота представляє собою невелике експериментальне дослідження. При виконанні будь-якої з них студент повинен самостійно підготувати всі потрібні розчини, освоїти необхідні методи дослідження, провести експеримент і оформити результати у вигляді звіту, ілюструючи отримані дані таблицями та графіками.
Рівень використовуваних методичних прийомів відповідає вимогам сучасної науки. При необхідності в описі роботи наводяться короткі теоретичні відомості. Всі роботи, включені до «Практикум», неодноразово виконувалися студентами.
Всі зауваження та побажання будуть прийняті авторами з вдячністю.
Робота 1. Титрометричним визначення активності каталази
Обладнання і реактиви: кипляча водяна лазня; піпетки на 5, 10, 20 і 25 мл; циліндри вимірювальні з носиком на 10 і 25 мл; колба мірна на 100 мл; колби конічні на 200 мл; ступка з товкачиком порцелянові; перманганат калію (0 , 1 н); сірчана кислота (10%); карбонат натрію; пероксид водню (0,1 н); свіжий рослинний матеріал (картопля або морква).
2 г сирої картоплі (або моркви) розтирають в ступці, поступово додаючи 2-3 мл води. Для зменшення кислої реакції додають на кінчику шпателя карбонат натрію до припинення виділення бульбашок вуглекислого газу. Розтерту масу кількісно переносять у мірну колбу і доводять водою до об'єму 100 мл. Суміш залишають стояти протягом 30 хвилин, після чого її фільтрують. Далі визначають активність за схемою (2 досвідчених проби і 2 контрольних):
| досвід | контроль |
| 20 мл витяжки ферменту | 20 мл витяжки ферменту |
| - | Нагрівання 10 хв на киплячій водяній бані |
| 25 мл 0,1 н перекису водню | 25 мл 0,1 н перекису водню |
| Інкубація 30 хвилин при кімнатній температурі | |
| 5 мл 10% H 2 SO 4 | 5 мл 10% H 2 SO 4 |
Розрахунок ведуть у відповідності з рівнянням реакції:
5H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 → 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 + 8H 2 O,
згідно з яким 1 мл 0,1 н розчину перманганату калію відповідає 1,7 мг пероксиду водню.
Приклад розрахунку: з 1,25 г моркви приготовлена витяжка каталази об'ємом 100 мл: на титрування дослідної проби витрачено 15,5 мл, контрольної 30,2 мл 0,1 н розчину перманганату калію. Кількість розкладеного пероксиду водню в пробі еквівалентно (30,2 - 15,5) 14,7 мл 0,1 н. розчину перманганату калію і, отже, так само (14,7 ∙ 1,7) 24,99 мг. Значить, в 1 г сирої моркви міститься кількість каталази, здатне розкласти
Зміст звіту
1. Розрахуйте вміст каталази в досліджуваному матеріалі.
2. Напишіть систематичне назва даного ферменту, його код за систематичного каталогу і опишіть його біологічну роль.
Робота 2. Фотометричне визначення активності трипсину
Обладнання і реактиви: пробірки, піпетки на 10 мл, паранітроанілін, 100 мкМ розчин бензоїл-аргінін-пара-нітроаніліда (БАПНА) у фосфатному буфері *, розчин трипсину (10 мкг / мл) *, 1 н HCl, 0,0025 н HCl , ацетон.
* Приготування розчину БАПНА. 43,5 мг препарату суспендують в 1 мл ацетону, після цього додають приблизно 80 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,6). Суміш нагрівають на водяній бані при температурі 75-80 ° С до повного розчинення препарату, потім доводять об'єм до 100 мл. Розчин можна зберігати протягом місяця в темному місці.
** Приготування розчину трипсину. 3 мг ферменту розчиняють в 3 мл 0,0025 н HCl, виходить матковий розчин. Робочий розчин готують шляхом стократного розведення маточного розчину дистильованою водою (500 мкл маточного розчину трипсину поміщають у мірну колбу на 50 мл, доводять дистильованою водою до мітки).
1. Для розрахунку питомої активності препарату ферменту будують калібрувальний графік по пара-нітроанілін (п-НА). Для цього в 11 пробірках готують розчини п-НА різних концентрацій шляхом змішування 100 мкМ розчину п-НА та дистильованої води за наступною схемою.
| № пробірки | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 мкМ п-НА, мл | 0 | 0,5 | 1 | 1,5 | 2 | 2,5 | 3 | 3,5 | 4 | 4,5 | 5 |
| Дист. Вода, мл | 5 | 4,5 | 4 | 3,5 | 3 | 2,5 | 2 | 1,5 | 1 | 0,5 | 0 |
2. Для визначення активності препарату трипсину беруть 6 пробірок - 3 досвідчених і 3 контрольних. Активність ферменту визначають за наступною схемою.
| досвід | контроль |
| 1,6 мл розчину БАПНА | 1,6 мл розчину БАПНА |
| - | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преінкубація в термостаті при 37 ° С протягом 10 хвилин | |
| 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) | 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) |
| Інкубація в термостаті при 37 ° С протягом 30 хвилин | |
| 0,7 мл 1 н HCl | - |
Реакційну суміш переливають у кювети і вимірюють оптичну щільність при 364 нм. Питому активність ферменту виражають в мкМ п-НА, відщепленим 1 мкг трипсину за 1 хв, по калібрувальної кривої.
Зміст звіту
1. Калібрувальний графік по пара-нітроанілін:
| Конц. п-НА | |||||||||||
| Опт. щільність |
3. Напишіть рекомендований систематичне назва даного ферменту, його код за систематичного каталогу і опишіть його біологічну роль.
Робота 3. Флюоріметріческое визначення активності фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази
Обладнання і реактиви: пробірки, автоматична піпетка, гомогенізатор, набір для визначення фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази (ФМСФ-КП): відкалібрована по спирту піпетка на 10 мкл, піпетка на 2 мл, скляна лійка, циліндр на 250 мл з притертою пробкою, гомогенізатор, 50 мМ натрій-ацетатний буфер з 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовий розчин ФМСФ *, розчин данс-фен-лей-арг (DNS-FLR) **, 1 н HCl, хлороформ, печінку тварини, реактив Фоліна, реактиви А і В для методу Лоурі.
* Приготування розчину ФМСФ (25 мМ): 22 мг ФМСФ розчиняють в 5 мл двічі перегнанного етилового спирту.
** Приготування розчину DNS-FLR: До 1 мг DNS-FLR дозатором додають 50 мкл метанолу, а потім - 7,5 мл натрій-ацетатного буфера рН = 5,6.
200 мг печінки гомогенізують на льоду в 10 мл буфера. Гомогенат зберігають на льоду. Пробірки кожної паралелі (3 досвідчених і 3 контрольних) поміщають, попередньо підписавши, в один штатив. Розкопують реактиви за наступною схемою.
| Досвід (-) | Контроль (+) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогенату | 50 мкл гомогенату |
| - | 10 мкл розчину ФМСФ (додають спеціально відкалібрований скляній піпеткою) |
| Преінкубація 8 хвилин при 37 ° С | |
| 50 мкл розчину DNS-FLR | 50 мкл розчину DNS-FLR |
| Інкубація 30 хв при 37 ° С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
а =
Зміст звіту
1. Розрахуйте активність ферменту в досліджуваному матеріалі.
2. Опишіть фермент і його ймовірну біологічну роль. Напишіть передбачуваний систематичний код ферменту.
Робота 4. Визначення кінетичних параметрів реакції гідролізу трипсином бензоїл-аргінін-пара-нітроаніліда методами Лайнуйвера-Берк і Ейзенталя-Корніш-Боудена. Визначення типу інгібування трипсину високомолекулярним інгібітором трипсину з бичачого легкого
Обладнання і реактиви: пробірки, піпетки на 10 мл, розчини БАПНА наступних концентрацій: 1 мМ, 0,75 мМ, 0,5 мМ, 0,25 мМ, 0,125 мМ, розчин трипсину (10 мкг / мл), розчин інгібітора трипсину * (10 мкг / мл), 1 н HCl.
* Приготування розчину інгібітора: 1 мг інгібітору розчиняють в 1 мл 0,0025 н HCl. Робочий розчин готують безпосередньо перед досвідом шляхом стократного розведення вихідного розчину дистильованою водою.
