Вплив гіпотермії на вміст білків в тканинах рослин
1. Вплив гіпотермії на вміст водорозчинних білків у тканинах вищих рослин
Припущення про те, що під час загартовування рослин до холоду відбувається синтез білків, було вперше висловлено Дж. Дойлом і П. клінчем в 1927 році. Перші докази того, що процес синтезу білка безпосередньо бере участь у загартовуванні рослини, були отримані Г. Сіміновіч. Згодом у багатьох роботах повідомлялося про зміну вмісту нуклеїнових кислот і загального білка під час загартовування рослин до холоду. Аналіз змін водо-і солерозчинних білків озимої пшениці після загартування і перезимівлі показав збільшення вмісту водорозчинних білків. У той же час зміст солерозчинних білків знижувався. За цими ознаками виявлені відмінності між озимою пшеницею сорту Безоста 1 і високозімостой мутантом цього сорту, отриманим під дією нітрозометілмочевіни. Амінокислотний аналіз досліджуваних білків виявив значні зміни за цією ознакою як у початково форми, так і у мутанта під дією перезимівлі. У ряді інших робіт повідомлялося про зміну змісту загального білка під час дії низької температури і загартовування. При вивченні біосинтезу білка під час низькотемпературної адаптації озимих злаків у зв'язку з їх морозостійкістю було встановлено, що у озимої пшениці, озимого жита та ячменю при зниженні температури з 18 0 С до 2 0 С у перші - третю добу адаптації відбувається зниження рівня синтезу білка, але на п'яту - сьому добу синтез білка зростає, при цьому 10-15% загально маси рослинного білка складають знову синтезовані білки, не були присутні в контрольних рослинах.
Під час перезимівлі рослин озимої пшениці відбуваються значні зміни у змісті білків у тканинах кореня і вузлів кущіння: спостерігається гідроліз білків у коренях і переміщення вільних амінокислот у вузли кущіння, причому якщо восени із зниженням температури кількість розчинних білків у коренях зменшується, то до весни воно збільшується . Накопичення білків за рахунок слабшого в порівнянні із зростанням уповільнення швидкості білкового синтезу зазначалося в клітинах кореня кукурудзи під впливом низької температури.
Застосування електрофорезу для поділу рослинних білків дозволило отримати нову інформацію про вплив гіпотермії на склад білків рослин. Різке зниження температури викликає помітні зміни в електрофоретичному спектрі легкорозчинних білків. Зокрема, в озимої пшениці в період перезимівлі виявлені значні зміни в складі білків, виділених з вузлів кущіння. У процесі загартовування утворення білків, судячи з кількості смуг в електрофоретичному спектрі, наростало, а в осінньо-зимовий період зменшувалася. Була відзначена сортова специфіка у відношенні цієї ознаки. Зокрема, морозостійкий сорт озимої пшениці відрізнявся від морозочувствітельного сорти великим числом смуг в електрофоретичному спектрі.
Поява нових смуг в спектрі білків під дією гіпотермії та в процесі загартовування рослин до холоду відзначається багатьма дослідниками. Зокрема, в ході процесу адаптації озимої пшениці до низьких негативних температур відзначалася поява в електрофоретичному спектрі білків з молекулярними масами 24 і 85 кДа, а також на додаток до них 67 і 74 кДа. При вивченні поліпептидного складу білків вузла кущіння озимої пшениці в процесі зимівлі було виявлено зміну змісту глобулінів з молекулярними масами 23 і 48 кДа. Загартовування озимої пшениці призводить і до змін у складі білків надземних органів, при цьому спостерігається новоутворення чітко виражених смуг в електрофоретичному спектрі у зонах високо-і нізкоподвіжних білків. Автори, враховуючи, що значна частина білків має ферментативними властивостями, припускають появу ферментів, які виявляються тільки при холодовому впливі на озиму пшеницю.
При дослідженні білків, синтез яких корелює зі зростанням холодостійкості клітинних культур Bromus inermis Leyss. cv. Manchar було відзначено посилення синтезу білків з молекулярними масами 25, 165, 190 і 200 кДа.
Одним з найбільш вивчених до теперішнього часу сімейств білків, вміст яких у рослині корелює з холодостійкість, є дегідріни. Дане сімейство білків має певні, характерні для цього сімейства послідовності амінокислот, що дозволяє достатньо легко і впевнено ідентифікувати його членів як на рівні транскриптів, так і на рівні індивідуальних білків. У зв'язку з цим члени даного сімейства в даний час інтенсивно вивчаються.
Значні зміни під дією холодового акліматизації були виявлені при вивченні експресії дегідрінов у ярих та озимих зернових культур. Було встановлено, що зміст дегідрінових транскриптів зростає з вересня по листопад, причому їх зміст у ярих культур зростає менше, ніж в озимих. При дослідженні експресії гена дегідріна було виявлено, що після 14 дні загартовування в контрольованих умовах в значних кількостях виявляються три транскрипту, гибрідизуючою з кДНК білка DHN-4. Після низькотемпературної гарту рослин в польових умовах до листопада в рослинах накопичувався високі рівень транскриптів дегідріна, при цьому рослини розвивали дуже високу морозостійкість. Збільшення рівня синтезу дегідріна з молекулярною масою 50 кДа під час холодової акліматизації було зазначено у пшениці. Було також встановлено, що деякі з поліпептидів, що з'являються під дією загартовування в інших культур, також відносяться до сімейства білків-дегідрінов.
За допомогою електрофорезу білків в градієнті ПААГ і ізоелектрофокусірованія було показано, що загартовані і незагартованих до холоду листя озимої пшениці мають розрізняються білкові спектри. Після загартовування спостерігалося поява білкових компонентів з високомолекулярної масою. У ряді робіт було висловлено припущення, що холодова обробка індукує синтез поліпептидів з відмінною первинно структурою, оскільки цими авторами було встановлено, що охолодження проростків ярої пшениці призводить до появи нових смуг не тільки в спектрах нативних білків, але і в електрофоретичних спектрах білків, оброблених додецилсульфатом натрію.
