Методи переносу генетичного матеріалу в клітини ссавців
Введення
Всі експерименти з перенесення генетичного матеріалу складаються з двох окремих етапів: перенесення ДНК від донора до реципієнта та відбору реципієнтного клітин, які включили генетичний матеріал донора. Більшість відповідних методів дозволяють ввести чужорідний матеріал в одну клітку з тисячі, а то й десяти мільйонів, тому для відбору потрібні дуже ефективні засоби. Саме ця стадія часто є лімітуючою в ході експерименту.
Перші досліди з перенесення генетичного матеріалу здійснювали за допомогою злиття цілих клітин. Така техніка знайшла застосування при вивченні процесів диференціювання і канцерогенезу, однак найбільш успішно її використовували при картуванні генів людини та отриманні моноклональних антитіл. Відомо, що сформувався при злитті клітин гризуна і людини міжвидовий гібрид спонтанно втрачає людські хромосоми. Як правило, втрата хромосом відбувається випадковим чином, і це дозволяє конструювати гібридні лінії клітин, в яких містяться різні хромосоми людини. Кореляція між присутністю конкретної хромосоми людини та експресією генетичного маркера є основою для віднесення відповідного гена до певної групи зчеплення. З 1300 генів людини, картіровани на сьогоднішній день, приблизно третина локалізована на конкретних хромосомах за допомогою методів генетики соматичних клітин. Процес втрати хромосом у внутрішньовидових гібридів відбувається не так швидко, як у гібридів міжвидових. При злитті клітин мишачої мієломи з клітинами селезінки формуються стабільні лінії гібридних клітин. Їх характеризує іммортальность, успадкована від мієломних клітин, і здатність продукувати антитіла.
Хромосомна нестабільність міжвидових гібридів, складності при каріотипування тетраплоїдних внутрішньовидових гібридів обмежували застосування методів генетики соматичних клітин для генетичного аналізу складних фенотипів. Треба було навчитися переносити окремі хромосоми між соматичними клітинами. Це вдалося зробити за допомогою міні-клітин. Незважаючи на технічні труднощі, метод MMGT з успіхом використовували для створення гібридів і подальшого картування генів, для аналізу процесів диференціювання і розвитку пухлини. Такі експерименти дозволили з упевненістю говорити про існування специфічних ^ rans-діючих регуляторів, які беруть участь у формуванні фенотипу диференційованої клітини; крім того, був підтверджений рецесивний характер гена пухлини Вільмса.
Методи злиття цілих клітин і MMGT ефективні для хромосомної локалізації гена, можливість більш тонкого картування цими методами обмежена, тому що воно вимагає наявності хромосом з транслокаціями і ділок. Для вирішення цього завдання розроблено два методи: перенесення генів, опосередкований хромосомою, і перенесення генів у процесі злиття опроміненої клітини-донора з неопромінених реципієнтом. Перший спосіб передбачає інкубацію очищених мітотичних хромосом з клітинами-реципієнтами в присутності фосфату кальцію. При цьому відбувається вбудовування фрагментів донорних хромосом в хромосоми клітини-реципієнта. Для ідентифікації гібридів, які містять потрібні фрагменти ДНК донора, застосовують відповідні методи селекції. На жаль, вбудовані фрагменти хромосом найчастіше зазнають реорганізацію, крім того, є достовірні дані про найбільш зручною проникненні у клітину і послідовностей з центромірних областей. Ці недоліки не дозволяють використовувати CMGT для картування, хоча даний метод дуже ефективний для збагачення специфічними фрагментами хромосом - складової частини стратегії клонування, званої «зворотної генетикою». Госс і Харіс вперше показали, що фрагменти Х-хромосоми людини, що з'являються в його гамма-опроміненої клітці, можна зберегти при злитті цієї клітини з клітиною гризуна. Поглиблений аналіз методу IFGT показав, що отримані фрагменти реорганізовані і для них характерна та ж тенденція представляти Центромерна області, що і при CMGT.
Геномної ДНК можна ввести, додаючи її очищений препарат до реципієнтного клітинам. Ця процедура також дуже важлива для аналізу функціонування генів у клітинах ссавців. Розроблено три способи введення ДНК: преципитация з фосфатом кальцію, за допомогою ретровирусного вектора і мікроін'єкція. Ймовірно, для кожного з них існує граничний розмір фрагментів ДНК, які переносяться без пошкодження. Хоча цю гіпотезу не піддавали ретельній перевірці, швидше за все справа йде саме так. Фрагменти довжиною понад 100 тисяч пар основ навряд чи можна перенести без втрат, якщо це взагалі можливо. Метод DMGT крім функціональних досліджень використовують для випадкового вбудовування в геном селектіруемих генів і для клонування генів, при селекції яких необхідна експресія.
1. Загальні положення
1.1 Необхідні умови
Умови культивування клітин повинні забезпечувати їх максимальну життєздатність. Це особливо важливо для клітин, які використовуються в експерименті з перенесення, оскільки дана процедура припускає використання потенційно токсичних речовин, таких, наприклад, як поліетиленгліколь.
Успіх експериментів з генетичного переносу багато в чому визначається ефективністю посіву клітин-реципієнтів. Отже, ефективність посіву всіх клітинних ліній, які будуть використані в якості реципієнтів, повинна бути перевірена в умовах, аналогічних експериментальним. Лінії, що демонструють ефективність посіву менше 10%, не годяться на роль реципієнта.
Всі маніпуляції необхідно проводити в стерильних умовах і зі стерильними реагентами. Розчини слід готувати лише з реактивів, призначених для культивування клітин, обов'язково використовувати для цього бідистильовану воду.
1.2 Селекція
Мета селекції - надання певних переваг клітинам, необхідним експериментатору. Існують чотири групи методів селекції.
