Реферат студентки II лікувального факультету Аветян А.С
Моноклональні антитіла
ВСТУП
При введенні в організм тварин і людини чужорідних макромолекулярних речовин - білків або полісахаридів (антигенів) в крові з'являються захисні білки - антитіла, для яких характерна незвичайна, унікальна специфічність. Кожне антитіло дізнається тільки свій антиген,-точніше, одну його детермінантних групу. Детермінантні група складається з декількох амінокислот (зазвичай з 6-8), що утворюють просторову структуру, характерну для даного білка.
В одному білку, що складається з декількох сотень амінокислот є кілька (5-15) різних детермінант, тому до одного білку утворюється ціле сімейство різних за своєю специфічності антитіл. Навіть до однієї детермінанті утворюється цілий спектр антитіл, що відрізняються за структурою, ступеня специфічності і міцності зв'язування з нею. Те ж відноситься і до полісахаридних антигенів, детермінантні групи яких утворюються 3-6 залишками моносахаридів.
Таким чином, при введенні антигену виникає велике сімейство антитіл, спрямованих до різних його детерминантам і різняться так само всередині групи антитіл, спрямованих до однієї і тієї ж детермінанті. У крові імунізованих тварин з'являється багатий і унікальний за складом спектр антитіл, який і забезпечує абсолютну специфічність в розпізнаванні даного антигену.
Антитіла давно і широко використовуються для нейтралізації бактеріальних токсинів (дифтерійного, правцевого), зміїних отрут (кобри, гадюк) вірусів, що потрапили в кров (особливо ефективно вірусу кору), і для ідентифікації індивідуальних білків (та інших антигенів), що знаходяться в клітці або найскладніших тканинних екстрактах. Однак іноді потрібні не багатокомпонентні суміші антитіл, що виникають в крові у відповідь на введення антигену, а окремі, елементарні складові цієї суміші, спрямовані лише до однієї детермінанті антигену і мають одні і ті ж характеристики. Такі антитіла бувають потрібні як для вивчення їхньої власної природи, так і для практичного використання, наприклад для ставки в пухлині токсичних речовин.
ЯК ОТРИМАТИ ТАКІ АНТИТІЛА?
Очевидно, що шляхом імунізації, тобто введенням тварині індивідуального антигену або тільки однієї його детермінантних групи, це зробити, як правило, неможливо. Чому? Справа в тому, що в організмі в процесі дозрівання антітелообразующіх клітин (АОК) утворюється велика кількість - мільйони генетично однорідних сімейств клітин - клонів, кожен з яких спеціалізується на синтезі тільки одного варіанту антитіл, і в цьому причина великої різноманітності антитіл, індукованих навіть одним антигеном . Таких клонів багато більше, ніж потрібно антитіл для розпізнавання будь-якого, випадково взятого антигену. Антиген, потрапляючи в організм, стимулює розмноження тих клонів, які продукують антитіла до його детерминантам.
Здавалося б, вихід простий: треба виростити окремі клони антітелообразующіх клітин у пробірці - в культурі тканин - і вони будуть продукувати моноклональні антитіла, то є антитіла однієї суворо певної специфічності, продукт одного клону. Але і це виявилося неможливим: нормальні клітини смертні, незабаром після висаджування у культуру вони гинуть. Справа не доходить до утворення клонів АОК. Додавання в культуру чинників зростання дещо подовжує їхнє життя, але теж не вирішує проблеми.
Дорозі вказує ПУХЛИНИ
Шлях вирішення проблеми несподівано вказали злоякісні пухлини. Вже давно відомі пухлини в людини - плазмоцитома, що виробляють і секретирующие в кров імуноглобуліни, за структурою своєї відрізнити від антитіл. Причому кожне таке "антитіло" злегка відрізнялося від іншого, що виробляється інший плазмоцитома. Утворювалася як би колекція випадкових антитіл до невідомих антигенів. Коли накопичилися сотні таких "антитіл" і вони були випробувані з сотнями навмання взятих антигенів, виявилося, що в цій колекції виявилися специфічно реагують пари "антиген-антитіло".
Чому саме пухлини вказали на можливість отримання моноклональних антитіл? Є кілька причин, і всі вони лежать у самій природі пухлинної клітини. Вона завжди або майже завжди зберігає властивості і функції клітини, з якої стався. Плазмоцитома відбувається з "юних" плазматичних клітин, тобто саме з тих клітин, які синтезують антитіла. Це властивість зберігається в пухлинах, що виникли з відповідних клітин. Дуже важливою особливістю пухлин є їх виникнення з однієї генетично зміненою (мутантної) клітини. Тому пухлина виникає і розвивається як клон, в нашому випадку як клон іммуноглобулінобразующіх клітин. Причому вони утворюють строго однорідний за всіма властивостями моноклональний імуноглобулін.
