ВСТУП
Для кількісного накопичення вірусів найбільш зручну систему представляють культури клітин. Перші спроби культивування клітин тварин поза організмом відносяться до кінця минулого століття. Ці уривчасті спостереження вказували на можливість збереження життєздатності тканин і клітин в штучних умовах і поклали початок глибоким науковим дослідженням тканинних культур.
Велика заслуга в справі paзработкі методів культивування тканин належить Каррелю Він вперше довів можливість розмноження клітин тварин у штучних умовах і тим самим продемонстрував їх «безсмертність» і схожість з одноклітинними свободноживущими організмами. Значних успіхів у цьому напрямку досягла група дослідників під керівництвом Ерла. Вони перші отримали зростання великого числа клітин на склі і в рідкій перемішуваної суспензії. Поява антибіотиків і успіхи у створенні штучних поживних середовищ відкрили нову еру в розвитку методів тканинних культур.
Тканинні культури давно знайшли застосування для вирішення різних питань біології та медицини. Однак лише успіхи в області вірусології, досягнуті за допомогою тканинних культур, стали потужним стимулом їх розвитку до сучасного рівня.
Культивування вірусів допомагає вирішити ряд теоретично проблем, пов'язаних з вивченням особливостей взаємодії "вірус-клітина". Крім того, рішення цілого ряду прикладних задач, пов'язаних з діагностикою та виробництвом препаратів для профілактики вірусних інфекцій неможливо без накопичення віруссодержащего сировини.
ВИДИ КУЛЬТУР КЛІТИН.
Перенесення клітин цілісного організму в умови життя in vitro припиняє існування їх як одного з численних структурних елементів тканини або органу, до складу яких вони раніше входили. При цьому клітини виходять з-під контролю нейро-гуморальних факторів і набувають ряд особливостей, що залежать як від самого факту відторгнення клітин від цих тканин, так і від конкретних умов їх існування in vitro.
Живуть поза організмом клітини або тканини характеризуються цілим комплексом метаболічних, морфологічних і генетичних рис, різко відмінних від властивостей клітин органів і тканин in vivo.
У залежності від методики первинної експлантаціі тканини і техніки її культивування розрізняють кілька видів переживають і зростаючих культур тканин і клітин. Найбільше поширення мають одношарові, а також суспензійні культури зростаючих клітин. Саме вони складають основу сучасної лабораторної та виробничої вірусологічної практики.
Розрізняють два основних види одношарових клітинних культур: первинні та перещеплюваних.
Терміном «первинна» позначають клітинну культуру, отриману безпосередньо з тканин людини або тварин в ембріональному або постнатальному періоді. Термін життя таких культур обмежений. Після певного часу в них виникають явища неспецифічної дегенерації, що виражається в грануляції і вакуолізація цитоплазми, округлення клітин, втраті зв'язку між клітинами і твердим субстратом, на якому вони вирощувалися. Періодична зміна середовища, зміна складу останньої та інші процедури можуть лише дещо збільшити терміни життя первинної клітинної культури, але не можуть запобігти її кінцевої деструкції та загибелі. По всій імовірності, цей процес пов'язаний із природним згасанням метаболічної активності клітин, виведених з-під контролю нейро-гуморальних факторів, що діють в цілісному організмі.
Лише окремі клітини або групи клітин популяції на тлі дегенерації більшої частини клітинного шару можуть зберегти здатність до зростання і розмноження. Ці клітини, виявивши потенцію нескінченного розмноження in vitro, при багаторазових перевивання дають початок перещеплюваних культурах клітин.
Розрізняють лінії і штами перещеплюваних клітин. Першим терміном позначають перещеплюваних клітини, які характеризуються потенційним безсмертям і, як правило, гетероплоідним каріотипом другий терміном - полуперевіваемие клітини з диплоїдним набором хромосом і обмеженою тривалістю життя in vitro. Поява і тих, і інших клітин пов'язані з процесом відбору в клітинній популяції первинних культур, що є, таким чином, джерелом всіх ліній і штамів перещеплюваних клітин.
Основна перевага ліній перещеплюваних клітин, в порівнянні з будь первинної культурою, полягає в потенції необмеженого розмноження поза організмом і відносної автономності зближує їх з бактеріями і одноклітинними найпростішими.
Здатність перещеплюваних клітин до нескінченного розмноження in vitro знаменує собою якісний стрибок, в результаті якого клітини набувають здатність до автономного існування, подібно мікроорганізмам, вирощуваних на штучних поживних середовищах. Сукупність змін, що призводять до появи у клітин таких особливостей, називають трансформацією, а клітини перещеплюваних тканинних культур - трансформованими.
Удосконалення техніки культивування клітин значно розширило можливості отримання перещеплюваних клітинних ліній з найрізноманітніших тканин тварин і людини. При цьому не було виявлено вікову межу, вище якої тканини втрачали б здатність адаптації до необмеженого росту in vitro, тобто до трансформації.
Іншим джерелом перещеплюваних клітинних ліній є злоякісні новоутворення. У цьому випадку трансформація клітин відбувається in vivo в результаті розвитку патологічного процесу, етіологія якого багато в чому залишається ще нез'ясованою.
Не всі злоякісні новоутворення здатні давати початок перещеплюваних клітинним культурам. Так, наприклад, безуспішними були спроби отримати перещеплюваних клітини з ракових пухлин шлунка і молочних залоз людини. Насилу вдається адаптувати до життя in vitro клітини плоскоклітинного раку шкіри і слизових оболонок. З іншого боку, порівняно легко виводяться лінії з тканин сарком і злоякісних пухлин нервової системи.
Особливу категорію клітинних культур складають полуперевіваемие штами, що мають диплоїдний набір хромосом. Вони вигідно поєднують в собі риси первинних та перещеплюваних клітин.
ЖИВИЛЬНІ СЕРЕДОВИЩА.
У будь-якій клітинній культурі розрізняють клітинну і рідку фази. Рідка фаза забезпечує життєдіяльність клітин культури і являє собою живильні середовища різного складу та властивостей.