Ф.Р. Гимале з співавторами констатували, що під дією холодового шоку у пшениці відбувається індукція синтезу поліпептидів з молекулярними масами 50, 70 і 94 кДа. Згодом цими ж авторами було проведено скринінг ряду представників триби Triticeae для порівняння поліпептидів, що синтезуються у них під дією гіпотермії. Обробка об'єктів низькою температурою проводилася протягом 7 діб. Радіоактивна мітка вводилася протягом останніх 24 годин холодової обробки. За допомогою електрофорезу в ПААГ і радіоавтографіі було встановлено, що у всіх диплоїдних видів знизився рівень синтезу поліпептидів з молекулярною масою 50 і 66 кДа. У всіх цих видів у спектрі білків з'явився поліпептид з молекулярно масо 43 кДа. У рослинах виду T. urartu синтезувалися також білки з молекулярними масами 20, 27 і 37 кДа; у виду T. sinskajae - 20 і 37 кДа, а у T. monococcum - 20 і 27 кДа. У егілопсов в спектрах з'являлися білки з молекулярними масами 33 і 43 кДа і спостерігалося збільшення синтезу білків з молекулярними масами 20, 40, 50 і 62 кДа. У T. dicoccum спостерігалося зменшення синтезу білка з молекулярною масою 66 кДа і посилення синтезу білків з молекулярними масами 45 і 48 кДа. У білковому спектрі з'являлися смуги з молекулярними масами 20, 33 і 43 кДа. У T. aestivum спостерігалося поява в спектрі білків з молекулярними масами 43 кДа і 43 і 48 кДа. Зменшувалась включення радіоактивно мітки в білок 66 кДа і 46 кДа. У озимого жита було відзначено зниження включення мітки в білки з молекулярними масами 13, 38, 50 і 90 кДа та збільшення включення мітки в білки з молекулярними масами 15 і 22 кДа. У білковому спектрі з'являлася смуга з молекулярною масою 28 кДа. Автори виділяють ряд поліпептидів, які з'являються в білкових спектрах більшості досліджених видів рослин під дією низької температури.
З листя загартованої до холоду капусти був виділений і очищений білок, який захищав тилакоїди незагартованого шпинату від пошкодження при заморожуванні. Процедура виділення включала в себе осадження тепловою обробкою, осадження сульфатом амонію та глікозаміногліканів гепарину, а також колонкової хроматографії на Поліаміди 6 і обернено-фазну хроматографію на матриксі С-18. Після обернено-фазною хроматографії на електрофорезі була виявлена одна смуга з приблизною молекулярної масою 7 кДа. Ця фракція мала кріопротекторную активність. Гель-фільтрація підтвердила, що даний білок є мономером з молекулярною масою 7 кДа. Цей білок можна виділити тільки з загартованих до холоду рослин капусти, але не з рослин, вирощених у незакалівающіх умовах. З використанням мічених пероксидазою лектинів було показано, що даний кріопротектін є глікопротеїном і містить пов'язані залишок а1-3 пов'язаної фукози.
Листя омели містять трігалактозу і специфічні N-ацетилгалактозаміном-ізолектіновие групи. Групи ML I і ML III показали високу кріозахисних активність в ізольованих мембранах тилакоїдів шпинату в період замерзання і відтавання грунту, в той час як ML II не володіли такою активністю. У ході експериментів встановлено, що кріозахисних ефективність білків корелювала з їх відносно гідрофобністю. Було встановлено також, що морозостійкість листя омели сезонно регулюється природними умовами. У той час як листя, зібрані взимку, не пошкоджувалися при замерзанні грунту до -20 0 C, листя, зібрані в липні, зазнавали 70% витік електроліту після замерзання грунту до -5 0 C. Дані експериментів свідчать, що і кількість фракцій ML I і ML III змінюється протягом року. Найбільш високий вміст цих кріозахисних лектинів спостерігалося взимку і ранньою весною, а найбільш низький - у період літніх місяців. Змін в утриманні ML II не було зафіксовано. Ці дані підтверджують те, що деякі лектини можуть грати роль у стабілізації клітинних мембран під дією стресових умов навколишнього середовища.
При вивченні впливу розвитку морозостійкості на синтез білків було ідентифіковано сімейство білків, асоційоване з розвитком морозостійкості у пшениці. Дане сімейство білків специфічне для злаків і їх зміст регулюється низько температурою. Антитіла, отримані проти білка з мовляв. масою 50 кДа, реагують, принаймні, з п'ятьма членами даного сімейства. Використовуючи ці антитіла, були визначені зміст і локалізація даного сімейства білків у акліматизованих до холоду сходах пшениці. Вестерн-блот субклітинних частинок показав наявність всіх членів родини у цитозолі та очищених ядерних частинках. Після 21 дня холодової акліматизації озимої пшениці ці білки накопичувалися аж до 0.9% від всіх розчинних екстрагуються білків. Їх клітинна концентрація становила 1.34. Імуногістохімічне локалізація показала, що вміст цих білків найбільш високо в зоні судинного переходу. Ці білки не були виявлені в зріло ксилемі, у верхівковій меристемі пагонів або в бічних кореневих примордіїв. Дана тканеспеціфічная індукція дозволяє припускати, що чутливі клітини в областях, де вода має тенденцію замерзати в першу чергу, для свого захисту потребують більш високого вмісту цих білків.
Отримані дані добре відповідають тому факту, що відростання після замороження в значно мірою залежить від життєздатність цієї частини пагона. Електронно-мікроскопічний аналіз з використанням імунно-золотий мітки показав, що ці білки присутні в цитоплазмі і в нуклеоплазмі. У той же час вони не були знайдені в клітинних стінках або інших клітинних органелах. Дослідження кріозахисних дії in vitro показало, що білок WCS120 так само ефективно, як БСА та сахароза, захищає лактатдегідрогенази від денатурації в ході заморожування. Ці результати показують, що дане сімейство білків може бути залучено в загальний механізм захисту розчинних частинок клітини. Їхня присутність у нуклеоплазмі також дозволяє запропонувати як їх можливу функцію - запобігання процесів транскрипції. Висока гідрофільність, високий вміст даних білків і стійкість цих білків при кип'ятінні дозволяють пропонувати, що вони можуть забезпечувати особливу мікросередовище, необхідну для виживання клітини в чутливо зоні судинного переходу під час стресу при заморожуванні.
При дослідженні взаємозв'язку відповідей рослини на різні типи стресу було виявлено, що сольовий стрес збільшує морозостійкість у деяких видів трав'янистих рослин. З метою зрозуміти молекулярні основи збільшення индуцируемой холодовим стресом морозостійкості за допомогою двовимірного електрофорезу в ПААГ був проаналізований ефект обробки сольовим розчином на склад загальних білків рослин картоплі. Після 24-годинної обробки NaCl, під час якої холодостійкість зросла в три рази, були виявлені дев'ять індукованих сольовим стресом білків. Пряме порівняння цих білків з білками, індуковані низькотемпературним стресом і екзогенно абсцизової кислотою, дозволило встановити, що п'ять індукованих сольовим стресом білків индуцировали також низькотемпературним стресом, а сім - обробкою абсцизової кислотою. Три білка 13/7.0, 27/6.6 і 48/6.9) індукувати і холодом і екзогенно абсцизової кислотою і були пов'язані зі зміною морозостійкості. Після 6 годин обробки сіллю, перед тим як розвивалася холодостійкість, ендогенних рівень абсцизової кислоти в листках короткочасно збільшувався в шість разів. Результати дозволяють вважати, що сольова індукція холодового загартовування включає синтез холодоіндуціруемих і індукованих абсцизової кислотою білків, а також те, що зміна білкового синтезу можна пов'язати зі збільшенням концентрації абсцизової кислоти у відповідь на сольовий стрес. Ці дані також дозволяють припускати, що деяка частина білків, індукованих холодом і абсцизової кислотою, пов'язана з сольовим стресом.