Для визначення V max і К м даної реакції, а також типу інгібування трипсину будують графік залежності швидкості реакції від концентрації субстрату без інгібітора і в присутності інгібітора (у системах координат Лайнуйвера-Берка і Ейзенталя-Корніш-Боудена). Для кожної концентрації субстрату виставляють по 4 пробірки: 2 дослідних і 2 контрольних. Схема визначення активності трипсину.
| досвід | контроль |
| 1,6 мл розчину БАПНА | 1,6 мл розчину БАПНА |
| - | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преінкубація в термостаті при 37 ° С протягом 10 хвилин | |
| 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) | 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) |
| Інкубація в термостаті при 37 ° С протягом 30 хвилин | |
| 0,7 мл 1 н HCl | - |
Активність ферменту в присутності інгібітора визначають за схемою.
| досвід | контроль |
| 1,6 мл розчину БАПНА | 1,6 мл розчину БАПНА |
| 100 мкл розчину інгібітора трипсину (10 мкг / мл) | 100 мкл буфера |
| - | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преінкубація в термостаті при 37 ° С протягом 10 хвилин | |
| 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) | 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) |
| Інкубація в термостаті при 37 ° С протягом 30 хвилин | |
| 0,7 мл 1 н HCl | - |
Зміст звіту
1. Розрахуйте кінетичні параметри та визначте тип інгібування способом Лайнуйвера-Берк.
2. Розрахуйте кінетичні параметри та визначте тип інгібування способом Ейзенталя і Корніш-Боудена.
Робота 5. Вивчення вплив температури і рН середовища на активність трипсину
Обладнання і реактиви: пробірки, піпетки на 10 мл, дві водяні лазні, 1 мМ розчини БАПНА в 0,05 М фосфатному буфері з наступними значеннями рН: 9, 7.6, 6, 5, розчин трипсину (10 мкг / мл), 1 н HCl.
1. Для вивчення впливу рН середовища на активність трипсину користуються розчинами БАПНА з різними значеннями рН, по 2 досвіду і 2 контролю в кожній паралелі. Активність визначають за схемою.
| досвід | контроль |
| 1,6 мл розчину БАПНА | 1,6 мл розчину БАПНА |
| - | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преінкубація в термостаті при 37 ° С протягом 10 хвилин | |
| 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) | 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) |
| Інкубація в термостаті при 37 ° С протягом 30 хвилин | |
| 0,7 мл 1 н HCl | - |
2. Для вивчення впливу температури середовища на активність трипсину користуються цією ж схемою, використовуючи розчин БАПНА зі значенням рН = 7,6, але пробірки інкубують:
а) при кімнатній температурі;
б) при 4 ° С (Інкубувати в холодильнику. Використовувати попередньо охолоджені розчини!);
в) на водяній бані при t = 55 ° С;
г) на водяній бані при t = 75 ° С.
Зміст звіту
1. Графік залежності активності трипсину від рН середовища.
2. Графік залежності активності трипсину від температури.
Робота 6. Визначення константи інгібування трипсину високомолекулярним інгібітором трипсину з бичачого легкого методом Діксона
Обладнання і реактиви: пробірки, піпетки на 10 мл, 1 мМ розчин БАПНА, розчин трипсину (10 мкг / мл), розчини інгібітора трипсину наступних концентрацій: 10 мкг / мл, 5 мкг / мл, 2,5 мкг / мл, 1 мкг / мл *, 1 н HCl.
* Приготування розчинів інгібітора: 1 мг інгібітору розчиняють в 1 мл 0,0025 н HCl. Отримують матковий розчин з концентрацією 1 мг / мл. Робочі розчини готують безпосередньо перед досвідом шляхом розведення маточного розчину в необхідному співвідношенні дистильованою водою.
Визначають активність трипсину за різних концентраціях субстрату і інгібітору. Для кожної концентрації інгібітора виставляють по 4 пробірки: 2 дослідних і 2 контрольних. Схема визначення активності трипсину.
| досвід | контроль |
| 1,6 мл розчину БАПНА | 1,6 мл розчину БАПНА |
| 100 мкл розчину інгібітора трипсину | 100 мкл буфера |
| - | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преінкубація в термостаті при 37 ° С протягом 10 хвилин | |
| 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) | 0,5 мл розчину трипсину (10 мкг / мл) |
| Інкубація в термостаті при 37 ° С протягом 30 хвилин | |
| 0,7 мл 1 н HCl | - |
Зміст звіту
1. Визначте константу інгібування методом Діксона.
Робота 7. Часткова очищення ФМСФ-КП з печінки щурів фракціонуванням сульфатом амонію
Обладнання і реактиви: пробірки, автоматична піпетка, гомогенізатор, скляні стакани на 50 і 100 мл, набір для визначення фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази (ФМСФ-КП): відкалібрована по спирту піпетка на 10 мкл, піпетка на 2 мл, скляна лійка, циліндр на 250 мл з притертою пробкою, гомогенізатор, 50 мМ натрій-ацетатний буфер з 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовий розчин ФМСФ, розчин данс-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, кристалічний сульфат амонію, набір розчинів для визначення білка за Лоурі, печінку тварини.
Всі подальші операції проводять на льоду. Вимірюють обсяг залишився центрифугованих гомогенату. Додають кристалічний сульфат амонію до досягнення 10% концентрації і ретельно перемішують. Випав осад відокремлюють центрифугуванням при 4000 об / хв протягом 10 хв. Надосадову рідину обережно зливають і вимірюють об'єм. До осадку додають вихідний буфер до повного розчинення, потім розводять цим же буфером в 10 разів і поміщають на лід, надалі використовуючи для визначення активності і кількості білка.
До надосадової рідини додають кристалічний сульфат амонію до досягнення 20% концентрації, центрифугують, відокремлюють осад, розчиняють його в буфері, розводять в два рази буфером і поміщають на лід. Повторюють операцію з висолювання, додаючи сульфат амонію до надосадової рідини до досягнення 60% концентрації. Осад, відокремлений центрифугуванням ресуспендіруют у вихідному буфері і розбавляють в десять разів. У всіх фракціях, гомогенаті і кінцевому супернатанті визначають активність за наступною схемою.
| Досвід (-) | Контроль (+) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогенату | 50 мкл гомогенату |
| - | 10 мкл розчину ФМСФ (додають спеціально відкалібрований скляній піпеткою) |
| Преінкубація 8 хвилин при 37 ° С | |
| 50 мкл розчину DNS-FLR | 50 мкл розчину DNS-FLR |
| Інкубація 30 хв при 37 ° С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
а =
Зміст звіту
1. Визначте ступінь очищення ФМСФ-КП.
| Фракція | Гомогенат | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% | 60% |
| Активність | |||||||
| Ступінь очищення | 100% |
Обладнання і реактиви: пробірки, автоматична піпетка, гомогенізатор, скляні стакани на 50 і 100 мл, колонка для гель-фільтрації заввишки 15 см, шприц, набір для визначення фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази (ФМСФ-КП): відкалібрована по спирту піпетка на 10 мкл , піпетка на 2 мл, скляна лійка, циліндр на 250 мл з притертою пробкою, гомогенізатор, 50 мМ натрій-ацетатний буфер з 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовий розчин ФМСФ, розчин данс-фен-лей-арг (DNS -FLR), 1 н HCl, хлороформ, сефадекса G-75, 0,9% розчин NaCl, набір розчинів для визначення білка за Лоурі, печінку тварини.
Сефадекса G-75 суспендують у 5-10 кратному обсязі дистильованої води і залишають для набухання на 3 години. Потім перемішують до однорідної маси, дають відстоятися. Після осідання основної маси гелю обережно декантирують надосадову рідину з неосевшімі уламками гранул. Суспендированием і подальшу декантація (відмулювання) повторюють 3-4 рази.
Колонку закріплюють у вертикальному положенні, закривають нижній кінець пробкою зі вставленим фітінгом, поміщають у днище колонки гурток фільтрувального паперу, розмір якого повинен точно відповідати внутрішньому розміру колонки. Заливають приблизно 2 мл розчину NaCl, дають заповнитися фітинги і через лійку по стінці заливають густу суспензію гелю. Відкривають затиск колонки і дають розчину вільно витікати, стежачи за тим, щоб колонка не висохла. Суспензію гелю додають до тих пір, поки його висота в колонці не досягне потрібного рівня, верхня поверхня гелю (стартова зона) повинна бути строго горизонтальною. Потім на поверхню гелю поміщають гурток фільтрувального паперу. Колонку промивають (врівноважують) 1 обсягом NаС1.