Всі середовища за своїм призначенням діляться на ростові і підтримують. У складі ростових середовищ повинно міститися більше поживних речовин, щоб забезпечити активне розмноження клітин для формування моношару на поверхні скла або достатньо високу концентрацію клітинних елементів в суспензії (при отриманні суспензійних культур). Підтримуючі середовища фактично повинні забезпечувати лише переживання клітин у вже сформованому монослое при розмноженні в клітинах вірусних агентів.
Ростові і підтримують середовища багатокомпонентні. До їх складу можуть входити як природні продукти (амніотичні рідини, сироватки тварин), так і субстрати, отримані в результаті часткової обробки природних продуктів (ембріональні екстракти, гідролізат лактальбуміну, гемогідролізат, аминопептид і т. д.), а також синтетичні хімічно чисті речовини (амінокислоти, вітаміни, солі).
Як приклад живильного середовища, повністю складається з природних компонентів, можна назвати середу Баклі, запропоновану для вирощування клітинних культур з ниркового епітелію мавп. У цю середу входить коров'яча амніотіче-ська рідина (85%), кінська сироватка (10%) і коров'ячий ембріональний екстракт (5%).
Всі природні продукти малостандартни, їх використання пов'язане з великою небезпекою мікробної та вірусної контамінації клітинних культур. У зв'язку з цим і відбувається поступове витіснення їх синтетичними стандартними сумішами. Найбільше застосування знаходять синтетична середу 199 і середу Голка. Широко використовуються середовища, що містять строго певні кількості солей, амінокислот і вітамінів.
Незалежно від призначення всі поживні середовища для тканинних культур конструюються на основі якого-небудь збалансованого сольового розчину з достатньою буферною ємністю. Найчастіше ними є розчини Хенкса і Ерла. Ці розчини - обов'язковий компонент будь-якої живильного середовища. Невід'ємним компонентом більшості ростових середовищ є сироватка тварин (теляча, бичача, кінська), без наявності 5-10% якої розмноження клітин і формування моношару не відбувається.
Включення сироватки в той же час перешкоджає створенню ростових середовищ точного хімічного складу, дуже важливих для розвитку фундаментальних досліджень з клітинної фізіології, так як разом з сироваткою (або її дериватами) вводиться цілий комплекс неконтрольованих факторів, що варіюють залежно від серії сироватки.
У 50-ті роки Ewans і Waymouth були запропоновані бессивороточние середовища точного хімічного складу. Однак ці середовища не забезпечували тих показників проліферативної активності клітин, які зумовлюють середовища з додаванням сироваток. У зв'язку з цим становить інтерес робота Birch і Pirt, що показали, що для забезпечення інтенсивного росту клітин у бессивороточних середовищах визначальним є включення сірчанокислих солей Fe, Zn, Cu, а також МnС12.
У ростові живильні середовища, а так само в буферний розчин для промивання тканин додають антибіотики. Їх вводять в середу безпосередньо перед вживанням з розрахунку 1 мл основного розчину антибіотиків на 500 мл середовища.
Нижче наведено склад та метод приготування однієї з поширених поживних середовищ.
Середа Голка
л-аргініну - 17,4
л-цистину - 4,8
л-гістидину - 3,1
л-ізолейцин - 26,2
л-лейцііа - 13,1
л-лізину - 14,6
л-метіоніну - 7,5
л-фенілаланіну - 8,3
л-треоніну - 11,9
л-тріптафана - 2,0
л-тирозину - 18,1
л-валіну - 11,7
біотину - 0,24
холіну - 0,12
холін-хлориду - 0,14
вітаміну В12 (птероілглютаміновой кислоти) - 0,44
нікотинаміду - 0,12
пантотенової кислоти - 0,22
пантотенату кальцію - 0,48
піридоксаля (піридоксин хлоргідрату) - 0,20
тіамін-хлоргідрату - 0,34
рибофлавіну - 0,04
хлористого натрію - 5850,0
хлористого калію - 373,0
фосфату натрію однозамещенного (NaH2PO4. Н2О) - 138,0
кальцію хлористого - 111,0
двовуглекислого натрію (NaHCO3) - 1680,0
магнію хлористого (MgCl2. 6Н2О) - 102,0
глюкози - 900,0
л-глютамина - 146,2-292,3
пеніциліну - 50,0
стрептоміцину - 50,0
фенолу червоного - 5,0
води до 1000,0
Приготування.
Розчин 1. У 500 мл води, нагрітої приблизно до 80 °, помішуючи, розчиняють зазначені вище кількості амінокислот, після чого додають л-глютамін і фенол-червоний.
Розчин 2. У 100,0 мл води розчиняють неорганічні солі, за винятком двовуглекислого натрію (NaHCO3), змішують з попереднім розчином неорганічних солей і додають біотин і вітамін B12.
Розчин 3. У 200,0 мл води розчиняють всі вітаміни, окрім біотину та Птер-ілглютаміновой кислоти, і антибіотики - пеніцилін і стрептоміцин. Усі розчини стерилізують фільтруванням через скляний фільтр-нутч (пориста скляна пластина, величина пір 0,7-1,5) або через асбестоцеллюлозние пластини Зейтца після попереднього промивання водою, а потім - приготованим розчином.
500 мл розчину 1 + 200 мл розчину 2 + 200 мл розчину 3 змішують і доводять стерильною водою до 1000,0 мл. Можна додати 1 мг інозиту на 1 л.
ОТРИМАННЯ КЛІТИННИХ КУЛЬТУР. ПРИГОТУВАННЯ ПЕРВИННИХ КЛІТИННИХ КУЛЬТУР.
Первинною - називається культура, отримана з тканини і вирощувана in vitro до початку субкультівірованія, тобто до першого посіву. Первинна культура позбавлена багатьох клітин, присутніх у вихідній тканини, оскільки не всі клітини здатні прикріплятися до субстрату і вижити in vitro. У процесі культивування клітин відбувається відносне збіднення культури неделящимся або повільно діляться клітинами.
