Методи і умови культивування ізольованих клітин і тканин рослин

1. Допоміжне використання методів in в селекции растений vitro в селекції рослин

, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение. У віддаленій гібридизації знаходять застосування такі методи культури ізольованих тканин, як запліднення in vitro, ембріокультура (вирощування ізольованих зародків на штучних поживних середовищах), клональне мікророзмноження цінних гібридів, а також отримання гаплоїдів in vitro та кріозбереження.

Запліднення in (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. vitro (подолання прогамной несумісності) проводиться в тому випадку, коли неможливо здійснити запліднення між обраними парами в природних умовах. Це викликано декількома причинами: 1) фізіологічні (невідповідність в часі дозрівання пилку і т.д.), 2) морфологічні (коротка пилкова трубка або блокування зростання її на різних етапах розвитку і т.д.). можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Запліднення in vitro можна здійснити двома способами: а) культивування на штучній агаризованому живильному середовищі зав'язі з нанесеною на неї готової пилком; б) зав'язь розкривається і на живильне середовище переносяться шматочки плаценти з семяпочками, поблизу яких або безпосередньо на тканині плаценти культивується готова пилок. или нет, можно по быстроувеличивающимся в размерах семяпочкам. Візуально визначити, пройшло запліднення in vitro чи ні, можна по бистроувелічівающімся в розмірах семяпочкам. Сформувався зародок, як правило, не переходить у стан спокою, а відразу проростає і дає початок гібридному поколінню. позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Плацентарний запліднення in vitro дозволило подолати несумісність в схрещуванні сортів культурного тютюну N. tabacum з дикими видами N. rosulata і N. debneyi і зробило можливим отримання міжвидових гібридів тютюну в дослідах М.Ф. Тернівського та ін (1976), Шинкарьової (1986).

Подолання постгамной несумісності. Постгамная несумісність при віддаленій гібридизації виникає після запліднення. Часто при цьому утворюються щуплі невсхожіе насіння. Причиною може бути розбіжність у часі розвитку зародка і ендосперму. З-за слабкого розвитку ендосперму зародок буває нездатний до нормального проростання. У таких випадках з зрілої щупле зернівки ізолюють зародок і вирощують його у живильному середовищі.

Вирощування зародків у штучному живильному середовищі називається ембріокультура. Середовище для вирощування зрілого зародка може бути простою, без добавок фізіологічекі активних речовин (наприклад, середовище Уайта) або будь-яка інша, містить мінеральні солі і сахарозу. При більш віддалених схрещуваннях порушення в розвитку зародка можуть спостерігатися вже на ранніх етапах, що виражається у відсутності диференціювання, уповільненому рості. У цьому випадку культура зародка складається з двох етапів - ембріонального розвитку зародка, під час якого триває його диференціювання, і проростання підрослого зародка. Для першого етапу потрібно більш складна за складом середа з підвищеним вмістом сахарози, з добавками різних амінокислот, вітамінів і гормонів.

Застосування ембріокультури в селекції набуває останнім часом велике значення для отримання віддалених гібридів зернових, злакових та інших сільськогосподарських культур. Показана можливість збільшення виходу пшенично-житніх гібридів шляхом дорощування незрілих зародків, а також використання ембріокультури для подолання постгамной несумісності при гібридизації пшениці з колосняком.

Метод ембріокультури знаходить все більш широке застосування в міжвидової гібридизації овочевих рослин. абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Для цибулі розроблені прийоми вирощування in vitro абортивних зародків від гібридного насіння з різних етапів ембріогенезу, вирощування зародків від частково фертильних міжвидових гібридів. Культура ізольованих зародків використовується в селекції томатів та інших овочевих рослин.

. Досліджено гормональна регуляція росту та розвитку зародків томата in vitro. зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления. Обговорюється можливість застосування ембріокультури для отримання віддалених гібридів соняшнику, вивчаються фактори, що контролюють ріст і розвиток in vitro зародків соняшнику, виділених у різні терміни після запилення.

Культура ізольованих зародків як допоміжний метод при віддаленій гібридизації застосовується не тільки для подолання постгамной несумісності, але також з метою мікророзмноження цінних гібридів. У цьому випадку мікророзмноження йде шляхом каллусогенеза, індукції морфогенезу та отримання рослин-регенерантів з калюсних тканини. Техніка клонування незрілих зародків дозволяє розмножувати цінні генотипи рослин на ранніх стадіях життєвого циклу. Ще одна можливість застосування культури зародків-використання її в клітинній селекції.