100 мг печінці тварини гомогенізують на льоду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугують 10 хв при 1000 об / хв для видалення плівок. Центрифугованих гомогенат поміщають на лід, надалі використовуючи для визначення активності і кількості білка в гомогенаті.
Відкривають затиск колонки і зливають стовп розчину NaCl, що знаходиться над сефадекса. Коли нижній меніск розчину торкнеться поверхні гуртка фільтрувального паперу, на колонку обережно за допомогою шприца наносять 1 мл центрифугованих гомогенату. Дають зразком вбратися і потім швидко змивають залишки зразка зі стінок колонки тим же об'ємом розчинника, знову дають вбратися. Потім заповнюють колонку розчином NaCl, закривають верхній пробкою з голкою і під'єднують фітінгом до судини, з якого надходить елюірующій розчин. З моменту нанесення зразка на колонку збирають 10 фракцій об'ємом 1 мл.
У 2, 4, 5, 6, 7, 9 фракціях і в розведеному гомогенаті вимірюють активність ФМСФ-КП за наступною схемою.
| Досвід (-) | Контроль (+) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогенату | 50 мкл гомогенату |
| - | 10 мкл розчину ФМСФ (додають спеціально відкалібрований скляній піпеткою) |
| Преінкубація 8 хвилин при 37 ° С | |
| 50 мкл розчину DNS-FLR | 50 мкл розчину DNS-FLR |
| Інкубація 30 хв при 37 ° С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
Активність ФМСФ-КН розраховують як різницю флюоресценції проб не містять ФМСФ і проб, які містять ФМСФ, і виражають у нМ продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка. Формула для розрахунку активності:
а =
Зміст звіту
1. Визначте ступінь очищення ФМСФ-КП.
| Фракція | Гомогенат | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
| Активність | |||||||
| Ступінь очищення | 100% |
Обладнання і реактиви: пробірки; автоматична піпетка; гомогенізатор; скляні стакани на 50 і 100 мл; колонка для іонно-обмінної хроматографії заввишки 15 см; шприц; набір для визначення фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази (ФМСФ-КП): відкалібрована по спирту піпетка на 10 мкл, піпетка на 2 мл, скляна лійка, циліндр на 250 мл з притертою пробкою; гомогенізатор; 50 мМ натрій-ацетатний буфер з 50 мМ NaCl (рН 5,6); 0,05 М натрій-ацетатний буфер, що містить 0,05 М NaCl, pH 3,5 і 6,0; спиртовий розчин ФМСФ, розчин данс-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ; карбоксиметилцелюлоза (КМЦ); набір розчинів для визначення білка за Лоурі, печінка тварини.
Колонку для хроматографії закріплюють у вертикальному положенні, закривають нижній кінець пробкою зі вставленим фітінгом, поміщають у днище колонки гурток фільтрувального паперу, розмір якого повинен точно відповідати внутрішньому розміру колонки. Заливають приблизно 2 мл розчину 0,05 М натрій-ацетатного буфера, що містить 0,05 М NaCl, pH 3,5, дають заповнитися фітинги і через лійку по стінці заливають густу суспензію КМЦ. Відкривають затиск колонки і дають розчину вільно витікати, стежачи за тим, щоб колонка не висохла. Суспензію КМЦ додають до тих пір, поки його висота в колонці не досягне потрібного рівня, верхня поверхня гелю (стартова зона) повинна бути строго горизонтальною. Потім на поверхню гелю поміщають гурток фільтрувального паперу. Колонку промивають (врівноважують) 20 мл 0,05 М натрій-ацетатного буфера, що містить 0,05 М NaCl, pH 3,5.
2 г печінки тваринного гомогенізують на льоду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугують 10 хв при 1000 об / хв для видалення плівок. У пробірку відбирають 200 мкл центрифугованих гомогенату і додають 3,8 мл буфера. Перешивають і поміщають на лід, надалі використовуючи для визначення активності і кількості білка в гомогенаті.
Відкривають затиск колонки і зливають стовпчик буфера, що знаходиться над гелем. Коли нижній меніск розчину торкнеться поверхні гуртка фільтрувального паперу, на колонку обережно за допомогою шприца наносять 1 мл центрифугованих гомогенату. Дають зразком вбратися і потім швидко змивають залишки зразка зі стінок колонки тим же об'ємом розчинника. Потім заповнюють колонку розчином 0,05 М натрій-ацетатного буфера, що містить 0,05 М NaCl, pH 3,5, закривають верхній пробкою з голкою і під'єднують фітінгом до судини, з якого надходить елюірующій розчин. Для видалення незв'язаних білків колонку промивають 50 мл буфера.
Потім фермент елюіруют 0,05 М натрій-ацетатний буфер з 0,05 М NaCl, pH 6,0. З моменту нанесення цього буфера на колонку збирають 10 фракцій об'ємом 3 мл.
У 2, 3, 4, 5, 6, 9 фракціях і в розведеному гомогенаті вимірюють активність ФМСФ-КП за наступною схемою.
| Досвід (-) | Контроль (+) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогенату | 50 мкл гомогенату |
| - | 10 мкл розчину ФМСФ (додають спеціально відкалібрований скляній піпеткою) |
| Преінкубація 8 хвилин при 37 ° С | |
| 50 мкл розчину DNS-FLR | 50 мкл розчину DNS-FLR |
| Інкубація 30 хв при 37 ° С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
а =
Зміст звіту
1. Визначте ступінь очищення ФМСФ-КП
| Фракція | Гомогенат | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
| Активність | |||||||
| Ступінь очищення | 100% |
Робота 10. Часткова очищення ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази з печінки методом іонообмінної хроматографії (на діетіламіноетілцеллюлозе)
Обладнання і реактиви: пробірки; автоматична піпетка; гомогенізатор; скляні стакани на 50 і 100 мл; колонка для іонно-обмінної хроматографії заввишки 15 см; шприц; набір для визначення фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази (ФМСФ-КП): відкалібрована по спирту піпетка на 10 мкл, піпетка на 2 мл, скляна лійка, циліндр на 250 мл з притертою пробкою; гомогенізатор; 50 мМ натрій-ацетатний буфер з 50 мМ NaCl (рН 5,6); 0,05 М натрій-ацетатний буфер, що містить 0,05 М NaCl, pH 6,0; 1 М натрій-ацетатний буфер, що містить 0,05 М NaCl, pH 3,7; спиртовий розчин ФМСФ, розчин данс-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ ; діетіламіноетілцеллюлоза (ДЕАЕЦ); набір розчинів для визначення білка за Лоурі, печінку тварини.
Колонку для хроматографії закріплюють у вертикальному положенні, закривають нижній кінець пробкою зі вставленим фітінгом, поміщають у днище колонки гурток фільтрувального паперу, розмір якого повинен точно відповідати внутрішньому розміру колонки. Заливають приблизно 2 мл розчину 0,05 М натрій-ацетатного буфера, що містить 0,05 М NaCl, pH 6,0, дають заповнитися фітинги і через лійку по стінці заливають густу суспензію ДЕАЕЦ. Відкривають затиск колонки і дають розчину вільно витікати, стежачи за тим, щоб колонка не висохла. Суспензію ДЕАЕЦ додають до тих пір, поки її висота в колонці не досягне потрібного рівня, верхня поверхня гелю (стартова зона) повинна бути строго горизонтальною. Потім на поверхню гелю поміщають гурток фільтрувального паперу. Колонку промивають (врівноважують) 20 мл 0,05 М натрій-ацетатного буфера, що містить 0,05 М NaCl, pH 6,0.
4 г печінки тваринного гомогенізують на льоду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугують 10 хв при 1000 об / хв для видалення плівок. У пробірку відбирають 100 мкл центрифугованих гомогенату і додають 4,9 мл буфера. Перешивають і поміщають на лід, надалі використовуючи для визначення активності і кількості білка в гомогенаті.
Відкривають затиск колонки і зливають стовпчик буфера, що знаходиться над гелем. Коли нижній меніск розчину торкнеться поверхні гуртка фільтрувального паперу, на колонку обережно за допомогою шприца наносять 1 мл центрифугованих гомогенату. Дають зразком вбратися і потім швидко змивають залишки зразка зі стінок колонки тим же об'ємом розчинника. Потім заповнюють колонку розчином 0,05 М натрій-ацетатного буфера, що містить 0,05 М NaCl, pH 6,0, закривають верхній пробкою з голкою і під'єднують фітінгом до судини, з якого надходить елюірующій розчин. Для видалення незв'язаних білків колонку промивають 50 мл буфера.