2. Вплив гіпотермії на вміст водорозчинних білків у тканинах бактерій і водоростей
Зміна експресії водорозчинних білків у відповідь на зниження температури спостерігається також і у водрослей і у бактерій. Під час різкого зниження температури в бактеріях тимчасово експресуються на високому рівні «індуковані холодом білки». За допомогою двовимірного електрофорезу в ПААГ були ідентифіковані деякі з цих білків. Незважаючи на це, загальні функції даних білків, як відповіді організму на холодовий шок, в даний час все ще незрозумілі. Останнім часом найбільшу увагу дослідників сфокусовано на групі «білків холодового шоку», синтез яких, як було показано, в значно мірою індукується під час холодового шоку і після нього і які грають важливу регуляторну роль у фізіології адаптації мікроорганізмів до низьких температур. E. Coli, B. Subtilis і B. Cereus володіють сімейством білків, що нараховує, щонайменше, 3 - 7 білків CSP - невеликих кислих білків, які мають між собою більше 45% ідентичності в послідовності амінокислот. Останні дані підтверджують, що члени цього широко розповсюдженого сімейства білків можуть in vitro діяти як на рівні транскрипції, так і на рівні трансляції. Тим не менш, всі функції CSP залишаються невідомі. До того ж, відповідно до недавно отриманими даними, в індукції синтезу CSP також грає важливу роль Посттрансляційна регуляція. У цей процес можуть бути також залучені рибосоми. Це припущення знаходиться у відповідності з моделлю, в якій, як передбачається, рибосоми є температурним сенсором в бактеріях.
Перенесення Enterococcus faecalis в умови низько температури викликав посилення експресії 11 білків холодового шоку. Крім того, мезофільні прокаріоти синтезували також 10 білків холодової акліматизації, 5 з яких збігалися з білками холодового шоку, під час тривалого росту при температурі 8 0 С.
Listeria monocytogenes - грампозитивних продовольчий патоген - здатний рости при температурі холодильника. При зниженні температури від 37 до 5 0 C у L. monocytogenes індукується синтез дванадцяти білків холодового шоку з молекулярними масами 48,6; 41,0; 21,8; 21,1; 19,7; 19,2; 18,8; 17,2; 15,5; 14,5 і 14,0 кДа. Це було встановлено в експериментах по включенню мітки з наступним двовимірним електрофорезом в гелі. Штам SLCC53 показав аналогічну відповідь на холодовий шок. Білки холодової акліматизації спостерігалися в культурах штаму 10403S в умовах росту при 5 0 C, чотири з цих білків, з молекулярними масами 48,0; 21,1; 19,7 і 18,8 кДа, також були білками холодового шоку. Два чутливих до холоду транспозон-індукованих мутанта включали мітку менш ефективно, ніж нечутливі до холоду батьківськи штам, але в той же час відповідна індукція білків холодового шоку у вивчених мутантів була дуже схожа на відповідну індукцію батьківського штаму.
Дальне шиї вивчення основного білка холодового шоку Listeria monocytogenes за допомогою двовимірного електрофорезу показало, що його ізоелектрична точка складає 5.1. За допомогою N-термінального сиквенсу отриманого за допомогою двовимірного електрофорезу білку була встановлена його повна ідентичність з негеміновим залізозв'язуючих феритином з Listeria innocua. Очищення цього феритин-подібного білка дозволила встановити, що його нативна молекулярна маса становить близько 100-110 кДа, що свідчить про те, що він складається з шести 18 кДа субодиниць. Нозерн-блот аналіз показав присутність його 0.8 kb мРНК у клітинах під час фази експоненціального зростання, а також значне збільшення кількості мРНК цього білка як після падіння, так і після зростання температури.
CSPA є основним білком холодового шоку E. coli, його синтез значно зростає у відповідь на холодовий шок. Амінокислотна послідовність CSPA має 43% ідентичності «домену холодового шоку» еукаріотичного Y-box семі ства білків, члени якого взаємодіють з РНК і ДНК для регуляції їх функцій. Показано, що CSPA кооперативно зв'язується з денатурований під дією низько температури одноланцюжковий РНК, розміром більше, ніж 74 підстави. Для його кооперативного зв'язування необхідна мінімальна концентрація CSPA 2.7х10 -5 М, що значно нижче, ніж присутня в клітині після холодового шоку концентрація CSPA. Для зв'язування CSPA не було встановлено специфічних послідовностей РНК, що показує, що він може зв'язуватися з широким спектром послідовностей. Коли складається з 142 підстав 5'-нетрансльовані ділянку власної мРНК CSPA був використаний як субстрат для рибонуклеази А і Т1, додавання CSPA значно стимулювало гідроліз РНК шляхом запобігання утворенню РНКазоустойчівих зв'язків через утворення стабільних вторинних структур в 5'-нетрансльованою ділянці. Ці дані показують, що зв'язування CSPA з РНК дестабілізує вторинну структуру РНК і робить її доступно для рибонуклеази. Передбачається, що CSPA діє як шаперон РНК для запобігання утворення вдруге структури у РНК при низьких температурах. Ця функція CSPA може бути необхідна для ефективно трансляції мРНК при низьких температурах і, мабуть, може також впливати на процес транскрипції.
При падінні температури в клітинах Escherichia coli виявлена сильна індукція синтезу найважливішого білка холодового шоку - CSPA. Оскільки цей білок дуже консервативний, було використано підхід, заснований на PCR з використанням пари дегенерованих праймерів, отриманих з високо консервативних областей cspA-пов'язаних білків, щоб довести присутність як мінімум трьох пов'язаних з cspA генів у Lactacoccus lactis. Один з них, cspB, був клонований і секвенований. Він кодує білок з 66 амінокислот, який володіє 60% тотожності послідовності з CSPA з Escherichia coli. Після холодового шоку рівень транскриптів мРНК CspB збільшувався, що було показано за допомогою Нозерн-блот гібридизації. Крім того, спостерігалася індукція активності CSPB-залежною бета-галактозидази. Ці результати вказують на те, що ген cspB з L. Lactis індукується холодовим шоком.