Клональне мікророзмноження віддалених гібридів. Ембріокультура дає можливість виростити гібридні рослини з неповноцінних зародків. Проте вихід гібридних рослин малий, і гібриди часто бувають стерильні. Іноді, наприклад, при селекції гречки, важко відтворити в потомстві унікальні генотипи через перехресне запилення культури. Тому перед дослідниками часто постає завдання - розмножити і зберегти отримані рослини. У цьому допомагає метод клонального мікророзмноження. Розмножують гібриди шляхом активації розвитку меристеми пазушних бруньок (живцюванням стерильних пагонів), адвентивними нирками чи регенерацією рослин із калюсних тканини, зокрема отриманої при культивуванні зародків.

Отримання гаплоїдів in и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. vitro та використання їх в селекції. Роль гаплоїдних рослин в селекції дуже велика. Застосування їх дозволяє швидше знайти потрібну комбінацію, скорочує час для створення сорту. Гаплоїд використовуються для отримання стабільних гомозиготних ліній. Для мутагенезу також зручніше використовувати гаплоїдів, оскільки на гаплоидном рівні полегшується відбір рецесивних мутацій.

У диплоїдних рослинах мутації рідко зачіпають обидва алельних гена в гомологічних хромосомах. Особина зазвичай гетерозиготна (два гени розрізняються), при цьому виявляється дія тільки домінантного (але не рецесивного) гена. Оскільки мутації частіше рецесивні, ніж домінантні, їх досить складно виявити. У гаплоїдних же рослинах, які містять тільки одну з кожної пари гомологічних хромосом, мутації проявляються негайно. Селекція на гаплоидном рівні дозволяє вести прямий відбір не тільки домінантних, але і рецесивних ознак.

Гаплоїдні особини стерильні, але можна штучно подвоїти набір їх хромосом за допомогою колхіцину і отримати диплоїдні гомозиготні рослини.

Гаплоїд можуть виникати спонтанно, але частота їх спонтанного виникнення дуже мала. удается получить большие количества гаплоидных растений. Штучним шляхом з Використанням методів in vitro вдається отримати великі кількості гаплоїдних рослин. Існує три способи одержання гаплоїдів з використанням методу культури ізольованих тканин:

Андрогенез - отримання гаплоїдних рослин на штучному живильному середовищі з ізольованих пиляків і мікроспор.

гіногенез - отримання гаплоїдних рослин на штучному живильному середовищі з ізольованих сім'ябруньок;

партеногенез - отримання гаплоїдів з гібридного зародка, у якого з-за несумісності хромосом батьків втрачені батьківські хромосоми.

Утворилися в результаті елімінації хромосом батьківського геному гаплоїдні ембріоїдів культивують на штучних поживних середовищах і отримують гаплоїдні рослини. Сорти ячменю Джерело та Одеська-15 були отримані комбінацією партеногенетичного методу з культурою ізольованих зародків за чотири роки замість звичайних 10-12 років. Методом культури пиляків з сортів і гібридів м'якої і твердої пшениці в НВО «Еліта Поволжя» за чотири роки отримано понад 2,5 тис. дігаплоідних ліній, які характеризуються гомогенністю і стабільністю.

Триває розробка технології одержання гаплоїдів допомогою культури пильовиків пшениці, ячменю, кукурудзи, озимого жита, картоплі. У культурі пиляків можливі два шляхи утворення гаплоїдних рослин. Перший - освіта рослин шляхом ембріогенезу у пилкових зернах. При цьому усередині пиляків з окремих пилкових зерен виникають ембріоїдів. Вони проростають і дають гаплоїдні рослини. Другий - освіта калюсу з клітин пильовика. У подальшому в результаті морфогенезу з калюсних клітин регенерують рослини. У цьому випадку утворилися рослини не завжди бувають гаплоїдними і часто відрізняються за плоїдності. До кінця не з'ясовано, утворюються вони від поліплоідізірованних гаплоїдних клітин або від злилися клітин.

, могут применяться не только в практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а также по клеточной селекции. Гаплоїд, отримані in vitro, можуть застосовуватися не тільки в практичній селекції, але і в роботах з генетичної інженерії, а також з клітинної селекції. Пилкові зерна є в деяких випадках більш зручними, ніж протопласти, об'єктами для дослідів з генетичної трансформації.

столетия. Кріозбереження рослин. Кріозбереження соматичних клітин рослин у рідкому азоті (температура - 196 ° С) - новий напрям в біотехнології, що широко стало розвиватися з початку 70-х років XX століття. генофонда, а также в обеспечении селекционеров в любое время генотипом, имеющим искомые признаки: необходимая пыльца для проведения гибридизации; уникальные и единичные семена, в том числе не выносящие обезвоживания; трансформированные, мутантные, гибридные клетки разных видов растений, способных к морфогенезу in vitro ; зиготические и соматические зародыши и т.д. Мета даної технології полягає у збереженні в культурі in vitro генофонду, а також у забезпеченні селекціонерів в будь-який час генотипом, що мають шукані ознаки: необхідна пилок для проведення гібридизації; унікальні і поодинокі насіння, в тому числі не виносять зневоднення; трансформовані, мутантні, гібридні клітини різних видів рослин, здатних до морфогенезу in vitro; зіготіческіе і соматичні зародки і т.д. В даний час розроблено умови кріозбереження для культивованих клітин більш 30 видів, калюсних культур (близько 10 видів), ізольованих протопластів (8 видів), зберігання меристем (25 видів) і кінчиків стебла (13 видів). Пріоритет у цьому напрямку належить Інституту фізіології рослин РАН і, зокрема, відділу культури тканин і морфогенезу, очолюваному проф. Р.Г. Бутенко.

