Ймовірні функції білків, що синтезуються при гіпотермії
Є відносно мало даних про природу і функції білків, синтез яких стимулюється гіпотермії. У більшості робіт показана тільки кореляція процесу загартовування до холоду з синтезом білка. У той же час ця кореляція дозволяє припускати важливу роль білків у формуванні загартованого стану рослини. Передбачається, що одним з неодмінних чинників, потрібних для індукції морозостійкості озимого жита, є посилене утворення протоплазми і клітинних мембран.
У ряді робіт показано вплив генів, локалізованих в певних хромосомах ядра, на активність мітохондрій при гіпотермії. Було встановлено, що охолодження морозостійких рослин озимих злаків викликає значні зміни в інтенсивності роботи дихального ланцюга мітохондрій і в ступені спряженості процесів окислення і фосфорилювання. Згодом був показаний ядерний контроль за проявом цієї ознаки, оскільки введення в малохолодоустойчівий генотип озимої пшениці хромосом з Х-геному високоморозоустойчівого пирію супроводжувалося реакцією мітохондрій на охолодження, типово для високоморозостойкіх форм, тобто швидким переходом мітохондрій в низькоенергетичне стан. Заміна ж хромосом Х-геному пирію на хромосоми пирейно D-геному в клітинах пшенично-пирейно гібрида уповільнювала цю реакцію мітохондрій на охолодження. Дослідження, проведені на мітохондріях 43 хромосомних лини показали, що гени, які контролюють даний ознака мітохондрії, локалізовані, ймовірно, у двох хромосомах Х-геному. Вивчення ліній з міжсортових заміщенням хромосом, при якому всі пари хромосом D-геному, а також деякі хромосоми А-і В-геномів озимої пшениці Безоста 1 були заміщені на відповідні пари хромосом високоморозоустойчівой пшениці сорту Альбідум 114, показало, що тільки дві хромосоми геному пшениці Альбідум 114 контролюють енергетичну активність мітохондрій при гіпотермії. Таким чином, оскільки, як показано вище, блокування цитоплазматичного синтезу білка не дозволяє пере ти мітохондрій при гіпотермії в низькоенергетичне стан, можна висунути припущення, що ядро за допомогою зміни синтезу білків бере участь у регуляції мітохондріальної активності при гіпотермії.
Дегідріни і ABA - регульовані білки
Останнім часом великий інтерес дослідника привертає вивчення змін у синтезі дегідрінов під дією холодового акліматизації. Зміна транскрипції генів білків LEA, RAB і DHN було спочатку зазначено за дії водного стресу і після обробки рослин абсцизової кислотою. Всі ці групи білків характеризуються високою гідрофільністю білкової молекули. Під час зневоднення клітини під дією водного стресу ці білки за рахунок своє високо гідрофільності перешкоджають втратою клітиною води і стабілізують клітинні білки. Згодом було виявлено, що синтез цих білків посилюється і під час холодової акліматизації. Дегідріни при цьому, мабуть, перешкоджають утворенню льоду в клітинах і також стабілізують клітинні білки.
Серед білків, що накопичуються в рослинах у відповідь на обезводнювання вплив або дія низьких температур, найбільш інтенсивно досліджуються дегідріни сімейства LEA D II. Дегідріни складаються з різних типових для білків даного виду доменів, що з'єднуються в кілька найбільш поширених варіантів поліпептидів, а також численних рідко зустрічаються варіацій. Ці домени включають в себе один або більше невеликих регіонів альфаспіралей амфіпатічних залишків, залишки серину і N-термінальну послідовність. До цих пір невідомі всі біохімічні функції дегідрінов, але значне число досліджень, присвячених з'ясуванню локалізації дегідрінов в клітці за допомогою клітинного фракціонування та іммунолокалізаціі, встановили, що дегідріни можуть локалізуватися і в ядрі, і в цитоплазмі. Більш того, отримані дані показують, що цей клас білків асоціюється з макромолекулами нуклеопротеїнових комплексу в ядрі і з мембранами цитоплазми. На даний момент вважають, що дегідріни є чинниками, що запобігають коагуляцію ряду макромолекул, зберігаючи їх структурну єдність під час стресового впливу.
При дослідженні відповідають на охолодження дегідрінов ожини було встановлено, що обробка низькими температурами закаливающими викликає холодову акліматизацію рослин, а також накопичення трьох дегідріноподобних білків з молекулярними масами 65, 60 і 14 кДа. Денситометрія гелів показала тісний взаємозв'язок між змістом дегідрінов і ступенем холодової гарту всіх трьох досліджених сортів ожини. Автори роблять висновок, що зміни в експресії дегідрінов більш тісно пов'язані з холодовим загартовуванням, ніж зі станом спокою рослини.
Поліпшене відновлення проморожені меристем і калюсів смородини було отримано після 2 години попередньо обробки в сахарозі, проліну, RAB - білках, або бичачому альбуміном. Двогодинне занурення в 0.4 M RIB-SM до проморожування істотно поліпшило відростання меристеми у порівнянні з 0, 1, 3 і 4 годинниковим зануренням. Двогодинне занурення меристем в 5 і 10% пролін, розчинений в 0.4 M RIB-SM, значно поліпшило відростання після проморожування. А первинні тест з екстрактами сирого RAB P з насіння пшениці показав, що відростання проморожені апікальних меристем смородини поліпшується після 2 години попередньо обробки зануренням з максимумом виживання в 1% RAB P. RAB P препарати, що містять еквівалентні білки, мали аналогічну дію на відростання, що вказує на те, що ефект залежав від присутності білків, а не цукрів і інших вуглеводів в сирих екстрактах RAB P. Аналогічні результати показують меристеми і каллус, попередньо оброблені 5 або 10% пролином, 1% розчином RAB P або 1% БСА в 0.4 M розчині сахарози. Попередньо оброблені меристеми продовжили приріст через 3 дні після зігрівання і досягли максимуму відростання через 1 тиждень, порівняно з 2 тижнями для попередньо необробленого контролю.