Білок холодового шоку Bacillus subtilis, CSPB, після гіпотермії впливає на рівень вмісту декількох інших білків холодового шоку в B. Subtilis. Експресія CSPB в Escherichia coli при 37 0 C - в умовах, коли білки холодового шоку CSPA і CSPB E. Coli не виявляються - призводить до помітного зниження швидкості росту клітин і має значний вплив на рівень синтезу інших білків. При цьому відбувається як зменшення, так і збільшення рівні синтезу специфічних білків. Зокрема, індукція CSPB призводить до посилення активності бета-галактозидази, експресувати з злитих транскриптів hns-lacz. Це збільшення відображає індукцію транскрипції hns і синтезу HNS після холодового шоку і in vitro залежить від присутності CSPA. Навпаки, експресія мутантної форми CSPB, яка нездатна зв'язуватися з суперскрученому ДНК in vitro, не мала впливу на ступені збільшення експресії генів, рівня синтезу білка або активність бета-галактозидази. Ці дані демонструють сильний вплив CSPB на синтез білка в E. Coli і припускають аналогічну функцію для CSPA в E. Coli в порівнянні з CSPB в B. Subtilis. Однак згодом було встановлено, що CSPA і CSPB по-різному пов'язуються з одноланцюжковою ДНК. Зокрема, в ході цих досліджень було встановлено, що, якщо CSPB пов'язує полі-Т олігонуклеотиди приблизно на порядок сильніше, ніж полі-U або полі-З одноланцюгові ssДНК, тоді як CSPA пов'язує полі-Т, полі-U та полі-С ssДНК з однаковою інтенсивністю.
Як і інші бактерії, Bacillus subtilis має сімейством гомологів невеликих кислих білків, синтез яких індукується у відповідь на холодовий шок. Делеція генів cspC або cspD не призводить до видимого зміни фенотипу, навпаки, подвійні мутанти по генах csp проявили серйозне зниження швидкості клітинного росту як при 15 0 C, так і при 37 0 C і погіршення виживаності під час стаціонарно фази зростання. За допомогою двовимірного гель-електрофорезу показано, що у подвійних мутантів за генами csp розрегульований синтез білка і втрата одного або двох білків CSP призводить до збільшення синтезу залишкових CSP при 37 0 C і після холодового шоку, що дозволяє припустити, що CSP інгібують синтез інших членів цього семі ства білків. Потрійний мутант cspB / C / D міг розмножуватися тільки в присутності CSPB, перенесеного плазмидой, що свідчить про те, що хоча б мінімальну кількість гена csp необхідно для життєздатності B. Subtilis. Після холодового шоку синтез CSPB в 64bcdbt був набагато нижчим, ніж у клітинах дикого типу, що супроводжувалося припиненням зростання і значним зменшенням загального синтезу білка. Оскільки як CSPB, CSPC, так і CSPD показали здатність зв'язувати РНК кооперативним та інтерактивним способом, передбачається, що білки CSP діють як РНК-шаперони, що полегшують ініціювання трансляції при оптимальних і низьких температурах.
При вивченні характеристик CSPB було встановлено, що CspB з Bacillus subtilis конформаційно стабільний лише у двох граничних станах, але чрезвича але швидко змінює свою укладання між цими стабільними станами. Вивчення відповідних білків холодового шоку з термофильном Bacillus caldolyticus і гіпертермофільно Thermotoga maritima показало, що вони мають значно вища конформаційної стабільністю, але з незмінно дуже швидко кінетики переходів між двома стабільними станами. Мабуть, це невід'ємна властивість невеликих білків, повністю складаються з вигинів.
У білку холодового шоку CSPB з Bacillus subtilis є три незахищених залишку фенілаланіну, які необхідні для його функціонування при зв'язуванні з одноланцюжковий суперскрученому нуклеїновими кислотами. Зазвичай гідрофобні бокові ланцюги фенілаланіну в складчастих білках заховані. Авторами була зроблена спроба з'ясувати, чи може експозиція цих залишків фенілаланіну бути причиною низької конформаційної стабільності CSPB. У ході експериментів були виміряні індуковані сечовиною та індуковані нагріванням рівноважні переходи для трьох мутантів CspB, у яких Phe 15, Phe 17 і Phe 27 індивідуально були замінені аланином. Несподівано було виявлено, що всі три мутації сильно дестабілізували CspB. Таким чином, ароматичні бічні ланцюги Phe 15, Phe 17 і Phe 27 в активному сайті важливі і для зв'язування з нуклеїновими кислотами, і для конформаційної стабільності.
У цілому, згідно з сучасними уявленнями, бактеріальні білки холодового шоку функціонують як регулятори трансляції і РНК-шаперони. Під час росту при 37 0 С CSP зв'язуються з мРНК і підтримують її в лині але формі. Під час трансляції рибосоми витісняють CSP з мРНК, оскільки CSP володіють більш низькою спорідненістю до мРНК. Під час холодового шоку відбувається різке збільшення вмісту CSP, оскільки це необхідно для врівноваження зростання стабільності вдруге структури мРНК.
Штучне зниження концентрації CSP призводить до утворення вдруге структури мРНК і припинення процесу трансляції.
Після різкого падіння температури різні види бактерій проявляють мультігенний відповідь. Докази такого роду відповіді на дію холоду у Salmonella typhimurium були отримані при визначенні діапазону індукованих низькими температурами злиттів генів, що містили Mudlux-вставки. З виділених Mudlux-злиття генів було знайдено одне, яке не виробляло Детектируемая світіння під час вирощування за 30 0 C, але виявило швидкі і високі рівень індукції при зниженні температури до 10 0 C. Мішень даного злиття гена, як було показано, розташована по сусідству з umudc опероном і кодує гомолог основного білка холодового шоку Escherichia coli, CSPA. Вивчення люмінесценції показало, що Детектируемая світіння відбувалося від злиття CspB: Mudlux при температурах нижче 22 0 C, але не при більш високих температурах, навіть після падіння температури від 30 0 C. Більш того, було виявлено, що рівні вмісту мРНК CSPB відповідають даній моделі люмінесценції, що дозволяє пропонувати, що експресія cspB відбувається нижче визначено порогової температури. Як було виявлено, мРНК CSPB дуже стабільна при 10 0 C, але стає надзвичайно нестабільно, коли температура піднімається вище порогової. Існуючі клітинні РНКази, таким чином, мабуть, опосередковує руйнування мРНК CSPB при високих температурах, але не здатні робити це при низьких температурах.
Необхідно відзначити, що білки холодового шоку в мезофільних і термофільних бактерій мають велику схожість у структурі, але вельми відрізняються в стабільності. Порівняння структури CSP з мезофіли і гіпертермофільно бактерії Thermotoga maritima показало велику значущість певних заряджених груп білкової молекули для її стабілізації при низькій температурі.
