Андрій Артурович Недоспасов, д.х.н., Наталія Володимирівна Біда, м.н.с., Інститут молекулярної генетики РАН
"Немає нічого більш практичного, ніж добра теорія" - фундаментальна наука неминуче знаходить вихід у практику. На жаль, у рідній батьківщині ця аксіома все частіше виявляється теоремою, проблемою, а то й просто ілюзією. Бути може, фундаментальні дослідження, описані в цій роботі, дозволять відновити статус-кво і мінімізувати збиток від виниклого дисбалансу.
Багато лікарські препарати і методи лікування, відкриті задовго до "ери NO", більшою чи меншою мірою впливають на метаболізм оксидів азоту, але дія це часто залишається непоміченим, а лікувальні ефекти пояснюються якимись іншими причинами. Яскравий приклад тому - клінічне застосування штучних кровозамінників на основі перфторорганічних сполук (ПФС), відомих в Росії під назвами "Блакитна кров" і "Перфторан" [1 -3].
Ідея ПФС-кровозамінників виникла наприкінці 60-х років XX ст. Оскільки рідкі ПФС чудово розчиняють кисень, емульсії з них могли б виконувати газотранспортну функцію еритроцитів крові. Дослідження активно велися в Японії, СРСР і США. У 80-ті роки, під час афганської війни, досвідчені партії радянських препаратів врятували чимало життів пораненим, приреченим на неминучу смерть від втрати крові. В даний час "Перфторан" допущено до клінічного застосування і вільно продається в аптеках.
Згодом з'ясувалося, що застосування "Перфторан", в тому числі в малих дозах, часто дає позитивні ефекти, для яких зв'язок з його газотранспортної функцією не проглядається. Одночасно виявили ряд побічних ефектів, також не знаходили пояснення. Сьогодні багато хто з них стали зрозумілі завдяки уявленням про міцелярно окислювальному нітрозірованіі *. Цей термін, запропонований нами для введення радикала · NO в гетерогенному середовищі, має на увазі, що в значній мірі реакції йдуть по радикальному механізму: молекула NO реагує з вільним радикалом, що утворився з молекули-мішені під дією · NO2 - продукту окиснення NO.
* Детальніше див: Недоспасов А.А., Біда Н.В. Біогенні оксиди азоту / / Природа. 2005. № 7. С.33-39.
Перфторуглеводороди (ПФУ) - екстремально гідрофобні речовини з великим коефіцієнтом розподілу Q для кисню та NO в сумішах з водою. Кисень розчиняється в них (у гідрофобною фазі емульсії) набагато краще, ніж у воді або плазмі крові, через що вони й знайшли застосування в складі кровозамінників. Завдяки міцелярно каталізу мікрокраплі емульсії в крові діють як губки для обох газів, саме в них відбувається тепер основна частина окислення NO.
У попередній статті ми розглядали вплив гідрофобних фаз на процеси окислення NO (наприклад, при утворенні холестеринових бляшок на стінках кровоносних судин). При порівнянні з емульсією ПФС-кровозамінників помітні три істотні відмінності.
По-перше, набагато вище значення Q. Оскільки прискорення реакції окислення NO при введенні оптимальних кількостей гідрофобною фази пропорційно QNO у присутності "Перфторан" окислюється набагато швидше [4, 5]. При цьому збільшуються швидкості нітрозірованія та інших процесів, залежних від міцелярно каталізу, - всі вони протікають переважно в штучної гідрофобною фазі або на межі розділу фаз. Концентрація NO у водній фазі спочатку падає, що призводить до активації ферментів NO-синтази, що постачають NO.
По-друге, краплі емульсії не змочують стінки судин (перфторуглеводороди взагалі нічого не змочують з наявних у організмі поверхонь розділу фаз). Більш того, NO з холестеринових бляшок і інших "звичайних" гідрофобних фаз також частково перетворюється на краплі емульсії. Значить, шкідлива дія продуктів окислення NO на стінки судин зменшується.