На першому етапі отримання первинної культури проводять стерильне видалення фрагмента тканини, органу тварини і його механічну або ферментативну дезагрегацію. Тканина подрібнюється до шматочків обсягом до 1 - 3 мм, шматочки тканини відмиваються від еритроцитів розчином Хенкса з антибіотиками. Для дезагрегації тканини використовують трипсин (0,25% неочищений або 0,01 - 0,05% очищений) або коллагеназу (200 - 2000 од / мл, неочищена) та інші протеолітичні ферменти. Такий спосіб отримання культури забезпечує високий вихід клітин.
Первинні культури можуть бути також отримані від шматочків тканини, об'ємом 1 мм, які прикріплюються до поверхні субстрату завдяки власній адгезивності або наявності насічок на чашці, або за допомогою згустку плазми. У цих випадках буде відбуватися ріст клітин з фрагментів. Клітини, що мігрують з експлантатів можуть використовуватися для пасирування. Фрагменти тканини (експлантатів) переносяться на нові чашки, мігруючі клітини можуть видалятися пересівом, сумішшю версії і трипсину, а позосталі експлантатів будуть утворювати нові вирости.
Відомі такі первинні культури, як культура фібробластів курячого ембріона, культура клітин нирки теляти, лейкоцити.
ОТРИМАННЯ моношарова перещеплюваних КУЛЬТУР КЛІТИН.
Як вже зазначалося вище, одним з методів отримання перещеплюваних клітинних ліній є відбір клітин з підвищеною активністю росту і розмноження з популяції первинних культур. Відбір можна здійснити при регулярній зміні середовища, що омиває моношар первинно тріпсінізірованной клітинної культури. Для цього відбирають матраци з добре сформованим клітинним монослоем (самі матраци повинні мати рівне дно і не повинні мати на стінках подряпин і матових плям). Приготовлену для систематичної зміни ростовую середовище розливають по невеликих судинах (щоб виключити бактеріальне забруднення) і зберігають при t - 4 °.
Зміну середовища виробляють регулярно, не рідше 1 разу на тиждень. Протягом перших 3 тижнів замінюють по 20 - 30% обсягу ростової середовища, протягом наступних 3 - 4 тижнів - 50 - 60%, пізніше проводять повну зміну середовища. Свіжу середу безпосередньо перед роботою підігрівають до t - 37 °.
У міру зміни середовищ клітини міняють свою морфологію. Частина клітин заокруглюється і відпадає від скла. Більшість клітин стягується до центру, і моношар набуває зірчастий вигляд. Самі клітини при цьому кілька подовжуються. Через 7 - 10 змін середовища в матрацах, як правило, починають з'являтися нові клітинні елементи, причому в різних культурах вони мають різну морфологію.
У культурі клітин нирки курячого ембріона в центрі монослоя або між стягнутими його ділянками з'являються заокруглені клітинні елементи, з яких поступово формуються скупчення у вигляді невеликих колоній. У культурі клітин нирки мавпи з'являються поодинокі утворення, що нагадують зерна. Клітини щільно прилягають один до одного, утворюючи дрібні прозорі колонії. Кількість таких клітин наростає повільно, розміри колоній також майже не збільшуються. Колонії з'являються не тільки на дні матраца, але також на бічних поверхнях, на кордоні живильного середовища. Тому обов'язковою умовою при зміні живильного середовища є підтримка її постійного об'єму. У культурі клітин нирок ембріона людини на тлі масової дегенерації стягнених в тяжі монослоя виявляються великі полігональні клітини з довгими відростками.
Виниклі в процесі відбору атипові клітинні елементи повинні бути відокремлені від решти ділянок монослоя і перенесені в окремі пробірки або матраци. Для цього може бути використаний метод версенізаціі або механічний відкол атипових клітин за допомогою бактеріологічної петлі або шпателя. Останній спосіб особливо необхідний при роботі з культурою клітин нирок мавпи, де колонії атипових клітин щільно прикріплені до скла і самі від нього не відокремлюються.
При зміні живильного середовища у разі появи атипових клітин рекомендується обережно видалити більшу частину ростової середовища, а меншою частиною енергійно отполоскать моношар і цю середу розлити по пробірках. У цьому випадку в середовищі можуть виявитися атипові клітини, що мають здатність утворювати колонії, придатні для подальших пересівань.
Після перенесення культури атипових клітин в новий посуд спостереження за основною культурою доцільно продовжити, оскільки процес виведення нової клітинної лінії дуже складний, і далеко не завжди відібрані атипові елементи дають початок життєздатною лінії перещеплюваних клітин. Необхідно, щоб вся робота по отриманню нових клітинних ліній, що триває протягом багатьох місяців, проводилася з одними і тими ж поживними середовищами, сироватками тварин і серіями антибіотиків.
Відомі такі первинні культури, як культура клітин нирки золотистого хом'ячка (BHK), культура клітин нирки сибірського гірського козерога (ПСГК), культура клітин нирки зеленої мавпи (CV).
Роллерний КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН
До недавнього часу тканинні культури застосовувалися у вірусології переважно у вигляді одношарових стаціонарних культур. У багатьох випадках цей метод вирощування клітин є незамінним. Багаторічний досвід показує, що при використанні одношарових стаціонарних культур зустрічається ряд труднощів, пов'язаних з величезними витратами робочого часу і матеріалів. З цієї точки зору, більш вигідні роллерниє культури, які економічні, характеризуються оптимальним відношенням корисної площі культивування до обсягу поживного середовища і відкривають сприятливі можливості для накопичення клітинної маси.