Нормальні плазматичні клітини (або їх попередники - лімфоцити) смертні, їх термін життя - кілька днів. Пухлина, і в цьому її принципова відмінність від нормальних попередників, безсмертна. Її можна культивувати в пробірці або пересаджувати від однієї тварини іншій необмежену кількість разів і протягом необмеженого часу. На відміну від нормальної тканини пухлина автономна, організм "хазяїна" нездатний (за дуже рідкісними винятками) зупинити необмежене зростання злоякісного пухлинного клону.
Плазмоцитома виникають не лише спонтанно, тобто непередбачувано, як би випадково, але їх можна досить легко індукувати у мишей і щурів і отримати, таким чином, безсмертний, необмежено зростаючий, перещеплюваних клон клітин, що продукують імуноглобуліни, іноді володіють специфічністю антитіл, причому антитіл моноклональних . Цілком природно було бажання імунологів навчитися отримувати плазмоцитома, які продукують антитіла заданої специфічності. Для цього мишей спочатку інтенсивно імунізували, а потім индуцировали у них плазмоцитома, щоб отримати пухлини і з тих клонів, які виробляли антитіла до антигенів, використаним для імунізації, але це практично не вдавалося. Занадто рідкісні були збіги. Тоді спробували індукувати пухлини антітелообразующіх клітин опухолеродного вірусами. Результати були кращими, проте створити простий і універсальний метод отримання моноклональних антитіл на цьому шляху також не виявилося можливим.
ЯК ЦЕ БУЛО ЗРОБЛЕНО?
Успіх прийшов, як завжди, несподівано, як побічний продукт дослідження, що мав інші цілі. На початку 70-х років молодий німецький імунолог Георг Кьолер, отримав стипендію для роботи в знаменитому Базельському інституті імунології, зацікавився питанням про генетичної мінливості антитіл. У той час можна було очікувати, що антитіла мутують (генетично змінюються) з більшою частотою, ніж інші білки. Для дослідження треба було ізолювати клон АОК, який продукує антитіла певної специфічності, отримати з нього стабільну клітинну лінію, підтримувану в пробірці (в культурі), і простежити, з якою частотою з'являться там генетично змінені варіанти. Для реалізації проекту Келер поїхав до Англії, в лабораторію Цезаря Мільштейна, який вивчав клони плазмоіітом, і вони разом розробили оригінальний підхід до цієї проблеми: вирішили отримати гібрид нормальної АОК і пухлинної клітини. У разі успіху такої гібрид успадкував би від нормальної клітини здатність до синтезу антитіл, а від пухлинної - безсмертя і здатність до необмеженого і безконтрольного зростання. Це їм вдалося здійснити?
Гібридоми
Методи гібридизації соматичних (тобто не статевих) клітин на той час були добре відомі і широко застосовувалися для різних цілей. Для цього використовували вірус, що сприяє злиттю клітин. Різнорідні клітини, у яких злилися оболонки, утворювали двоядерні гібриди, які зберігали здатність до клітинних поділів. У процесі клітинного ділення хромосоми обох ядер перемішувалися і утворювали загальне ядро. Таким чином, виникав істинний гібрид, нащадок двох соматичних клітин, або Гібридома. Гібрид можна отримати і між нормальною АОК і пухлинної, плазмоцітомной клітиною. Плазмоцитома була взята тому, що вона найбільше відповідала АОК за типом диференціювання. Весь її синтетичний апарат був налаштований на синтез імуноглобулінів. Проблема полягала в тому, як відокремити задану гібридів від присутніх у системі окремих мчали клітин і від гібридів іншого складу або іншої специфічності, ніж необхідні.
Для досягнення цієї мети автори розробили спеціальну схему, яка використовує відбір клітин в селектірующей середовищі. Перш за все було отримано особливий мутант мишачою плазмоцитома, зріст якого можна було контролювати складом живильного середовища. Для отримання мутанта використовували особливості синтезу нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), наявних в усіх клітинах і необхідних для їх існування. Відомо, що є два шляхи синтезу попередників нуклеїнових кислот: основний і резервний. Основний - це шлях новоутворення нуклеотидів, ланок, що входять до складу нуклеїнових кислот. Цей шлях включає кілька етапів і блокується протипухлинним препаратом аміноптеріном (А). Однак клітини не гинуть від цього препарату, оскільки мають резервним шляхом - здатністю синтезувати нук-леотіди і нуклеїнові кислоти, реутілізіруя продукти розпаду раніше синтезованих нуклеїнових кислот: гіпоксантину (Г) та тимідину (Т). Додавання Г і Т в живильне середовище, що містить А, знімає токсичний ефект останнього.