По-третє, лінійні розміри крапель емульсії в "перфторану" менш 0.1 мкм (діаметр еритроцита ~ 20 мкм, а холестерину бляшки багато більше); відповідно, відношення поверхні до об'єму оптимально для протікання реакцій нітрозірованія на кордоні розділу. Якщо в навколишньому просторі присутні тіоли (RSH), крапля емульсії може діяти як мініатюрний реактор з виробництва тіонітрітов (RSNO). У нормі в плазмі крові досить висока концентрація відновленого глутатіону (тріпептідов, що містить залишок цистеїну з вільною HS-групою), нітрозоформа якого - прекрасний донор NO.
Таким чином, аналогія краплі перфторуглеводородной емульсії з еритроцитом виявилася набагато глибше, ніж вважали спочатку: обидва переносять і кисень, і вуглекислий газ, і NO / RSNO. Зрозуміло, що навіть малі дози кровозамінників типу "Перфторан", введені в кров'яне русло, мають ефект, характерним для нітрогліцерину (основи динаміту і одночасно популярного ліки), тобто викликають релаксацію судин і відновлюють кровообіг.
У перших дослідах на щурах було наочно продемонстровано вплив емульсій перфторуглеводородов на метаболізм NO: при введенні "Перфторан" спостерігалися передбачені коливання концентрацій нітриту і нітрату в плазмі, зміни частоти серцевих скорочень, звичайні при дії вазоділаторов типу нітрогліцерину. Інгібування NO-синтази знімало ці ефекти [6]. Кілька років по тому цю роботу повторили у США [7].
Побічні ефекти застосування кровозамінників типу "Перфторан" у багатьох випадках виявлялися не відразу, а через значний час після переливання крові. Поверхнево-активні речовини, використовувані для стабілізації емульсій при створенні ПФУ-кровозамінників, виводяться з організму набагато швидше, ніж самі ПФУ (характерні часи - добу і місяць відповідно). Якщо в перші години після введення емульсія стає основним місцем окислення NO, то через добу процеси переміщуються головним чином в природні ліпідні фази організму, в яких розчинилися ПФУ. Ясно, що в організмі вони (у вигляді окремої фази або розчинені у наявних гідрофобних фазах) будуть впливати не тільки на параметри міцелярно окислення NO через зростання QO2 і, особливо, QNO, але і на всі наступні процеси, включаючи нітрування і нітрозірованіе ліпідів , білків і нуклеїнових кислот. Отже, "отруєння" під дією хімічно інертних перфторуглеводородов, в тому числі газоподібних, що розчиняються в ліпідах, можна пояснити втратою стійкості системи регуляції метаболізму оксидів азоту.
Рис.1. Схема біосинтезу NO і основні метаболічні шляхи оксидів азоту.
Прискорення окислення NO киснем відбивається на рівновазі вищих оксидів азоту; при цьому їх стаціонарні концентрації змінюються. Якщо електрофільне нітрозілірованіе (освіта RSNO, рис.1) переважно протікає під дією NO + (N2O3, N2O4), а радикальні реакції (включаючи нітрування і окислення білків і нуклеїнових кислот) - під дією · NO2, то при використанні штучних гідрофобних фаз в якості кровозамінників бажано змістити рівновагу у бік перших, у всякому разі не збільшувати стаціонарні концентрації NO2.