1. Вплив гіпотермії на вміст водорозчинних білків у тканинах вищих рослин
Припущення про те, що під час загартовування рослин до холоду відбувається синтез білків, було вперше висловлено Дж. Дойлом і П. клінчем в 1927 році. Перші докази того, що процес синтезу білка безпосередньо бере участь у загартовуванні рослини, були отримані Г. Сіміновіч. Згодом у багатьох роботах повідомлялося про зміну вмісту нуклеїнових кислот і загального білка під час загартовування рослин до холоду. Аналіз змін водо-і солерозчинних білків озимої пшениці після загартування і перезимівлі показав збільшення вмісту водорозчинних білків. У той же час зміст солерозчинних білків знижувався. За цими ознаками виявлені відмінності між озимою пшеницею сорту Безоста 1 і високозімостой мутантом цього сорту, отриманим під дією нітрозометілмочевіни. Амінокислотний аналіз досліджуваних білків виявив значні зміни за цією ознакою як у початково форми, так і у мутанта під дією перезимівлі. У ряді інших робіт повідомлялося про зміну змісту загального білка під час дії низької температури і загартовування. При вивченні біосинтезу білка під час низькотемпературної адаптації озимих злаків у зв'язку з їх морозостійкістю було встановлено, що у озимої пшениці, озимого жита та ячменю при зниженні температури з 18 0 С до 2 0 С у перші - третю добу адаптації відбувається зниження рівня синтезу білка, але на п'яту - сьому добу синтез білка зростає, при цьому 10-15% загально маси рослинного білка складають знову синтезовані білки, не були присутні в контрольних рослинах.
Під час перезимівлі рослин озимої пшениці відбуваються значні зміни у змісті білків у тканинах кореня і вузлів кущіння: спостерігається гідроліз білків у коренях і переміщення вільних амінокислот у вузли кущіння, причому якщо восени із зниженням температури кількість розчинних білків у коренях зменшується, то до весни воно збільшується . Накопичення білків за рахунок слабшого в порівнянні із зростанням уповільнення швидкості білкового синтезу зазначалося в клітинах кореня кукурудзи під впливом низької температури.
Застосування електрофорезу для поділу рослинних білків дозволило отримати нову інформацію про вплив гіпотермії на склад білків рослин. Різке зниження температури викликає помітні зміни в електрофоретичному спектрі легкорозчинних білків. Зокрема, в озимої пшениці в період перезимівлі виявлені значні зміни в складі білків, виділених з вузлів кущіння. У процесі загартовування утворення білків, судячи з кількості смуг в електрофоретичному спектрі, наростало, а в осінньо-зимовий період зменшувалася. Була відзначена сортова специфіка у відношенні цієї ознаки. Зокрема, морозостійкий сорт озимої пшениці відрізнявся від морозочувствітельного сорти великим числом смуг в електрофоретичному спектрі.
Поява нових смуг в спектрі білків під дією гіпотермії та в процесі загартовування рослин до холоду відзначається багатьма дослідниками. Зокрема, в ході процесу адаптації озимої пшениці до низьких негативних температур відзначалася поява в електрофоретичному спектрі білків з молекулярними масами 24 і 85 кДа, а також на додаток до них 67 і 74 кДа. При вивченні поліпептидного складу білків вузла кущіння озимої пшениці в процесі зимівлі було виявлено зміну змісту глобулінів з молекулярними масами 23 і 48 кДа. Загартовування озимої пшениці призводить і до змін у складі білків надземних органів, при цьому спостерігається новоутворення чітко виражених смуг в електрофоретичному спектрі у зонах високо-і нізкоподвіжних білків. Автори, враховуючи, що значна частина білків має ферментативними властивостями, припускають появу ферментів, які виявляються тільки при холодовому впливі на озиму пшеницю.
При дослідженні білків, синтез яких корелює зі зростанням холодостійкості клітинних культур Bromus inermis Leyss. cv. Manchar було відзначено посилення синтезу білків з молекулярними масами 25, 165, 190 і 200 кДа.
Одним з найбільш вивчених до теперішнього часу сімейств білків, вміст яких у рослині корелює з холодостійкість, є дегідріни. Дане сімейство білків має певні, характерні для цього сімейства послідовності амінокислот, що дозволяє достатньо легко і впевнено ідентифікувати його членів як на рівні транскриптів, так і на рівні індивідуальних білків. У зв'язку з цим члени даного сімейства в даний час інтенсивно вивчаються.
Значні зміни під дією холодового акліматизації були виявлені при вивченні експресії дегідрінов у ярих та озимих зернових культур. Було встановлено, що зміст дегідрінових транскриптів зростає з вересня по листопад, причому їх зміст у ярих культур зростає менше, ніж в озимих. При дослідженні експресії гена дегідріна було виявлено, що після 14 дні загартовування в контрольованих умовах в значних кількостях виявляються три транскрипту, гибрідизуючою з кДНК білка DHN-4. Після низькотемпературної гарту рослин в польових умовах до листопада в рослинах накопичувався високі рівень транскриптів дегідріна, при цьому рослини розвивали дуже високу морозостійкість. Збільшення рівня синтезу дегідріна з молекулярною масою 50 кДа під час холодової акліматизації було зазначено у пшениці. Було також встановлено, що деякі з поліпептидів, що з'являються під дією загартовування в інших культур, також відносяться до сімейства білків-дегідрінов.
За допомогою електрофорезу білків в градієнті ПААГ і ізоелектрофокусірованія було показано, що загартовані і незагартованих до холоду листя озимої пшениці мають розрізняються білкові спектри. Після загартовування спостерігалося поява білкових компонентів з високомолекулярної масою. У ряді робіт було висловлено припущення, що холодова обробка індукує синтез поліпептидів з відмінною первинно структурою, оскільки цими авторами було встановлено, що охолодження проростків ярої пшениці призводить до появи нових смуг не тільки в спектрах нативних білків, але і в електрофоретичних спектрах білків, оброблених додецилсульфатом натрію.