Для селекції гібридом треба було отримати мутант плазмоцитома, не здатний користуватися резервним шляхом і, отже, гине в середовищі, що містить Г, Т і А (ДАТ-середовище). Такий мутант отримали шляхом додавання в середовище токсичних аналогів Г і Т. Усі клітини, здатні засвоювати Г і Т, включали їх токсичні аналоги і гинули. Виживали лише ті рідкісні мутанти, які нездатні засвоювати Г і Т, тобто були позбавлені резервного шляху. З потомства цих клітин додатково відбирали ще й такі мутанти, які втратили здатність до синтезу власних імуноглобулінів. Тепер все було готове для отримання гібридом, тобто гібридів нормальних плазмоцітомних клітин (рис. 1).
Мишей інтенсивно імунізували певним матеріалом - білком, бактеріальної або клітиною тваринного походження. Коли в їх крові з'являлися антитіла, у них брали селезінку і лімфатичні вузли (місця скупчення АОК), і з них готували завись клітин.
Моноклональні антитіла
ВСТУП
При введенні в організм тварин і людини чужорідних макромолекулярних речовин - білків або полісахаридів (антигенів) в крові з'являються захисні білки - антитіла, для яких характерна незвичайна, унікальна специфічність. Кожне антитіло дізнається тільки свій антиген,-точніше, одну його детермінантних групу. Детермінантні група складається з декількох амінокислот (зазвичай з 6-8), що утворюють просторову структуру, характерну для даного білка.
В одному білку, що складається з декількох сотень амінокислот є кілька (5-15) різних детермінант, тому до одного білку утворюється ціле сімейство різних за своєю специфічності антитіл. Навіть до однієї детермінанті утворюється цілий спектр антитіл, що відрізняються за структурою, ступеня специфічності і міцності зв'язування з нею. Те ж відноситься і до полісахаридних антигенів, детермінантні групи яких утворюються 3-6 залишками моносахаридів.
Таким чином, при введенні антигену виникає велике сімейство антитіл, спрямованих до різних його детерминантам і різняться так само всередині групи антитіл, спрямованих до однієї і тієї ж детермінанті. У крові імунізованих тварин з'являється багатий і унікальний за складом спектр антитіл, який і забезпечує абсолютну специфічність в розпізнаванні даного антигену.
Антитіла давно і широко використовуються для нейтралізації бактеріальних токсинів (дифтерійного, правцевого), зміїних отрут (кобри, гадюк) вірусів, що потрапили в кров (особливо ефективно вірусу кору), і для ідентифікації індивідуальних білків (та інших антигенів), що знаходяться в клітці або найскладніших тканинних екстрактах. Однак іноді потрібні не багатокомпонентні суміші антитіл, що виникають в крові у відповідь на введення антигену, а окремі, елементарні складові цієї суміші, спрямовані лише до однієї детермінанті антигену і мають одні і ті ж характеристики. Такі антитіла бувають потрібні як для вивчення їхньої власної природи, так і для практичного використання, наприклад для ставки в пухлині токсичних речовин.
ЯК ОТРИМАТИ ТАКІ АНТИТІЛА?
Очевидно, що шляхом імунізації, тобто введенням тварині індивідуального антигену або тільки однієї його детермінантних групи, це зробити, як правило, неможливо. Чому? Справа в тому, що в організмі в процесі дозрівання антітелообразующіх клітин (АОК) утворюється велика кількість - мільйони генетично однорідних сімейств клітин - клонів, кожен з яких спеціалізується на синтезі тільки одного варіанту антитіл, і в цьому причина великої різноманітності антитіл, індукованих навіть одним антигеном . Таких клонів багато більше, ніж потрібно антитіл для розпізнавання будь-якого, випадково взятого антигену. Антиген, потрапляючи в організм, стимулює розмноження тих клонів, які продукують антитіла до його детерминантам.
Здавалося б, вихід простий: треба виростити окремі клони антітелообразующіх клітин у пробірці - в культурі тканин - і вони будуть продукувати моноклональні антитіла, то є антитіла однієї суворо певної специфічності, продукт одного клону. Але і це виявилося неможливим: нормальні клітини смертні, незабаром після висаджування у культуру вони гинуть. Справа не доходить до утворення клонів АОК. Додавання в культуру чинників зростання дещо подовжує їхнє життя, але теж не вирішує проблеми.
Дорозі вказує ПУХЛИНИ
Шлях вирішення проблеми несподівано вказали злоякісні пухлини. Вже давно відомі пухлини в людини - плазмоцитома, що виробляють і секретирующие в кров імуноглобуліни, за структурою своєї відрізнити від антитіл. Причому кожне таке "антитіло" злегка відрізнялося від іншого, що виробляється інший плазмоцитома. Утворювалася як би колекція випадкових антитіл до невідомих антигенів. Коли накопичилися сотні таких "антитіл" і вони були випробувані з сотнями навмання взятих антигенів, виявилося, що в цій колекції виявилися специфічно реагують пари "антиген-антитіло".