1.2.1 Біохімічна селекція, заснована на ендогенних генах
Найбільш широко поширений приклад такого підходу - НАТ-селекція. У присутності аміноптеріна інгібується синтез de novo попередників ДНК. Клітини, позбавлені ферменту тимідинкінази, не можуть утилізувати екзогенний тимідин і гинуть у присутності аміноптеріна. Аналогічно, клітини, позбавлені гіпоксантин-фосфорибозилтрансферази, не можуть засвоювати гіпоксантин і також нежиттєздатні у присутності аміноптеріна. Соматичні гібриди, отримані при злитті ТК -, НРКТ +-клітин-ток з клітинами ТК +, HPRT -, можуть виявитися одночасно ТК +, HPRT +. Гібридні клітини з таким генотипом здатні рости в присутності аміноптеріна, якщо гіпоксантин і тимідин додані в середу. Поширений варіант НАТ-методу, коли один партнер по гібридизації не може розмножуватися in vitro, а інший - є дефіцитним по ТК або HPRT. Для досліджень в галузі генетики соматичних клітин розроблено велику кількість систем комплементації. Багато з них засновані на використанні різних ауксотрофних і прототрофних клітинних ліній хом'ячків. Цей підхід вимагає створення відповідних мутантних клітин-реципієнтів.
Враховуючи важливість НАТ-селекції, ми пропонуємо увазі читачів керівництво з приготування відповідного середовища.
1.2.2 Біохімічна селекція, заснована на екзогенних генах
Цей підхід позбавляє нас від необхідності виділяти специфічний мутант, оскільки він має на увазі використання бактеріальних генів, які дають селективні переваги при їх експресії в клітинах ссавців. Для цього конструюють плазмідні і ретровірусних вектори, у яких бактеріальні гени поєднуються з промоторами, місцями сплайсингу і сигналами Поліаденілювання ссавців. Введення бактеріальних генів у клітини ссавців за допомогою трансфекції або інфекції призводить до їх випадковому розподілу в геномі реципієнта. Як приклад бактеріальних генів, здатних забезпечувати селективні переваги клітин ссавців, можна назвати ген Є. coli gpt і генлео. Основний недолік цього методу - випадковий розподіл сайтів інтеграції; проте останні дослідження дозволяють сподіватися, що за допомогою гомологічною рекомбінації вдасться здійснювати спрямовану інтеграцію.
1.2.3 Антигени клітинної поверхні
У ролі селективного фактора можуть виступати антитіла. При цьому ми отримуємо можливість виділяти клітини з певним набором антигенів клітинної поверхні. Застосування антитіл лежить в основі ряду методів, серед них відбір клітин за допомогою клітинного сортер, розеткоутворення з еритроцитами, пов'язаними антитілами, виборче прикріплення клітин до поверхні з іммобілізованими на ній антитілами. Хоча ефективність селекції клітин за допомогою антитіл недостатньо висока, тим не менш селекція з використанням антитіл застосовується у всіх методах перенесення генів, що описуються тут, за винятком MMGT.
1.2.4 Активовані онкогени
Мутовані протоонкогени, особливо члени сімейства ras-генів, забезпечують переваги в рості клітин ссавців і, отже, можуть бути використані для селекції.
2. Злиття цілих клітин
2.1 Вступ
Відомо, що при змішуванні клітин вони можуть спонтанно зливатися, проте подія це надзвичайно рідкісне. Ефективність злиття може бути істотно збільшена з допомогою специфічних антигенів. Спочатку для цієї мети використовували інактивований вірус Сендай, однак біологічна неоднорідність різних партій інактивованого вірусу і громіздкість процедури злиття, індукованого вірусом, привели до широкого використання хімічного індуктора-поліетиленгліколю. Метод, представлений нижче, придатний для злиття клітин як одного, так і різних видів тварин. Внутрішньовидові гібриди формуються з частотою 10 ~ 5-Ю -3. Частота злиття клітин різних видів варіює від 10 ~ 7 до 10 ~ 5. Клітини, які мають схожі фенотипи та близькі параметри росту, зливаються з більш високою частотою.
2.2 Отримання клітинних гібридів за допомогою злиття, індукованого ПЕГ
Таблиця 2. Основні розчини, необхідні для злиття клітин
2.3 Можливі помилки та варіанти методики
Деякі лінії клітин зливаються з працею, якщо ж все-таки необхідні саме такі комбінації, спробуйте зробити наступне.
1. Варіюйте співвідношення батьківських клітин в діапазоні 1:10-10:1.
2. Спробуйте різний ПЕГ:
а) поміняйте партію ПЕГ. У наших експериментах та партія ПЕГ, яка давала гарні результати при злитті одного типу клітин, ефективно працювала і з іншими. Добре зарекомендував себе препарат необхідно відокремити й зберігати. За деякими даними властивості ПЕГ можуть бути поліпшені використанням розчинів, що не містять солей кальцію;
б) варіюйте молекулярний вагу. Як правило, підвищення молекулярного ваги тягне за собою збільшення здатності індукувати злиття. Однак розчин ПЕГ з великою молекулярною вагою володіє більшою в'язкістю, що ускладнює відмивання клітин. Так як ПЕГ є
Для кожної конкретної клітинної лінії необхідно підібрати оптимальну концентрацію колцеміда і час експозиції. Освіта міні-клітин легко контролюється під фазово-контрастним мікроскопом. У вдалих експериментах близько 50% всіх клітин утворюють міні-клітини. Ця частота збільшується після обробки цітохала-зіном В.
Другий день
3. Через 16 год замініть середу на середовище, що містить цітоха-Лазініо В в концентрації 2 мкг / мл; інкубують протягом ночі.
4. Вихідні градієнтні розчини помістіть у посудини з нещільно загвинченими кришкою та інкубують в атмосфері 5% СОГ при 37 ° С протягом ночі.
5. Заздалегідь нагрівайте ротор SW41.
Третій день
6. Приготування ступеневої градієнта фіколл. Ретельно промийте необхідну кількість центріфужний пробірок для ротора SW41 абсолютним спиртом, висушіть у перевернутому положенні в ламінарному боксі. Приготуйте градієнт фіколл, використовуючи урівноважені вихідні розчини.
7. Зберіть оброблені колцемідом і цітохалазіном клітини і облоги їх центрифугуванням. Ресуспендіруйте в 3 мл 10%-ного фіколл і м'яко нашарувати на градієнт. Заповніть центрифужні пробірки розчином без фіколл.
8. Помістіть пробірки, що містять градієнт, у нагрітий ротор SW41 і поставте ротор в заздалегідь нагріту до 37 ° С ультрацентрифугу.
9. Центрифугують 1 год при 25000 об / хв при 37 ° С; використовуйте мінімальне прискорення при розгоні і мінімальне гальмування, щоб запобігти руйнуванню градієнта.