При проведенні робіт з кріозбереження необхідно, перш за все, враховувати специфіку рослинних клітин: відбирати дрібні клітини, з маленькою вакуолью і зниженим вмістом води; розробляти в кожному окремому випадку підходи заморожування і подальшого відтавання рослинних клітин. При кріозбереження зустрічається ряд труднощів, одна з яких пов'язана із захистом заморожуються клітин і тканин від осмотичного стресу і механічного руйнування структури результаті утворення і росту кристалів льоду всередині клітини. Одночасно з цим необхідно правильно підбирати умови, що забезпечують високу виживаність клітин при відтаванні і рекультивації.

Незважаючи на різноманіття робіт у цьому напрямку, в них все ж таки намітилися спільні прийоми, що лежать в основі кріозбереження: обробка клітин перед заморожуванням, застосування кріопротекторів, дотримання певного режиму заморожування в інтервалі від 0 до -40 ° С (у рідкісних випадках до -70 ° С), а також спеціальні заходи при відтаванні об'єктів.

Процес кріоконсервації, як правило, починається з підготовки культури клітин до заморожування. Це може бути досягнуто кількома способами, що передбачають культивування клітин на живильних середовищах, що містять різні осмотично активні речовини: маніт або сорбіт в концентрації 2-6%, амінокислоти і серед них, в першу чергу, пролін, чиє значення для зв'язування води в клітинах рослин широко відомо, а також у-аміномасляна кислота.

Підбір кріопротекторів, речовин, що зменшують пошкодження клітин від осмотичного і механічного стресу, проводять емпірично за принципом найменшої токсичності та оптимального ефекту. Серед всіх відомих кріопротекторів виділяються такі легко проникають в клітини речовини, як диметилсульфоксид (ДМСО, 5-10%), гліцерин (10-20%), а також непроникаючі високомолекулярні-полівінілпіролідон (ПВП), декстран, поліетиленгліколь (ПЕГ) з молекулярною масою 6000.

Велике значення при кріозбереження має правильно підібраний режим заморожування від 0 до -40 ° С. Як правило, для всіх об'єктів встановлюється швидкість заморожування 0,5-1 ° С за хвилину і всю цю роботу проводять на спеціальному обладнанні, що забезпечує програмне заморожування. Такі прилади випускає спеціальне конструкторське технологічне бюро з дослідним виробництвом при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини (м. Харків).

Таким чином, повільне заморожування і використання кріопротекторів дозволяє звільнити клітину від вільної води, і при -40 ° С клітини стають повністю зневоднений, що дає можливість проводити подальше заморожування, а саме занурювати ампули з рослинним матеріалом у рідкий азот.

Зберігання матеріалу в рідкому азоті практично не лімітовано. Наприклад, в кріобанку Інституту фізіології рослин РАН зберігаються клітини моркви, які перебувають у рідкому азоті близько 20 років, меристеми картоплі - більше 10 років і ін

Відтавання і перевірка життєздатності клітин після зберігання в рідкому азоті є останнім етапом технології кріозбереження. Якщо заморожування здійснюють повільно, поступово, то відтавання повинно бути проведено як можна швидше. Для цього ампули поміщають у водяну баню з температурою 40 °, а іноді й 60 ° С і витримують до повного зникнення останнього кристалика льоду.

Для визначення життєздатності клітин після відтавання застосовують найбільш простий, швидкий і цілком задовільний спосіб - забарвлення вітальним барвником (0,1%-ним феносафраніном або 0,25%-ним розчином сині Еванса), в результаті якої мертві клітини фарбуються, а живі немає. Остаточним критерієм, безумовно, служить чітке відновлення зростання і ділення клітин при рекультивації на штучних поживних середовищах після відтавання.

Експериментально було показано, що клітини після зберігання в рідкому азоті не втрачають здатність до поділу, регенерації рослин, не зменшується продуктивність синтезу вторинних метаболітів (клітини продуценти) і т.д. Так, Інститутом фізіології рослин РАН спільно з НУО з картоплярства розроблені методи кріозбереження меристем чотирьох сортів картоплі та показана можливість з 20% зберігаються меристем регенерувати цілі рослини, які при висадці в полі не відрізнялися за всіма ознаками, включаючи темпи зростання і продуктивність, від звичайних пробіркових рослин (С. Манжулін та ін, 1982). Більш докладно про техніку кріозбереження можна дізнатися з оглядових робіт А.С. Попова.