Чому саме пухлини вказали на можливість отримання моноклональних антитіл? Є кілька причин, і всі вони лежать у самій природі пухлинної клітини. Вона завжди або майже завжди зберігає властивості і функції клітини, з якої стався. Плазмоцитома відбувається з "юних" плазматичних клітин, тобто саме з тих клітин, які синтезують антитіла. Це властивість зберігається в пухлинах, що виникли з відповідних клітин. Дуже важливою особливістю пухлин є їх виникнення з однієї генетично зміненою (мутантної) клітини. Тому пухлина виникає і розвивається як клон, в нашому випадку як клон іммуноглобулінобразующіх клітин. Причому вони утворюють строго однорідний за всіма властивостями моноклональний імуноглобулін.
Нормальні плазматичні клітини (або їх попередники - лімфоцити) смертні, їх термін життя - кілька днів. Пухлина, і в цьому її принципова відмінність від нормальних попередників, безсмертна. Її можна культивувати в пробірці або пересаджувати від однієї тварини іншій необмежену кількість разів і протягом необмеженого часу. На відміну від нормальної тканини пухлина автономна, організм "хазяїна" нездатний (за дуже рідкісними винятками) зупинити необмежене зростання злоякісного пухлинного клону.
Плазмоцитома виникають не лише спонтанно, тобто непередбачувано, як би випадково, але їх можна досить легко індукувати у мишей і щурів і отримати, таким чином, безсмертний, необмежено зростаючий, перещеплюваних клон клітин, що продукують імуноглобуліни, іноді володіють специфічністю антитіл, причому антитіл моноклональних . Цілком природно було бажання імунологів навчитися отримувати плазмоцитома, які продукують антитіла заданої специфічності. Для цього мишей спочатку інтенсивно імунізували, а потім индуцировали у них плазмоцитома, щоб отримати пухлини і з тих клонів, які виробляли антитіла до антигенів, використаним для імунізації, але це практично не вдавалося. Занадто рідкісні були збіги. Тоді спробували індукувати пухлини антітелообразующіх клітин опухолеродного вірусами. Результати були кращими, проте створити простий і універсальний метод отримання моноклональних антитіл на цьому шляху також не виявилося можливим.
ЯК ЦЕ БУЛО ЗРОБЛЕНО?
Успіх прийшов, як завжди, несподівано, як побічний продукт дослідження, що мав інші цілі. На початку 70-х років молодий німецький імунолог Георг Кьолер, отримав стипендію для роботи в знаменитому Базельському інституті імунології, зацікавився питанням про генетичної мінливості антитіл. У той час можна було очікувати, що антитіла мутують (генетично змінюються) з більшою частотою, ніж інші білки. Для дослідження треба було ізолювати клон АОК, який продукує антитіла певної специфічності, отримати з нього стабільну клітинну лінію, підтримувану в пробірці (в культурі), і простежити, з якою частотою з'являться там генетично змінені варіанти. Для реалізації проекту Келер поїхав до Англії, в лабораторію Цезаря Мільштейна, який вивчав клони плазмоіітом, і вони разом розробили оригінальний підхід до цієї проблеми: вирішили отримати гібрид нормальної АОК і пухлинної клітини. У разі успіху такої гібрид успадкував би від нормальної клітини здатність до синтезу антитіл, а від пухлинної - безсмертя і здатність до необмеженого і безконтрольного зростання. Це їм вдалося здійснити?
Гібридоми
Методи гібридизації соматичних (тобто не статевих) клітин на той час були добре відомі і широко застосовувалися для різних цілей. Для цього використовували вірус, що сприяє злиттю клітин. Різнорідні клітини, у яких злилися оболонки, утворювали двоядерні гібриди, які зберігали здатність до клітинних поділів. У процесі клітинного ділення хромосоми обох ядер перемішувалися і утворювали загальне ядро. Таким чином, виникав істинний гібрид, нащадок двох соматичних клітин, або Гібридома. Гібрид можна отримати і між нормальною АОК і пухлинної, плазмоцітомной клітиною. Плазмоцитома була взята тому, що вона найбільше відповідала АОК за типом диференціювання. Весь її синтетичний апарат був налаштований на синтез імуноглобулінів. Проблема полягала в тому, як відокремити задану гібридів від присутніх у системі окремих мчали клітин і від гібридів іншого складу або іншої специфічності, ніж необхідні.