Ф.Р. Гимале з співавторами констатували, що під дією холодового шоку у пшениці відбувається індукція синтезу поліпептидів з молекулярними масами 50, 70 і 94 кДа. Згодом цими ж авторами було проведено скринінг ряду представників триби Triticeae для порівняння поліпептидів, що синтезуються у них під дією гіпотермії. Обробка об'єктів низькою температурою проводилася протягом 7 діб. Радіоактивна мітка вводилася протягом останніх 24 годин холодової обробки. За допомогою електрофорезу в ПААГ і радіоавтографіі було встановлено, що у всіх диплоїдних видів знизився рівень синтезу поліпептидів з молекулярною масою 50 і 66 кДа. У всіх цих видів у спектрі білків з'явився поліпептид з молекулярно масо 43 кДа. У рослинах виду T. urartu синтезувалися також білки з молекулярними масами 20, 27 і 37 кДа; у виду T. sinskajae - 20 і 37 кДа, а у T. monococcum - 20 і 27 кДа. У егілопсов в спектрах з'являлися білки з молекулярними масами 33 і 43 кДа і спостерігалося збільшення синтезу білків з молекулярними масами 20, 40, 50 і 62 кДа. У T. dicoccum спостерігалося зменшення синтезу білка з молекулярною масою 66 кДа і посилення синтезу білків з молекулярними масами 45 і 48 кДа. У білковому спектрі з'являлися смуги з молекулярними масами 20, 33 і 43 кДа. У T. aestivum спостерігалося поява в спектрі білків з молекулярними масами 43 кДа і 43 і 48 кДа. Зменшувалась включення радіоактивно мітки в білок 66 кДа і 46 кДа. У озимого жита було відзначено зниження включення мітки в білки з молекулярними масами 13, 38, 50 і 90 кДа та збільшення включення мітки в білки з молекулярними масами 15 і 22 кДа. У білковому спектрі з'являлася смуга з молекулярною масою 28 кДа. Автори виділяють ряд поліпептидів, які з'являються в білкових спектрах більшості досліджених видів рослин під дією низької температури.
З листя загартованої до холоду капусти був виділений і очищений білок, який захищав тилакоїди незагартованого шпинату від пошкодження при заморожуванні. Процедура виділення включала в себе осадження тепловою обробкою, осадження сульфатом амонію та глікозаміногліканів гепарину, а також колонкової хроматографії на Поліаміди 6 і обернено-фазну хроматографію на матриксі С-18. Після обернено-фазною хроматографії на електрофорезі була виявлена одна смуга з приблизною молекулярної масою 7 кДа. Ця фракція мала кріопротекторную активність. Гель-фільтрація підтвердила, що даний білок є мономером з молекулярною масою 7 кДа. Цей білок можна виділити тільки з загартованих до холоду рослин капусти, але не з рослин, вирощених у незакалівающіх умовах. З використанням мічених пероксидазою лектинів було показано, що даний кріопротектін є глікопротеїном і містить пов'язані залишок а1-3 пов'язаної фукози.
Листя омели містять трігалактозу і специфічні N-ацетилгалактозаміном-ізолектіновие групи. Групи ML I і ML III показали високу кріозахисних активність в ізольованих мембранах тилакоїдів шпинату в період замерзання і відтавання грунту, в той час як ML II не володіли такою активністю. У ході експериментів встановлено, що кріозахисних ефективність білків корелювала з їх відносно гідрофобністю. Було встановлено також, що морозостійкість листя омели сезонно регулюється природними умовами. У той час як листя, зібрані взимку, не пошкоджувалися при замерзанні грунту до -20 0 C, листя, зібрані в липні, зазнавали 70% витік електроліту після замерзання грунту до -5 0 C. Дані експериментів свідчать, що і кількість фракцій ML I і ML III змінюється протягом року. Найбільш високий вміст цих кріозахисних лектинів спостерігалося взимку і ранньою весною, а найбільш низький - у період літніх місяців. Змін в утриманні ML II не було зафіксовано. Ці дані підтверджують те, що деякі лектини можуть грати роль у стабілізації клітинних мембран під дією стресових умов навколишнього середовища.
При вивченні впливу розвитку морозостійкості на синтез білків було ідентифіковано сімейство білків, асоційоване з розвитком морозостійкості у пшениці. Дане сімейство білків специфічне для злаків і їх зміст регулюється низько температурою. Антитіла, отримані проти білка з мовляв. масою 50 кДа, реагують, принаймні, з п'ятьма членами даного сімейства. Використовуючи ці антитіла, були визначені зміст і локалізація даного сімейства білків у акліматизованих до холоду сходах пшениці. Вестерн-блот субклітинних частинок показав наявність всіх членів родини у цитозолі та очищених ядерних частинках. Після 21 дня холодової акліматизації озимої пшениці ці білки накопичувалися аж до 0.9% від всіх розчинних екстрагуються білків. Їх клітинна концентрація становила 1.34. Імуногістохімічне локалізація показала, що вміст цих білків найбільш високо в зоні судинного переходу. Ці білки не були виявлені в зріло ксилемі, у верхівковій меристемі пагонів або в бічних кореневих примордіїв. Дана тканеспеціфічная індукція дозволяє припускати, що чутливі клітини в областях, де вода має тенденцію замерзати в першу чергу, для свого захисту потребують більш високого вмісту цих білків.
Отримані дані добре відповідають тому факту, що відростання після замороження в значно мірою залежить від життєздатність цієї частини пагона. Електронно-мікроскопічний аналіз з використанням імунно-золотий мітки показав, що ці білки присутні в цитоплазмі і в нуклеоплазмі. У той же час вони не були знайдені в клітинних стінках або інших клітинних органелах. Дослідження кріозахисних дії in vitro показало, що білок WCS120 так само ефективно, як БСА та сахароза, захищає лактатдегідрогенази від денатурації в ході заморожування. Ці результати показують, що дане сімейство білків може бути залучено в загальний механізм захисту розчинних частинок клітини. Їхня присутність у нуклеоплазмі також дозволяє запропонувати як їх можливу функцію - запобігання процесів транскрипції. Висока гідрофільність, високий вміст даних білків і стійкість цих білків при кип'ятінні дозволяють пропонувати, що вони можуть забезпечувати особливу мікросередовище, необхідну для виживання клітини в чутливо зоні судинного переходу під час стресу при заморожуванні.
При дослідженні взаємозв'язку відповідей рослини на різні типи стресу було виявлено, що сольовий стрес збільшує морозостійкість у деяких видів трав'янистих рослин. З метою зрозуміти молекулярні основи збільшення индуцируемой холодовим стресом морозостійкості за допомогою двовимірного електрофорезу в ПААГ був проаналізований ефект обробки сольовим розчином на склад загальних білків рослин картоплі. Після 24-годинної обробки NaCl, під час якої холодостійкість зросла в три рази, були виявлені дев'ять індукованих сольовим стресом білків. Пряме порівняння цих білків з білками, індуковані низькотемпературним стресом і екзогенно абсцизової кислотою, дозволило встановити, що п'ять індукованих сольовим стресом білків индуцировали також низькотемпературним стресом, а сім - обробкою абсцизової кислотою. Три білка 13/7.0, 27/6.6 і 48/6.9) індукувати і холодом і екзогенно абсцизової кислотою і були пов'язані зі зміною морозостійкості. Після 6 годин обробки сіллю, перед тим як розвивалася холодостійкість, ендогенних рівень абсцизової кислоти в листках короткочасно збільшувався в шість разів. Результати дозволяють вважати, що сольова індукція холодового загартовування включає синтез холодоіндуціруемих і індукованих абсцизової кислотою білків, а також те, що зміна білкового синтезу можна пов'язати зі збільшенням концентрації абсцизової кислоти у відповідь на сольовий стрес. Ці дані також дозволяють припускати, що деяка частина білків, індукованих холодом і абсцизової кислотою, пов'язана з сольовим стресом.