Потім фермент елюіруют 1 М натрій-ацетатний буфер з 0,05 М NaCl, pH 3,7. З моменту цього буфера на колонку збирають 12 фракцій об'ємом 2 мл.
У 2, 4, 5, 6, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 фракціях і в розведеному гомогенаті вимірюють активність ФМСФ-КП за наступною схемою.
| Досвід (-) | Контроль (+) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогенату | 50 мкл гомогенату |
| - | 10 мкл розчину ФМСФ (додають спеціально відкалібрований скляній піпеткою) |
| Преінкубація 8 хвилин при 37 ° С | |
| 50 мкл розчину DNS-FLR | 50 мкл розчину DNS-FLR |
| Інкубація 30 хв при 37 ° С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
а =
Зміст звіту
1. Визначте ступінь очищення ФМСФ-КП.
| Фракція | Гомогенат | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
| Активність | |||||||
| Ступінь очищення | 100% |
| Фракція | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 | 22 | 24 |
| Активність | |||||||
| Ступінь очищення |
Обладнання і реактиви: центрифуга з охолодженням; ФЕК; гомогенізатор; печінку тварини; піпетки; ДНК; 0,1 М NaOH; 0,01% розчин крезоловий червоного; 0,32 М розчин сахарози, який містить 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (середа А); 0,32 М розчин сахарози, який містить 0,01 μМ MgCl 2 ∙ 6H 2 O рН 5,0 (середа Б); набір розчинів для визначення білка за Лоурі.
Наважку тканини 2 г переносять у склянку гомогенізатора і додають 20 мл середовища Б, гомогенізують. Відбирають 2 мл на визначення активності ферменту і вмісту білка в гомогенаті. Центрифугування і відбір фракцій для аналізу проводять за наступною схемою.
Гомогенат центрифугують 10 хв при 4000g |
Осад (ядерна фр.) ресуспендіруют в середовищі А і доводять об'єм до 18 мл |
супернатант центрифугують 12000g 20 хв |
Супернатант центрифугують 20 хв при 20000g |
Осад (мітохон. фр.) ресуспендіруют в середовищі А і доводять об'єм до 18мл |
Супернатант, доводять об'єм до 18 мл середовищем Б центрифугують 60 хв при 20000g |
Осад (лізосом. фр.) ресуспендіруют в середовищі А і доводять об'єм до 18мл |
Осад (мікросомальних фр.) ресуспендіруют в середовищі А і доводять об'єм до 18мл |
Кінцевий супернатант |
Ресуспендірованіе проводять гомогенізірованіем отриманих опадів в 4-6 мл середовища гомогенізації (б), потім отриману суспензію переносять кількісно в мірний циліндр на 20 мл і об'єм суспензії доводять до 18 мл; таким чином, концентрація субклітинних структур досягає вихідної (як у гомогенаті) концентрації.
Активність ДНКази визначають у вихідному гомогенаті, ядерної, мітохондріальної, лізосомальної, мікросомальної і розчинної клітинної фракції за наступною схемою.
| 1 мл розчину ДНК (1 мг / мл) |
| 1 мл 0,01% розчину крезоловий червоного |
| 1 мл буфера А |
| Преінкубація 8 хвилин при 37 ° С |
| 1 мл розчину нагрітого фракції |
Зміст звіту
1. Розрахунок отриманих даних представляють у вигляді таблиці.
| Фракції | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | З | ||||||
| Аналізовані проби | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптична щільність, в кожній паралелі і середнє | ||||||||||||
| А він - А кн | ||||||||||||
| Активність на 1 мг тканини | ||||||||||||
| Активність фракції у% від гомогенату | 100% | |||||||||||
| Кількість білка на 1 мг тканини | ||||||||||||
| Білок у% від білка гомогенату | 100% | |||||||||||
| Відносна питома активність фракцій | ||||||||||||
Обладнання і реактиви: центрифуга; печінку тварини; піпетки; 0,01 М фосфатний буфер, що містить 0,32 М сахарози, рН 7,55, 100 мМ натрій-ацетатний буфер рН 3,3; 8% розчин гемоглобіну; 5% розчин трихлороцтової кислоти (Тху); тирозин кристалічний; 0,32 М розчин сахарози, який містить 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (середа А); 0,32 М розчин сахарози, який містить 0,01 μМ MgCl 2 ∙ 6H 2 O рН 5,0 (середа Б).
Наважку тканини 2 г переносять у склянку гомогенізатора і додають 20 мл середовища Б, гомогенізують. Відбирають 2 мл на визначення активності ферменту і вмісту білка в гомогенаті. Центрифугування і відбір фракцій для аналізу проводять за схемою, наведеною в роботі № 11.
Активність кислих протеаз визначають у вихідному гомогенаті, ядерної, мітохондріальної, лізосомальної, мікросомальної і розчинної клітинної фракції за наступною схемою.
| досвід | контроль |
| 200 мкл фракції | 200 мкл фракції |
| 600 мкл NaAc буфера, рН 3,3 | 800 мкл NaAc буфера, рН 3,3 |
| Преінкубація 8 хвилин при 37 ° С | |
| 200 мкл 8% розчину гемоглобіну | - |
| Інкубація 40 хвилин при 37 ° С | |
| 1 мл 5% Тху | 1 мл 5% Тху |
Побудова калібрувального графіка
Готують робочий розчин тирозину з концентрацією 100 мкг / мл. Потім проводять його розведення у відповідності зі схемою.
| № пробірки | V р-ра тир | V р-ра води | Конц, мкг / мл | D ср |
| 1 | 0,5 | 4,5 | ||
| 2 | 1 | 4 | ||
| 3 | 1,5 | 3,5 | ||
| 4 | 2,0 | 3 | ||
| 5 | 2,5 | 2,5 | ||
| 6 | 3,0 | 2,0 | ||
| 7 | 3,5 | 1,5 | ||
| 8 | 4,0 | 1,0 | ||
| 9 | 4,5 | 0,5 | ||
| 10 | 5,0 | 0,0 |
1. Розрахунок отриманих даних представляють у вигляді таблиці.
| Фракції | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | З | ||||||
| Аналізовані проби | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптична щільність, в кожній паралелі і середнє | ||||||||||||
| А він - А кн | ||||||||||||
| Кількість тирозину по калібрувальної кривої | ||||||||||||
| Активність на 1 мг тканини | ||||||||||||
| Активність фракції у% від гомогенату | 100% | |||||||||||
| Кількість білка на 1 мг тканини | ||||||||||||
| Білок у% від білка гомогенату | 100% | |||||||||||
| Відносна питома активність фракцій | ||||||||||||
Обладнання і реактиви: центрифуга; печінку тварини; піпетки; буфер фосфатний 0,067 М (субстратний), рН 7,55; 0,5 М розчин сукцинату натрію в субстратної буфері; 0,32 М розчин сахарози, який містить 0,01 М трис -буфер рН 7,4 (середа А); 0,32 М розчин сахарози, який містить 0,01 μМ MgCl 2 ∙ 6H 2 O рН 5,0 (середа Б); 0,02 М розчин феназінметасульфата *; 0,001 М розчин 2,6-діхлорфеноліндофенола (ДХФІФ) **.
* Приготування розчину феназінметасульфата. 12 мг речовини переносять в скляну пробірку, додають 2 мл дистильованої води, закривають пробкою і перемішують. РЕАКТИВ ГОТУЮТЬ У ДЕНЬ ДОСВІДУ.
** Приготування розчину ДХФІФ. 17 мг речовини розчиняють в колбі на 50 мл. РЕАКТИВ ГОТУЮТЬ У ДЕНЬ ДОСВІДУ.
Наважку тканини 2 г переносять у склянку гомогенізатора і додають 20 мл середовища Б, гомогенізують. Відбирають 2 мл на визначення активності ферменту і вмісту білка в гомогенаті. Центрифугування і відбір фракцій для аналізу проводять за схемою, наведеною в роботі № 11.