Концентрації вищих оксидів азоту при окисленні NO надзвичайно низькі, і виміряти їх звичними методами не вдається. Ми знайшли простий і чутливий спосіб, заснований на визначенні нітрату в продуктах окислення. Нітрат відновлюється в нітрит сполуками ванадію, швидкість цього процесу вимірюють за допомогою реакції Грісса (за освітою барвника). Якщо із зразка видалити наявний спочатку (до відновлення нітрату) нітрит, весь утворився барвник буде відбуватися з нітрату. Оскільки в результаті гідролізу N2O3 виходить тільки нітрит
N2O3 + H2O = 2HNO2, (1)
а при гідролізі N2O4 - еквімолярної суміш нітриту і нітрату
N2O4 + H2O = HNO2 + HNO3, (2)
частка нітрату в продуктах буде мірою стаціонарних концентрацій обох оксидів. У цілому, в малополярних гідрофобних фазах стабілізація N2O3 при сольватації мінімальна, розпад на NO і NO2 посилюється, і частка NO2 повинна зростати:
NO2 + NO = N2O3. (3)
Аналіз системи рівнянь для стаціонарних концентрацій оксидів азоту показав, що можливе зниження [NO2] ст незалежно від змін [NO] ст і загального пулу оксидів азоту [8]. Зокрема, вибірково прискорюючи нітрозілірованіе, ми знижуємо не тільки [N2O3] ст, але і [NO2] ст, тобто швидкості всіх радикальних реакцій з його участю. У зв'язку шукати каталізаторів нітрозілірованія / денітрозілірованія стає важливим завданням біохімії.
Рис.2. Гістограма, яка відображає внесок гетерогенності середовища і каталізаторів денітрозірованія в баланс нітрит / нітрат при окисленні NO. Ліворуч: у гетерогенному середовищі швидкість окислення NO вище, ніж у гомогенної. Зазвичай система рівноваг вищих оксидів азоту зсувається в бік NO2 і N2O4, і частка нітрату в продуктах зростає. Triton X 100 - детергент (аналог мила), використаний для отримання ліпосом (за даними Liu et al., 1998). Праворуч: хоча в CF-емульсіях швидкість окислення NO зростає сильніше, ніж у звичайних ліпідах, сольватація та швидкості гідролізу вищих оксидів азоту змінені. У присутності "Перфторан" частка нітрату в продуктах нижче, ніж у гомогенному водному розчині (ліва пара стовпчиків). Фосфат (PO4-3), піро-(P2O7-4) і триполіфосфат (P3O10-5) прискорюють гідроліз N2O3 на нітрит. У результаті стаціонарні концентрації NO2 і N2O4 зменшуються і вихід нітрату падає. Видно, що поліфосфат набагато активніше, ніж фосфат. Hepes - компонент буферного розчину.
Порівняємо вплив гетерогенності середовища і сольватації на нітрит-нітратний баланс в продуктах окислення NO у присутності звичайних ліпідів і в "перфторану" (рис.2). Видно, що в першому випадку при додаванні гідрофобною фази частка нітрату (а значить, що викликаються · NO2 радикальних реакцій!) Росте, у другому виявляється нижче, ніж у гомогенному водному розчині [9]. Почасти ефект пов'язаний з каталітичною дією поліефірного стабілізатора емульсії на реакцію нітрозірованія. Його можна підсилити за допомогою інших знайдених нами каталізаторів. На рис.2 в якості ілюстрації показані каталітичні ефекти фосфату і триполіфосфату. При збільшенні швидкості гідролізу N2O3 (фактично - нітрозілірованія води) зменшуються стаціонарні концентрації як N2O3, так і NO2 через зсув рівноваги в реакції (3).
Втім, і тут не обійшлося без парадоксів і несподіванок. Перфторуглеводороди та їх гетероаналоги (речовини, що містять крім C і F інші атоми, наприклад, перфтороктілбромід - ПФБ), близькі по розчинювальній здібності щодо кисню, вважалися однаково інертними. Тому при створенні кровозамінників вибір конкретних сполук був випадковим і визначався в значній мірі тиском пари і доступністю в чистому вигляді. (У промисловості ПФУ та їх гетероаналоги отримують для далеких від медицини цілей, зокрема для електротехніки.) Так, основу "Перфторан" становить суміш ізомерів перфтордекаліна і перфтор-(4-циклогексил, N-метил) пиперидина (рис.3). У Японії і США найбільш популярний перфтороктілбромід (C8F17Br, ПФБ; в кровозамінника "Перфлюброн", "Оксіджент" та ін.)
Рис.3. Формули перфторорганічних сполук, використовуваних у виробництві кровозамінників.