Для досягнення цієї мети автори розробили спеціальну схему, яка використовує відбір клітин в селектірующей середовищі. Перш за все було отримано особливий мутант мишачою плазмоцитома, зріст якого можна було контролювати складом живильного середовища. Для отримання мутанта використовували особливості синтезу нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), наявних в усіх клітинах і необхідних для їх існування. Відомо, що є два шляхи синтезу попередників нуклеїнових кислот: основний і резервний. Основний - це шлях новоутворення нуклеотидів, ланок, що входять до складу нуклеїнових кислот. Цей шлях включає кілька етапів і блокується протипухлинним препаратом аміноптеріном (А). Однак клітини не гинуть від цього препарату, оскільки мають резервним шляхом - здатністю синтезувати нук-леотіди і нуклеїнові кислоти, реутілізіруя продукти розпаду раніше синтезованих нуклеїнових кислот: гіпоксантину (Г) та тимідину (Т). Додавання Г і Т в живильне середовище, що містить А, знімає токсичний ефект останнього.
Для селекції гібридом треба було отримати мутант плазмоцитома, не здатний користуватися резервним шляхом і, отже, гине в середовищі, що містить Г, Т і А (ДАТ-середовище). Такий мутант отримали шляхом додавання в середовище токсичних аналогів Г і Т. Усі клітини, здатні засвоювати Г і Т, включали їх токсичні аналоги і гинули. Виживали лише ті рідкісні мутанти, які нездатні засвоювати Г і Т, тобто були позбавлені резервного шляху. З потомства цих клітин додатково відбирали ще й такі мутанти, які втратили здатність до синтезу власних імуноглобулінів. Тепер все було готове для отримання гібридом, тобто гібридів нормальних плазмоцітомних клітин (рис. 1).
Мишей інтенсивно імунізували певним матеріалом - білком, бактеріальної або клітиною тваринного походження. Коли в їх крові з'являлися антитіла, у них брали селезінку і лімфатичні вузли (місця скупчення АОК), і з них готували завись клітин.
До неї додавали в надлишку клітини мутантної плазмоцитома і поліетиленгліколь (ПЕГ). Після короткої інкубації, що вимагається для злиття клітин, їх відмивали від ПЕГа і поміщали в середовище, що містить Г, Т і А (ДАТ-середовище). Тепер у системі перебували гібриди АОК і АОК, АОК і плазмоцитома, а також що залишилися вільними АОК і клітини плазмоцитома. З них треба було відібрати тільки гібриди АОК і плазмоцитома. Після недовгого (кілька днів) культивування поодинокі АОК, а також гібриди АОК і АОК гинули, тому що нормальні клітини смертні і швидко гинуть в культурі. Плазмоцітомние клітини і їх гібриди також гинули, так як А блокував основний шлях синтезу попередників нуклеїнових кислот, а Г і Т їх не рятували. Виживали, отже, тільки гібриди АОК і плазматичних клітин, так як безсмертя вони успадкували від плазмоцитома, а резервний шлях - від нормальної клітини. Такі гібриди, гібридоми, зберігали здатність синтезувати і секретувати антитіла.
Моноклональні антитіла
Наступний етап після отримання гібридом - клонування і відбір потрібних клонів. Ті, що вижили в ДАТ клітини розсівали у спеціальні пластикові планшети, що містять зазвичай 96 лунок ємністю приблизно по 0,2 см 3. У кожну лунку поміщали в середньому по 10 гібридомних клітин, які культивували у присутності "шалених" клітин, що не мають відношення до гібридоми, але сприяють їх зростанню. Після кількох днів культивування вміст кожної лунки перевіряли на присутність антитіл потрібної специфічності. Для цього використовували мікрометодом виявлення антитіл до відповідного антигену. Клітини з лунок, що містять потрібні антитіла, клонували, тобто повторно розсівали за такими ж лунках, але з розрахунку 1 клітина на лунку, знову культивували і перевіряли на присутність потрібних антитіл. Процедуру повторювали 1-2 рази. Таким чином, відбирали клони, які продукують антитіла тільки однієї потрібної специфічності, тобто моноклональні антитіла. Отримані клони можна заморозити при -70 ° С і зберігати до того, поки вони не будуть потрібні. Їх можна культивувати і накопичувати антитіла в культуральному середовищі, а можна прищепити мишам (так як гібридоми - це пухлинні клітини), де вони будуть рости і накопичувати колосальні кількості моноклональних антитіл. Від однієї мишки можна отримати антитіл не менше, ніж від кролика. Ці антитіла не містять сторонніх антитіл і настільки однорідні фізико-хімічно, що можуть розглядатися як чисті хімічні реактиви.
Рис. 2. Імунофлуоресцентній фарбування клітини сполучної тканини (фібробласта) моноклональних антитіл до тубуліну - білку мікротрубочок, що утворюють скелет клітини.