Термін «роллерниє культури» позначає метод культивування, при якому клітинний моношар розташовується по всій циліндричної поверхні горизонтально обертових судин і періодично омивається живильним середовищем. В силу певних причин деяка кількість клітин може в окремих випадках бути зважене в культуральному середовищі. У подібному варіанті культуру клітин називають ролерною-суспензійний. "Врожайність" клітинної культури буде тим більше, чим більше площа, з якої збирають клітини. Дослідники використовували різні шляхи збільшення площі поверхні, на якій відбувалося прикріплення і розмноження клітин. Для цього застосовували різного характеру основи з великою питомою поверхнею: тверду, губчасту, з вовни, колагену, на скляних спіралях і т. д. Широкого поширення ці методи не отримали, так як значно ускладнювали маніпуляції з клітинами, але слід зазначити описану Л. С . Ратнером і В. А. Крикуном методику багатоярусного культивування. Клітини культивували в 1,5, 10 і 15-літрових бутлях, повністю завантажених овальними скляними трубками, розташованими паралельно поздовжній осі судин. Корисна площа при цьому зростала в порівнянні із стаціонарними одношаровими культурами в судинах того ж об'єму в 20 разів. Культивування проходило в 2 етапи. На першому етапі бутлі обертали навколо горизонтальної осі з метою рівномірного розподілу клітин. Надалі, коли клітини прикріплялися до скла, культивування тривало в стаціонарному положенні. Описана культуральна система була успішно використана для культивування вірусу ящуру.
Більш ефективним виявилося обертання судин, в яких відбувалося розмноження клітин. Спочатку клітини вирощували в пробірках, але з розвитком технічного оснащення зросли обсяги культуральних судин, і від вирощування клітин в обертових пробірках дослідники перейшли до обертовим бутлях. Ролерні культури стали застосовуватися як для накопичення клітин, так і розмноження вірусів.
Для роллерного культивування використовуються спеціальні стелажної-ярусні апарати для обертання бутлів або барабани. Частіше за все для культивування використовують 0,5-3-літрові бутлі. У виробничих умовах обсяг їх може досягати 20 літрів і більше. Апарати для роллерного культивування прості, надійні та обслуговування їх нескладно. Велике значення має швидкість обертання бутлів. Вона не повинна бути занадто великою, щоб не перешкоджати прикріпленню клітин, але й не занадто низькою, тому що тривале перебування клітин в газовій фазі погіршує умови їх живлення. У роботах різних авторів швидкості обертання бутлів варіювали від 8-12 об / годину, до 1 об / хв. Найбільш придатною для різних клітинних культур виявилася швидкість обертання флаконів в межах 0,5-1 об / хв. Рекомендується протягом перших 30 хв. після засіву клітин забезпечити високу швидкість обертання флаконів (0,5-1,0 об / хв) для рівномірного розподілу матеріалів, потім перевести їх на низьку швидкість обертання (20-30 об / год).
Посівна концентрація в 1 мл середовища становить для клітин СНЕВ, ВНК-21, HeLa, L - 60-80 тис., для диплоїдних клітин 100-200 тис., для первинних культур - 200-300 тис. Обсяг ростової середовища повинен складати 1 / 10, 1 / 20 частину обсягу роллерного флакона. Роллерний метод культивування дозволяє отримати більшу кількість клітин. Так, з флакона ємністю 3 л можна одержати врожай клітин HeLa у 8 разів, ВНК-21 - у 9 разів, АТ - у 11 разів більший, ніж з моношарова стаціонарної культурою флакона ємністю в 1 л. Кратність економії середовищ при використанні 3-літрових флаконів становить для клітин HeLa 2,8; ВНК-21 - 5,0, АТ - 4,0. Здатністю до зростання і розмноження в ролерний умовах мають субкультури, перещеплюваних культури і рідше первинні, а також диплоїдні штами клітин. Для кращого розмноження клітин в ролерний апаратах необхідна адаптація їх до нових умов культивування. Роллерний метод культивування дозволяє отримати великі кількості клітин. Перевагою ролерний культур порівняно з традиційними стаціонарними культурами є, зокрема, більш економічне використання поживних середовищ і більш високий вихід вірусного антигену (на 1-2 lg).
Суспензійний КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН
У 1953 році Оуенс із співробітниками вперше показав здатність клітин розмножуватися в рідкому середовищі у вільно суспендованих стані. З тих пір метод суспензійного культивування привертає увагу дослідників у зв'язку з його високою ефективністю при накопиченні великих кількостей клітин. Виявилося, що клітини перещеплюваних ліній, на відміну від інших типів клітинних культур, можуть довго культивуватися в підвішеному стані. Клітини в цих умовах розмножуються, не прикріплений до стінок культурального судини, перебуваючи в суспензійному стані, завдяки постійному перемішуванню середовища. При оптимальному режимі вирощування клітини в суспензіях швидко розмножуються, мають більш високий «урожай», ніж у стаціонарних культурах. Первинні та перещеплюваних ліній клітин мають неоднакову здатність зростання в суспензії. Так, гетероплоідние і анеуплоїдні постійні лінії, на відміну від псевдодіплоідних ліній, адаптуються швидше до зростання в суспензії.
Суспензійні культури готують з одношарових культур. Клітини отслаивают від скла за допомогою розчинів версії і трипсину. Осад клітин після центрифугування (1000 об / хв.) Ресуспендіруют у свіжій живильному середовищі. Приготовлену суспензію поміщають в культуральні судини (реактори, ферментери) і вирощують при постійному перемішуванні. У наукових дослідженнях концентрація клітин у вихідній суспензії коливається від 0,3 до 10х10 в 1 мл. Оптимальна концентрація клітин у вихідній суспензії повинна бути 2-5х10 в 1 мл. На думку Ерла і його співробітників, концентрація клітин у суспензійних культурі повинна бути такою, щоб фаза логарифмічного росту наступала не пізніше 16-24 годин після приготування культури. Суспензійні клітинні культури проходять характерні стадії: лаг-фазу, фазу логарифмічного росту, стаціонарну фазу і фазу логарифмічного відмирання. У першій стадії, як правило, кількість клітин зменшується, у другій стадії популяція клітин збільшується (логарифмічна стадія зростання), в третій стадії збільшення кількості клітин не спостерігається (стаціонарна фаза). Якщо культивування продовжити далі, то виявиться період зменшення чисельності клітин-фаза логарифмічного відмирання (фаза руйнування). Швидкість розмноження клітин у логарифмічній фазі росту висловлюють часом генерації. Під часом генерації мається на увазі період, необхідний для подвоєння популяції клітин в культурі. Для суспензійного вирощування клітин важливою умовою є перемішування рідини, яка має бути безперервним і досить інтенсивним, щоб підтримувати клітини в підвішеному стані, перешкоджати їх осадженню і прикріплення до стінок посудини і в той же час не викликати їх механічного пошкодження.
