Іммобілізовані ферменти

Зміст

1. Іммобілізовані ферменти. Методи іммобілізації

2. Застосування іммобілізованих ферментів

Література

1. Іммобілізовані ферменти. Методи іммобілізації

Іммобілізовані ферменти (від лат. Immobiiis - нерухомий), препарати ферментів, молекули яких брало пов'язані з матрицею, або носієм (як правило, полімером), зберігаючи при цьому повністю або частково свої каталітіч. св-ва. Іммобілізовані ферменти зазвичай не розч. у воді; між двома фазами можливий обмін молекулами субстрату, продуктів каталітіч. р-ції, інгібіторів і активаторів.

Комерційне використання ферментів обмежена рядом чинників. Найважливіші з них - нестабільність ферментів та їх висока вартість. Вартість можна істотно знизити за рахунок іммобілізації ферменту. Це означає, що фермент закріплюють на поверхні або всередині твердої підкладки, яку легко видаляють з реакційної суміші після завершення ферментації. Фермент може бути використаний повторно, що істотно знижує вартість процесу.

Інша перевага іммобілізації полягає в тому, що фермент стає більш стабільним, ймовірно, за рахунок обмеження його здатності денатурувати при змінах рН, температури і розчинників. Приміром, іммобілізованих глюкозоізомераза стабільна при 65 ° С протягом року, тоді як в розчині вона денатурує при 45 ° С за кілька годин.

Іммобілізований фермент можна використовувати для безперервного (відкритого) виробництва, пропускаючи реагенти через фермент і збираючи продукт на кінцевому етапі.

Методи іммобілізації ферментів

Існують різні способи іммобілізації ферментів. Вони включають або механічне включення (захоплення) ферменту, або його приєднання до певної структури, або матриці. Перевагою методу захоплення є те, що фермент зберігається в природному стані. Однак великим молекулам важко дістатися до ферменту.

Фізична іммобілізація ферментів являє собою включення ферменту в таке середовище, в якій для нього доступною є лише обмежена частина загального обсягу. При фізичної іммобілізації фермент не пов'язаний з носієм ковалентними зв'язками. Існує чотири типи зв'язування ферментів:

- Адсорбція на нерозчинних носіях;

- Включення до пори гелю;

- Просторове відділення ферменту від решти обсягу реакційної системи за допомогою напівпроникною перегородки (мембрани);

- Включення до двофазну середовище, де фермент розчинний і може знаходитися тільки в одній з фаз.

Для іммобілізації ферментів в гелі існує два основних способи. При одному з них фермент поміщають у водний розчин мономера, а потім проводять полімеризацію, в результаті чого утворюється полімерний гель з включеними в нього молекулами ферменту. У реакційну суміш часто додають також біфункціональних (що містять в молекулі два подвійні зв'язки) зшиваючі агенти, які надають образу полімеру структуру тривимірної сітки. В іншому випадку фермент вносять в розчин готового полімеру, який потім якимось чином переводять в гелевидний стан. Спосіб іммобілізації ферментів шляхом включення в полімерний гель дозволяє створювати препарати будь-якої геометричної конфігурації, забезпечуючи при цьому рівномірний розподіл біокаталізатора в обсязі носія. Метод універсальний, застосовний для іммобілізації практично будь-яких ферментів, Поліферментні систем, клітинних фрагментів і клітин. Фермент, включений в гель, стабільний, надійно захищений від інактивації внаслідок бактеріального зараження, тому що великі клітини бактерій не можуть проникнути в дрібнопористу полімерну матрицю. У той же час, ця матриця може створювати значні перешкоди для дифузії субстрату до ферменту, знижуючи каталітичну ефективність іммобілізованого препарату, тому для високомолекулярних субстратів даний метод іммобілізації не застосуємо взагалі.

Захоплення кульками альгината легко продемонструвати на лабораторних заняттях; він є найбільш поширеним промисловим методом. Розчин, що містить фермент і альгінат натрію, по краплях вносять в розчин хлористого кальцію. Як тільки крапельки вступають в контакт з хлористим натрієм, вони негайно починають перетворюватися на гель, при цьому утворюються ідеальні за формою кульки гелю, що містять всередині захоплений фермент. Для тривалого використання гель можна стабілізувати поліакриламідом або приготувати його у вигляді пластин, якщо помістити його на тканинну основу.