ЗАСТОСУВАННЯ
Області застосування моноклональних антитіл:
- Ідентифікація субпопуляцій лімфоцитів людини
- Виснаження клітинних популяцій
- Виділення клітин
- Встановлення функцій молекул клітинної поверхні
- Визначення групи крові - діагностика пухлин
- Локалізація пухлин
- Іммунорадіометріческій аналіз
- Аналіз складних сумішей антигенів
- Аналіз ембріонального розвитку
- Моноклональні мутантні антитіла
- Квадроми
- Аналіз імунної відповіді
- Штучні ферменти.
Звичайні поліклональні антитіла давно і широко застосовуються для визначення біологічно активних речовин - білків крові й інших біологічних рідин, гормонів, ростових факторів, клітинних рецепторів, медіаторів запалення та імунітету, бактеріальних і вірусних антигенів, різних отрут і т.п. Моноклональні антитіла через найвищої специфічності, стандартності і технологічності отримання успішно витісняють і замінюють імунні сироватки.
Далі гібридоми створюють унікальні можливості в аналітичних цілях: їх можна застосовувати як "імунологічний мікроскоп" з надзвичайно високою роздільною здатністю. Так, наприклад, якщо потрібно порівняти дві клітинні лінії, що відрізняються одним або небагатьма антигенами, і треба виявити такі антигени, то метод гібридом надає для цього виняткові можливості. Проіммунізіровав мишей однієї з ліній і отримавши сотні гібридом, які продукують антитіла до антигенів цієї лінії, можна знайти одну або дві з антитілами тільки до даної лінії. Розмножив таку гібридом в пробірці або виростивши її на мишах, можна отримати величезну кількість антитіл до унікального антигену (або детермінантних групі), загубленому серед інших компонентів клітини подібно голці в стозі сіна. Це буде продукт одного клону. У крові імунізованих тваринного серед безлічі інших антитіл він ніяк не проявиться через суто кількісних відносин. Завдяки ж гібридоми його можна не тільки виявити, але і вивести в лінію і отримати будь-яку кількість відповідних антитіл. За допомогою гібридом можна виявити антигени, характерні для пухлин певних тканин, отримати до них антитіла і використовувати їх для діагностики та типування пухлин.
Рис. 3. Послідовні зрізи через шлунок (жел) і стравохід (харч) миші, пофарбовані двома моноклональними антитілами: 1 - перше моноклональних антитіл реагує з епітелієм стравоходу і слабкіше з епітелієм шлунка; 2 - друге моноклональних антитіл реагує тільки з епітелієм шлунка.
Такі моноклональні антитіла знайшли широке застосування в онкологічній клініці. Нарешті, у всьому світі ведуться активні дослідження з використання моноклональ антитіл в якості специфічних переносників токсичних речовин у пухлинні клітини. Поки ж за допомогою моноклональних антитіл в пухлину і її метастази доставляються радіоактивні речовини, що дозволяють виявити невеликі вузлики пухлини по локалізації в них радіоактивності.
Гібридоми зіграли і продовжують грати величезну роль у фундаментальній і прикладній імунології. Вони створені на основі клонально-селекційної теорії імунітету і з'явилися самим яскравим і остаточним доказом цієї теорії. Гібридоми зробили реальністю передбачувані клони антітелообразующіх клітин і дозволили навіть виявити їх існування в організмі до введення відповідного антигену. Гібридоми революціонізували імунологічну промисловість і створили в ній зовсім нові області. Завдяки гібридоми виникли методи діагностики багатьох захворювань і з'явилися нові шляхи для вивчення злоякісних пухлин. І хоча гібридоми швидше відносять до геніальних винаходів, а не до відкриттів, вони були відзначені в 1984 році Нобелівською премією, вищої наукової нагородою, яка присуджується за видатні відкриття. (Келер і Мільштейн)
До теперішнього часу отримано величезну кількість гібридом-продуцентів моноклональних антитіл до різних, в тому числі до пухлини-асоційованим антигенів. Найбільш популярними препаратами МКА в даний час є Мабтера і Герцептин (Швейцарія). Перший застосовується для лікування деяких злоякісних захворювань крові людини, другий - при раку молочної залози. Ці антитіла специфічно зв'язуються з антигеном злоякісних клітин, викликаючи їх загибель в результаті каскаду імунологічних реакцій. Перші клінічні результати застосування Мабтера показали, що у 50% пацієнтів з великими пухлинами та рецидивами при несприятливому прогнозі захворювання настає стабілізація процесу. Герцептин порівняно недавно увійшов до арсеналу терапевтичних засобів, що застосовуються в онкології, але вже зарекомендував себе як ефективний препарат при раку молочної залози, стійкому до звичайному лікуванню. Використання Герцептин у хворих на рак молочної залози разом з хіміопрепаратами дозволяє підвищити ефективність лікування особливо в тих випадках, коли захворювання не піддається звичайній хіміотерапії. Інтенсивні роботи по отриманню нових моноклональних антитіл і розробці на їх основі лікарських і діагностичних засобів ведуться і в нашій країні. Перспективним є ще один напрямок. Це - використання моноклональних антитіл для створення іммуномагнітного фільтра, "сорбенту". Суть методу полягає в тому, що прив'язані до феромагнітним микрочастицам моноклональні антитіла, перебуваючи в магнітному полі, можуть високо специфічно витягувати клітини, наприклад, з кісткового мозку або з пухлини. Потім іммуномагнітний сорбент відокремлюють і залишаються тільки витягнуті клітини. За допомогою такого сорбенту можна зв'язувати і видаляти клітини (наприклад, злоякісні) або одержувати з кісткового мозку здорові клітини - родоначальники кровотворення, які можуть використовуватися для введення цього ж хворому в разі пошкодження кровотворення.