При дослідженні дії короткого дня на Betula pubescens було встановлено, що в доповненні до різних конститутивний синтезується дегідрінам на короткому дні виявлялися два специфічних поліпептиду з молекулярними масами 34 і 36 кДа.
З бібліотеки кДНК, отриманої з коріння сходів проростків Triticum durum, підданих водного стресу, були охарактеризовані чотири клону дегідрінов. Два з них, ptd27e і ptd16, кодують білки з класичними характеристиками дегідрінов, тобто консенсусним мотивом KIKEKLPG, який присутній за межами послідовності серинових залишків у карбоксильного кінця. Білки, що кодуються Tddhn15 і Tddhn16, мають схожість з послідовностями білків Triticum aestivum. Клони ptd25a і ptd38 кодують дегідріни, які не мають послідовності серинових залишків і володіють схожістю послідовності з Cor - білками T. aestivum. Щоб скоррелировать стійкість T. durum до посухи з експресією генів дегідрінов, для чотирьох сортів було проведено порівняння накопичення транскриптів дегідрінов в коренях і пагонах сходів у відповідь на водний стрес і екзогенну абсцизової кислоти. Дослідження дії водного стресу в часі показало, що накопичення транскриптів дегідрінов запізнюється в посухостійких сортах. При цьому рівень акумульованих транскриптів був вищим у посухостійких, ніж у засухочувствітельних сортах. Аналогічні результати був відзначені після обробки екзогенно абсцизової кислотою.
Роль такого гормону, як Абсцизова кислота і стійкості рослин до низьких температур вивчалася у Arabidopsis шляхом використання мутантів, у яких був змінений або біосинтез, або режим де ствия даного гормону. Різні мутанти використовувалися для аналізу ролі ABA у розвитку і проростання насіння і стійкості до стресу. Мутанти були виділені премущественно за зміненими характеристиками проростання і росту проростків. Ген зеаксантінепоксідази, кодованих геном aba1, клонованих за гомології з геном Nicotiana plumbaginifolia, блокованим на той же биосинтетической щаблі. При цьому були виявлені біохімічні пошкодження мутантів aba1, aba2 і aba3. ABA-нечутливі мутанти також мають фенотип, на який впливають різні ABA-залежні процеси і, таким чином, дозволяють припускати, що вони або кодують ранні щаблі в передачі сигналу ABA, або вони впливають на специфічні щаблі. Гени abi1 і abi2 кодують фермент протеїнфосфатаз 2c і ген abi3 кодує фактор транскрипції із специфічною експресією в насінні. Гіперчутливою до абсцизової кислоти мутант era1 має порушення в фарнезілтрансферазе.
У два рази було покращено відновлення кріоконсервованих in vitro решт пагонів берези повисло за допомогою включення абсцизової кислоти у культуральне середовище під час холодового загартовування материнських пагонів. Рівень відновлення решт пагонів після холодового загартовування протягом 28 дні при +5 0 C в 8 / 16 годинному фотоперіоду на середовищі, содержавше 10 -4 M абсцизової кислоти становив понад 40%. Абсцизова кислота була ефективно тільки в поєднанні з низько температурою і коротко довжиною дня, хоча в ході експериментів і були відзначені великі генотипічну відмінності. Абсцизова кислота мала два різних варіанти впливу: посилення холодової загартованості і посилення формування калюсу під час регенерації кріоконсервованих решт пагонів.
Білки, що перешкоджають льодоутворення
Однією з функцій білків, що синтезуються в рослинах при гіпотермії, зокрема, при дії негативних температур, є перешкоджання процесу льодоутворення. Хоча, як було зазначено вище, в основному зниження температури початку льодоутворення відбувається за рахунок накопичення в рослинній клітині цукрів у результаті посилення синтезу і підвищення активності відповідних ферментів, в рослинних клітинах при гіпотермії відбувається також і синтез специфічних білків, які безпосередньо впливають на температуру початку льодоутворення і зростання крижаних кристалів.
Здатність контролювати позаклітинне утворення льоду під час заморожування є критичною для виживання толерантних до заморожування рослин. Антифризного білки, які є білками, здібними гальмувати зростання кристалів льоду, нещодавно були ототожнені як найпоширеніші апопластного білки в листі акліматизований до холоду озимого жита. Порівняння аміно-термінальних послідовностей, імуно-перехресної реактивності і ферментативної активності показали, що ці антифризного білки схожі з членами трьох класів білків, що відносяться до патогенезу, а саме, з ендохітіназамі, ендо-бета-1,3 - глюканазу і тауматин-подібними білками . Апопластного ендохітінази і ендо-бета-1 ,3-глюканазу сильно індукуються патогенами в чутливому до заморожування тютюні і не володіють антифризного активністю. Отримані дані дозволяють пропонувати, що в патогенез-пов'язаних білках могли розвинутися тонкі структурні відмінності, які дозволили цих білків отримати можливість зв'язуватися з льодом.