10. Вийміть пробірки з центрифуги. Міні-клітини утворюють пухкі смужки в градієнті між 15:16% і 16:17% фіколл. Обережно відберіть ці смужки, використовуючи стерильну пастерівською піпетку, вводячи її через верх градієнта; помістіть міні-клітини в нову, стерильну центрифужну пробірку від ротора SW41 і заповніть її середовищем для зростання клітин. Забруднення фрагментами цитоплазми, ядрами і цілими клітинами можна контролювати під фазово-контрастним мікроскопом.
11. Центрифугують при 20 000 об / хв при кімнатній температурі в роторі SW41 10 хв при максимальному прискоренні і гальмуванні. Ця процедура тримає в облозі міні-клітини і відокремлює їх від фіколл.
12. Для подальшої очистки міні-клітин ми пропонуємо три різних прийому. Очищення не потрібна, лише коли у розпорядженні дослідників є чітка система селекції. У цьому випадку вони можуть відразу використовувати міні-клітини для злиття з клітинами-реципієнтами.
13. Злиття міні-клітин з цілими клітинами. Зберіть клітини-реципієнти і отмойте їх бессивороточной середовищем. Додайте приблизно 10 7 клітин-реципієнтів до осаду міні-клітин в 2 мл бессивороточной ростової середовища, що містить 100 мкг / мл фітогемагглютиніну. Помістіть в пластиковий посудину з конічним дном і інкубують 10 хв при 37 ° С.
14. Осадити центрифугуванням.
15. Процедуру злиття міні-клітин з цілими клітинами проводите за допомогою ПЕГ, як зазначено у відповідній методиці.
3. Перенесення генів, опосередкований хромосомами JCMGTJ
3.1 Вступ
Метод CMGT може бути використаний для переносу фрагментів хромосом з ядер клітин одного типу в ядра клітин іншого типу. Теоретично клітини будь-якого типу можуть бути використані як в якості донорів, так і в якості реципієнтів хромосом. Однак на практиці можливість застосування методу визначається наявністю відповідних реципієнтного ліній, що володіють підвищеною здатністю акцептувати чужорідну ДНК.
Висока частота трансфекції може бути досягнута при використанні як реципієнтів імморталізованних мишачих клітин. Клітинам хом'ячка і імморталізованним людських клітин зазвичай властива більш низька частота трансфекції. Правда, недавно отримані результати свідчать про те, що людські клітини лінії EJ здатні трансфіціроваться з високою частотою. У ролі донора з однаковим успіхом можуть виступати найрізноманітніші клітинні лінії - як суспензійні, так і субстрат-залежні. Переважно використовувати в якості донорних ті лінії, клітини яких легше культивувати і отримувати у великих кількостях. Нижче описуються загальні процедури, що забезпечують виділення донорних хромосом і перенесення фрагментів цих хромосом в реципієнтного клітини шляхом CMGT.
3.2 Виділення хромосом
У ході описуваних процедур для запобігання втрат і поломок хромосом, для забезпечення температурного режиму необхідно використовувати пластикові піпетки і пробірки. Клітини блокують на стадії мітозу, мітотичний хромосоми вивільняють впливом гіпотонічного шоку і гомогенізацією. Хромосоми очищають диференціальним центрифугуванням.
Таблиця. Вихідні розчини на CMGT
Введення
Всі експерименти з перенесення генетичного матеріалу складаються з двох окремих етапів: перенесення ДНК від донора до реципієнта та відбору реципієнтного клітин, які включили генетичний матеріал донора. Більшість відповідних методів дозволяють ввести чужорідний матеріал в одну клітку з тисячі, а то й десяти мільйонів, тому для відбору потрібні дуже ефективні засоби. Саме ця стадія часто є лімітуючою в ході експерименту.
Перші досліди з перенесення генетичного матеріалу здійснювали за допомогою злиття цілих клітин. Така техніка знайшла застосування при вивченні процесів диференціювання і канцерогенезу, однак найбільш успішно її використовували при картуванні генів людини та отриманні моноклональних антитіл. Відомо, що сформувався при злитті клітин гризуна і людини міжвидовий гібрид спонтанно втрачає людські хромосоми. Як правило, втрата хромосом відбувається випадковим чином, і це дозволяє конструювати гібридні лінії клітин, в яких містяться різні хромосоми людини. Кореляція між присутністю конкретної хромосоми людини та експресією генетичного маркера є основою для віднесення відповідного гена до певної групи зчеплення. З 1300 генів людини, картіровани на сьогоднішній день, приблизно третина локалізована на конкретних хромосомах за допомогою методів генетики соматичних клітин. Процес втрати хромосом у внутрішньовидових гібридів відбувається не так швидко, як у гібридів міжвидових. При злитті клітин мишачої мієломи з клітинами селезінки формуються стабільні лінії гібридних клітин. Їх характеризує іммортальность, успадкована від мієломних клітин, і здатність продукувати антитіла.
Хромосомна нестабільність міжвидових гібридів, складності при каріотипування тетраплоїдних внутрішньовидових гібридів обмежували застосування методів генетики соматичних клітин для генетичного аналізу складних фенотипів. Треба було навчитися переносити окремі хромосоми між соматичними клітинами. Це вдалося зробити за допомогою міні-клітин. Незважаючи на технічні труднощі, метод MMGT з успіхом використовували для створення гібридів і подальшого картування генів, для аналізу процесів диференціювання і розвитку пухлини. Такі експерименти дозволили з упевненістю говорити про існування специфічних ^ rans-діючих регуляторів, які беруть участь у формуванні фенотипу диференційованої клітини; крім того, був підтверджений рецесивний характер гена пухлини Вільмса.
Методи злиття цілих клітин і MMGT ефективні для хромосомної локалізації гена, можливість більш тонкого картування цими методами обмежена, тому що воно вимагає наявності хромосом з транслокаціями і ділок. Для вирішення цього завдання розроблено два методи: перенесення генів, опосередкований хромосомою, і перенесення генів у процесі злиття опроміненої клітини-донора з неопромінених реципієнтом. Перший спосіб передбачає інкубацію очищених мітотичних хромосом з клітинами-реципієнтами в присутності фосфату кальцію. При цьому відбувається вбудовування фрагментів донорних хромосом в хромосоми клітини-реципієнта. Для ідентифікації гібридів, які містять потрібні фрагменти ДНК донора, застосовують відповідні методи селекції. На жаль, вбудовані фрагменти хромосом найчастіше зазнають реорганізацію, крім того, є достовірні дані про найбільш зручною проникненні у клітину і послідовностей з центромірних областей. Ці недоліки не дозволяють використовувати CMGT для картування, хоча даний метод дуже ефективний для збагачення специфічними фрагментами хромосом - складової частини стратегії клонування, званої «зворотної генетикою». Госс і Харіс вперше показали, що фрагменти Х-хромосоми людини, що з'являються в його гамма-опроміненої клітці, можна зберегти при злитті цієї клітини з клітиною гризуна. Поглиблений аналіз методу IFGT показав, що отримані фрагменти реорганізовані і для них характерна та ж тенденція представляти Центромерна області, що і при CMGT.