ЛІТЕРАТУРА
1. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б.
Моноклональ антитіла: гібридоми: новий рівень логічного аналізу. М.: Медицина, 1983.
2. Роіт А. Основи імунології. М.: Світ, 1991.
3. О.Ю. Баришніков, Є.Р. Полосухин. Моноклональні тіла в онкології.
4. Г.І. Абель. Моноклональні антитіла.
Моноклональні антитіла
Наступний етап після отримання гібридом - клонування і відбір потрібних клонів. Ті, що вижили в ДАТ клітини розсівали у спеціальні пластикові планшети, що містять зазвичай 96 лунок ємністю приблизно по 0,2 см 3. У кожну лунку поміщали в середньому по 10 гібридомних клітин, які культивували у присутності "шалених" клітин, що не мають відношення до гібридоми, але сприяють їх зростанню. Після кількох днів культивування вміст кожної лунки перевіряли на присутність антитіл потрібної специфічності. Для цього використовували мікрометодом виявлення антитіл до відповідного антигену. Клітини з лунок, що містять потрібні антитіла, клонували, тобто повторно розсівали за такими ж лунках, але з розрахунку 1 клітина на лунку, знову культивували і перевіряли на присутність потрібних антитіл. Процедуру повторювали 1-2 рази. Таким чином, відбирали клони, які продукують антитіла тільки однієї потрібної специфічності, тобто моноклональні антитіла. Отримані клони можна заморозити при -70 ° С і зберігати до того, поки вони не будуть потрібні. Їх можна культивувати і накопичувати антитіла в культуральному середовищі, а можна прищепити мишам (так як гібридоми - це пухлинні клітини), де вони будуть рости і накопичувати колосальні кількості моноклональних антитіл. Від однієї мишки можна отримати антитіл не менше, ніж від кролика. Ці антитіла не містять сторонніх антитіл і настільки однорідні фізико-хімічно, що можуть розглядатися як чисті хімічні реактиви.
Рис. 2. Імунофлуоресцентній фарбування клітини сполучної тканини (фібробласта) моноклональних антитіл до тубуліну - білку мікротрубочок, що утворюють скелет клітини.
ЗАСТОСУВАННЯ
Області застосування моноклональних антитіл:
- Ідентифікація субпопуляцій лімфоцитів людини
- Виснаження клітинних популяцій
- Виділення клітин
- Встановлення функцій молекул клітинної поверхні
- Визначення групи крові - діагностика пухлин
- Локалізація пухлин
- Іммунорадіометріческій аналіз
- Аналіз складних сумішей антигенів
- Аналіз ембріонального розвитку
- Моноклональні мутантні антитіла
- Квадроми
- Аналіз імунної відповіді
- Штучні ферменти.
Звичайні поліклональні антитіла давно і широко застосовуються для визначення біологічно активних речовин - білків крові й інших біологічних рідин, гормонів, ростових факторів, клітинних рецепторів, медіаторів запалення та імунітету, бактеріальних і вірусних антигенів, різних отрут і т.п. Моноклональні антитіла через найвищої специфічності, стандартності і технологічності отримання успішно витісняють і замінюють імунні сироватки.