Цікаво, що сьогодні перфтороктілбромід застосовується при штучній вентиляції легенів. У легені пацієнта (частіше в одне) вводять рідкий ПФБ (~ 1 л) і шланг з розпилювачем для подачі повітря або кисню. Після завершення процедури шланг видаляється, а ПФБ залишається в легенях і повільно (тижні-місяці) виводиться з видихається, а частина його знаходять у крові.
Неодноразово зазначалося, що фізіологічні властивості і кровозамінників на основі перфторуглеводородов, перфтороктілбромідов і чистих компонентів різні. Причини цього залишалися незрозумілими. Дійсно, якщо б ефекти цих сполук зводилися лише до транспорту кисню, вони були б однакові для всіх ПФУ та ПФБ, оскільки значення коефіцієнта розподілу NO для перфтороктілбромідов і не містять атома брому перфторсоедіненій, включаючи перфтордекалін (основний компонент "Перфторан"), також виявилися близькими . Таким чином, пояснити різні фізіологічні ефекти лише різною сольватацией NO не вдалося. У цьому зв'язку ми поставили під сумнів постулат про інертність перфтороктілбромідов in vivo і почали шукати природні супернуклеофіли, здатні реагувати з ним при температурі тіла [10].
Для перфторалкілгалогенідов були відомі реакції перфторалкілірованія при каталізі низьковалентних комплексами нікелю і кобальту. Найбільш відома форма існування кобальту in vivo - кобаламін (вітамін В12), який у відновленій формі служить кофактором ряду ферментів (рис. 4). Ми показали, що кобаламін активує ПФБ, мабуть, з утворенням перфтороктільного радикала і Co (II), який може знову відновлюватися до Co (I). Значить, вітамін В12 у присутності відновників грає роль каталізатора перфторалкілірованія під дією ПФБ. Реакцію вдалося "візуалізувати" з використанням флюоресцирующих мішеней. У тих же умовах зв'язок CF виявилася стійкою: ми не виявили перфторалкілірованія під дією перфтордекаліна. Доля гідрофобних перфторалкільних радикалів in vivo залишається невідомою. Ймовірно, вони здатні ефективно реагувати з NO (природним инактиваторам вільних радикалів), утворюючи нові токсичні продукти.
Рис.4. Схема каталізу кобаламін (вітаміном В12) реакцій перфторалкілірованія під дією перфторалкілгалогенідов. In vivo кобаламін відновлюється до Зі +1. Цей супернуклеофіл здатний "вирвати" атом брому з молекули перфторалкілброміда (показана як CFBr). Утворений перфторалкільний радикал CF · вступає в реакції з активованими подвійними зв'язками (показаний заміщений акриламід, Х - флуоресцентний група), ароматичними сполуками і ін Знову утворилися радикали (2) стабілізуються різними шляхами, приводячи до стабільних CF-містить продуктів (3, 4) .
Принципова відмінність ПФУ та ПФБ у ставленні до супернуклеофілам типу відновлених форм кобаламина дозволяє пояснити відмінність властивостей кровозамінників на їх основі: ПФБ у фізіологічних умовах не можна вважати хімічно інертним. Аналогічні пояснення застосовні і до численних отруєнь іншими перфторалкілгалогенідамі (ПФГ): крім механізмів, пов'язаних з NO-катастрофами, вони можуть брати участь у реакціях перфторалкілірованія звичайних метаболітів. Ясно, що низькі концентрації кобаламина в тканинах роблять їх малопомітними, але не менш неприємними, особливо при великих "періодах напіввиведення" (міра часу життя в організмі) вищих гомологів. Не виключено, що в якості відновників ПФГ, крім B12, можуть виступати й інші метаболіти. Оскільки сучасний рівень знань не дозволяє оцінити віддалені наслідки і ступінь ризику, експерименти з використанням перфторалкілгалогенідов на людях слід було б гранично обмежити.