Геномної ДНК можна ввести, додаючи її очищений препарат до реципієнтного клітинам. Ця процедура також дуже важлива для аналізу функціонування генів у клітинах ссавців. Розроблено три способи введення ДНК: преципитация з фосфатом кальцію, за допомогою ретровирусного вектора і мікроін'єкція. Ймовірно, для кожного з них існує граничний розмір фрагментів ДНК, які переносяться без пошкодження. Хоча цю гіпотезу не піддавали ретельній перевірці, швидше за все справа йде саме так. Фрагменти довжиною понад 100 тисяч пар основ навряд чи можна перенести без втрат, якщо це взагалі можливо. Метод DMGT крім функціональних досліджень використовують для випадкового вбудовування в геном селектіруемих генів і для клонування генів, при селекції яких необхідна експресія.
1. Загальні положення
1.1 Необхідні умови
Умови культивування клітин повинні забезпечувати їх максимальну життєздатність. Це особливо важливо для клітин, які використовуються в експерименті з перенесення, оскільки дана процедура припускає використання потенційно токсичних речовин, таких, наприклад, як поліетиленгліколь.
Успіх експериментів з генетичного переносу багато в чому визначається ефективністю посіву клітин-реципієнтів. Отже, ефективність посіву всіх клітинних ліній, які будуть використані в якості реципієнтів, повинна бути перевірена в умовах, аналогічних експериментальним. Лінії, що демонструють ефективність посіву менше 10%, не годяться на роль реципієнта.
Всі маніпуляції необхідно проводити в стерильних умовах і зі стерильними реагентами. Розчини слід готувати лише з реактивів, призначених для культивування клітин, обов'язково використовувати для цього бідистильовану воду.
1.2 Селекція
Мета селекції - надання певних переваг клітинам, необхідним експериментатору. Існують чотири групи методів селекції.
1.2.1 Біохімічна селекція, заснована на ендогенних генах
Найбільш широко поширений приклад такого підходу - НАТ-селекція. У присутності аміноптеріна інгібується синтез de novo попередників ДНК. Клітини, позбавлені ферменту тимідинкінази, не можуть утилізувати екзогенний тимідин і гинуть у присутності аміноптеріна. Аналогічно, клітини, позбавлені гіпоксантин-фосфорибозилтрансферази, не можуть засвоювати гіпоксантин і також нежиттєздатні у присутності аміноптеріна. Соматичні гібриди, отримані при злитті ТК -, НРКТ +-клітин-ток з клітинами ТК +, HPRT -, можуть виявитися одночасно ТК +, HPRT +. Гібридні клітини з таким генотипом здатні рости в присутності аміноптеріна, якщо гіпоксантин і тимідин додані в середу. Поширений варіант НАТ-методу, коли один партнер по гібридизації не може розмножуватися in vitro, а інший - є дефіцитним по ТК або HPRT. Для досліджень в галузі генетики соматичних клітин розроблено велику кількість систем комплементації. Багато з них засновані на використанні різних ауксотрофних і прототрофних клітинних ліній хом'ячків. Цей підхід вимагає створення відповідних мутантних клітин-реципієнтів.
Враховуючи важливість НАТ-селекції, ми пропонуємо увазі читачів керівництво з приготування відповідного середовища.
1.2.2 Біохімічна селекція, заснована на екзогенних генах
Цей підхід позбавляє нас від необхідності виділяти специфічний мутант, оскільки він має на увазі використання бактеріальних генів, які дають селективні переваги при їх експресії в клітинах ссавців. Для цього конструюють плазмідні і ретровірусних вектори, у яких бактеріальні гени поєднуються з промоторами, місцями сплайсингу і сигналами Поліаденілювання ссавців. Введення бактеріальних генів у клітини ссавців за допомогою трансфекції або інфекції призводить до їх випадковому розподілу в геномі реципієнта. Як приклад бактеріальних генів, здатних забезпечувати селективні переваги клітин ссавців, можна назвати ген Є. coli gpt і генлео. Основний недолік цього методу - випадковий розподіл сайтів інтеграції; проте останні дослідження дозволяють сподіватися, що за допомогою гомологічною рекомбінації вдасться здійснювати спрямовану інтеграцію.
1.2.3 Антигени клітинної поверхні
У ролі селективного фактора можуть виступати антитіла. При цьому ми отримуємо можливість виділяти клітини з певним набором антигенів клітинної поверхні. Застосування антитіл лежить в основі ряду методів, серед них відбір клітин за допомогою клітинного сортер, розеткоутворення з еритроцитами, пов'язаними антитілами, виборче прикріплення клітин до поверхні з іммобілізованими на ній антитілами. Хоча ефективність селекції клітин за допомогою антитіл недостатньо висока, тим не менш селекція з використанням антитіл застосовується у всіх методах перенесення генів, що описуються тут, за винятком MMGT.
1.2.4 Активовані онкогени
Мутовані протоонкогени, особливо члени сімейства ras-генів, забезпечують переваги в рості клітин ссавців і, отже, можуть бути використані для селекції.
2. Злиття цілих клітин
2.1 Вступ
Відомо, що при змішуванні клітин вони можуть спонтанно зливатися, проте подія це надзвичайно рідкісне. Ефективність злиття може бути істотно збільшена з допомогою специфічних антигенів. Спочатку для цієї мети використовували інактивований вірус Сендай, однак біологічна неоднорідність різних партій інактивованого вірусу і громіздкість процедури злиття, індукованого вірусом, привели до широкого використання хімічного індуктора-поліетиленгліколю. Метод, представлений нижче, придатний для злиття клітин як одного, так і різних видів тварин. Внутрішньовидові гібриди формуються з частотою 10 ~ 5-Ю -3. Частота злиття клітин різних видів варіює від 10 ~ 7 до 10 ~ 5. Клітини, які мають схожі фенотипи та близькі параметри росту, зливаються з більш високою частотою.