У листі озимого жита спостерігався синтез білка, що виділяється ендогенно і що виділяється в вакуолі і міжклітинний простір, який значно змінював картину зростання крижаних кристалів і знижував температуру замерзання розчину. Надалі цими ж авторами з апопласта листя озимого жита були виділені шість антифризного білків, що володіють здатністю абсорбуватися на поверхні льоду і пригнічувати зростання кристалів. Антифризного білки жита накопичувалися під час холодової акліматизації і подібні з рослинними білками, пов'язаними з патогенезом, включаючи два ендоглюканазоподобних, два хітіназоподобних і два тауматінподобних білка. Іммунолокалізація ендоглюканазоподобних білків показала, що вони накопичуються на міжклітинної поверхні клітинних стінок мезофілу, в опектіненних районах, у вторинних клітинних стінках ксілемних судин і в епідермальних клітинних стінках. Оскільки антифризного білки жита локалізовані в місцях, де можливий їх контакт з льодом, вони можуть виконувати функцію бар'єру на шляху поширення льоду або придушувати рекристалізацію льоду. Антифризного білки, схожі з патогенез-зв'язаними білками, були також виявлені в інших видах триби Triticae, але не у морозостійких дводольних рослин. Було встановлено, що у озимої пшениці накопичення антифризного білків і розвиток холодостійкості регулюються п'ятого хромосомою.
Синтез значної кількості апопластного білків з молекулярними масами від 15 до 109 кДа спостерігався в процесі підвищення морозостійкості озимого жита. Для визначення того, чи є накопичення цих антифризного білків загальним явищем для трав'янистих рослин, були досліджені антифризного активність і загальний вміст білка в екстракті апопласта листя ряду видів рослин, що ростуть при низьких температурах, включаючи як однодольні, так і дводольні. Білки апопласта поділялися SDS-ПААГ електрофорезом і з допомогою иммуноблоттинга визначалося, чи дійсно рослини відповідають на низькі температури накопиченням білків, пов'язаних з патогенезом. Отримані результати показують, що значні рівень антифризного активності був присутній тільки в апопласте морозостійких однодольних рослин після холодової акліматизації при 5,2 0 С. Більш того, під час холодової акліматизації тільки тісно пов'язана група рослин - жито, пшениця і ячмінь - накопичували антифризного білки, подібні з пов'язаними з патогенезом білками. При цьому накопичення антифризного білків є специфічною відповіддю, який може бути скоріше важливий у холодостійкості деяких видів рослин, ніж як спільні відповідь всіх рослин на низькотемпературного стресу.
Два антифризного білка жита з молекулярними масами 32 і 35 кДа аналогічні в їх амінокислотних послідовностях та епітопів бета - 1,3 - ендоглюканазе. Локалізація цих антифризного білків, які були позначені як глюканазоподобние білки, була встановлена з використанням імунної сироватки, отриманої проти антифризного білка 32 кДа. Іммуноелектронная мікроскопія високої роздільної здатності листя акліматизованих до холоду рослин виявила високий вміст GLP у стінках клітин мезофілу, в стінках клітин, суміжних з міжклітинними просторами, і в другорядних судинах ксилеми. Враховуючи відсутність GLP у вакуолях, ці результати підтверджують накопичення апопластного антифризного білків у акліматизованих до холоду рослинах озимого жита. У межах клітини GLP локалізувалися в цистернах шорсткого ендоплазматичного ретикулума, апараті Гольджі і плазматичної мембрани, що вказує на те, що GLP виділяються через екзоцітозний шлях. Наявність високого вмісту GLP у листі акліматизованих до холоду рослин, їх низький вміст в листках неаккліматізірованних рослин і недолік GLP у коренях дозволяють вважати, що є кореляція між зростаючим накопиченням GLP і підвищенням морозостійкості цих рослин. Крім того, локалізація GLP в безпосередній близькості до магістралей для вільно води в межах тканин підтверджує, що ці білки грають важливу роль у кристалізації та / або рекристалізації води при її заморожуванні.
Антифризного білки мають здатність гальмувати утворення льоду. Для того, щоб пояснювати їх роль у даному процесі, були проведені визначення їх концентрації та іммунолокалізація цих білків в листках, пагонах і коренях озимого жита. Кожен із загальних розчинних білків, екстрагованих з акліматизованих до холоду житніх листя, стеблі і корені, мав антифризного активністю, в той час як відсутність антифризного активності спостерігалася в екстрактах з неаккліматізірованних рослин жита. Антитіла, отримані проти трьох апопластного антифризного білків з жита, відповідних глюконазоподобному білку, хітіназоподобному білку і тауматіноподобному білку, були використані для обробки тканинних відбитків. При цьому було показано, що антифризного білки локалізуються в епідермісі і в клітинах, що оточують міжклітинні простори, у акліматизованих до холоду рослин. Хоча GLP, CLP і TLP були присутні в неаккліматізірованних рослинах, вони виявлялися в інших місцях і не мали антифризного активністю, що підтверджує, що при низько температурі проводяться інші ізоформи пов'язаних з патогенезом білків. Локалізація антифризного білків у жита може запобігати вторинне пошкодження клітин епіфіпіческім льодом або льодом, що розповсюджується через ксилему. Поширення білків, пов'язаних з патогенезом, і білків GLP, CLP, і TLP, що накопичуються під дією холоду, аналогічно і може відображати спільні шляхи, якими як патогени, так і лід входять і поширюються по тканинах рослини.
Синтетично ген антифризного білка експресуватися в рослинах і, як показали результати експериментів, знижував витік електроліту з листя при температурі замерзання грунту. Синтетично антифризного білок експресуватися в якості злитого з сигнальним пептидом, що направляють його до міжклітинний простір, де спочатку проявляється кристалізація льоду. Ген був введений в Solanum tuberosum L. Cv. Russet Burbank за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації. Трансформанта ідентифікувалися за допомогою PCR - скринінгу і експресія введеного білка перевірялася иммуноблоттинга. Аналіз вивільнення електролітів з листя трансгенних рослин виявив кореляцію між рівнем експресії трансгенного білка і ступенем витривалості до замерзання грунту.