Загальна кількість пацієнтів, які отримали великі дози перфтороктілбромідов за медичними показаннями, і добровольців, учасників випробувань, невідомо, але свідомо п'ятизначне. Нижчі газоподібні перфторалкілгалогеніди використовуються як розчинники, в тому числі при хімічному чищенні одягу, як фреони (бромтріфторметан), а також у вогнегасниках і автоматичних протипожежних системах - від військової техніки до космічних кораблів багаторазового використання ("Спейс Шаттл"). Описано багато випадків отруєнь, в тому числі зі смертельними наслідками, при вдиханні газоподібних перфторалкілгалогенідов. Очевидно, що і тривалість впливу, та концентрації цих речовин (зокрема, в наших хімчистках самообслуговування) можуть змінюватися в широких межах. Відомі приклади, коли серйозні проблеми зі здоров'ям і смерть наступали через значне часу після отруєння ПФГ.
Відкриття перфторалкілірованія при каталізі відомим вітаміном після 40 років робіт з використання ПФГ в медицині піднімає серйозні філософські питання. Кореляція між появою озонових дір і попаданням фреонів в атмосферу - факт, встановлений в ході фундаментальних наукових досліджень. Реакція утворення перфторалкільних радикалів при опроміненні ультрафіолетом фреонів потрапила не тільки у вузівські, але і в шкільні підручники. Зв'язок алкілування ДНК і вільно-радикальних реакцій з мутаціями і раком повинен вміти пояснити будь-який випускник середньої школи. Аналогія між озоном і високоактивними метаболітами, які беруть участь в реакціях окислення (у тому числі при біосинтезі NO), також здається досить очевидною. Тим не менш тисячам добровольців і пацієнтів вводили і продовжують вводити великі дози ПФГ, які залишаються в організмі на місяці. Залишається загадкою, чому й у учасників, і у організаторів таких експериментів, незважаючи на всі ці знання, ніколи не виникало питання про хімічну інертності ПФГ in vivo. Негативну відповідь на це питання міг і повинен був бути отриманий багато років тому, до початку масових експериментів на людях.
Сьогодні гостра необхідність у вивченні біохімії ПФГ і методів детоксикації цих з'єднань і їх потенційних метаболітів очевидні, оскільки, незважаючи на попередження екологів, їх як і раніше широко використовують в техніці і в побуті, і випадкові контакти з ними у разі різного роду аварій і форс- мажорних обставин будуть траплятися і надалі навіть при повному припиненні використання перфтороктілбромідов в медицині. Не виключено, що ефективним методом виведення важколетких ПФГ та продуктів їх перетворень виявиться короткочасне введення стабілізованих емульсій хімічно інертних перфторуглеводородов (типу "Перфторан") з наступним видаленням їх гемосорбцією разом з "екстрагованих" перфторалкілгалогенідамі.
* * *
На закінчення ми хочемо навести приклади популярних препаратів, механізм дії яких пов'язаний з регуляцією метаболізму оксидів азоту. Нагадаємо, що NO синтезується з аргініну під дією NO-синтази (NOS) і активує гуанілатциклазу (GC), що постачає цикло-ГМФ, що й служить молекулярним сигналом до розширення судин (мал. 5). Нітрогліцерин та амилнитрит як штучні донори NO при серцевій недостатності забезпечують розширення судин міокарда і запобігають розвитку інфаркту. Більше того, вони можуть бути корисні навіть на ранніх стадіях після того, що сталося інфаркту чи інсульту: крім відновлення кровотоку (завдяки активації гуанілатциклази), що утворюється NO діє як детоксикатор вільних радикалів, концентрація яких різко зростає після інфаркту або інсульту, що і служить причиною загибелі клітин серцевого м'язи або мозку. В останні роки в якості ефективної екстреної заходи пацієнта поміщають в атмосферу з дуже невеликою кількістю NO.
Рис.5. Популярні фармацевтичні препарати, механізм дії яких пов'язаний з регуляцією метаболізму оксидів азоту.