2.2 Отримання клітинних гібридів за допомогою злиття, індукованого ПЕГ
Таблиця 2. Основні розчини, необхідні для злиття клітин
| Середовище для росту клітин Середовище для росту клітин без ембріональної телячої сироватки | Зазвичай ми використовуємо середу Голка, модифіковану Дульбекко, з додаванням ембріональної телячої сироватки, однак склад культурального середовища прямо на процес злиття не впливає |
| Селективна середу | Культуральна середа, придатна для селекції гібридних клітин |
| 50%-ний розчин ПЕГ, приготований в бессивороточной середовищі | 5,5 г ПЕГ 4000 н 5 мл бессивороточной середовища змішують і авто-клавіру. Кінцевий рН доводять до 8,2, розчин нагрівають до 37 ° С безпосередньо перед використанням |
2.3 Можливі помилки та варіанти методики
Деякі лінії клітин зливаються з працею, якщо ж все-таки необхідні саме такі комбінації, спробуйте зробити наступне.
1. Варіюйте співвідношення батьківських клітин в діапазоні 1:10-10:1.
2. Спробуйте різний ПЕГ:
а) поміняйте партію ПЕГ. У наших експериментах та партія ПЕГ, яка давала гарні результати при злитті одного типу клітин, ефективно працювала і з іншими. Добре зарекомендував себе препарат необхідно відокремити й зберігати. За деякими даними властивості ПЕГ можуть бути поліпшені використанням розчинів, що не містять солей кальцію;
б) варіюйте молекулярний вагу. Як правило, підвищення молекулярного ваги тягне за собою збільшення здатності індукувати злиття. Однак розчин ПЕГ з великою молекулярною вагою володіє більшою в'язкістю, що ускладнює відмивання клітин. Так як ПЕГ є
Для кожної конкретної клітинної лінії необхідно підібрати оптимальну концентрацію колцеміда і час експозиції. Освіта міні-клітин легко контролюється під фазово-контрастним мікроскопом. У вдалих експериментах близько 50% всіх клітин утворюють міні-клітини. Ця частота збільшується після обробки цітохала-зіном В.
Другий день
3. Через 16 год замініть середу на середовище, що містить цітоха-Лазініо В в концентрації 2 мкг / мл; інкубують протягом ночі.
4. Вихідні градієнтні розчини помістіть у посудини з нещільно загвинченими кришкою та інкубують в атмосфері 5% СОГ при 37 ° С протягом ночі.
5. Заздалегідь нагрівайте ротор SW41.
Третій день
6. Приготування ступеневої градієнта фіколл. Ретельно промийте необхідну кількість центріфужний пробірок для ротора SW41 абсолютним спиртом, висушіть у перевернутому положенні в ламінарному боксі. Приготуйте градієнт фіколл, використовуючи урівноважені вихідні розчини.
7. Зберіть оброблені колцемідом і цітохалазіном клітини і облоги їх центрифугуванням. Ресуспендіруйте в 3 мл 10%-ного фіколл і м'яко нашарувати на градієнт. Заповніть центрифужні пробірки розчином без фіколл.
8. Помістіть пробірки, що містять градієнт, у нагрітий ротор SW41 і поставте ротор в заздалегідь нагріту до 37 ° С ультрацентрифугу.
9. Центрифугують 1 год при 25000 об / хв при 37 ° С; використовуйте мінімальне прискорення при розгоні і мінімальне гальмування, щоб запобігти руйнуванню градієнта.
10. Вийміть пробірки з центрифуги. Міні-клітини утворюють пухкі смужки в градієнті між 15:16% і 16:17% фіколл. Обережно відберіть ці смужки, використовуючи стерильну пастерівською піпетку, вводячи її через верх градієнта; помістіть міні-клітини в нову, стерильну центрифужну пробірку від ротора SW41 і заповніть її середовищем для зростання клітин. Забруднення фрагментами цитоплазми, ядрами і цілими клітинами можна контролювати під фазово-контрастним мікроскопом.
11. Центрифугують при 20 000 об / хв при кімнатній температурі в роторі SW41 10 хв при максимальному прискоренні і гальмуванні. Ця процедура тримає в облозі міні-клітини і відокремлює їх від фіколл.
12. Для подальшої очистки міні-клітин ми пропонуємо три різних прийому. Очищення не потрібна, лише коли у розпорядженні дослідників є чітка система селекції. У цьому випадку вони можуть відразу використовувати міні-клітини для злиття з клітинами-реципієнтами.
13. Злиття міні-клітин з цілими клітинами. Зберіть клітини-реципієнти і отмойте їх бессивороточной середовищем. Додайте приблизно 10 7 клітин-реципієнтів до осаду міні-клітин в 2 мл бессивороточной ростової середовища, що містить 100 мкг / мл фітогемагглютиніну. Помістіть в пластиковий посудину з конічним дном і інкубують 10 хв при 37 ° С.
14. Осадити центрифугуванням.
15. Процедуру злиття міні-клітин з цілими клітинами проводите за допомогою ПЕГ, як зазначено у відповідній методиці.
3. Перенесення генів, опосередкований хромосомами JCMGTJ
3.1 Вступ
Метод CMGT може бути використаний для переносу фрагментів хромосом з ядер клітин одного типу в ядра клітин іншого типу. Теоретично клітини будь-якого типу можуть бути використані як в якості донорів, так і в якості реципієнтів хромосом. Однак на практиці можливість застосування методу визначається наявністю відповідних реципієнтного ліній, що володіють підвищеною здатністю акцептувати чужорідну ДНК.
Висока частота трансфекції може бути досягнута при використанні як реципієнтів імморталізованних мишачих клітин. Клітинам хом'ячка і імморталізованним людських клітин зазвичай властива більш низька частота трансфекції. Правда, недавно отримані результати свідчать про те, що людські клітини лінії EJ здатні трансфіціроваться з високою частотою. У ролі донора з однаковим успіхом можуть виступати найрізноманітніші клітинні лінії - як суспензійні, так і субстрат-залежні. Переважно використовувати в якості донорних ті лінії, клітини яких легше культивувати і отримувати у великих кількостях. Нижче описуються загальні процедури, що забезпечують виділення донорних хромосом і перенесення фрагментів цих хромосом в реципієнтного клітини шляхом CMGT.