2. Вплив гіпотермії на вміст водорозчинних білків у тканинах бактерій і водоростей
Зміна експресії водорозчинних білків у відповідь на зниження температури спостерігається також і у водрослей і у бактерій. Під час різкого зниження температури в бактеріях тимчасово експресуються на високому рівні «індуковані холодом білки». За допомогою двовимірного електрофорезу в ПААГ були ідентифіковані деякі з цих білків. Незважаючи на це, загальні функції даних білків, як відповіді організму на холодовий шок, в даний час все ще незрозумілі. Останнім часом найбільшу увагу дослідників сфокусовано на групі «білків холодового шоку», синтез яких, як було показано, в значно мірою індукується під час холодового шоку і після нього і які грають важливу регуляторну роль у фізіології адаптації мікроорганізмів до низьких температур. E. Coli, B. Subtilis і B. Cereus володіють сімейством білків, що нараховує, щонайменше, 3 - 7 білків CSP - невеликих кислих білків, які мають між собою більше 45% ідентичності в послідовності амінокислот. Останні дані підтверджують, що члени цього широко розповсюдженого сімейства білків можуть in vitro діяти як на рівні транскрипції, так і на рівні трансляції. Тим не менш, всі функції CSP залишаються невідомі. До того ж, відповідно до недавно отриманими даними, в індукції синтезу CSP також грає важливу роль Посттрансляційна регуляція. У цей процес можуть бути також залучені рибосоми. Це припущення знаходиться у відповідності з моделлю, в якій, як передбачається, рибосоми є температурним сенсором в бактеріях.
Перенесення Enterococcus faecalis в умови низько температури викликав посилення експресії 11 білків холодового шоку. Крім того, мезофільні прокаріоти синтезували також 10 білків холодової акліматизації, 5 з яких збігалися з білками холодового шоку, під час тривалого росту при температурі 8 0 С.
Listeria monocytogenes - грампозитивних продовольчий патоген - здатний рости при температурі холодильника. При зниженні температури від 37 до 5 0 C у L. monocytogenes індукується синтез дванадцяти білків холодового шоку з молекулярними масами 48,6; 41,0; 21,8; 21,1; 19,7; 19,2; 18,8; 17,2; 15,5; 14,5 і 14,0 кДа. Це було встановлено в експериментах по включенню мітки з наступним двовимірним електрофорезом в гелі. Штам SLCC53 показав аналогічну відповідь на холодовий шок. Білки холодової акліматизації спостерігалися в культурах штаму 10403S в умовах росту при 5 0 C, чотири з цих білків, з молекулярними масами 48,0; 21,1; 19,7 і 18,8 кДа, також були білками холодового шоку. Два чутливих до холоду транспозон-індукованих мутанта включали мітку менш ефективно, ніж нечутливі до холоду батьківськи штам, але в той же час відповідна індукція білків холодового шоку у вивчених мутантів була дуже схожа на відповідну індукцію батьківського штаму.
Дальне шиї вивчення основного білка холодового шоку Listeria monocytogenes за допомогою двовимірного електрофорезу показало, що його ізоелектрична точка складає 5.1. За допомогою N-термінального сиквенсу отриманого за допомогою двовимірного електрофорезу білку була встановлена його повна ідентичність з негеміновим залізозв'язуючих феритином з Listeria innocua. Очищення цього феритин-подібного білка дозволила встановити, що його нативна молекулярна маса становить близько 100-110 кДа, що свідчить про те, що він складається з шести 18 кДа субодиниць. Нозерн-блот аналіз показав присутність його 0.8 kb мРНК у клітинах під час фази експоненціального зростання, а також значне збільшення кількості мРНК цього білка як після падіння, так і після зростання температури.
CSPA є основним білком холодового шоку E. coli, його синтез значно зростає у відповідь на холодовий шок. Амінокислотна послідовність CSPA має 43% ідентичності «домену холодового шоку» еукаріотичного Y-box семі ства білків, члени якого взаємодіють з РНК і ДНК для регуляції їх функцій. Показано, що CSPA кооперативно зв'язується з денатурований під дією низько температури одноланцюжковий РНК, розміром більше, ніж 74 підстави. Для його кооперативного зв'язування необхідна мінімальна концентрація CSPA 2.7х10 -5 М, що значно нижче, ніж присутня в клітині після холодового шоку концентрація CSPA. Для зв'язування CSPA не було встановлено специфічних послідовностей РНК, що показує, що він може зв'язуватися з широким спектром послідовностей. Коли складається з 142 підстав 5'-нетрансльовані ділянку власної мРНК CSPA був використаний як субстрат для рибонуклеази А і Т1, додавання CSPA значно стимулювало гідроліз РНК шляхом запобігання утворенню РНКазоустойчівих зв'язків через утворення стабільних вторинних структур в 5'-нетрансльованою ділянці. Ці дані показують, що зв'язування CSPA з РНК дестабілізує вторинну структуру РНК і робить її доступно для рибонуклеази. Передбачається, що CSPA діє як шаперон РНК для запобігання утворення вдруге структури у РНК при низьких температурах. Ця функція CSPA може бути необхідна для ефективно трансляції мРНК при низьких температурах і, мабуть, може також впливати на процес транскрипції.
При падінні температури в клітинах Escherichia coli виявлена сильна індукція синтезу найважливішого білка холодового шоку - CSPA. Оскільки цей білок дуже консервативний, було використано підхід, заснований на PCR з використанням пари дегенерованих праймерів, отриманих з високо консервативних областей cspA-пов'язаних білків, щоб довести присутність як мінімум трьох пов'язаних з cspA генів у Lactacoccus lactis. Один з них, cspB, був клонований і секвенований. Він кодує білок з 66 амінокислот, який володіє 60% тотожності послідовності з CSPA з Escherichia coli. Після холодового шоку рівень транскриптів мРНК CspB збільшувався, що було показано за допомогою Нозерн-блот гібридизації. Крім того, спостерігалася індукція активності CSPB-залежною бета-галактозидази. Ці результати вказують на те, що ген cspB з L. Lactis індукується холодовим шоком.