Розвиток септичного шоку пов'язано з надмірною активністю NO-синтази, індукованої потрапили в кровотік патогенами. Організм, намагаючись забезпечити себе від вторгнення чужорідних клітин, виробляє великі кількості NO для їхнього знищення. Це призводить до активації гуанілатциклази, занадто сильному розширенню судин, як наслідок - до падіння тиску крові. Смерть настає від зниження ефективності кровообігу. Інгібітори NO-синтази (наприклад, нітроаргінін) або введення в кров аргінази (ферменту, що руйнує аргінін - попередник NO) можуть бути рятівними.
Рівень цикло-ГМФ підтримується балансом активностей гуанілатциклази (синтез) і специфічної фосфодіестерази PDE5 (розпад). Інгібування останньої забезпечує високу концентрацію цикло-ГМФ навіть при нестачі синтезу NO, активуючого гуанілатциклазу. Кофеїн - слабкий і неспецифічний інгібітор фосфодіестераз, розщеплюють цикло-ГМФ. Силденафіл ("Віагра") - потужний і специфічний інгібітор фосфодіестерази PDE5 - виявився ефективним засобом при імпотенції (злі язики стверджують, що саме це відкриття було вирішальним для членів Нобелівського комітету). Той же ефект може бути досягнутий інгібуванням аргінази.
"Перфторан" та інші штучні гідрофобні фази можуть виступати і як активатори, і як блокатори різних NO-залежних процесів. Розчинність NO і O2 в емульсії перфторуглеводорода вище, ніж у плазмі крові, що спочатку забезпечує перетік NO з плазми в гідрофобну фазу емульсії де через міцелярно каталізу швидкість його окислення вище, ніж у навколишньому краплі емульсії плазмі. У цілому, концентрація NO в крові падає (показано червоною стрілкою), одночасно падає необоротне окислення NO у нітрат під дією гемоглобіну. Зниження концентрації розчиненого NO може активувати NOS. Продукти окислення NO переважно утворюються в емульсії, і саме там вище нітрозілірующая активність. Подальша доля продуктів окислення може регулюватися; можливий варіант, коли емульсія стає джерелом NO-донорів.
Швидкості накопичення знань, появи нових технологій до початку третього тисячоліття стали буквально фантастичними. У істотному ступені настільки бурхливе зростання має автокаталітіческій механізм: він забезпечується успіхами науки в попередні роки і регулюється швидкістю перетворення фундаментальних наукових відкриттів в нові технології, які використовуються як для "споживання", так і для подальшого розвитку досліджень. Для біологічних наук прикладами перших є поява методів діагностики і лікування невиліковних раніше захворювань або виведення високопродуктивних сільськогосподарських культур. До других можна віднести все більш тонкі методи аналізу (речовин, клітин і цілих організмів) або синтезу складних "біологічних" молекул. У цілому, попередні успіхи у фундаментальних дослідженнях зумовлюють нові досягнення як в економіці, так і в самій науці.
Робота виконана за підтримки Російського фонду фундаментальних досліджень.
Проекти 02-04-49530 та 03-04-06492.
Список літератури
1. Шноль С.Е. Герої і лиходії російської науки. М., 1997.
2. Іваницький Г.Р. / / Біофізика. 2001. V.46. P.5-33.
3. Squires JE / / Science. 2002. V.295. P.1002-1005.
4. Gordin VA, Nedospasov AA / / FEBS Lett. 1998. V.424. P.239-242.
5. Рафікова О.В. / / Тетянин день. Міцелярні каталіз окислення оксиду азоту в емульсіях перфторуглеводородов і його вплив на цикл оксиду азоту в організмі ссавців. М., 2000.
6. Rafikova O., Sokolova E., Rafikov R., Nudler E. / / Circulation. 2004. V.110. P.3573-3580.
7. Nedospasov AA / / J. Biochem. Molecular. Toxicol. 2002. V.16. P.109-120.
8. Біда Н.В., Піменова (Сунцова) Т.П., Недоспасов А.А. / / Проблеми і перспективи молекулярної генетики / Ред. Є. Д. Свердлов. М., 2004. Т.2. C.237-301.
9. Біда Н.В., Недоспасов А.А. / / Біохімія. 2003. Т.68. С.1697-1704.