Таким чином, технологія, пов'язана з кріозбереження рослинних об'єктів, розвивається і постійно вдосконалюється. Безсумнівно, ця технологія має своє майбутнє, тому що вже сьогодні кріобанк можуть значно полегшити роботу селекціонерів, надавши їм можливість широко використовувати пул генів сортів, в тому числі старої селекції і диких видів, а також зникаючих видів рослин.

2. Клітинна селекція рослин

Сомаклональная варіабельність. , широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, в настоящее время находит все большее применение и при создании новых биотехнологий. Метод культури ізольованих клітин, тканин і органів рослин in vitro, широко використовуваний для вирішення багатьох фундаментальних питань клітинної біології, фізіології та генетики рослин, в даний час знаходить все більше застосування і при створенні нових біотехнологій. Починаючи з перших робіт з культивування рослинних клітин, тканин і органів особливий інтерес у дослідників викликало питання про те, які клітинні зміни можуть відбуватися в ізольованих клітинах, що ростуть на штучних живильних середовищах, і причини, що їх викликають. З розробкою техніки отримання рослин-регенерантів з калюсних тканини з'явилася можливість отримувати нові форми рослин, що відрізняються як за фенотипическим, так і за генетичними ознаками від вихідних рослин. Така різноманітність серед клітинних ліній та рослин-регенерантів отримало назву «сомаклони», хоча ще в 70-80-і роки нашого століття було прийнято називати рослини, одержані з калюсна тканини, «калліклонамі», а з протопластів - «протоклонамі».

Генетична природа і механізм виникнення сомаклональной мінливості поки мало вивчені. , а также от генотипа и исходного экспланта. Проте чітко можна виділити залежність виникнення сомаклональних варіантів, перш за все, від генетичної гетерогенності соматичних клітин вихідного експлантів, генетичної та епігенетичної мінливості, индуцируемой умовами культивування in vitro, а також від генотипу і вихідного експлантів.

Диференційовані клітини в нормальному рослині можуть мати різну ступінь плоїдності, але для окремих видів характерна наявність тільки диплоїдних клітин. Однак у процесі онтогенезу можуть виникати клітини з різною плоїдності. Наприклад, експериментально доведено, що в меристемних тканинах, разом з фактором видового сталості числа хромосом, майже у 80% покритонасінних рослин в процесі диференціювання в соматичних клітинах може відбуватися ендоредуплікація хромосом і формування тканин різного рівня плоїдності. Для вегетативно розмножуваних і апоміктічних рослин характерне утворення з високою частотою анеуплоїдних клітин. Посилення хромосомних перебудов, що приводять до появи химерного і міксоплоідіі у рослин, спостерігається при зміні умов зростання, особливо при їх різкому погіршенні: засолення грунтів, підвищені або знижені температури, застосування гербіцидів або пестицидів, мінеральних добрив у підвищених дозах і ін Ці та інші часто зустрічаються в практиці фактори можуть приводити до фізіологічних порушень, пов'язаних, в першу чергу, з появою аномальних мітозів і формуванням клітин з числом хромосом, що відрізняється від такого в материнської тканини.

, связана с генетическими изменениями. Цитологічні дослідження показали, що варіабельність, індукована умовами культивування in vitro, пов'язана з генетичними змінами. Перш за все одним з основних джерел появи фенотипічних варіантів є різні кариологических зміни і перебудови. Проте виявити, які з них будуть мати фенотипический ефект і успадковуватися як стабільна мутація генів, часто складно. Як грубі, так і тонкі хромосомні зміни - дрібні ділення, дуплікації, транслокації, інверсії - можуть викликати суттєві фенотипічні зміни як у рослинах-регенерантів, так і в подальшому потомство. Хромосомні зміни часто спостерігаються при мейозі. Аналіз мейозу клітини в регенерантів показав такі інтенсивні перебудови хромосом, як транслокація, інверсія, субхроматідний обмін, часткова втрата хромосом. Це є доказом того, що більша частина фенотипічних змін обумовлена ​​генетичними механізмами.

Сомаклональную мінливість можна простежити на молекулярному рівні, оцінюючи тонкі перебудови ядерної ДНК.

Крім сомаклональной варіабельності, пов'язаної з успадкованими перебудовами геному, відзначені фенотипічні зміни («епігенетичні»), які можуть стабільно передаватися дочірнім клітинам, але не виявлятися в рослинах-регенерантів або їх статевому потомство (Додаток 1).