Перемішування суспензійних культур проводять лопатевими магнітними мішалками, а також круговими гойдалками. В даний час широко застосовують обертання флаконів і бутлів навколо поздовжньої осі (15-40 об / хв). На магнітних мішалках швидкість обертання становить 100-200 об / хв. Швидкість перемішування залежить від обсягу культури; малі обсяги культури вимагають невисокій швидкості, тоді як її необхідно збільшити при великих обсягах. Для запобігання осідання клітин на внутрішній поверхні судини виробляють сіліконірованіе. Силіконове покриття в силу своєї гідрофобності перешкоджає прикріпленню клітин до стінки судини.
Внутрішні стінки культурального судини змочують 5% або 10%-ним розчином силікону і після випаровування розчинника (бензольними, ацетонового) посудини витримують при 85 ° С і 200 ° (відповідно протягом 30 і 60 хв). Після охолодження судини наповнюють гарячою бидистиллированной водою і залишають на 2 години, потім їх 3 рази обполіскують бидистиллированной водою і висушують при 100 ° С. Судини стерилізують у сушильній шафі при 170 ° С протягом 2 годин.
Максимальний ріст клітин у суспензії спостерігають при рН 7,0-7,2. Живильні середовища, які застосовують для вирощування клітин в суспензії, не відрізняються від середовищ, які використовуються для вирощування клітинних ліній в одношарової культурі. Частіше за все при культивуванні клітин в суспензіях беруть середу Голка з дворазовою концентрацією амінокислот і вітамінів.
Суспензійні культури споживають в 2-7 разів більше глюкози, ніж моношарова. У процесі споживання глюкози клітини виділяють в середу токсичну для них молочну кислоту. Споживання клітинами глюкози і вироблення молочної кислоти йдуть паралельно і знаходяться в прямій залежності від щільності клітинної популяції. Корисним виявилося додаток до живильного середовища інсуліну в кількості від 40 до 200 ОД на 1 л. Додаток до живильного середовища інсуліну змінює співвідношення між кількістю поглинутої глюкози та виділеної молочної кислоти. Для клітин лінії L зазначений коефіцієнт може бути знижений з 74-81 до 37-38%.
Різні амінокислоти споживаються із поживного середовища зростаючими клітинами з неоднаковою швидкістю. Відзначено, що регулярне поповнення аргініну (20-40 мг / л) і збільшення кількості глутаміну до 450 мг / л сприяють зростанню зважених культур.
Додаток инозитола (0,4 мг / л) дозволяє прискорити зростання культур амниотических клітин людини. Бажаним є додавання до середовища каталази (1 мг / л) і тироксину (12 мг / л).
Великий інтерес представляють роботи, присвячені отриманню зважених культур клітин у синтетичному середовищі, що не містить сироватки крові. Робляться спроби збільшити в'язкість живильного середовища за рахунок безбілкових інгредієнтів. З цією метою використовується метил-целюлоза і гіалуронова кислота.
Метилцелюлоза в концентрації 0,1-0,2% володіє максимальним захисним дією на зважені в середовищі клітини. Протективное дію метилцелюлоза полягає в тому, що молекули утворюють захисний шар навколо клітини, що запобігає пошкодження клітин при перемішуванні середовища. Дуже важливим показником стану суспензійної культури є парціальний тиск кисню в рідкій фазі. Концентрація кисню в газовій фазі залежить від щільності клітинної популяції і нерідко буває нижче атмосферної. Недолік кисню веде до появи грануляції цитоплазми, клітини втрачають правильну округлу форму. При невеликому надлишку кисню клітини мають добре окреслену, правильну, округлу форму, і стають дуже великими при ушкоджувальний дії надлишку кисню. Оптимальна концентрація кисню для різних клітинних культур знаходиться в межах від 9 до 17% або 293 мм рт. стовпа. При концентрації кисню вище 20% відбувається інгібіція клітинного росту. Так, при концентрації кисню 24% розмноження клітин нирок ембріона кролика (лінія ERK) знижувалося наполовину, а при 30% зводилося до нуля. Підвищення концентрації кисню токсично впливає на клітинний метаболізм.
Таким чином, розмноження клітин в суспензії залежить від концентрації клітин у вихідній суспензії, аерації і рН середовища, складу живильного середовища, способу перемішування, об'єму суспензії та інших факторів.
Однорідність суспензії, можливість тривалого підтримки клітин у логарифмічній фазі росту, перспективи математичного моделювання процесів клітинного росту залежно від впливу факторів зовнішнього середовища, зручність багаторазового дослідження фізіологічного стану культури клітин в суспензії, висока економічність методу-ось далеко не повний перелік переваг суспензійних культур.
Суспензійні культури широко використовується у вірусологічних дослідженнях і для накопичення великих кількостей віруссодержащего матеріалу, при виготовленні вакцин і діагностичних препаратів.
КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН НА мікроносіях.
У 1967 р. Van Werel запропонував метод культивування, що поєднує елементи моношарова і суспензійного вирощування клітин, який він назвав методом «мікроносіях». Суть його полягає в тому, що клітини прикріплюються і розмножуються на поверхні полімерних кульок-частинок «мікроносіях» (МН), які містяться в суспензії за допомогою перемішують, наприклад мішалки. На одній частці МН діаметром 160-230 мм може поміститися 350-630 (або в середньому 460) клітин. В одному мл середовища можна суспензійовані кілька тисяч частинок мікроносіях, при цьому загальна площа їх складе від кількох до 50 см2/мл.
Інокульованої в культиватор клітини прикріплюються до поверхні частинок МН і розмножуючись, утворюють суцільний моношар на кожній окремій частці.