Активність сукцинатдегідрогенази визначають у вихідному гомогенаті, ядерної, мітохондріальної, лізосомальної, мікросомальної і розчинної клітинної фракції по одній з наступних схем:
а) кінетична схема визначення активності.
| досвід | контроль |
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
| 200 мкл сукцинату натрію на субстратної буфері | - |
| 200 мкл 0,02 М феназінметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназінметасульфата |
| 200 мкл 0,001 М ДХФІФ БЕЗПОСЕРЕДНЬО ПЕРЕД ДОСВІДОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФІФ БЕЗПОСЕРЕДНЬО ПЕРЕД ДОСВІДОМ |
| Інкубація на водяній бані 3 хв при 37 ° С | |
| 3 мл фракції, Нагрітий до 37 ° С | 3 мл фракції, Нагрітий до 37 ° С |
Активність виражають у нмоль окисленого сукцинату за 1 хв на 1 мг білка, враховуючи, що зниження оптичної щільності на 1,0 еквівалентно відновленню 60 нмоль 2,6-ДХФІФ, а кількість відновленого барвника пропорційно кількості окисленого сукцинату.
б) стаціонарна схема визначення активності.
| досвід | контроль |
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
| 200 мкл сукцинату натрію на субстратної буфері | - |
| 200 мкл 0,02 М феназінметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназінметасульфата |
| 200 мкл 0,001 М ДХФІФ БЕЗПОСЕРЕДНЬО ПЕРЕД ДОСВІДОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФІФ БЕЗПОСЕРЕДНЬО ПЕРЕД ДОСВІДОМ |
| Інкубація на водяній бані 3 хв при 37 ° С | |
| 3 мл фракції, Нагрітий до 37 ° С | 3 мл фракції, Нагрітий до 37 ° С |
| Інкубація на водяній бані 30 хв при 37 ° С | |
| 1 мл 1 н HCl | 1 мл 1 н HCl |
Активність виражають у нмоль окисленого сукцинату за 1 хв на 1 мг білка, враховуючи, що зниження оптичної щільності на 1,0 еквівалентно відновленню 60 нмоль 2,6-ДХФІФ, а кількість відновленого барвника пропорційно кількості окисленого сукцинату.
Зміст звіту
1. Розрахунок отриманих даних представляють у вигляді таблиці.
| Фракції | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | З | ||||||
| Аналізовані проби | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптична щільність, в кожній паралелі і середнє | ||||||||||||
| А він - А кн | ||||||||||||
| Кількість сукцинату | ||||||||||||
| Активність на 1 мг тканини | ||||||||||||
| Активність фракції у% від гомогенату | 100% | |||||||||||
| Кількість білка на 1 мг тканини | ||||||||||||
| Білок у% від білка гомогенату | 100% | |||||||||||
| Відносна питома активність фракцій | ||||||||||||
Обладнання і реактиви: центрифуга; печінку тварини; піпетки; 0,1 М цитратний буфер рН 6,5; 0,08 М розчин глюкозо-6-фосфату (Г-6-Ф) в 0,1 М цитратно буфері **** , 10% розчин трихлороцтової кислоти (Тху); розчин молібдату амонію *; відновлює розчин **; стандартний розчин фосфору (5 ∙ 10 -5 М )***.
* Приготування розчину молібдату амонію. 2,5 г молібдату амонію розчиняють в 50 мл води, 14 мл конц. сірчаної кислоти доливають до 200 мл води. Розбавлену кислоту наливають у розчин молібдату і доводять об'єм до 1000 мл.
** Приготування відновлюючого розчину. До 1,8 г Na 2 SO 3 доливають 11,3 мл 1 н HCl та 5 мл води. Потім розчиняють 25 мг 1-аміно-2-нафтол-4-сульфокислоти і доводять загальний об'єм до 25 мл. ГОТУЮТЬ У ДЕНЬ ДОСВІДУ.
*** Приготування стандартного розчину фосфору. 68 мг КН 2 РО 4 розчиняють в 20 мл води і додають 10 мл конц. сірчаної кислоти і доводять об'єм до 1000 мл.
**** Приготування розчину Г-6-Ф. 55 мг глюкозо-6-фосфату розчиняють в 2 мл 0,1 М цитратного буфера рН 6,5. ГОТУЮТЬ У ДЕНЬ ДОСВІДУ.
Наважку тканини 2 г переносять у склянку гомогенізатора і додають 20 мл середовища Б, гомогенізують. Відбирають 2 мл на визначення активності ферменту і вмісту білка в гомогенаті. Центрифугування і відбір фракцій для аналізу проводять за схемою, наведеною в роботі № 11.
Активність глюкозо-6-фосфатази визначають у вихідному гомогенаті, ядерної, мітохондріальної, лізосомальної, мікросомальної і розчинної клітинної фракції за наступною схемою.
| досвід | контроль 1 | контроль 2 |
| 100 мкл фракції | 100 мкл фракції | 100 мкл буфера |
| Інкубація 10 хв при 37 ° С | - | - |
| 100 мкл Г-6-Ф | 100 мкл буфера | 100 мкл Г-6-Ф |
| Інкубація 20 хв при 37 ° С | ||
| 2 мл 10% Тху | ||
| досвід | контроль 1 | контроль 2 | стандарт |
| 1 мл надосадової рідини | 1 мл станд. р-ра фосфору | ||
| 5 мл розчину молібдату | |||
Кожну пробу залишають на 15 хв при кімнатній температурі і потім проміряють екстинкцію при 750 нм на ФЕК. Кількість білка визначають за Лоурі. Активність ферменту виражають в ммоль фосфату, відщепленим за 1 хв інкубації на 1 мг білка.
Зміст звіту
1. Обгрунтуйте наявність у даній методиці двох контролів і стандарту.
2. Розрахунок отриманих даних представляють у вигляді таблиці:
| Фракції | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | З | ||||||
| Аналізовані проби | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптична щільність, в кожній паралелі і середнє | ||||||||||||
| А він - А кн | ||||||||||||
| Кількість фосфату | ||||||||||||
| Активність на 1 мг тканини | ||||||||||||
| Активність фракції у% від гомогенату | 100% | |||||||||||
| Кількість білка на 1 мг тканини | ||||||||||||
| Білок у% від білка гомогенату | 100% | |||||||||||
| Відносна питома активність фракцій | ||||||||||||
Робота 15. Визначення глюкози в крові людини з використанням ферментних електродів
Обладнання і реактиви: свіжа кров (взята безпосередньо перед визначенням) *, скляні капіляри Roche, автоматичний аналізатор Roche Omni S 6 **.
* Для роботи використовується капілярну кров з пальця. Палець обробити ватою, змоченою медичним спиртом, зробити прокол скарифікатором за допомогою автоматичної ручки-прокаливателя. Кров збирати в скляний капіляр Roche.
** Перед роботою з приладом уважно ознайомтеся з його будовою і правилами експлуатації.
У ферментних електродах фермент і електрод утворюють єдину конструкцію, яка не вимагає для функціонування додаткових реагентів, крім буферних розчинів. Такі електроди отримали назву «безреагентний» датчиків, а засновані на їх використанні методи аналізу називаються «безреагентному». Для визначення глюкози використовується фермент глюкозооксидаза, іммобілізована ковалентним зв'язуванням з напівпроникною полікарбонатною мембраною. Вимірювання здійснюється за допомогою амперометрией. Операційні характеристики електрода залишаються стабільними протягом двох-чотирьох тижнів.
Проведіть вимір трьох різних зразків крові. Переведіть прилад у режим роботи з капілярною кров'ю. Зніміть верхню кришку з аналізатора для ознайомлення з ходом розподілу зразка крові під час аналізу. Помістіть капіляр із зразком у диск-приймач (Fill Port). Активуйте всмоктування зразка. Аналізатор автоматично перейде в режим вимірювання. Вивчіть розподіл зразка крові та проходження буферних та промивають розчином. Дочекайтеся закінчення вимірювання і роздрукуйте звіт.
Зміст звіту
1. Запишіть результати визначень глюкози в крові.
2. Замалюйте схеми пристрою ферментного електрода і автоматичного аналізатора.
Робота 16. Визначення сечовини в крові людини з використанням ферментних реагентів
Обладнання і реактиви: свіжа кров (взята безпосередньо перед визначенням) *, скляні капіляри Roche, автоматична піпетка з наконечниками, біохімічний аналізатор Рефлотрон +.
* Забір крові здійснюється в капіляр, як описано в роботі № 14.