Висока ступінь різноманітності сомаклонов залежить від вихідного генотипу, природи і стадії розвитку експлантів. =6х=42) из 192 исследованных растений-регенерантов 29% были анеуплоидами, у гексаплоидного овса (2n=6х=42) выявлены цитоге-нетические изменения с такой же частотой, а для кукурузы частота возникновения анеуплоидных растений не превышала 2–3%. Наприклад, у різних злаків ступінь мінливості серед сомаклонов може значно відрізнятися: у пшениці (2 n = 6х = 42) з 192 досліджених рослин-регенерантів 29% були анеуплоїдії, у гексаплоїдної вівса (2n = 6х = 42) виявлені цітоге-нетической зміни з такою ж частотою, а для кукурудзи частота виникнення анеуплоїдних рослин не перевищувала 2-3%. Освіта поліплоїдних і анеуплоїдних рослин може спостерігатися і в інших видів, наприклад, на картоплі. Причому частота появи нових варіантів у диких видів значно нижче, ніж у дігаплоідних ліній культивованого картоплі.

Тип вихідного експлантів також впливає на появу сомаклональних варіантів, що відрізняються кількісними та якісними ознаками. Для картоплі, наприклад, аномальні рослини отримані в 12% випадків при використанні як первинного експлантів мезофільних тканин листа, а у разі використання пелюсток або осі суцвіть частота формування рослин з фенотипическими відхиленнями від норми склала 50%.

Умови культивування та, зокрема, порушення гормонального балансу живильного середовища - одна з причин виникнення генетичного різноманіття культивованих клітин внаслідок порушення клітинного циклу, зокрема мітозу. Від співвідношення фітогормонів, що входять до складу живильних середовищ, багато в чому залежить цитогенетична структура клітинних популяцій. Однак морфологічна і цитогенетична різноякісність клітинних популяцій може виникнути і внаслідок впливу окремих компонентів живильного середовища: деяких мінеральних солей, сахарози або іншого джерела вуглецевого живлення, вітамінів, рослинних екстрактів, а також від режиму вирощування. также способствует повышению генетического разнообразия сомаклонов. Тривале культивування клітин in vitro також сприяє підвищенню генетичного різноманіття сомаклонов. Причому для деяких видів показано, що, незважаючи на присутність у культурі клітин різної плоїдності, регенеровані рослини були переважно диплоїдними. Це явище було пояснено тим, що в процесі культівгірованія відбиралися рослини-регенеранти з більш-менш нормальною морфологією, які регенерували, як правило, в першу чергу.

Різні типи морфогенезу - соматичний ембріогенез або органогенез-також можуть по-різному позначатися на генетичних змін і, відповідно, на фенотипі рослин. Експериментально встановлено, що при соматичному ембріогенезі час проходження циклу клітина - рослина значно коротше, ніж при органогенезе, тому ступінь подібності одержуваного матеріалу і вихідного батьківського генотипу може бути значно вище.

Сомаклональние варіанти мають, безсумнівно, практичне застосування у сільськогосподарській практиці, в силу появи форм, що відрізняються від батьківських по різним біохімічним, якісним і кількісним ознаками, а також цитогенетичними характеристиками. Наприклад, отримані сомаклони картоплі сорту Зарево, що відрізняються високою врожайністю, підвищеною стійкістю до захворювань, більш високим вмістом в бульбах протеїну і крохмалю. Причому спадкоємство важливих ознак при розмноженні бульбами зберігалося протягом трьох років польових випробувань (В. В. Сидоров та ін, 1984, 1985). . Для рослин тютюну отримані через калюсних культур сомаклони, стійкі до вірусу тютюнової мозаїки, а для цукрової тростини »отримано новий сорт, що характеризується високою врожайністю і підвищеною стійкістю до захворювань, зокрема до хвороби Fiji. В даний час метод культури тканин почав широко використовуватися в селекції не тільки кормових і технічних культур, але і декоративних і лікарських рослин. , полученный через каллусную культуру. Прикладом тому може служити новий сорт пеларгонії Velvet Rose, отриманий через калюсних культур.

Таким чином, отримані позитивні результати свідчать про необхідність більш ефективного впровадження різних прийомів отримання сомаклональних варіантів у практику селекційної роботи, і найбільш реальним є застосування сомаклональной мінливості для поліпшення або «доопрацювання» вже існуючих сортів або ліній по окремих відсутньою ознаками.

Селекція рослин на клітинному рівні. Значний інтерес представляє питання про використання клітинної селекції в комплексі з отриманням сомаклонов. в создании технологий для сельского хозяйства – возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками. Одна з найбільш сильних сторін культури in vitro у створенні технологій для сільського господарства - можливість на основі сомаклональних варіацій або індукованих мутацій відбирати в жорстких селективних умовах клітини, які характеризуються шуканими ознаками.