Застосування методик, заснованих на вивченні рекристалізації льоду, дозволило останнім часом встановити в ряді видів рослин наявність білків, що володіють антифризного активністю. Зокрема в корені акліматизований до холоду моркви було виділено і ідентифіковано нові індукованих холодом антифризного білок з молекулярною масою 36 кДа. У ході вивчення його властивостей було встановлено, що цей білок пригнічує рекристалізацію льоду і володіє термогістерезісной активністю.
Показано, що цей поліпептид існує в розчині у вигляді N-глікозильованого мономера. Білок, так само як і інші відомі антифризного білки, локалізована в апопласте. Відповідний цьому білку ген, як показали результати досліджень, є унікальним і індукується холодом.
Регульовані холодом білки
Під час холодового акліматизації Arabidopsis thaliana синтезуються різні регульовані холодом поліпептиди, які не мають або мають дуже невелика схожість з іншими відомими білками. Регульовані холодом гени cor15а і cor6.6 кодують, відповідно, 15 і 6.6 кДа поліпептиди. Відомо, що поліпептид COR15а транспортується в хлоропласти і під час імпорту процесує в 9.4 кДа поліпептид, позначений як COR15ам. Поліпептид COR6.6, як вважається, локалізується в цитозолі. Кодуючі послідовності ш5ам і cor6.6 були перенесені під промотор фага Т7 і експресувати в E. coli. Рекомбінантні поліпептиди COR15аm і COR6.6 були очищені до майже гомогенного стану з використанням комбінації фракціонування сульфатом амонію, іонообмінної хроматографії та адсорбційної хроматографії на гідроксиапатит. COR15аm і більшість зразків COR15аm спільно мігрували як на двовимірному електрофорезі по O'Farrell, так і на неденатурірующем електрофорезі. Ці дані підтверджують місце процесингу COR15а і показують відсутність відмінностей у четвертинної структурі між COR15аm і більшістю видів COR15аm в рослинах. Навпаки, міграція плям COR6.6 і COR6.6 на двовимірних гелях показує, що значна частина популяції COR6.6 в рослинах модифікується. При подальшому дослідженні цих двох білків були визначені їх гідратаційні характеристики і їх дію на переходи суміші фосфоліпідів з рідкокристалічного в гелевидні стан і з ламеллярной фази в гексагональну II фазу. Після зневоднення при осмотическом тиску від 8 до 150 МПа вміст води в COR - поліпептид було менше, ніж у БСА, причому COR15ам був гідратованих менше, ніж COR6.6. Ні COR6.6, ні COR15ам не змінювали температуру викликаного дегідратацією переходу як дипальмитоилфосфатидилхолина, так і діолеілфосфатіділхоліна з гелеобразного в рідкокристалічний стан. У мультіламеллярних везикулах, що складаються з суміші дипальмитоилфосфатидилхолин, ні COR15ам, ні COR6.6, ні БСА не впливали на викликане зневодненням освіта інвертованою гексагональної фази як на функцію осмотичного тиску. Тим не менш, в суміші дипальмитоилфосфатидилхолин, дегідратованих у присутності COR15аm, спостерігалося специфічне ультраструктурні зміни - освіта визначено поверхнево морфології в ламеллярной доменах. Тим не менш, ні COR15ам, ні COR6.6, мабуть, не беруть участь у специфічному білково-фосфоліпідно взаємодії, що змінює викликане дегідратацією стан фаз фосфоліпідних везикул. Було перевірено, чи діють COR15ам і COR6.6 на індуковані холодом злиття або цілісність мембран невеликих уніламеллярних везикул, які складаються як з різних видів фосфатидилхоліну, так і з суміші діолеілфосфатіділхоліна, диолеилфосфатидилэтаноламина і вільних стеролів, а також на спільні ліпідний екстракт плазматичних мембран як неаккліматізірованних, так і акліматизованих до холоду листя рису. Коли везикули були суспендировані в буферному розчині, як COR15ам, так і COR6.6 значно зменшували викликане заморожуванням злиття незалежно від їх ліпідного складу. У той же час, коли везикули були суспендировані в сахарозі або в середовищі, що містить NaCl, COR-білки не впливали на індуковані холодом злиття. Більш того, COR-білки не впливали на зменшення викликаних холодом витоків, чи були везикули суспендировані в чистому буфері або в буфері з добавками NaCl або сахарози. Фактично, дію COR-білків на везикули, складені з окремих видів фосфатидилхоліну, суспендованих в буфері, виражалося в аномальному збільшенні викликаних заморожуванням витоків. Таким чином, було встановлено, що ні COR15ам, ні COR6.6 не мають прямого кріопротекторного дії на везикули, заморожені in vitro.
Багато рослин, у тому числі Arabidopsis, збільшують стійкість до заморожування після впливу низьких температур незаморажівающіх. Данна відповідь, званий холодової акліматизацією, опосередкований ДНК-регулюючим елементом «C-повторення / засухоотзивчівий елемент» і пов'язаний з індукцією генів COR. Посилення експресії у Arabidopsis CBF1, транскріпціонального активатора, що зв'язується з послідовністю CRT / DRE, індукувало експресію генів COR і збільшувало стійкість до заморожування неаккліматізірованних рослин Arabidopsis. На підставі цих даних був зроблений висновок, що CBF1 представляє собою ймовірний регулятор холодової акліматизації, який контролює рівень експресії генів COR, і сприяє підвищенню стійкості до проморожування.