** Перед роботою з приладом уважно ознайомтеся з його будовою і правилами експлуатації.
Біохімічний аналізатор Рефлотрон призначений для експрес-аналізу зразків свіжої крові та сироватки людини. Прилад не вимагає для роботи ніяких реактивів, крім тест-смужок для одноразового визначення досліджуваних речовин. Тест-смужка для визначення сечовини містить ліофілізований фермент уреазу і індикатор на лейко-формі. Зразок нагрівають, і сечовина, що міститься у зразку, при 37 ° С розщеплюється з утворенням аміаку та оксиду вуглецю. Це веде до часткову зміну забарвлення індикатором на зелено-блакитну, інтенсивність якої прямо пропорційна кількості сечовини в пробі:
(NH 2) 2 CO + H 2 O = 2 NH 3 + CO 2
NH 3 + індикатор (безбарвний) = NH 4 + + індикатор (синьо-зелений).
Після 3 хвилин, необхідних для інкубації зразка, вимірюється оптична щільність за принципом рефлексійність фотометрії. На тест-смужці є магнітна стрічка з інформацією про аналіз. Прилад прочитує інформацію про аналіз і перераховує оптичну щільність в концентрацію.
Приготуйте тест-смужку для аналізу. Видаліть з її поверхні захисну алюмінієву смужку. Дозатором відміряйте 32 мкл зразка і нанесіть його в центр зони аплікації, не торкаючись наконечником тест-смужки. Відкрийте кришку приладу і помістіть тест-смужку в аналізовану зону. Закрийте кришку. Аналізатор автоматично перейде в режим вимірювання. Дочекайтеся закінчення вимірювання і роздрукуйте звіт.
Зміст звіту
1. Запишіть результати визначень сечовини в крові.
Робота 17. Імуноферментного визначення тестостерону в сироватці крові
Обладнання і реактиви: сироватка крові людини, автоматична піпетка з наконечниками, набір стандартних розчинів тестостерону з відомими концентраціями, імуноферментний кон'югат, субстратний розчин, стоп-розчин, стрипи з іммобілізованими моноклональними антитілами до тестостерону, інкубатор для планшет, вошер для планшет, імуноферментний рідер планшет .
Тест-система ІФА для визначення тестостерону заснована на принципі конкурентного зв'язування. Лунки мікротітра покриті антитілом до унікального антигенною сайту на молекулі тестостерону. Ендогенний тестостерон в пробі конкурує з кон'югатом тестостерону та пероксидази хрону за зв'язування з антитілом, яке сорбувати на мікропанелях. Після інкубації незв'язаної кон'югат змивається. Кількість зв'язаного кон'югату обернено пропорційно концентрації тестостерону в зразку. При додаванні субстратного розчину інтенсивність отриманого фарбування обернено пропорційна концентрації тестостерону в сироватці.
Загальні зауваження до проведення аналізу
- Всі проби і реагенти перед проведенням аналізу повинні бути доведені до кімнатної температури. Змішування реагентів треба здійснювати, уникаючи спінювання.
- Після початку проведення тесту слід здійснювати всі етапи послідовно без переривання.
- Для кожного реагенту використовуйте нові чисті пластикові наконечники мікропіпеток для виключення перехресної контамінації. Для розкопування субстрату і зупиняє розчину не слід використовувати піпетки з металевими частинами.
- Вносьте стандарти і проби в нижню частину лунки за допомогою микропипетки. Що стосується внесення імуноферментного кон'югату та Стоп-розчину, рекомендується тримати піпетку вертикально і направляти падаючу краплю строго в центр лунки для здійснення повного перемішування зазначених компонентів.
- Перед постановкою тесту рекомендується підготувати всі реагенти, зняти кришки, закріпити в тримачі необхідну кількість смужок з лунками. Це забезпечить рівні витрати часу на всі необхідні етапи ІФА і запобіжить затримки піпетування.
- У цілому ферментативна реакція звичайно лінійно пропорційна часу проведення і температурі. Це робить можливою інтерполяцію для фізико-хімічних умов реакції. Зокрема, якщо величина абсорбції нульового стандарту нижче 1,0 або ж перевищує верхній рівень можливого виміру для використовуваного рідера, можна змінити час інкубації з субстратом до 30 хв, або ж до 10 хв, відповідно цим спостереженням.
- Оскільки калібрують стандарти проставляються в кожному тесті, флуктуації абсолютних величин абсорбції не відбиваються на кінцевому результаті ІФА.
- Розчин субстрату перед використанням повинен бути безбарвним або мати ледве помітний блакитно-зеленуватий відтінок. Наявність вираженого блакитного забарвлення вказує на непридатність субстрату. Його слід замінити!
- Під час інкубації з Субстратом слід захистити мікротітровальние панелі від світла.
ЗАБІР І ПІДГОТОВКА ПРОБ ДЛЯ АНАЛІЗУ
1. Для дослідження треба використовувати сироватки, або ж плазму після обробки EDTA. Не потрібно будь-якої додаткової підготовки проб. Проби для аналізу можна зберігати при 2 - 8 ° С до 5 днів, при необхідності більш тривалого зберігання проби необхідно заморожувати і зберігати при - 20 ° С або більш низькій температурі. Не використовуйте проби з вираженим гемолізом або з підвищеним вмістом ліпідів.
2. Проби, вміст тестостерону в яких імовірно перевищує 16 нг / мл, слід розводити з використанням нульового стандарту.
3. Якщо при першій постановці зразок сироватки показав концентрацію більше, чим вищий стандарт, то зразок повинен бути розведений в 10 або в 100 разів нульовим стандартом і проаналізовано знову. При підрахунку повинен братися до уваги фактор перерахунку.
УВАГА! У даному тесті не можна використовувати проби, що містять азид натрію.
1. Закріпіть бажану кількість смужок з підготовленими лунками в утримувачі.
2. Внесіть по 25 мкл стандартів тестостерону і проб у відповідні лунки.
3. Внесіть 200 мкл імуноферментного кон'югату в кожну лунку.
4. Протягом 10 сек. змішуйте реагенти в панелі. На цьому етапі надзвичайно важливо домогтися повного змішування реагентів.
5. Не закриваючи панель, інкубують при кімнатній температурі 60 хв.
6. Звільніть лунки від вмісту (наприклад виплеснув і постукавши по фільтрувальному паперу). Тричі промийте лунки розчином для промивання (по 400 мкл в лунку). Ретельно "вибийте" залишки рідини на фільтрувальному папері. Операцію № 6 рекомендується здійснювати в автоматичному режимі, використовуючи автоматичний вошер для планшет.
7. Внесіть 200 мкл ензим-субстрату в кожну лунку з рівними інтервалами часу.
8. Інкубація 15 хв при кімнатній температурі.
9. Зупиніть реакцію додаванням в кожну лунку 100 мкл стоп-розчину з такими ж інтервалами часу, як на етапі 7.
10. Виміряйте оптичну густину в лунках при довжині хвилі 450 + 10 нм протягом 10 хв після додавання стоп-розчину
Зміст звіту
1. Визначте значення абсорбції для стандартів і зразків.
2. Використовуючи будь-яку міліметрову або логарифмічну сітчасту папір, побудуйте стандартну криву, завдаючи значення абсорбції (Y) Стандартів проти їх концентрації (Х) в нг / мл.
3. Використовуйте середню величину абсорбції кожної проби для інтерполяції концентрації Тестостерону шляхом простого накладення даних на зазначену криву.
Запишіть концентрацію тестостерону в сироватці крові.
ПРИМІТКИ
1. Роботи № 11 - № 14 виконуються кожна протягом одного дня, оскільки ферменти-маркери субклітинних фракцій інактивуються при заморожуванні-відтаванні. У випадку нестачі часу на виконання повної схеми роботи виконуються в наступному варіанті:
- Активність ферментів-маркерів визначається у свіжоприготовленому 1% гомогенаті. 100 мг печінки гомогенізується в 1,9 мл робочого буфера (у роботі № 11 - 0,01 М трис-буфер рН 7,4; у роботі № 12 - 100 мМ натрій-ацетатний буфер рН 3,3; у роботі № 13 - буфер фосфатний 0,067 М (субстратний), рН 7,55; у роботі № 14 - 0,1 М цитратний буфер рН 6,5). Потім гомогенат центрифугують 10 хв при 1000 об / хв для видалення плівок.
2. Визначення білка за Лоурі. Необхідні реактиви: реактив Фоліна, реактив А, реактив В.
Реактив А. 0,5 г CuSO 4 · 5H 2 O + 1 г цитрату Na на 100 мл води, зберігати у морозильній камері. Для використання розморозити невелику частину і зберігати в холодильнику.