Для проведення клітинної селекції використовують такі прийоми:

• пряма (позитивна) селекція, при якій виживає лише певний шуканий мутантний тип клітин;

• непряма (негативна) селекція, заснована на виборчій загибелі клітин, які діляться дикого типу та виживання метаболічно неактивних клітин, але вимагає додаткової ідентифікації у них мутаційних змін;

• тотальна селекція, при якій індивідуально тестуються всі клітинні клони;

• візуальна селекція і неселективний відбір, коли варіантна лінія може бути ідентифікована серед всієї популяції клітин візуально або при використанні біохімічних методів (тонкошарова або рідинна хроматографія, радіоімунний аналіз, мікроспектрофотометрія та ін.)

З перерахованих вище прийомів клітинної селекції пряма селекція є найбільш поширеним методом і використовується головним чином для виділення рослин-регенерантів, стійких, наприклад, до гербіцидів, антибіотиків, токсинів, важких металів, солей і інших антиметаболитами.

в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Для проведення робіт з клітинної селекції рослин в умовах in vitro в якості об'єкта дослідження можуть бути використані калюсна, суспензійні культури або ізольовані протопласти. Вибір об'єкта залежить від наявності розроблених технологій стосовно до різних видів рослин, а також від кінцевих цілей дослідження.

Калюсна тканина являє собою легко доступний матеріал, який найбільш часто використовують для клітинної селекції. Як правило, роботу проводять на первинній або пересадковою калюсна тканини, яка не втрачає здатності до регенерації протягом ряду субкультівірованій. Однак при роботі з калюсних культур багато дослідників відзначають істотні недоліки даного об'єкта, повільний ріст тканини, нерівноцінні для всіх клітин дію токсичних речовин, які застосовуються в якості селективного фактора, а також втрата регенераційної здатності в процесі культивування калюсних клітин. Безсумнівно, проводити селекцію доцільно на рівні поодиноких клітин (суспензійна культура, протопласти). Однак для багатьох видів рослин не розроблені ефективні технології та способи культивування поодиноких клітин. Тому, незважаючи на перераховані вище недоліки використання калюсних культур, цей спосіб селекції залишається для деяких видів рослин поки єдиним.

Отримання стабільно стійких ліній - процес тривалий. Як правило, селекція починається з отримання достатньої кількості калюсна маси з ізольованих рослинних експлантів, що використовується в подальшому для визначення концентрації селективного фактора (побудова дозової кривої), при якій спостерігається одночасно зростання калюсна тканини, і в той же час частина калюсних колоній гине. Обрана концентрація селективного фактора визнається оптимальною і використовується в подальших експериментах. Так як первинно отримані на середовищах з селективними факторами колонії клітин могли виникнути внаслідок фізіологічної адаптації чи певного стану диференціювання клітин і не бути генетично стійкими, то протягом наступних 4-6 субкультівірованій на селективної середовищі перевіряється стабільність стійкості отриманих клонів. Потім їх переносять на середовище без селективного фактора і субкультівіруют ще 2-3 пасажу. І тільки після повторного повернення в селективні умови відбирають стабільні клони, з яких намагаються отримати рослини-регенеранти. Однак роботи, проведені з отриманням рослин, стійких до підвищених солей, а також до токсинів, виділеним із грибів-збудників хвороб, показали, що стійкість клітини і рослини до досліджуваного селективного фактора може збігатися і не збігатися. отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам. Пряма кореляція між стійкістю рослин і клітин in vitro відзначена лише для низьких температур, стійкістю до гербіцидів, високих концентрацій алюмінію та інших факторів.

Велика кількість робіт з культивування калюсу, з метою отримання нового селекційного матеріалу, проведено на пшениці, ячмені, рисі, сорго, а також на картоплі, томатах, люцерні, вкрай рідко, на деревних. или Na ₂ S 0 ₄ . Вже досягнуто перші позитивні результати з отримання рослин пшениці, рису, картоплі, стійких до NaCl або Na ₂ S 0 _4. Отримано клітини, а з них рослини моркви, які синтезують в 20 разів більше метіоніну, в 30 разів - триптофану, в 5 разів - лізину шляхом додавання в живильне середовище токсичних аналогів амінокислот. Для картоплі отримані рослини, стійкі до кільцевої гнилі. Що стосується деревних, то для них роботи в цьому напрямку вкрай рідкісні і часто мають пошуковий характер. Таким чином, використання калюсна культури в селекційних цілях відкриває величезні можливості у створенні нових форм рослин, що несуть цінні ознаки, необхідні для людства.