Є відносно мало даних про природу і функції білків, синтез яких стимулюється гіпотермії. У більшості робіт показана тільки кореляція процесу загартовування до холоду з синтезом білка. У той же час ця кореляція дозволяє припускати важливу роль білків у формуванні загартованого стану рослини. Передбачається, що одним з неодмінних чинників, потрібних для індукції морозостійкості озимого жита, є посилене утворення протоплазми і клітинних мембран.
У ряді робіт показано вплив генів, локалізованих в певних хромосомах ядра, на активність мітохондрій при гіпотермії. Було встановлено, що охолодження морозостійких рослин озимих злаків викликає значні зміни в інтенсивності роботи дихального ланцюга мітохондрій і в ступені спряженості процесів окислення і фосфорилювання. Згодом був показаний ядерний контроль за проявом цієї ознаки, оскільки введення в малохолодоустойчівий генотип озимої пшениці хромосом з Х-геному високоморозоустойчівого пирію супроводжувалося реакцією мітохондрій на охолодження, типово для високоморозостойкіх форм, тобто швидким переходом мітохондрій в низькоенергетичне стан. Заміна ж хромосом Х-геному пирію на хромосоми пирейно D-геному в клітинах пшенично-пирейно гібрида уповільнювала цю реакцію мітохондрій на охолодження. Дослідження, проведені на мітохондріях 43 хромосомних лини показали, що гени, які контролюють даний ознака мітохондрії, локалізовані, ймовірно, у двох хромосомах Х-геному. Вивчення ліній з міжсортових заміщенням хромосом, при якому всі пари хромосом D-геному, а також деякі хромосоми А-і В-геномів озимої пшениці Безоста 1 були заміщені на відповідні пари хромосом високоморозоустойчівой пшениці сорту Альбідум 114, показало, що тільки дві хромосоми геному пшениці Альбідум 114 контролюють енергетичну активність мітохондрій при гіпотермії. Таким чином, оскільки, як показано вище, блокування цитоплазматичного синтезу білка не дозволяє пере ти мітохондрій при гіпотермії в низькоенергетичне стан, можна висунути припущення, що ядро за допомогою зміни синтезу білків бере участь у регуляції мітохондріальної активності при гіпотермії.
Дегідріни і ABA - регульовані білки
Останнім часом великий інтерес дослідника привертає вивчення змін у синтезі дегідрінов під дією холодового акліматизації. Зміна транскрипції генів білків LEA, RAB і DHN було спочатку зазначено за дії водного стресу і після обробки рослин абсцизової кислотою. Всі ці групи білків характеризуються високою гідрофільністю білкової молекули. Під час зневоднення клітини під дією водного стресу ці білки за рахунок своє високо гідрофільності перешкоджають втратою клітиною води і стабілізують клітинні білки. Згодом було виявлено, що синтез цих білків посилюється і під час холодової акліматизації. Дегідріни при цьому, мабуть, перешкоджають утворенню льоду в клітинах і також стабілізують клітинні білки.
Серед білків, що накопичуються в рослинах у відповідь на обезводнювання вплив або дія низьких температур, найбільш інтенсивно досліджуються дегідріни сімейства LEA D II. Дегідріни складаються з різних типових для білків даного виду доменів, що з'єднуються в кілька найбільш поширених варіантів поліпептидів, а також численних рідко зустрічаються варіацій. Ці домени включають в себе один або більше невеликих регіонів альфаспіралей амфіпатічних залишків, залишки серину і N-термінальну послідовність. До цих пір невідомі всі біохімічні функції дегідрінов, але значне число досліджень, присвячених з'ясуванню локалізації дегідрінов в клітці за допомогою клітинного фракціонування та іммунолокалізаціі, встановили, що дегідріни можуть локалізуватися і в ядрі, і в цитоплазмі. Більш того, отримані дані показують, що цей клас білків асоціюється з макромолекулами нуклеопротеїнових комплексу в ядрі і з мембранами цитоплазми. На даний момент вважають, що дегідріни є чинниками, що запобігають коагуляцію ряду макромолекул, зберігаючи їх структурну єдність під час стресового впливу.
При дослідженні відповідають на охолодження дегідрінов ожини було встановлено, що обробка низькими температурами закаливающими викликає холодову акліматизацію рослин, а також накопичення трьох дегідріноподобних білків з молекулярними масами 65, 60 і 14 кДа. Денситометрія гелів показала тісний взаємозв'язок між змістом дегідрінов і ступенем холодової гарту всіх трьох досліджених сортів ожини. Автори роблять висновок, що зміни в експресії дегідрінов більш тісно пов'язані з холодовим загартовуванням, ніж зі станом спокою рослини.
Поліпшене відновлення проморожені меристем і калюсів смородини було отримано після 2 години попередньо обробки в сахарозі, проліну, RAB - білках, або бичачому альбуміном. Двогодинне занурення в 0.4 M RIB-SM до проморожування істотно поліпшило відростання меристеми у порівнянні з 0, 1, 3 і 4 годинниковим зануренням. Двогодинне занурення меристем в 5 і 10% пролін, розчинений в 0.4 M RIB-SM, значно поліпшило відростання після проморожування. А первинні тест з екстрактами сирого RAB P з насіння пшениці показав, що відростання проморожені апікальних меристем смородини поліпшується після 2 години попередньо обробки зануренням з максимумом виживання в 1% RAB P. RAB P препарати, що містять еквівалентні білки, мали аналогічну дію на відростання, що вказує на те, що ефект залежав від присутності білків, а не цукрів і інших вуглеводів в сирих екстрактах RAB P. Аналогічні результати показують меристеми і каллус, попередньо оброблені 5 або 10% пролином, 1% розчином RAB P або 1% БСА в 0.4 M розчині сахарози. Попередньо оброблені меристеми продовжили приріст через 3 дні після зігрівання і досягли максимуму відростання через 1 тиждень, порівняно з 2 тижнями для попередньо необробленого контролю.