3.2 Виділення хромосом
У ході описуваних процедур для запобігання втрат і поломок хромосом, для забезпечення температурного режиму необхідно використовувати пластикові піпетки і пробірки. Клітини блокують на стадії мітозу, мітотичний хромосоми вивільняють впливом гіпотонічного шоку і гомогенізацією. Хромосоми очищають диференціальним центрифугуванням.
Таблиця. Вихідні розчини на CMGT
| Середовище для росту клітин і селективна середу | NB. Трансфекції необхідно проводити в середовищах з невеликим вмістом фосфатів, таких, як DMEM. Клітини, які ростуть в середовищах, збагачених фосфатами, безпосередньо перед проведенням трансфекції пересів на середу, бідну фосфатами. Середовища, збагачені фосфатами, можна використовувати при гліцериновому шоці |
| Гіпотонічний розчин | 10 мМ Hepes 3 мМ хлориду кальцію |
| Розчин для трансфекції | 25 мМ Hepes 134 мМ хлориду натрію 5 мМ хлориду калію 0,7 мМ дигідрофосфату натрію 5 мМ глюкози |
| 1,25 М хлориду кальцію Розчин для відмивання | 25 мМ Hepes 134 мМ хлориду натрію 5 мМ хлориду калію 0,7 мМ дигідрофосфату натрію |
3.3 Перенесення хромосом
Процес перенесення хромосом в цьому випадку дуже нагадує описуваний в методі DMGT. Хромосоми осаджують на поверхні клітин хлоридом кальцію, і через кілька годин клітини обробляють реагентом, здатним перфорувати мембрани. Тут теж важливо використовувати пластикові пробірки і піпетки. Послідовність дій, яка наведена нижче, розроблена Нельсоном.
1. За день перед проведенням трансфекції висейте по 5Х Х10 5 клітин на 10 чашок діаметром 9 см. Використовуйте низькофосфатної середу, наприклад DMEM.
2. Ресуспендіруйте 10 серпня хромосом в 9 мл розчину для трансфекції.
3. Повільно додайте до хромосомам 1 мл 1,25 М розчину СаС1 2, одночасно продуваючи повітря через суспензію хромосом.
4. Інкубують 20-30 хв при кімнатній температурі для: освіти суміші фосфат кальцію - ДНК.
5. Додайте по 1 мл цієї суміші до середовища в кожну чашку з реципієнтного клітинами. Інкубують клітини з хромосомами 4-6 год у зволожуючому інкубаторі при 37 ° С.
6. Видаліть середовище і додайте 10 мл отмивочного розчину.
7. Видаліть отмивочний розчин і обробіть клітини 1 мл середовища для гліцеринового шоку протягом 4 хв при кімнатній температурі.
8. Отмойте клітини 3 рази розчином для промивання та інкубують протягом ночі в неселективною середовищі для росту клітин.
9. Через 24 год поміняйте середу на селективну. Міняйте середу на свіжу кожні 3-4 дні.
10. Колонії з'являться на 14-21-й день.
3.4 Попередня селекція
При використанні DMGT донорно геномна ДНК зазвичай переноситься разом з плазміди, що кодує домінантний селективний маркер. Попередня селекція, що виявляє включення плазмідної ДНК, дозволяє отримати 100-кратне збагачення клітинами, які містять цікавий для нас клітинний ген. Аналогічний прийом може бути використаний і в CMGT. Для проведення котрансфекціі необхідну кількість плазмідної ДНК додають до суспензії хромосом перед преципітацією хлоридом кальцію. Зазвичай ми додаємо плазмідну ДНК у кількості, достатній для досягнення співвідношення 20:1. Селекцію проводимо спут 24 год після хромосомної трансфекції.
3.5 Можливі помилки та варіанти методики
У літературі описано безліч методів виділення хромосом з клітин, блокованих у метафазі. Процедури очищення теж різноманітні. Одні з них дозволяють отримати високоочищені препарати, інші-грубу фракцію хромосом, забруднену різними компонентами клітини. Ми вважаємо за краще використовувати для проведення трансфекції саме такі грубі препарати, по-перше, тому що їх отримання займає мало часу, а по-друге, тому що хромосоми при цьому виявляються найменш зруйнованими.
Аналіз, проведений Льюїсом, показав, що існує лінійна залежність частоти CMGT-трансфекції від дози донорних хромосом. У більшості наступних експериментів дослідники намагалися ввести в клітину як можна більше хромосом. Однак на практиці кількість хромосом, яку можна отримати, обмежена. Основна перешкода у використанні дуже великої кількості донорних клітин - це висока в'язкість суспензії хромосом, яка сприяє їх аглютинації. Ось чому ми додаємо не більше 20 хромосом на одну реципієнтного клітку. Крім механічного впливу для отримання препарату хромосом можна застосовувати і хімічну обробку, включаючи використання м'яких детергентів, таких, як дигітоніну.
Виходячи з нашого досвіду, можна зробити висновок, що результати трансфекції відтворювані. У деяких випадках може виявитися необхідним оптимізувати умови «шоку», варіюючи концентрацію гліцерину і час інкубації. Обговорення способу трансфекції за допомогою осадження фосфатом кальцій наводиться в розд. 6.
При використанні методу CM.GT утворюються реципієнтного клітини, що містять фрагменти донорних хромосом: в деяких випадках вони вбудовуються в геном реципієнта, іноді реплицируются самостійно. Неможливо виділити параметр, що контролює розміри переданого фрагмента, і в більшості експериментів виходять клони, що містять донорний матеріал в широкому діапазоні. Ми детально аналізували введені фрагменти у всіх випадках. У них спостерігалися перебудови: це або внутрішні делеції, або переобогащение альфоіднимі послідовностями з області центромери. Внутрішні делеції описані також іншими авторами.