Реактив В. 4 г NaOH + 54 г Na 2 CO 3 · 10H 2 O (або 20 г Na 2 CO 3) на літр води.
Реактив С. 50 мл У + 1 мл А. Готувати безпосередньо перед визначенням концентрації білка.
Для визначення концентрації в три пробірки наливають по 0,5 мл розведеного розчину білка, в кожну з трьох пробірок і в контроль (0,5 мл дист. Води) доливають по 1 мл реактиву С, перемішують і витримують 10 хв при кімнатній температурі. Потім доливають по 0,1 мл реактиву Фоліна і витримують 40 хв при кімнатній температурі. Можна більше. Всі піпетки відразу промити дистильованою водою. Вимірюють светопоглощение на ФЕК при λ = 750 нм в кюветі товщиною 1 см проти контролю.
Бібліографічний список
1. Кретович В. Л. Введення в ензимології. - М.: Наука, 1986. - 332 с.
2. Діксон М., Уебб Е. Ферменти. - М.: Світ, 1982. - Т. 1 - 3.
3. Фершт Е. Структура і механізм дії ферментів. - М.: Світ,
1980. - 432 с.
4. Фрідріх П. Ферменти: четвертинна структура і надмолекулярних комплекси. - М.: Світ, 1986. - 374 с.
5. Кочетов Г.А. Практичний посібник з ензимології. - М.: Вищ. школа, 1980. - 272 с.
6. Практикум з біохімії / під ред. С.Є. Северина і Г.А. Соловйової.
- М.: МГУ, 1989. - 509 с.
7. Курганов Б.І. Аллостеріческій ферменти. - М.: Наука, 1978. - 248 с.
8. Корніш-Боуден Е. Основи ферментативної кінетики. - М.: Світ,
1979. - 280 с.
9. Трива М. Іммобілізовані ферменти. - М.: Світ, 1983. - 293 с.
10. Бернхард С. Структура та функція ферментів. - М.: Світ, 1971. - 334 с.
Пензенська ДЕРЖАВНИЙ ПЕДАГОГІЧНИЙ
УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В. Г. Бєлінський
В. Б. Соловйов, М. Т. Генгін
Практикум з ензимології
Навчально-методичний посібник
Редактор - Л. І. Дорошина
Коректор - Є. С. Мойсєєва
Оригінал-макет - В. Б. Соловйов
Поз. 157
Підписано до друку 07.12.07 Формат 60 Ч 84 / 16
Папір писальний біла Друк офсетний
Ум. - Друк. л. 3,0 Уч. - Вид. л. 3,2
Тираж прим. 100 Замовлення № 175 / 07 Ціна С. 183
Редакційно-видавничий відділ ПДПУ ім. В. Г. Бєлінського:
440026, Пенза, вул. Лермонтова, 37,
Педагогічний університет, корпус 5, кімната 466
Віддруковано з готового оригінал-макету в міні-друкарні
ТОВ КФ «Партнер-Делкон»:
м. Пенза, вул. Богданова, 2а,
тел. 52-58-60, 52-58-61
E-mail: p-audit@p-audit.ru, www.p-audit.ru
Обладнання і реактиви: свіжа кров (взята безпосередньо перед визначенням) *, скляні капіляри Roche, автоматичний аналізатор Roche Omni S 6 **.
* Для роботи використовується капілярну кров з пальця. Палець обробити ватою, змоченою медичним спиртом, зробити прокол скарифікатором за допомогою автоматичної ручки-прокаливателя. Кров збирати в скляний капіляр Roche.
** Перед роботою з приладом уважно ознайомтеся з його будовою і правилами експлуатації.
У ферментних електродах фермент і електрод утворюють єдину конструкцію, яка не вимагає для функціонування додаткових реагентів, крім буферних розчинів. Такі електроди отримали назву «безреагентний» датчиків, а засновані на їх використанні методи аналізу називаються «безреагентному». Для визначення глюкози використовується фермент глюкозооксидаза, іммобілізована ковалентним зв'язуванням з напівпроникною полікарбонатною мембраною. Вимірювання здійснюється за допомогою амперометрией. Операційні характеристики електрода залишаються стабільними протягом двох-чотирьох тижнів.
Проведіть вимір трьох різних зразків крові. Переведіть прилад у режим роботи з капілярною кров'ю. Зніміть верхню кришку з аналізатора для ознайомлення з ходом розподілу зразка крові під час аналізу. Помістіть капіляр із зразком у диск-приймач (Fill Port). Активуйте всмоктування зразка. Аналізатор автоматично перейде в режим вимірювання. Вивчіть розподіл зразка крові та проходження буферних та промивають розчином. Дочекайтеся закінчення вимірювання і роздрукуйте звіт.
Зміст звіту
1. Запишіть результати визначень глюкози в крові.
2. Замалюйте схеми пристрою ферментного електрода і автоматичного аналізатора.
Робота 16. Визначення сечовини в крові людини з використанням ферментних реагентів
Обладнання і реактиви: свіжа кров (взята безпосередньо перед визначенням) *, скляні капіляри Roche, автоматична піпетка з наконечниками, біохімічний аналізатор Рефлотрон +.
* Забір крові здійснюється в капіляр, як описано в роботі № 14.
** Перед роботою з приладом уважно ознайомтеся з його будовою і правилами експлуатації.
Біохімічний аналізатор Рефлотрон призначений для експрес-аналізу зразків свіжої крові та сироватки людини. Прилад не вимагає для роботи ніяких реактивів, крім тест-смужок для одноразового визначення досліджуваних речовин. Тест-смужка для визначення сечовини містить ліофілізований фермент уреазу і індикатор на лейко-формі. Зразок нагрівають, і сечовина, що міститься у зразку, при 37 ° С розщеплюється з утворенням аміаку та оксиду вуглецю. Це веде до часткову зміну забарвлення індикатором на зелено-блакитну, інтенсивність якої прямо пропорційна кількості сечовини в пробі:
(NH 2) 2 CO + H 2 O = 2 NH 3 + CO 2
NH 3 + індикатор (безбарвний) = NH 4 + + індикатор (синьо-зелений).
Після 3 хвилин, необхідних для інкубації зразка, вимірюється оптична щільність за принципом рефлексійність фотометрії. На тест-смужці є магнітна стрічка з інформацією про аналіз. Прилад прочитує інформацію про аналіз і перераховує оптичну щільність в концентрацію.
Приготуйте тест-смужку для аналізу. Видаліть з її поверхні захисну алюмінієву смужку. Дозатором відміряйте 32 мкл зразка і нанесіть його в центр зони аплікації, не торкаючись наконечником тест-смужки. Відкрийте кришку приладу і помістіть тест-смужку в аналізовану зону. Закрийте кришку. Аналізатор автоматично перейде в режим вимірювання. Дочекайтеся закінчення вимірювання і роздрукуйте звіт.
Зміст звіту
1. Запишіть результати визначень сечовини в крові.
Робота 17. Імуноферментного визначення тестостерону в сироватці крові
Обладнання і реактиви: сироватка крові людини, автоматична піпетка з наконечниками, набір стандартних розчинів тестостерону з відомими концентраціями, імуноферментний кон'югат, субстратний розчин, стоп-розчин, стрипи з іммобілізованими моноклональними антитілами до тестостерону, інкубатор для планшет, вошер для планшет, імуноферментний рідер планшет .
Тест-система ІФА для визначення тестостерону заснована на принципі конкурентного зв'язування. Лунки мікротітра покриті антитілом до унікального антигенною сайту на молекулі тестостерону. Ендогенний тестостерон в пробі конкурує з кон'югатом тестостерону та пероксидази хрону за зв'язування з антитілом, яке сорбувати на мікропанелях. Після інкубації незв'язаної кон'югат змивається. Кількість зв'язаного кон'югату обернено пропорційно концентрації тестостерону в зразку. При додаванні субстратного розчину інтенсивність отриманого фарбування обернено пропорційна концентрації тестостерону в сироватці.
Загальні зауваження до проведення аналізу
- Всі проби і реагенти перед проведенням аналізу повинні бути доведені до кімнатної температури. Змішування реагентів треба здійснювати, уникаючи спінювання.
- Після початку проведення тесту слід здійснювати всі етапи послідовно без переривання.
- Для кожного реагенту використовуйте нові чисті пластикові наконечники мікропіпеток для виключення перехресної контамінації. Для розкопування субстрату і зупиняє розчину не слід використовувати піпетки з металевими частинами.