Поряд з перерахованими вище об'єктами (калюсна, суспензійна культура, ізольовані протопласти), в якості вихідного матеріалу для селекції можуть бути використані культури соматичних або андрогенних ембріоїдів, такі органогенні експлантів, як сегменти листя або різні меристематические і стеблові частини рослин, а також культура ізольованих зародків . зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с улучшенным содержанием белка. Наприклад, шляхом культивування та селекції in vitro зародків з насіння отримані рослини ячменю, стійкі до аналогів амінокислот, з поліпшеним вмістом білка. Для картоплі розроблено ефективний метод обробки пагонів і черешків мутагеном, що приводив до отримання химерних мутантів хлорофіллдефектності і резистентності до антибіотиків. При культивуванні пиляків ярої пшениці сорту Саратовська-29 і Москов-ська-35 на поживних середовищах з підвищеним вмістом солей хлориду натрію отримані соматичні ембріоїдів, а в подальшому рослини-регенеранти, що проявили підвищену солестійкість (Беккужіна, 1993).

Таким чином, проведення селекції на клітинному рівні дозволяє створювати нові форми рослин в 2-4 рази швидше в порівнянні з традиційними способами селекції.

3. Гібридизація соматичних клітин

Наступний метод клітинної селекції-створення нестатевих гібридів шляхом злиття ізольованих протопластів, отриманих із соматичних клітин. Цей метод дозволяє схрещувати філогенетично віддалені види рослин, які неможливо схрестити звичайним статевим шляхом, викликати злиття трьох і більше батьківських клітин, отримувати асиметричні гібриди, які несуть весь генний набір одного з батьків разом з декількома хромосомами або генами, або тільки органелами і цитоплазмою іншого. Гібридизація соматичних клітин дає можливість не тільки поєднати в одному ядрі гени далеких видів рослин, але і поєднувати в гібридній клітині цитоплазматичні гени партнерів.

Виділення, культивування і злиття ізольованих протопластів. Для застосування методів соматичної гібридизації необхідна розробка відповідних технологій отримання протопластів, здатних ділитися і регенерувати рослини. Виділення протопластів рослинних клітин шляхом їх плазмолізірованія і механічного руйнування клітинної стінки було здійснено ще в кінці минулого століття. Однак метод ізольованих протопластів отримав розвиток лише після того, як в 1960 р. І.К. Коккінг вперше здійснив ферментативне руйнування клітинної стінки і виділив голі протопласти.

В даний час продовжується розробка та вдосконалення методів виділення і культивування протопластів на штучних поживних середовищах (рис. 1.15). Для культивування протопластів застосовують ті ж поживні середовища, що і для культури ізольованих клітин і тканин. Відмінною рисою середовищ для протопластів є підвищений осмотичний тиск на початкових етапах культивування, яке забезпечується високою концентрацією маніту або СаС1 _2.

У процесі культивування ізольовані протопласти регенерують нову клітинну стінку і перетворюються на клітини, здатні ділитися і давати початок утворенню калюсна тканини. На формування колоній протопластами впливає склад поживного середовища. Подальше завдання - отримання з калюсна тканини рослин-реге-нерантов. Поки не вдалося отримати регенерант з протопластів багатьох злакових (пшениці, ячменю). Проте успішно здійснюється регенерація з протопластів пасльонових (тютюн, картопля, томати) і інших культур.

Протопласти виділяють з калюсних, суспензійних клітин або з клітин листя, меристем, стебел. При виділенні протопластів з листя спочатку видаляють епідерміс, лист нарізають на сегменти і потім піддають ензиматичною обробці пектиназу і целюлозу (Додаток 2).

Злиття ізольованих протопластів може відбуватися спонтанно, але досить рідко. Індуковане злиття ізольованих протопластів вперше було отримано в лабораторії Коккінга в 1970 р. його співробітниками Пауером та ін В якості індуктора вони використовували нітрат натрію. Але цей метод виявився малоефективним, і зараз знайдені інші фьюзогени (індуктори злиття). Найбільш ефективними з них виявилися розчини з високим рН (9-11) і високою концентрацією іонів кальцію (100-300 мМ). Протопласти попередньо агглютинируют за допомогою концентрованих розчинів поліетиленгліколю з молекулярною масою 1500-6000. У. Циммерман зі співробітниками. розробили фізичний метод злиття протопластів тварин клітин, ліпосом, в якому в якості індуктора використовувалися імпульси електричного струму.

Злиття протопластів призводить до утворення чи гібрида, або цибридів (рис. 1.17). Цибридних клітина містить цитоплазму обох партнерів, а ядро - одного. Це можливо в тому випадку, якщо після злиття протопластів не відбувається з'єднання ядер, і одне ядро дегенерує. Освіта цибридів можливо і в тому випадку, якщо один з протопластів позбавлений ядра чи воно інактивована шляхом опромінення.

Цібрідізація дозволяє ввести цитоплазматичні гени, що несуть ознаки ЦМС (цитоплазматичної чоловічої стерильності), стійкості до деяких гербіцидів і патогенів.

и N. Langsdorfii . Перший нестатевої міжвидовий гібрид вищих рослин отриманий в 1972 р. шляхом злиття ізольованих протопластів двох видів тютюну: Nicotiana glauca і N. Langsdorfii.