4. Перенесення генів, опосередкований ДНК
4.1 Вступ
В даний час розроблено велику кількість методів для введення клонованих послідовностей ДНК в клітини ссавців. Серед них преципитация фосфатом кальцію або DEAE-декстраном, електропробой, використання інактивованих вірусів і злиття прокаріотичних і дріжджових протопластів з клітинами ссавців. Найбільш широке поширення отримала преципитация фосфатом кальцію. Точний механізм захоплення ДНК, її включення в реципієнтного клітку незрозумілий, проте відомо, що лише невелика кількість клітин у культурі реципієнтів включають ДНК. За аналогією з бактеріальною генетикою ці клітини отримали назву «компетентних». Кількість включається ДНК - найважливіша характеристика використовуваної клітинної лінії. Мишачі L-клітини включають кілька мільйонів пар основ екзогенної ДНК, людські фібробласти - тільки частина цієї кількості. Було проведено кілька експериментів з виявлення максимальних розмірів ДНК, що передається непошкодженою. Зазвичай не вдається перенести інтактну ДНК, розміри якої перевищують 100 т. п. н. Невідомо, чи залежить це від властивостей клітин-реципієнтів або визначається труднощами в отриманні таких великих фрагментів ДНК інтактними. Недавні успіхи в отриманні високомолекулярних фрагментів ДНК дозволяють проаналізувати обидва ці варіанти.
4.2 трансфекції ДНК з використанням фосфату кальцію
Таблиця. Розчини для DMGT
4.3 Спільний перенесення і попередня селекція
Відомо, що компетентні клітини здатні включати велику кількість донорной ДНК, причому одна реципієнтного клітина може включати кілька різних молекул донорной ДНК в один геномний сайт. Цей феномен дозволяє виділяти компетентні субпопуляції із загальної маси реципієнтного клітин і маркувати геном ссавців. Якщо донорно ДНК змішана з плазмідної, що кодує селективний для клітин ссавців маркер, селекція за плазмідної гену після трансфекції дозволяє виділити популяцію трансфіцірованних клітин. Таке збагачення полегшує подальше очищення реципієнтного клітин. Цей прийом виявився успішним при клонуванні генів, що кодують клітинні поверхневі антигени. У даному випадку для збагачення використовували антитіла, а для поділу субпопуляцій клітин флуоресцентний сортер.
У реципієнтного клітинах ДНК плазміди, що містить селективний маркер, лигируется із донорною геномної ДНК. Це призводить до «маркуванню» послідовності ДНК клітини ссавця і може спростити виділення донорного гена після декількох повторних трансфекції.
У дослідах з котрансфекціі ми використовували суміш з 1 мкг плазмідної і 20 мкг геномної ДНК. Суміш готували безпосередньо перед додаванням хлориду кальцію.
4.4 Можливі помилки та варіанти методики
Не всі клітини здатні до трансфекції геномної ДНК з високою частотою. Одні клітини взагалі не трансфіціруются, інші, наприклад людські фібробласти, здатні ефективно включати плазмідну ДНК і майже не включати геномної ДНК - Мишині L-клітини мають здатність до трансфекції геномної ДНК з високою частотою і можуть бути використані в якості позитивного контролю в експериментах по трансфекції ДНК новими клітинними лініями. Можливо, що альтернативні способи прямого включення геномної ДНК, такі, як електропробой або ліпосомних перенесення, зможуть розширити список клітинних ліній, здатних до трансфекції. На противагу загальноприйнятій думці ми отримували хороші результати по трансфекції L-клітин, використовуючи преципітацію, при якій утворювався осад як у вигляді слабо опалесцентний суспензії, так і у формі агрегатів. Тим не менш, звичайно, переважно дотримуватися умови, при яких формується гомогенний осад.
Гліцериновий шок збільшує частоту трансфекції в 2 - 5 разів. Оптимальні умови проведення шоку для різних клітин варіюють. У кожному новому випадку необхідно підбирати як концентрацію гліцерину, так і час інкубації.
Процес перенесення хромосом в цьому випадку дуже нагадує описуваний в методі DMGT. Хромосоми осаджують на поверхні клітин хлоридом кальцію, і через кілька годин клітини обробляють реагентом, здатним перфорувати мембрани. Тут теж важливо використовувати пластикові пробірки і піпетки. Послідовність дій, яка наведена нижче, розроблена Нельсоном.
1. За день перед проведенням трансфекції висейте по 5Х Х10 5 клітин на 10 чашок діаметром 9 см. Використовуйте низькофосфатної середу, наприклад DMEM.
2. Ресуспендіруйте 10 серпня хромосом в 9 мл розчину для трансфекції.
3. Повільно додайте до хромосомам 1 мл 1,25 М розчину СаС1 2, одночасно продуваючи повітря через суспензію хромосом.
4. Інкубують 20-30 хв при кімнатній температурі для: освіти суміші фосфат кальцію - ДНК.
5. Додайте по 1 мл цієї суміші до середовища в кожну чашку з реципієнтного клітинами. Інкубують клітини з хромосомами 4-6 год у зволожуючому інкубаторі при 37 ° С.
6. Видаліть середовище і додайте 10 мл отмивочного розчину.
7. Видаліть отмивочний розчин і обробіть клітини 1 мл середовища для гліцеринового шоку протягом 4 хв при кімнатній температурі.
8. Отмойте клітини 3 рази розчином для промивання та інкубують протягом ночі в неселективною середовищі для росту клітин.
9. Через 24 год поміняйте середу на селективну. Міняйте середу на свіжу кожні 3-4 дні.
10. Колонії з'являться на 14-21-й день.
3.4 Попередня селекція
При використанні DMGT донорно геномна ДНК зазвичай переноситься разом з плазміди, що кодує домінантний селективний маркер. Попередня селекція, що виявляє включення плазмідної ДНК, дозволяє отримати 100-кратне збагачення клітинами, які містять цікавий для нас клітинний ген. Аналогічний прийом може бути використаний і в CMGT. Для проведення котрансфекціі необхідну кількість плазмідної ДНК додають до суспензії хромосом перед преципітацією хлоридом кальцію. Зазвичай ми додаємо плазмідну ДНК у кількості, достатній для досягнення співвідношення 20:1. Селекцію проводимо спут 24 год після хромосомної трансфекції.
3.5 Можливі помилки та варіанти методики
У літературі описано безліч методів виділення хромосом з клітин, блокованих у метафазі. Процедури очищення теж різноманітні. Одні з них дозволяють отримати високоочищені препарати, інші-грубу фракцію хромосом, забруднену різними компонентами клітини. Ми вважаємо за краще використовувати для проведення трансфекції саме такі грубі препарати, по-перше, тому що їх отримання займає мало часу, а по-друге, тому що хромосоми при цьому виявляються найменш зруйнованими.