- Вносьте стандарти і проби в нижню частину лунки за допомогою микропипетки. Що стосується внесення імуноферментного кон'югату та Стоп-розчину, рекомендується тримати піпетку вертикально і направляти падаючу краплю строго в центр лунки для здійснення повного перемішування зазначених компонентів.
- Перед постановкою тесту рекомендується підготувати всі реагенти, зняти кришки, закріпити в тримачі необхідну кількість смужок з лунками. Це забезпечить рівні витрати часу на всі необхідні етапи ІФА і запобіжить затримки піпетування.
- У цілому ферментативна реакція звичайно лінійно пропорційна часу проведення і температурі. Це робить можливою інтерполяцію для фізико-хімічних умов реакції. Зокрема, якщо величина абсорбції нульового стандарту нижче 1,0 або ж перевищує верхній рівень можливого виміру для використовуваного рідера, можна змінити час інкубації з субстратом до 30 хв, або ж до 10 хв, відповідно цим спостереженням.
- Оскільки калібрують стандарти проставляються в кожному тесті, флуктуації абсолютних величин абсорбції не відбиваються на кінцевому результаті ІФА.
- Розчин субстрату перед використанням повинен бути безбарвним або мати ледве помітний блакитно-зеленуватий відтінок. Наявність вираженого блакитного забарвлення вказує на непридатність субстрату. Його слід замінити!
- Під час інкубації з Субстратом слід захистити мікротітровальние панелі від світла.
ЗАБІР І ПІДГОТОВКА ПРОБ ДЛЯ АНАЛІЗУ
1. Для дослідження треба використовувати сироватки, або ж плазму після обробки EDTA. Не потрібно будь-якої додаткової підготовки проб. Проби для аналізу можна зберігати при 2 - 8 ° С до 5 днів, при необхідності більш тривалого зберігання проби необхідно заморожувати і зберігати при - 20 ° С або більш низькій температурі. Не використовуйте проби з вираженим гемолізом або з підвищеним вмістом ліпідів.
2. Проби, вміст тестостерону в яких імовірно перевищує 16 нг / мл, слід розводити з використанням нульового стандарту.
3. Якщо при першій постановці зразок сироватки показав концентрацію більше, чим вищий стандарт, то зразок повинен бути розведений в 10 або в 100 разів нульовим стандартом і проаналізовано знову. При підрахунку повинен братися до уваги фактор перерахунку.
УВАГА! У даному тесті не можна використовувати проби, що містять азид натрію.
1. Закріпіть бажану кількість смужок з підготовленими лунками в утримувачі.
2. Внесіть по 25 мкл стандартів тестостерону і проб у відповідні лунки.
3. Внесіть 200 мкл імуноферментного кон'югату в кожну лунку.
4. Протягом 10 сек. змішуйте реагенти в панелі. На цьому етапі надзвичайно важливо домогтися повного змішування реагентів.
5. Не закриваючи панель, інкубують при кімнатній температурі 60 хв.
6. Звільніть лунки від вмісту (наприклад виплеснув і постукавши по фільтрувальному паперу). Тричі промийте лунки розчином для промивання (по 400 мкл в лунку). Ретельно "вибийте" залишки рідини на фільтрувальному папері. Операцію № 6 рекомендується здійснювати в автоматичному режимі, використовуючи автоматичний вошер для планшет.
7. Внесіть 200 мкл ензим-субстрату в кожну лунку з рівними інтервалами часу.
8. Інкубація 15 хв при кімнатній температурі.
9. Зупиніть реакцію додаванням в кожну лунку 100 мкл стоп-розчину з такими ж інтервалами часу, як на етапі 7.
10. Виміряйте оптичну густину в лунках при довжині хвилі 450 + 10 нм протягом 10 хв після додавання стоп-розчину
Зміст звіту
1. Визначте значення абсорбції для стандартів і зразків.
| Конц. стандартів, нг / мл | |||||
| Величина абс., D |
3. Використовуйте середню величину абсорбції кожної проби для інтерполяції концентрації Тестостерону шляхом простого накладення даних на зазначену криву.
Запишіть концентрацію тестостерону в сироватці крові.
ПРИМІТКИ
1. Роботи № 11 - № 14 виконуються кожна протягом одного дня, оскільки ферменти-маркери субклітинних фракцій інактивуються при заморожуванні-відтаванні. У випадку нестачі часу на виконання повної схеми роботи виконуються в наступному варіанті:
- Активність ферментів-маркерів визначається у свіжоприготовленому 1% гомогенаті. 100 мг печінки гомогенізується в 1,9 мл робочого буфера (у роботі № 11 - 0,01 М трис-буфер рН 7,4; у роботі № 12 - 100 мМ натрій-ацетатний буфер рН 3,3; у роботі № 13 - буфер фосфатний 0,067 М (субстратний), рН 7,55; у роботі № 14 - 0,1 М цитратний буфер рН 6,5). Потім гомогенат центрифугують 10 хв при 1000 об / хв для видалення плівок.
2. Визначення білка за Лоурі. Необхідні реактиви: реактив Фоліна, реактив А, реактив В.
Реактив А. 0,5 г CuSO 4 · 5H 2 O + 1 г цитрату Na на 100 мл води, зберігати у морозильній камері. Для використання розморозити невелику частину і зберігати в холодильнику.
Реактив В. 4 г NaOH + 54 г Na 2 CO 3 · 10H 2 O (або 20 г Na 2 CO 3) на літр води.
Реактив С. 50 мл У + 1 мл А. Готувати безпосередньо перед визначенням концентрації білка.
Для визначення концентрації в три пробірки наливають по 0,5 мл розведеного розчину білка, в кожну з трьох пробірок і в контроль (0,5 мл дист. Води) доливають по 1 мл реактиву С, перемішують і витримують 10 хв при кімнатній температурі. Потім доливають по 0,1 мл реактиву Фоліна і витримують 40 хв при кімнатній температурі. Можна більше. Всі піпетки відразу промити дистильованою водою. Вимірюють светопоглощение на ФЕК при λ = 750 нм в кюветі товщиною 1 см проти контролю.
Бібліографічний список
1. Кретович В. Л. Введення в ензимології. - М.: Наука, 1986. - 332 с.
2. Діксон М., Уебб Е. Ферменти. - М.: Світ, 1982. - Т. 1 - 3.
3. Фершт Е. Структура і механізм дії ферментів. - М.: Світ,
1980. - 432 с.
4. Фрідріх П. Ферменти: четвертинна структура і надмолекулярних комплекси. - М.: Світ, 1986. - 374 с.
5. Кочетов Г.А. Практичний посібник з ензимології. - М.: Вищ. школа, 1980. - 272 с.
6. Практикум з біохімії / під ред. С.Є. Северина і Г.А. Соловйової.
- М.: МГУ, 1989. - 509 с.
7. Курганов Б.І. Аллостеріческій ферменти. - М.: Наука, 1978. - 248 с.
8. Корніш-Боуден Е. Основи ферментативної кінетики. - М.: Світ,
1979. - 280 с.
9. Трива М. Іммобілізовані ферменти. - М.: Світ, 1983. - 293 с.
10. Бернхард С. Структура та функція ферментів. - М.: Світ, 1971. - 334 с.
Пензенська ДЕРЖАВНИЙ ПЕДАГОГІЧНИЙ
УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В. Г. Бєлінський
В. Б. Соловйов, М. Т. Генгін
Практикум з ензимології
Навчально-методичний посібник
Редактор - Л. І. Дорошина
Коректор - Є. С. Мойсєєва
Оригінал-макет - В. Б. Соловйов
Поз. 157
Підписано до друку 07.12.07 Формат 60 Ч 84 / 16
Папір писальний біла Друк офсетний
Ум. - Друк. л. 3,0 Уч. - Вид. л. 3,2
Тираж прим. 100 Замовлення № 175 / 07 Ціна С. 183
Редакційно-видавничий відділ ПДПУ ім. В. Г. Бєлінського:
440026, Пенза, вул. Лермонтова, 37,
Педагогічний університет, корпус 5, кімната 466
Віддруковано з готового оригінал-макету в міні-друкарні
ТОВ КФ «Партнер-Делкон»:
м. Пенза, вул. Богданова, 2а,
тел. 52-58-60, 52-58-61
E-mail: p-audit@p-audit.ru, www.p-audit.ru