Білок холодового шоку Bacillus subtilis, CSPB, після гіпотермії впливає на рівень вмісту декількох інших білків холодового шоку в B. Subtilis. Експресія CSPB в Escherichia coli при 37 0 C - в умовах, коли білки холодового шоку CSPA і CSPB E. Coli не виявляються - призводить до помітного зниження швидкості росту клітин і має значний вплив на рівень синтезу інших білків. При цьому відбувається як зменшення, так і збільшення рівні синтезу специфічних білків. Зокрема, індукція CSPB призводить до посилення активності бета-галактозидази, експресувати з злитих транскриптів hns-lacz. Це збільшення відображає індукцію транскрипції hns і синтезу HNS після холодового шоку і in vitro залежить від присутності CSPA. Навпаки, експресія мутантної форми CSPB, яка нездатна зв'язуватися з суперскрученому ДНК in vitro, не мала впливу на ступені збільшення експресії генів, рівня синтезу білка або активність бета-галактозидази. Ці дані демонструють сильний вплив CSPB на синтез білка в E. Coli і припускають аналогічну функцію для CSPA в E. Coli в порівнянні з CSPB в B. Subtilis. Однак згодом було встановлено, що CSPA і CSPB по-різному пов'язуються з одноланцюжковою ДНК. Зокрема, в ході цих досліджень було встановлено, що, якщо CSPB пов'язує полі-Т олігонуклеотиди приблизно на порядок сильніше, ніж полі-U або полі-З одноланцюгові ssДНК, тоді як CSPA пов'язує полі-Т, полі-U та полі-С ssДНК з однаковою інтенсивністю.
Як і інші бактерії, Bacillus subtilis має сімейством гомологів невеликих кислих білків, синтез яких індукується у відповідь на холодовий шок. Делеція генів cspC або cspD не призводить до видимого зміни фенотипу, навпаки, подвійні мутанти по генах csp проявили серйозне зниження швидкості клітинного росту як при 15 0 C, так і при 37 0 C і погіршення виживаності під час стаціонарно фази зростання. За допомогою двовимірного гель-електрофорезу показано, що у подвійних мутантів за генами csp розрегульований синтез білка і втрата одного або двох білків CSP призводить до збільшення синтезу залишкових CSP при 37 0 C і після холодового шоку, що дозволяє припустити, що CSP інгібують синтез інших членів цього семі ства білків. Потрійний мутант cspB / C / D міг розмножуватися тільки в присутності CSPB, перенесеного плазмидой, що свідчить про те, що хоча б мінімальну кількість гена csp необхідно для життєздатності B. Subtilis. Після холодового шоку синтез CSPB в 64bcdbt був набагато нижчим, ніж у клітинах дикого типу, що супроводжувалося припиненням зростання і значним зменшенням загального синтезу білка. Оскільки як CSPB, CSPC, так і CSPD показали здатність зв'язувати РНК кооперативним та інтерактивним способом, передбачається, що білки CSP діють як РНК-шаперони, що полегшують ініціювання трансляції при оптимальних і низьких температурах.
При вивченні характеристик CSPB було встановлено, що CspB з Bacillus subtilis конформаційно стабільний лише у двох граничних станах, але чрезвича але швидко змінює свою укладання між цими стабільними станами. Вивчення відповідних білків холодового шоку з термофильном Bacillus caldolyticus і гіпертермофільно Thermotoga maritima показало, що вони мають значно вища конформаційної стабільністю, але з незмінно дуже швидко кінетики переходів між двома стабільними станами. Мабуть, це невід'ємна властивість невеликих білків, повністю складаються з вигинів.
У білку холодового шоку CSPB з Bacillus subtilis є три незахищених залишку фенілаланіну, які необхідні для його функціонування при зв'язуванні з одноланцюжковий суперскрученому нуклеїновими кислотами. Зазвичай гідрофобні бокові ланцюги фенілаланіну в складчастих білках заховані. Авторами була зроблена спроба з'ясувати, чи може експозиція цих залишків фенілаланіну бути причиною низької конформаційної стабільності CSPB. У ході експериментів були виміряні індуковані сечовиною та індуковані нагріванням рівноважні переходи для трьох мутантів CspB, у яких Phe 15, Phe 17 і Phe 27 індивідуально були замінені аланином. Несподівано було виявлено, що всі три мутації сильно дестабілізували CspB. Таким чином, ароматичні бічні ланцюги Phe 15, Phe 17 і Phe 27 в активному сайті важливі і для зв'язування з нуклеїновими кислотами, і для конформаційної стабільності.
У цілому, згідно з сучасними уявленнями, бактеріальні білки холодового шоку функціонують як регулятори трансляції і РНК-шаперони. Під час росту при 37 0 С CSP зв'язуються з мРНК і підтримують її в лині але формі. Під час трансляції рибосоми витісняють CSP з мРНК, оскільки CSP володіють більш низькою спорідненістю до мРНК. Під час холодового шоку відбувається різке збільшення вмісту CSP, оскільки це необхідно для врівноваження зростання стабільності вдруге структури мРНК.
Штучне зниження концентрації CSP призводить до утворення вдруге структури мРНК і припинення процесу трансляції.
Після різкого падіння температури різні види бактерій проявляють мультігенний відповідь. Докази такого роду відповіді на дію холоду у Salmonella typhimurium були отримані при визначенні діапазону індукованих низькими температурами злиттів генів, що містили Mudlux-вставки. З виділених Mudlux-злиття генів було знайдено одне, яке не виробляло Детектируемая світіння під час вирощування за 30 0 C, але виявило швидкі і високі рівень індукції при зниженні температури до 10 0 C. Мішень даного злиття гена, як було показано, розташована по сусідству з umudc опероном і кодує гомолог основного білка холодового шоку Escherichia coli, CSPA. Вивчення люмінесценції показало, що Детектируемая світіння відбувалося від злиття CspB: Mudlux при температурах нижче 22 0 C, але не при більш високих температурах, навіть після падіння температури від 30 0 C. Більш того, було виявлено, що рівні вмісту мРНК CSPB відповідають даній моделі люмінесценції, що дозволяє пропонувати, що експресія cspB відбувається нижче визначено порогової температури. Як було виявлено, мРНК CSPB дуже стабільна при 10 0 C, але стає надзвичайно нестабільно, коли температура піднімається вище порогової. Існуючі клітинні РНКази, таким чином, мабуть, опосередковує руйнування мРНК CSPB при високих температурах, але не здатні робити це при низьких температурах.
Необхідно відзначити, що білки холодового шоку в мезофільних і термофільних бактерій мають велику схожість у структурі, але вельми відрізняються в стабільності. Порівняння структури CSP з мезофіли і гіпертермофільно бактерії Thermotoga maritima показало велику значущість певних заряджених груп білкової молекули для її стабілізації при низькій температурі.