В даний час методом парасексуальной гібридизації отримано велику кількість міжвидових, межсемейственних і міжтрибних гібридів. Однак у багатьох випадках гібридні рослини, отримані таким шляхом, в тій чи іншій мірі ненормальні. Прикладом може служити соматичний гібрид між арабідопсис і турнепсом, який є рослиною-монстром. Виникаючі аномалії є результатом хромосомної незбалансованості (Ю. Ю. Глеба, 1982).

Особливий інтерес представляють межцарственние клітинні гібриди, отримані від злиття протопластів рослинних і тваринних клітин. Описано гібриди між протопластами еритроцитів щура і протопластами дріжджових клітин, між протопластами моркви і людини, тютюну і людини та ін

При соматичної гібридизації експеримент будується аналогічно дослідам з генетики мікроорганізмів. Іншими словами, використовуються великі популяції клітин обох батьків. При обробці змішаної суспензії протопластів фьюзогенамі частина з них зливається один з одним, але в суспензії залишаються і мчали протопласти. Всі вони, включаючи гібридні, вдальнейшем регенерують клітинні стінки і переходять до поділам. Виникає завдання - виділити із загальної маси гібридні екземпляри. Селекція гібридів може застосовуватися або на клітинному рівні, або на стадії регенерації і здійснюється декількома методами.

Для ідентифікації гібридів можуть служити пластиди. Наприклад, при злитті протопластів тютюну та моркви в якості селективних маркерів використовувалися зелені хлоропласти тютюну та червоно-помаранчеві хромопласти моркви.

Іншим методом, що дозволяє проводити відбір гібридів, є генетична комплементації. Цей метод був застосований для виявлення гібридів тютюну, при цьому використовувалися хлорофіллдефектние мутації у батьків з подальшою комплементації в гібридних продуктах. Поєднання двох ядерних рецесивних мутацій у тютюну викликає светоза-вісім хлорофілльних недостатність. Рослини, гомозиготні по кожному із цих генів, що вирощуються при інтенсивному освітленні, знебарвлюються і гинуть. Після злиття і регенерації клітинні колонії пересаджують на середу, індукують стеблової органогенез, і культивують на світлі.

Під методом фізіологічної комплементації, який також використовується для виявлення соматичних гібридів, мають на увазі здатність гібридних клітин жити і розмножуватися або переходити до морфогенезу в умовах культури, при яких батьківські клітини цього робити не в змозі, причому нездатність батьківських клітин не пов'язана з якою-небудь певною мутацією , а є нормальною фізіологічною реакцією клітини на фізіологічні умови. и N. Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях in vitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов. Наприклад, статеві гібриди між N. glauca і N. Langsdorfii мають схильність до пухлиноутворення, а клітини гібридів в умовах in vitro здатні рости і розмножуватися на поживних середовищах без гормонів. Гормононезалежну клітин гібриду і була покладена в основу методу селекції. Після індукованого злиття протопластів з мезофілу листків обох видів тютюну клітини через деякий час пересаджували на поживне середовище, що не містить фітогормонів, і відбирали колонії, здатні рости в цих умовах. Існують також інші методи селекції соматичних гібридів: змішана фізіологогенетіческая комплементації, фізична збагачення (метод заснований на поділі протопластів при центрифугуванні у зв'язку з їх різною щільністю), механічна ізоляція.

Використання ізольованих протопластів в селекції рослин не обмежується можливістю їх індукованого злиття та отримання соматичних гібридів. Ізольовані протопласти здатні поглинати з навколишнього середовища макромолекули і органели, отже, в них можна вводити чужорідну інформацію, не пересаджуючи ДНК або органели інших клітин. Вже проведена успішна трансплантація ізольованих ядер в протопласти петунії і тютюну. Разом з тим поглинання протопластами чужорідних ядер не завжди веде до утворення гібридів. Крім ядер в ізольовані протопласти вдалося трансплантувати чужорідні хлоропласти. З цих протопластів Карлсон отримав рослини-регенеранти, що містять хлоропласти іншого організму.

Однак роботи з перенесення чужорідних органел і ДНК тільки починають розвиватися. У цілому використання ізольованих протопластів в генетичній реконструкції клітини, як ми бачимо, відкриває багаті перспективи перед клітинної селекцією.

Література

1. Бутенко Р.Г. Культура клітин рослин і біотехнологія. - М.: Наука, 1986.

2. Катаєва Н.В., Бутенко Р.Г. Клональне мікророзмноження рослин - М Наука, 1983.

3. . C . Шевелуха B. C. Ріст рослин і його регуляція в онтогенезі. - М.: Колос, 1992.

4. Шевелуха В.С., Калашнікова С.В., Дегтярьов С.В. та ін Сільськогосподарська біотехнологія - М.: Вища школа, 1998.