Аналіз, проведений Льюїсом, показав, що існує лінійна залежність частоти CMGT-трансфекції від дози донорних хромосом. У більшості наступних експериментів дослідники намагалися ввести в клітину як можна більше хромосом. Однак на практиці кількість хромосом, яку можна отримати, обмежена. Основна перешкода у використанні дуже великої кількості донорних клітин - це висока в'язкість суспензії хромосом, яка сприяє їх аглютинації. Ось чому ми додаємо не більше 20 хромосом на одну реципієнтного клітку. Крім механічного впливу для отримання препарату хромосом можна застосовувати і хімічну обробку, включаючи використання м'яких детергентів, таких, як дигітоніну.
Виходячи з нашого досвіду, можна зробити висновок, що результати трансфекції відтворювані. У деяких випадках може виявитися необхідним оптимізувати умови «шоку», варіюючи концентрацію гліцерину і час інкубації. Обговорення способу трансфекції за допомогою осадження фосфатом кальцій наводиться в розд. 6.
При використанні методу CM.GT утворюються реципієнтного клітини, що містять фрагменти донорних хромосом: в деяких випадках вони вбудовуються в геном реципієнта, іноді реплицируются самостійно. Неможливо виділити параметр, що контролює розміри переданого фрагмента, і в більшості експериментів виходять клони, що містять донорний матеріал в широкому діапазоні. Ми детально аналізували введені фрагменти у всіх випадках. У них спостерігалися перебудови: це або внутрішні делеції, або переобогащение альфоіднимі послідовностями з області центромери. Внутрішні делеції описані також іншими авторами.
4. Перенесення генів, опосередкований ДНК
4.1 Вступ
В даний час розроблено велику кількість методів для введення клонованих послідовностей ДНК в клітини ссавців. Серед них преципитация фосфатом кальцію або DEAE-декстраном, електропробой, використання інактивованих вірусів і злиття прокаріотичних і дріжджових протопластів з клітинами ссавців. Найбільш широке поширення отримала преципитация фосфатом кальцію. Точний механізм захоплення ДНК, її включення в реципієнтного клітку незрозумілий, проте відомо, що лише невелика кількість клітин у культурі реципієнтів включають ДНК. За аналогією з бактеріальною генетикою ці клітини отримали назву «компетентних». Кількість включається ДНК - найважливіша характеристика використовуваної клітинної лінії. Мишачі L-клітини включають кілька мільйонів пар основ екзогенної ДНК, людські фібробласти - тільки частина цієї кількості. Було проведено кілька експериментів з виявлення максимальних розмірів ДНК, що передається непошкодженою. Зазвичай не вдається перенести інтактну ДНК, розміри якої перевищують 100 т. п. н. Невідомо, чи залежить це від властивостей клітин-реципієнтів або визначається труднощами в отриманні таких великих фрагментів ДНК інтактними. Недавні успіхи в отриманні високомолекулярних фрагментів ДНК дозволяють проаналізувати обидва ці варіанти.
4.2 трансфекції ДНК з використанням фосфату кальцію
Таблиця. Розчини для DMGT
| Середовище для росту клітин | Використовуйте низькофосфатної середовище для росту |
| клітин, таку, як DMEM | |
| Селективна середу | |
| 2хНерее-буфер | рН дуже важливий і повинен бути перевірений, якщо |
| розчин тривало зберігався | |
| рН 7,1 ± 0,05 | 50 мМ Hepes |
| 290 мМ хлориду натрня | |
| 1,5 мМ фосфату натрію (рівна кількість гідро- | |
| і дигідрофосфату) | |
| 1XHBS | 25 мМ Hepes |
| 145 мМ хлориду натрію | |
| 0,75 мМ фосфату натрію (рівна кількість гідро- | |
| 1,25 М хлорид кальцію | і дигідрофосфату) |
| Розчин для гліцерин- | 15% гліцерину в 1XHBS |
| вого шоку |
Відомо, що компетентні клітини здатні включати велику кількість донорной ДНК, причому одна реципієнтного клітина може включати кілька різних молекул донорной ДНК в один геномний сайт. Цей феномен дозволяє виділяти компетентні субпопуляції із загальної маси реципієнтного клітин і маркувати геном ссавців. Якщо донорно ДНК змішана з плазмідної, що кодує селективний для клітин ссавців маркер, селекція за плазмідної гену після трансфекції дозволяє виділити популяцію трансфіцірованних клітин. Таке збагачення полегшує подальше очищення реципієнтного клітин. Цей прийом виявився успішним при клонуванні генів, що кодують клітинні поверхневі антигени. У даному випадку для збагачення використовували антитіла, а для поділу субпопуляцій клітин флуоресцентний сортер.
У реципієнтного клітинах ДНК плазміди, що містить селективний маркер, лигируется із донорною геномної ДНК. Це призводить до «маркуванню» послідовності ДНК клітини ссавця і може спростити виділення донорного гена після декількох повторних трансфекції.
У дослідах з котрансфекціі ми використовували суміш з 1 мкг плазмідної і 20 мкг геномної ДНК. Суміш готували безпосередньо перед додаванням хлориду кальцію.
4.4 Можливі помилки та варіанти методики
Не всі клітини здатні до трансфекції геномної ДНК з високою частотою. Одні клітини взагалі не трансфіціруются, інші, наприклад людські фібробласти, здатні ефективно включати плазмідну ДНК і майже не включати геномної ДНК - Мишині L-клітини мають здатність до трансфекції геномної ДНК з високою частотою і можуть бути використані в якості позитивного контролю в експериментах по трансфекції ДНК новими клітинними лініями. Можливо, що альтернативні способи прямого включення геномної ДНК, такі, як електропробой або ліпосомних перенесення, зможуть розширити список клітинних ліній, здатних до трансфекції. На противагу загальноприйнятій думці ми отримували хороші результати по трансфекції L-клітин, використовуючи преципітацію, при якій утворювався осад як у вигляді слабо опалесцентний суспензії, так і у формі агрегатів. Тим не менш, звичайно, переважно дотримуватися умови, при яких формується гомогенний осад.
Гліцериновий шок збільшує частоту трансфекції в 2 - 5 разів. Оптимальні умови проведення шоку для різних клітин варіюють. У кожному новому випадку необхідно підбирати як концентрацію гліцерину, так і час інкубації.