При дослідженні дії короткого дня на Betula pubescens було встановлено, що в доповненні до різних конститутивний синтезується дегідрінам на короткому дні виявлялися два специфічних поліпептиду з молекулярними масами 34 і 36 кДа.
З бібліотеки кДНК, отриманої з коріння сходів проростків Triticum durum, підданих водного стресу, були охарактеризовані чотири клону дегідрінов. Два з них, ptd27e і ptd16, кодують білки з класичними характеристиками дегідрінов, тобто консенсусним мотивом KIKEKLPG, який присутній за межами послідовності серинових залишків у карбоксильного кінця. Білки, що кодуються Tddhn15 і Tddhn16, мають схожість з послідовностями білків Triticum aestivum. Клони ptd25a і ptd38 кодують дегідріни, які не мають послідовності серинових залишків і володіють схожістю послідовності з Cor - білками T. aestivum. Щоб скоррелировать стійкість T. durum до посухи з експресією генів дегідрінов, для чотирьох сортів було проведено порівняння накопичення транскриптів дегідрінов в коренях і пагонах сходів у відповідь на водний стрес і екзогенну абсцизової кислоти. Дослідження дії водного стресу в часі показало, що накопичення транскриптів дегідрінов запізнюється в посухостійких сортах. При цьому рівень акумульованих транскриптів був вищим у посухостійких, ніж у засухочувствітельних сортах. Аналогічні результати був відзначені після обробки екзогенно абсцизової кислотою.
Роль такого гормону, як Абсцизова кислота і стійкості рослин до низьких температур вивчалася у Arabidopsis шляхом використання мутантів, у яких був змінений або біосинтез, або режим де ствия даного гормону. Різні мутанти використовувалися для аналізу ролі ABA у розвитку і проростання насіння і стійкості до стресу. Мутанти були виділені премущественно за зміненими характеристиками проростання і росту проростків. Ген зеаксантінепоксідази, кодованих геном aba1, клонованих за гомології з геном Nicotiana plumbaginifolia, блокованим на той же биосинтетической щаблі. При цьому були виявлені біохімічні пошкодження мутантів aba1, aba2 і aba3. ABA-нечутливі мутанти також мають фенотип, на який впливають різні ABA-залежні процеси і, таким чином, дозволяють припускати, що вони або кодують ранні щаблі в передачі сигналу ABA, або вони впливають на специфічні щаблі. Гени abi1 і abi2 кодують фермент протеїнфосфатаз 2c і ген abi3 кодує фактор транскрипції із специфічною експресією в насінні. Гіперчутливою до абсцизової кислоти мутант era1 має порушення в фарнезілтрансферазе.
У два рази було покращено відновлення кріоконсервованих in vitro решт пагонів берези повисло за допомогою включення абсцизової кислоти у культуральне середовище під час холодового загартовування материнських пагонів. Рівень відновлення решт пагонів після холодового загартовування протягом 28 дні при +5 0 C в 8 / 16 годинному фотоперіоду на середовищі, содержавше 10 -4 M абсцизової кислоти становив понад 40%. Абсцизова кислота була ефективно тільки в поєднанні з низько температурою і коротко довжиною дня, хоча в ході експериментів і були відзначені великі генотипічну відмінності. Абсцизова кислота мала два різних варіанти впливу: посилення холодової загартованості і посилення формування калюсу під час регенерації кріоконсервованих решт пагонів.
Білки, що перешкоджають льодоутворення
Однією з функцій білків, що синтезуються в рослинах при гіпотермії, зокрема, при дії негативних температур, є перешкоджання процесу льодоутворення. Хоча, як було зазначено вище, в основному зниження температури початку льодоутворення відбувається за рахунок накопичення в рослинній клітині цукрів у результаті посилення синтезу і підвищення активності відповідних ферментів, в рослинних клітинах при гіпотермії відбувається також і синтез специфічних білків, які безпосередньо впливають на температуру початку льодоутворення і зростання крижаних кристалів.
Здатність контролювати позаклітинне утворення льоду під час заморожування є критичною для виживання толерантних до заморожування рослин. Антифризного білки, які є білками, здібними гальмувати зростання кристалів льоду, нещодавно були ототожнені як найпоширеніші апопластного білки в листі акліматизований до холоду озимого жита. Порівняння аміно-термінальних послідовностей, імуно-перехресної реактивності і ферментативної активності показали, що ці антифризного білки схожі з членами трьох класів білків, що відносяться до патогенезу, а саме, з ендохітіназамі, ендо-бета-1,3 - глюканазу і тауматин-подібними білками . Апопластного ендохітінази і ендо-бета-1 ,3-глюканазу сильно індукуються патогенами в чутливому до заморожування тютюні і не володіють антифризного активністю. Отримані дані дозволяють пропонувати, що в патогенез-пов'язаних білках могли розвинутися тонкі структурні відмінності, які дозволили цих білків отримати можливість зв'язуватися з льодом.