Головною відмітною ознакою хімічних методів іммобілізації є те, що шляхом хімічної взаємодії на структуру ферменту в його молекулі створюються нові ковалентні зв'язки, зокрема між білком і носієм. Препарати іммобілізованих ферментів, отримані із застосуванням хімічних методів, мають принаймні двома важливими достоїнствами. По-перше, ковалентний зв'язок ферменту з носієм забезпечує високу міцність утворюється кон'югату. При широкому варіюванні таких умов, як рН і температура, фермент не десорбується з носія і не забруднює цільових продуктів каталізуються їм реакції. Це особливо важливо при реалізації процесів медичного та харчового призначення, а також для забезпечення стійких, відтворюваних результатів в аналітичних системах. По-друге, хімічна модифікація ферментів здатна приводити до істотних змін їх властивостей, таких як субстратна специфічність, каталітична активність і стабільність.

2. Застосування іммобілізованих ферментів

Кращим прикладом процесу, в якому успішно використовуються іммобілізовані ферменти, є виробництво кукурудзяного сиропу з високим вмістом фруктози. Він широко використовується в США і Японії в якості підсолоджувача, наприклад, у фруктових напоях, так як він значно дешевше сахарози. Сироп готують з відносно дешевого джерела вуглеводів - крохмалю, що отримується з кочерижек кукурудзяних качанів. Процес здійснюється за участю трьох ферментів. Спочатку одержують крохмальну масу шляхом перемелювання (розтирання) кукурудзи, потім дві амілази перетворюють крохмаль у глкжозний сироп. Знебарвлений і сконцентрований сироп додають у різні харчові продукти та напої. За допомогою ферменту глкжозоізомерази можна перетворити цей сироп в суміш, що містить рівні кількості глюкози і фруктози. Для цього сироп пропускають через колонку, в якій міститься фермент, іммобілізований шляхом адсорбції на целлюлозном іонообмінників. Активність ферменту з часом поступово знижується, тому зазвичай використовують кілька колонок, що працюють одночасно. Фруктоза солодше глюкози, хоча обидві містять однакову кількість калорій на одиницю маси. Це означає, що, використовуючи кукурудзяний сироп з високим вмістом фруктози, можна отримати такий же солодкий продукт як з глюкозою, але з меншою кількістю калорій. Щорічно в США виробляється близько 4 млн. тонн сиропу.

Першим іммобілізованим ферментом, застосованим в промисловому масштабі, була аміноацілаза. Вона була використана в Японії в 1969 р. для виробництва амінокислот, що додаються до корму тварин. На світовому ринку ця продукція має великий попит.

Кожна молекула амінокислоти може існувати у двох формах, одна з яких є дзеркальним відображенням іншої, як права і ліва рука. Ці дві форми називаються оптичними ізомерами і є право-і левовращающімі формами, або D-і L-формами (по напрямку обертання ними площині поляризації світла). Всі існуючі в природі амінокислоти є L-амінокислотами. Набагато легше отримати амінокислоти шляхом хімічного синтезу, ніж виділяти їх з клітин, однак синтезовані амінокислоти утворюються у вигляді суміші рівних кількостей D-і L-ізомерів. Проблема отримання L-амінокислот вирішується за допомогою ферментів, специфічно каталізують перетворення тільки однією з форм. Основні стадії процесу представлені у вигляді діаграми на малюнку.

Фермент иммобилизуют шляхом іонного зв'язування на колонці з носієм. Після безперервної автоматизованої роботи протягом 30 днів при 50 ° С активність ферменту знижується до 40%; для відновлення активності додають свіжий фермент. В результаті завдяки іммобілізації економиться 40% ферменту.

Інший приклад використання іммобілізованих ферментів - виробництво напівсинтетичних пеніцилінів з природних пеніцилінів. Іммобілізований фермент хімічно модифікує одну з бічних груп молекули пеніциліну, що призводить до підвищення антибіотичної активності пеніцилінів.

Література

1. Іммобілізовані ферменти. Сучасний стан та перспективи, під ред. І.О. Березіна, т. 1-2, М., 1976.

2. Козлов Л.В. "Біоорганічна хімія", 1980, т. 6, № 8, с. 1243-54.

3. Введення в прикладну етимологію. Іммобілізовані ферменти, під ред. І.В. Березина, К. Мартінека, М., 1982.

4. Трива М. Іммобілізовані ферменти. Вступний курс і застосування в біотехнології. - М., 1983.