Основними перевагами цього методу є:
1) створення рівномірних умов по всьому об'єму посудини, що робить можливим ефективно контролювати необхідні параметри (рН, р02 та ін), 2) отримання високої щільності клітинної популяції до 5-6 млн. клітин в 1 мл; 3) культивування одночасно кілька сот мільярдів клітин, 4) введення постійного контролю за динамікою росту клітин; 5) зниження зростання контамінації у зв'язку зі скороченням операцій, пов'язаних з розгерметизацією культураль-ного судини; 6) значна економії поживних середовищ; 7) можливість зберігати виросли клітини безпосередньо на частинках при низьких температурах; 8) можливість штучно створювати різні концентрації МН з виросли на них клітинами; 9) можливість пасирування культури без застосування трипсину шляхом додавання свіжих порцій мікроносіях.
Мікроносії повинні мати:
- Невеликий позитивний заряд в межах 1,5-1,8 мекв / м. У зв'язку з тим, що більшість клітин тварин мають слабо негативний заряд, вони легше будуть прикріплюватися до такого МН:
- Щільність 1,05-1,15 г / см; зазначена щільність є оптимальною для підтримки МН в підвішеному стані;
- Діаметр частинок від 100 до 250 мкм, що забезпечує площі для зростання декількох сотень клітин;
- Гладку поверхню;
- Прозорість;
- Відсутність токсичності компонентів для клітин;
- Незначне вбирання компонентів середовища;
- Універсальність, що забезпечує можливість використання їх для первинних, диплоїдних і гетероплоідних клітин. Важливе значення мають властивості МН, які дозволяють використовувати їх багаторазово.
Проведено дослідження багатьох гранульованих препаратів різної хімічної природи, в тому числі з поперечно-зшитого (ПС) декстрану, ПС-агарози, ПС-полівінілпіролідон, поліакрілнітріта, пористого селикагель, полістиролу, капрону, нейлону, алюмосилікати з метою використання їх як мікроносіях.
Придатними є тільки деякі з них, головним чином мають у своїй основі ПС-декстран.
Кілька зарубіжних фірм розробили комерційні препарати мікроносіях, готові до вживання: Цітодекс-1, 2, 3 (Франція, Швеція), Суперб (США, Англія), Біосілон (Данія). Вартість перерахованих препаратів досить висока, тому необхідно проводити дослідження з розробки та виробництва вітчизняних МН.
Культивування клітин на мікроносіях проводять у звичайних ферментерах для суспензійного культивування. У ферментере не повинно бути яких-небудь виступів, кишень, щоб запобігти накопиченню мікроносіях в застійних зонах. Тому розумно використовувати ферментери з круглим дном і гладенькими стінками. Внутрішня поверхня ферментера повинна бути силіконізована для запобігання прилипання мікроносіях до скла або нержавіючої сталі ферментера.
Для контролю за навколишніми культуру умовами такими, як рН і О2, може бути використано стандартне устаткування. Швидкість перемішування суспензії з носієм повинна бути 40-60 об. / хв. Для вирощування на МН застосовуються різні типи клітин.
Концентрація цітодекса може варіювати від 0,5 до 5 мг / мл. Однак, при виробництві профілактичних вакцин, застосовують звичайно кінцеву концентрацію цітодекса, що не перевищує 1 мг / мл. Підвищення концентрації до 3 мг / мл і вище створює додаткові труднощі, пов'язані з необхідністю перфузії живильного середовища та часткової її заміни, що ускладнює технологічний процес.
Посівна концентрація клітин, а також умови культивування на МН в перші години в значній мірі визначають оптимальні параметри для проліферації і максимального накопичення клітин. Показано, що посів 10 клітин / мл перещеплюваної лінії нирок мавп (Vero) і диплоїдних клітин фібробластів ембріона людини (MRC-5) у зменшеному до 1 / 3 об'єму живильного середовища і при періодичному включенні мішалки (30 об / хв) на одну хвилину через щогодини протягом 4 годин, з подальшим додаванням живильного середовища до кінцевого об'єму, веде до збільшення проліферації клітин та їх кількості в порівнянні з контролем (повний обсяг живильне середовище в момент посадки клітин і безперервна робота мішалки з початку культивування).
Важливе значення для культивування клітин на МН має живильне середовище. Правильний підбір живильного середовища також буде сприяти оптимізації процесу проліферації клітин та їх якість. Необхідно проводити підбір поживних середовищ для культивування клітин на різних типах МН. Показано, що перещеплюваних лінія клітин нирок мавп (Vero) на цітодексе дає найбільший вихід при використанні середовища Ігла ДМЕ (посадковий концентрація клітин 105 мл) але порівняно з середою вме і 199. Якщо ж кількість клітин при посадці знизити до 104, то кращі результати дає середу 199. Всі випробовувані середовища містили 10% фетальної сироватки.
ВИРОЩУВАННЯ вірусу в культурі клітин.
В даний час для виділення і розмноження вірусів тварин використовуються первинні культури, штами клітин і встановилися клітинні лінії. У загальних рисах процедура виявляється однаковою для всіх вірусів.
Середу видаляють з клітинного моношару і моношар промивають збалансованими буферними сольовими розчинами (СБСР) або фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) для видалення інгібіторів (антитіл), які можуть бути присутніми в середовищі. Вірусні частинки суспендують у невеликій кількості СБСР чи ФСБ і адсорбуються клітинами протягом 30 - 60 хв. Після цього сольові розчини замінюються свіжої середовищем.
Зараження вірусами культивованих клітин викликає характерні морфологічні зміни клітин. Кінцеві дегенеративні клітинні процеси (Цитопатогенні ефект, ЦПЕ) виявляються тільки через кілька тижнів зростання в присутності вірусів, але в ряді випадків ЦПЕ виявляються вже через 12 ч. Деталі морфологічних змін виявляються різними в разі різних вірусів.
Якщо замість продуктивної інфекції вірус викликає клітинну трансформацію, то це також супроводжується характерними змінами морфології та особливостей росту клітин.
ЗАХОДИ ПРИ РОБОТІ З ЗАРАЖЕННЯ вірусом клітини.