У листі озимого жита спостерігався синтез білка, що виділяється ендогенно і що виділяється в вакуолі і міжклітинний простір, який значно змінював картину зростання крижаних кристалів і знижував температуру замерзання розчину. Надалі цими ж авторами з апопласта листя озимого жита були виділені шість антифризного білків, що володіють здатністю абсорбуватися на поверхні льоду і пригнічувати зростання кристалів. Антифризного білки жита накопичувалися під час холодової акліматизації і подібні з рослинними білками, пов'язаними з патогенезом, включаючи два ендоглюканазоподобних, два хітіназоподобних і два тауматінподобних білка. Іммунолокалізація ендоглюканазоподобних білків показала, що вони накопичуються на міжклітинної поверхні клітинних стінок мезофілу, в опектіненних районах, у вторинних клітинних стінках ксілемних судин і в епідермальних клітинних стінках. Оскільки антифризного білки жита локалізовані в місцях, де можливий їх контакт з льодом, вони можуть виконувати функцію бар'єру на шляху поширення льоду або придушувати рекристалізацію льоду. Антифризного білки, схожі з патогенез-зв'язаними білками, були також виявлені в інших видах триби Triticae, але не у морозостійких дводольних рослин. Було встановлено, що у озимої пшениці накопичення антифризного білків і розвиток холодостійкості регулюються п'ятого хромосомою.
Синтез значної кількості апопластного білків з молекулярними масами від 15 до 109 кДа спостерігався в процесі підвищення морозостійкості озимого жита. Для визначення того, чи є накопичення цих антифризного білків загальним явищем для трав'янистих рослин, були досліджені антифризного активність і загальний вміст білка в екстракті апопласта листя ряду видів рослин, що ростуть при низьких температурах, включаючи як однодольні, так і дводольні. Білки апопласта поділялися SDS-ПААГ електрофорезом і з допомогою иммуноблоттинга визначалося, чи дійсно рослини відповідають на низькі температури накопиченням білків, пов'язаних з патогенезом. Отримані результати показують, що значні рівень антифризного активності був присутній тільки в апопласте морозостійких однодольних рослин після холодової акліматизації при 5,2 0 С. Більш того, під час холодової акліматизації тільки тісно пов'язана група рослин - жито, пшениця і ячмінь - накопичували антифризного білки, подібні з пов'язаними з патогенезом білками. При цьому накопичення антифризного білків є специфічною відповіддю, який може бути скоріше важливий у холодостійкості деяких видів рослин, ніж як спільні відповідь всіх рослин на низькотемпературного стресу.
Два антифризного білка жита з молекулярними масами 32 і 35 кДа аналогічні в їх амінокислотних послідовностях та епітопів бета - 1,3 - ендоглюканазе. Локалізація цих антифризного білків, які були позначені як глюканазоподобние білки, була встановлена з використанням імунної сироватки, отриманої проти антифризного білка 32 кДа. Іммуноелектронная мікроскопія високої роздільної здатності листя акліматизованих до холоду рослин виявила високий вміст GLP у стінках клітин мезофілу, в стінках клітин, суміжних з міжклітинними просторами, і в другорядних судинах ксилеми. Враховуючи відсутність GLP у вакуолях, ці результати підтверджують накопичення апопластного антифризного білків у акліматизованих до холоду рослинах озимого жита. У межах клітини GLP локалізувалися в цистернах шорсткого ендоплазматичного ретикулума, апараті Гольджі і плазматичної мембрани, що вказує на те, що GLP виділяються через екзоцітозний шлях. Наявність високого вмісту GLP у листі акліматизованих до холоду рослин, їх низький вміст в листках неаккліматізірованних рослин і недолік GLP у коренях дозволяють вважати, що є кореляція між зростаючим накопиченням GLP і підвищенням морозостійкості цих рослин. Крім того, локалізація GLP в безпосередній близькості до магістралей для вільно води в межах тканин підтверджує, що ці білки грають важливу роль у кристалізації та / або рекристалізації води при її заморожуванні.
Антифризного білки мають здатність гальмувати утворення льоду. Для того, щоб пояснювати їх роль у даному процесі, були проведені визначення їх концентрації та іммунолокалізація цих білків в листках, пагонах і коренях озимого жита. Кожен із загальних розчинних білків, екстрагованих з акліматизованих до холоду житніх листя, стеблі і корені, мав антифризного активністю, в той час як відсутність антифризного активності спостерігалася в екстрактах з неаккліматізірованних рослин жита. Антитіла, отримані проти трьох апопластного антифризного білків з жита, відповідних глюконазоподобному білку, хітіназоподобному білку і тауматіноподобному білку, були використані для обробки тканинних відбитків. При цьому було показано, що антифризного білки локалізуються в епідермісі і в клітинах, що оточують міжклітинні простори, у акліматизованих до холоду рослин. Хоча GLP, CLP і TLP були присутні в неаккліматізірованних рослинах, вони виявлялися в інших місцях і не мали антифризного активністю, що підтверджує, що при низько температурі проводяться інші ізоформи пов'язаних з патогенезом білків. Локалізація антифризного білків у жита може запобігати вторинне пошкодження клітин епіфіпіческім льодом або льодом, що розповсюджується через ксилему. Поширення білків, пов'язаних з патогенезом, і білків GLP, CLP, і TLP, що накопичуються під дією холоду, аналогічно і може відображати спільні шляхи, якими як патогени, так і лід входять і поширюються по тканинах рослини.
Синтетично ген антифризного білка експресуватися в рослинах і, як показали результати експериментів, знижував витік електроліту з листя при температурі замерзання грунту. Синтетично антифризного білок експресуватися в якості злитого з сигнальним пептидом, що направляють його до міжклітинний простір, де спочатку проявляється кристалізація льоду. Ген був введений в Solanum tuberosum L. Cv. Russet Burbank за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації. Трансформанта ідентифікувалися за допомогою PCR - скринінгу і експресія введеного білка перевірялася иммуноблоттинга. Аналіз вивільнення електролітів з листя трансгенних рослин виявив кореляцію між рівнем експресії трансгенного білка і ступенем витривалості до замерзання грунту.