Далі гібридоми створюють унікальні можливості в аналітичних цілях: їх можна застосовувати як "імунологічний мікроскоп" з надзвичайно високою роздільною здатністю. Так, наприклад, якщо потрібно порівняти дві клітинні лінії, що відрізняються одним або небагатьма антигенами, і треба виявити такі антигени, то метод гібридом надає для цього виняткові можливості. Проіммунізіровав мишей однієї з ліній і отримавши сотні гібридом, які продукують антитіла до антигенів цієї лінії, можна знайти одну або дві з антитілами тільки до даної лінії. Розмножив таку гібридом в пробірці або виростивши її на мишах, можна отримати величезну кількість антитіл до унікального антигену (або детермінантних групі), загубленому серед інших компонентів клітини подібно голці в стозі сіна. Це буде продукт одного клону. У крові імунізованих тваринного серед безлічі інших антитіл він ніяк не проявиться через суто кількісних відносин. Завдяки ж гібридоми його можна не тільки виявити, але і вивести в лінію і отримати будь-яку кількість відповідних антитіл. За допомогою гібридом можна виявити антигени, характерні для пухлин певних тканин, отримати до них антитіла і використовувати їх для діагностики та типування пухлин.
Рис. 3. Послідовні зрізи через шлунок (жел) і стравохід (харч) миші, пофарбовані двома моноклональними антитілами: 1 - перше моноклональних антитіл реагує з епітелієм стравоходу і слабкіше з епітелієм шлунка; 2 - друге моноклональних антитіл реагує тільки з епітелієм шлунка.
Такі моноклональні антитіла знайшли широке застосування в онкологічній клініці. Нарешті, у всьому світі ведуться активні дослідження з використання моноклональ антитіл в якості специфічних переносників токсичних речовин у пухлинні клітини. Поки ж за допомогою моноклональних антитіл в пухлину і її метастази доставляються радіоактивні речовини, що дозволяють виявити невеликі вузлики пухлини по локалізації в них радіоактивності.
Гібридоми зіграли і продовжують грати величезну роль у фундаментальній і прикладній імунології. Вони створені на основі клонально-селекційної теорії імунітету і з'явилися самим яскравим і остаточним доказом цієї теорії. Гібридоми зробили реальністю передбачувані клони антітелообразующіх клітин і дозволили навіть виявити їх існування в організмі до введення відповідного антигену. Гібридоми революціонізували імунологічну промисловість і створили в ній зовсім нові області. Завдяки гібридоми виникли методи діагностики багатьох захворювань і з'явилися нові шляхи для вивчення злоякісних пухлин. І хоча гібридоми швидше відносять до геніальних винаходів, а не до відкриттів, вони були відзначені в 1984 році Нобелівською премією, вищої наукової нагородою, яка присуджується за видатні відкриття. (Келер і Мільштейн)
До теперішнього часу отримано величезну кількість гібридом-продуцентів моноклональних антитіл до різних, в тому числі до пухлини-асоційованим антигенів. Найбільш популярними препаратами МКА в даний час є Мабтера і Герцептин (Швейцарія). Перший застосовується для лікування деяких злоякісних захворювань крові людини, другий - при раку молочної залози. Ці антитіла специфічно зв'язуються з антигеном злоякісних клітин, викликаючи їх загибель в результаті каскаду імунологічних реакцій. Перші клінічні результати застосування Мабтера показали, що у 50% пацієнтів з великими пухлинами та рецидивами при несприятливому прогнозі захворювання настає стабілізація процесу. Герцептин порівняно недавно увійшов до арсеналу терапевтичних засобів, що застосовуються в онкології, але вже зарекомендував себе як ефективний препарат при раку молочної залози, стійкому до звичайному лікуванню. Використання Герцептин у хворих на рак молочної залози разом з хіміопрепаратами дозволяє підвищити ефективність лікування особливо в тих випадках, коли захворювання не піддається звичайній хіміотерапії. Інтенсивні роботи по отриманню нових моноклональних антитіл і розробці на їх основі лікарських і діагностичних засобів ведуться і в нашій країні. Перспективним є ще один напрямок. Це - використання моноклональних антитіл для створення іммуномагнітного фільтра, "сорбенту". Суть методу полягає в тому, що прив'язані до феромагнітним микрочастицам моноклональні антитіла, перебуваючи в магнітному полі, можуть високо специфічно витягувати клітини, наприклад, з кісткового мозку або з пухлини. Потім іммуномагнітний сорбент відокремлюють і залишаються тільки витягнуті клітини. За допомогою такого сорбенту можна зв'язувати і видаляти клітини (наприклад, злоякісні) або одержувати з кісткового мозку здорові клітини - родоначальники кровотворення, які можуть використовуватися для введення цього ж хворому в разі пошкодження кровотворення.
ЛІТЕРАТУРА
1. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б.
Моноклональ антитіла: гібридоми: новий рівень логічного аналізу. М.: Медицина, 1983.
2. Роіт А. Основи імунології. М.: Світ, 1991.
3. О.Ю. Баришніков, Є.Р. Полосухин. Моноклональні тіла в онкології.
4. Г.І. Абель. Моноклональні антитіла.