Віруси надають цитопатогенну дію і служать етіологічними агентами при багатьох захворюваннях людини і тварин. Крім того, багато вірусів (наприклад, онкорнавіруси, вірус герпесу тип II, аденовіруси, вірус поліоми і SV40) є, мабуть, агентами, що викликають розвиток пухлин у тварин. Через здатність вірусів проходити через бактеріальні фільтри буває важко виключити віруси з культур незаражених клітин при наявності вірусних суспензій, коли можлива передача вірусу через повітря культуральної кімнати.
Зазначені нижче запобіжних заходів носять самий загальний характер і застосовні тільки в тих випадках, коли віруси не представляють будь-якої особливої небезпеки. При використанні особливо небезпечних вірусів, які становлять небезпеку для здоров'я співробітників лабораторії або людей і тварин навколишнього світу, слід застосовувати додаткові запобіжні заходи. До вірусів, що становлять особливу небезпеку, відносяться віруси ньюкаслської хвороби, віруси ящура, віруси везикулярного стоматиту, віруси віспи, віруси сказу, віруси герпесу типу В і так далі. Крім того, не можна бути впевненим, що навіть такі віруси, як SV40, не представляють небезпеки для людини.
Для зараження клітин і зростання заражених вірусами клітин повинна використовуватися спеціальна кімната або група кімнат.
Ніякі живі віруси не повинні виноситися з цих приміщень, не будучи укладені в щільно закриваються контейнери. Слід бути обережними, щоб зовнішні поверхні цих контейнерів не були забруднені вірусними частинками.
При роботі з вірусами повинні бути використані спеціальні захисні одягу (лабораторні халати). Після роботи цей одяг повинен поміщатися в спеціальний бак для автоклавування.
Всі середовища і скляний посуд, які були в контакті з вірусами, повинні бути оброблені хлоросом; тільки після цього їх можна виносити з приміщення, призначеного для роботи з вірусами.
Вся пластиковий посуд повинна бути поміщена в спеціальний бак для автоклавування.
Обладнання для зберігання і обробки вірусного матеріалу має розміщуватися всередині приміщення для роботи з вірусами.
Лабораторія повинна бути оснащена двоциклового автоклава, щоб співробітники лабораторії були захищені від шкідливих матеріалів.
ТРАСУВАННЯ ВІРУСІВ.
Виявити присутність вірусів і визначити їх кількість можна за допомогою цілого ряду різних тестів, наприклад:
1) Активність вірусу вимірюється шляхом визначення кількості містить вірус матеріалу, необхідного для того, щоб викликати специфічну реакцію в організмі господаря. Индуцируемая вірусом реакція може відбуватися за типом «все або нічого» (тобто наявність або відсутність інфекції), а може бути виражена кількісно, наприклад тривалістю часу, необхідного для прояву інфекції, або числом поразок у шарі чутливих клітин. Кількісне визначення вірусної активності називається титруванням.
Найменша кількість вірусу, здатне викликати відповідну реакцію, називається інфекційної одиницею, і титр вихідної вірусної суспензії виражається числом інфекційних одиниць, що припадають на одиницю об'єму. Наприклад, якщо мінімальна кількість суспензії вірусу грипу, що викликає у миші пневмонію при интраназальном введення суспензії тканини інфікованого легені в розведенні 1:106 дорівнює 0,1 мл, то це означає, що титр вірусу грипу у вихідній суспензії тканини легені дорівнює 107 інфекційним одиницям на 1 мл -1 / (10 ~ 1-10-6) = 107.
Як правило, обов'язковим компонентом методу титрування вірусу є тест, що дозволяє оцінити результат інокуляції як позитивний чи негативний. Наприклад, при титруванні вірусів тварин таким тестом може бути наявність або відсутність видимих уражень в культурі клітин, запальна реакція на місці інокуляції вірусу в шкіру або рогівку, паралічі, що виникають у тварини в результаті введення вірусу в мозок, і т. д. Іноді розмноження вірусу можна виявити і під час відсутності видимої реакції з боку організму-господаря: на приклад, зараження курячих ембріонів міксовірусів можна виявити по появі гемаглютинінів в аллантоісной рідини.
Найкращі результати дають методи титрування, в основі яких лежить підрахунок числа дискретних поразок на певній площі шару клітин, заражених відомою кількістю містить вірус матеріалу. У випадках коли число чутливих до вірусу і доступних для нього клітин можна практично вважати нескінченно великим, як, наприклад, при зараженні фагом одношарової культури бактерій на живильному агарі або при зараженні вірусом суцільний одношарової клітин тварин, ураження, спричинені вірусом, або бляшки, утворювані фагом, в даному сенсі подібні колоніям бактерій на щільному живильному середовищі. Як число цих колоній пропорційно числу бактеріальних клітин, що містяться в титруемой препараті, так і число бляшок прямо пропорційно кількості вірусу, доданим до одношарової культурі освіта зараженими клітинами вірусних частинок, які можуть бути ідентифікований, наприклад, за природою нуклеїнових кислот і симетрії частинок.
2) Освіта зараженими клітинами нуклеїнових кислот, які можуть володіти характерною щільністю при центрифугуванні в градієнті щільності або характерним розміром при електрофорезі в агарозному гелі або центрифугуванні в градієнті концентрації сахарози.