Застосування методик, заснованих на вивченні рекристалізації льоду, дозволило останнім часом встановити в ряді видів рослин наявність білків, що володіють антифризного активністю. Зокрема в корені акліматизований до холоду моркви було виділено і ідентифіковано нові індукованих холодом антифризного білок з молекулярною масою 36 кДа. У ході вивчення його властивостей було встановлено, що цей білок пригнічує рекристалізацію льоду і володіє термогістерезісной активністю.
Показано, що цей поліпептид існує в розчині у вигляді N-глікозильованого мономера. Білок, так само як і інші відомі антифризного білки, локалізована в апопласте. Відповідний цьому білку ген, як показали результати досліджень, є унікальним і індукується холодом.
Регульовані холодом білки
Під час холодового акліматизації Arabidopsis thaliana синтезуються різні регульовані холодом поліпептиди, які не мають або мають дуже невелика схожість з іншими відомими білками. Регульовані холодом гени cor15а і cor6.6 кодують, відповідно, 15 і 6.6 кДа поліпептиди. Відомо, що поліпептид COR15а транспортується в хлоропласти і під час імпорту процесує в 9.4 кДа поліпептид, позначений як COR15ам. Поліпептид COR6.6, як вважається, локалізується в цитозолі. Кодуючі послідовності ш5ам і cor6.6 були перенесені під промотор фага Т7 і експресувати в E. coli. Рекомбінантні поліпептиди COR15аm і COR6.6 були очищені до майже гомогенного стану з використанням комбінації фракціонування сульфатом амонію, іонообмінної хроматографії та адсорбційної хроматографії на гідроксиапатит. COR15аm і більшість зразків COR15аm спільно мігрували як на двовимірному електрофорезі по O'Farrell, так і на неденатурірующем електрофорезі. Ці дані підтверджують місце процесингу COR15а і показують відсутність відмінностей у четвертинної структурі між COR15аm і більшістю видів COR15аm в рослинах. Навпаки, міграція плям COR6.6 і COR6.6 на двовимірних гелях показує, що значна частина популяції COR6.6 в рослинах модифікується. При подальшому дослідженні цих двох білків були визначені їх гідратаційні характеристики і їх дію на переходи суміші фосфоліпідів з рідкокристалічного в гелевидні стан і з ламеллярной фази в гексагональну II фазу. Після зневоднення при осмотическом тиску від 8 до 150 МПа вміст води в COR - поліпептид було менше, ніж у БСА, причому COR15ам був гідратованих менше, ніж COR6.6. Ні COR6.6, ні COR15ам не змінювали температуру викликаного дегідратацією переходу як дипальмитоилфосфатидилхолина, так і діолеілфосфатіділхоліна з гелеобразного в рідкокристалічний стан. У мультіламеллярних везикулах, що складаються з суміші дипальмитоилфосфатидилхолин, ні COR15ам, ні COR6.6, ні БСА не впливали на викликане зневодненням освіта інвертованою гексагональної фази як на функцію осмотичного тиску. Тим не менш, в суміші дипальмитоилфосфатидилхолин, дегідратованих у присутності COR15аm, спостерігалося специфічне ультраструктурні зміни - освіта визначено поверхнево морфології в ламеллярной доменах. Тим не менш, ні COR15ам, ні COR6.6, мабуть, не беруть участь у специфічному білково-фосфоліпідно взаємодії, що змінює викликане дегідратацією стан фаз фосфоліпідних везикул. Було перевірено, чи діють COR15ам і COR6.6 на індуковані холодом злиття або цілісність мембран невеликих уніламеллярних везикул, які складаються як з різних видів фосфатидилхоліну, так і з суміші діолеілфосфатіділхоліна, диолеилфосфатидилэтаноламина і вільних стеролів, а також на спільні ліпідний екстракт плазматичних мембран як неаккліматізірованних, так і акліматизованих до холоду листя рису. Коли везикули були суспендировані в буферному розчині, як COR15ам, так і COR6.6 значно зменшували викликане заморожуванням злиття незалежно від їх ліпідного складу. У той же час, коли везикули були суспендировані в сахарозі або в середовищі, що містить NaCl, COR-білки не впливали на індуковані холодом злиття. Більш того, COR-білки не впливали на зменшення викликаних холодом витоків, чи були везикули суспендировані в чистому буфері або в буфері з добавками NaCl або сахарози. Фактично, дію COR-білків на везикули, складені з окремих видів фосфатидилхоліну, суспендованих в буфері, виражалося в аномальному збільшенні викликаних заморожуванням витоків. Таким чином, було встановлено, що ні COR15ам, ні COR6.6 не мають прямого кріопротекторного дії на везикули, заморожені in vitro.
Багато рослин, у тому числі Arabidopsis, збільшують стійкість до заморожування після впливу низьких температур незаморажівающіх. Данна відповідь, званий холодової акліматизацією, опосередкований ДНК-регулюючим елементом «C-повторення / засухоотзивчівий елемент» і пов'язаний з індукцією генів COR. Посилення експресії у Arabidopsis CBF1, транскріпціонального активатора, що зв'язується з послідовністю CRT / DRE, індукувало експресію генів COR і збільшувало стійкість до заморожування неаккліматізірованних рослин Arabidopsis. На підставі цих даних був зроблений висновок, що CBF1 представляє собою ймовірний регулятор холодової акліматизації, який контролює рівень експресії генів COR, і сприяє підвищенню стійкості до проморожування.