3) Освіта зараженими клітинами або трансформованими клітинами характерних антигенів, які можуть бути візуалізувати за допомогою фарбування флуоресціюючими специфічними антитілами або викликати зміни в клітинній мембрані, що призводять до адсорбції гема. У прямому методі антитіла, отримані до вірусних антигенів, поєднуються з флуорохромами і використовуються для фарбування заражених клітин. Позитивна реакція (жовто-зелений колір в люмінесцентному мікроскопі) вказує на присутність в клітинах вірусних антигенів. Цей метод, отже, може бути використаний для виявлення клітинної трансформації, коли антитіла виробляються, наприклад, проти ранніх антигенів вірусу SV40, або для виявлення освіти зрілих вірусів, коли виходять антитіла проти капсидних білків. У непрямому методі антитіла не поєднуються з флуорохромами. Замість цього після взаємодії антитіл з антигенами у фіксованих препаратах клітин до них додаються антігамма-глобуліновий антитіла, кон'юговані з флуорохромами. Цей метод більш чутливий і дозволяє уникнути кон'югації кожного індивідуального антитіла з флуоресцентним барвником. Так, одні й ті ж флуоресцентні антитіла до антитіл кролика (отримані у овець проти кролячих гамма-глобулінів) можуть бути використані для фарбування будь-яких антитіл, що утворюються у кроликів і взаємодіючих з вірусними антигенами в продуктивно заражених або трансформованих клітинах. Ще більш непрямий, але значно більш чутливий метод, не потребує використання флуоресцентного мікроскопа - пероксидазної - антіпероксідазний метод. Відповідно до цього методу, кролячі антитіла взаємодіють з антигенами фіксованих клітин і потім покриваються антитілами кози до імуноглобулінів кролика, кон'югованими з комплексами пероксидази хрону і кролячій антіпероксідази. Після цього препарати обробляють діамінів-бензидином і перекисом водню; коричневе забарвлення вказує на присутність антигенів.
4) Наявність антигенів на вірусних частинках може призводити до реакцій гемаглютинації, що дозволяє проводити кількісну оцінку. У багатьох вірусів є антигени, які можуть адсорбуватися на еритроцитах і викликати їх злипання. При взаємодії великої кількості вірусних часток і еритроцитів утворюється мережа клітин, і суспензія аглютинативна, тобто еритроцити випадають в осад. Існує деяка специфічність, яка полягає в тому, що певні віруси викликають аглютинацію еритроцитів певних тварин, але якщо виявлена активна комбінація, то гемаглютинація стає швидким тестом, що дозволяє визначити титр вірусу. Кров відбирають у гепаринизированную шприц і еритроцити промивають триразовим переосажденіем у 0,85%-ном NaCl при 200 g протягом 10 хв. Остаточний осад еритроцитів суспендують у 200-кратному обсязі 0,85%-ного розчину NaCl. Найзручніше проводити тест на гемаглютинацію в мікротітровальних платівках. У серію лунок мікротітровальной платівки вносять по 25 мкл 0,85%-ного NaCl або ФСБ; в першу лунку вносять 25 мкл суспензії вірусу, і суміш перемішують (розведення 1:2). 25 мкл переносять потім з першої лунки в другу (розведення 1:4) і так далі, до кінцевого розведення 1:2048. Після цього в кожну лунку додають по 25 мкл суспензії еритроцитів, суміш перемішують і залишають при 4 ° С, кімнатній температурі або 37 ° С до настання гемаглютинації (1-2 год). У лунках, де сталася аглютинація, осад еритроцитів має неправильну форму, а в лунках, де гемаглютинації не було, клітинний осад утворює компактну крапку на дні лунки. Розведення в останній лунці, в якій відбувалася гемаглютинація, розглядається як титр, і цьому розведенню приписується значення 1 гемагглютінірующей одиниці (Гаї). Попереднє розведення містить відповідно 2 Гаї і так далі.
5) Освіта зараженими клітинами характерних ферментів, або ферментів, легко відрізняються за властивостями від відповідних ферментів клітин-господарів.
КУЛЬТИВУВАННЯ пикорнавирусов НА ПРИКЛАДІ ОТРИМАННЯ поліовірусу ТИПУ 3 У КУЛЬТУРІ КЛІТИН HeLa.
В якості конкретної методики культивування вірусів можна навести спосіб вирощування поліовірусу в перещеплюваних клітинах.
Всі процедури проводяться в стерильних умовах.
Певні сублініі клітин HeLa (наприклад, HeLa S3) можуть рости в середовищах з низькою концентрацією іонів кальцію (наприклад, CaS2MEM). Для ефективного зараження істотно, щоб клітки добре росли у вигляді однорідної суспензії. Клітини осаджують низькошвидкісних центрифугуванням (15 хв при 900 g) і ресуспендіруют в середовищі CaS2MEM до концентрації ~ 2.107 кл / мл (~ 1 / 20 початкового об'єму).
До клітинної суспензії додають вірус в концентрації 10-50 БОЮ на клітину; інкубують її на магнітній мішалці протягом 1 год при 35 ° С.
Суспензію розводять тієї ж середовищем до концентрації 2.106 кл / мл і додають 100 мкКі [3Н]-уридину.
Клітинну суспензію інкубують протягом 8 год, після чого осаджують клітини низькошвидкісних центрифугуванням (15 хв при 900 g) і промивають один раз фосфатним буфером (PBS), що не містить іонів магнію і кальцію.
Клітини ресуспендіруют в PBS (5-107кл/мл) і проводять три цикли заморожування - відтавання.
Залишки клітин видаляють центрифугуванням.
Супернатант зберігають для подальшого очищення.
Список літератури
Адамс Р. Методи культури клітин для біохіміків. - М.: Мир, 1983, 263 с.
Вірусологія. Методи. / Под ред. Б. Мейх'ю. - М.: Мир, 1988, 344 с.
Голубєв Д. Б., Сомініна А. А., Медведєва М. Н. Керівництво щодо застосування клітинних культур у вірусології. - Л.: Медицина, 1976, 224 с.
Дьяконов Л. П., Глухів В. Ф., Поздняков А. А., Денисенко Г. Ф., Калмикова Т. П. Культивування клітин і тканин тварин. - Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988, 2 частина, 91 с.
Тваринна клітина в культурі під. ред. Л. П. Дьяконова, В. І. Сітькова. - М.: 2000
Культура клітин тварин. Методи. / Под ред. Р. Фрешні. - М.: Світ, 1989, 333 с.
Керівництво з ветеринарної вірусології. / Под ред. В. Н. Сюрін. - М.: Колос, 1965, 687 с.
Сергєєв В. А. Репродукція та вирощування вірусів тварин. - М.: Колос, 1976, 303 с.
Феннер Ф., Мак-Ослен Б., МИМС С., Сембрук Дж., Уайт Д. Біологія вірусів тварин. - М.: Мир, 1977, т. 1, 447 с.