Реферат на тему:
Штучний синтез олігонуклеотидів
2009
Штучний синтез олігонуклеотидів
2009
1. Штучний синтез олігонуклеотидів
Штучний хімічний синтез заданої послідовності рибо-або дезоксірібонуклеозідов (типу РНК і ДНК).
Перший нуклеотид послідовності через його 5'-фосфатну групу хімічно закріплюють на твердій основі, наприклад, полістиролу. Всі потенційно хімічно активні групи і атоми його нуклеїнового підстави (аміногрупи, кисень) тимчасово блокуються приєднанням інертної «захисту». 3'-ОН група цукру не блокується.
Всі нуклеотиди, що підлягають послідовному приєднання теж завчасно захищаються не тільки по нуклеїнових підставах, але і по 3'-ОН групи рибози або дезоксирибози. Активність фосфорної кислоти, приєднаної по 5'-положенню цукру приборкується «навішуванням» хлорбензолу по одному з її киснем. Таким чином, для реакції залишається вільною тільки ОН-група цієї кислоти.
Тепер в реакційне середовище вносять другий за заданому порядку нуклеотид послідовності - захищений, як це було тільки що описано. В реакції між двома ОН-групами відщеплюється вода і встановлюється ковалентний фосфодіефірних зв'язок двох нуклеотидів. Потім знімається хімічний захист з 3'-ОН групи тільки що приєдналася другого нуклеотиду і в реакційне середовище вносять третій захищений нуклеотид ... І так далі. Зрозуміло, відщеплення води та освіта фосфодіефірних зв'язку відбувається не саме собою, а в присутності складного хімічного каталізатора реакції.
Після закінчення синтезу заданої ланцюжка олігонуклеотиду все захисту знімаються і олігонуклеотиди відділяється від твердої підкладки.
Сучасні автоматичні синтезатори виробляють таку «збірку» олігонуклеотидів за заданою програмою на довжину до сотні нуклеїнових основ.
Згадаю ще, що недавно знайдений спосіб нарощування штучної ланцюга олігонуклеотидів із заміною хімічного каталізатора на опромінення цього ланцюга променем лазера на кожній наступній ступені синтезу. Це згадка незабаром нам стане в нагоді.
Отримавши описаним способом відрізок однієї нитки потрібного фрагмента ДНК, побудова другої нитки по ньому, як по матриці, можна доручити ДНК-полімеразі.
1.1 секвенатори білків
Залишається сказати кілька слів про ще один автоматі, що надає в розпорядження дослідника необхідну для всього подальшого послідовність амінокислот у вихідному білку. Перший варіант такого автомата був запропонований ще в 1967 році Ердманом і Бегг. Він настільки добре зарекомендував себе, що в основних рисах зберігся до цих пір. Єдине, але не менш важливе його поліпшення полягає в тому, що сучасні секвенатори можуть аналізувати амінокислотну послідовність з обох кінців білкової молекули (N-кінця і С-кінця), в той час, як ланцюг реакцій, запропонованих Ердманом вирішувала тільки першу з цих двох завдань .
Згадана ланцюг хімічних реакцій в деталях нам ще не доступна, тому я обмежуся загальної словесною характеристикою її 3-х етапів, звертаючи увагу на фізичний стан і характеристики реагентів.
На 1-му етапі якась складна органічна речовина у водному, злегка лужному середовищі приєднується до досліджуваного білку з його N-кінця. На 2-му етапі воно відокремлюється від білка, «прихопивши» з собою кінцеву амінокислоту. Цей етап доводиться проводити в кислому безводній середовищі. У результаті виходить складне і дуже гідрофобна похідне кінцевої амінокислоти та скорочений на одну ланку білок. Їх можна розділити між собою переводячи в такий органічний розчинник, у якому укорочений білок випадає в осад, а модифікована амінокислота в цьому розчиннику може бути виведена з приладу для її подальшої (хроматографічної) ідентифікації. . Перед початком наступного циклу осад білка повинен бути знову розчинений у водному, злегка лужного середовища.
Зі сказаного ясно, що в ході повного циклу реакції необхідно міняти розчинники, осаджувати один з компонентів (білок), екстрагувати інший, промивати осад, сушити його і знову розчиняти. Всі ці операції за певною програмою вдається здійснити за допомогою швидко обертається (> 1500 об / хв) скляною чашечки, яка служить реакційним посудиною (рис. 32).
Рис. 32.
У неї вносять вихідний препарат розчину білка. По центральній трубці на конічне дно чашечки один за іншим подаються необхідні рідкі реагенти. Завдяки обертанню вони тонким шаром піднімаються по стінках чашки. Їх кількість і швидкість обертання можна підібрати так, що шар не досягає канавки, виконаної у верхній частині внутрішньої поверхні. Тонка плівка прилеглої до стінки рідини ідеально підходить для екстракції з неї речовини в іншу тонку плівку. Її утворює не змішується з попередньою рідиною органічний розчинник, який піднімається по поверхні першого плівки. Тут же здійснюється центрифугування. На стінках чашки осідають укорочені поліпептидні ланцюги білка, в той час, як органічний розчинник вимиває з реакційної суміші відщепилися гідрофобну похідну черговий амінокислоти. Для цієї мети розчинник подається в надлишку, шар його піднімається до канавки, звідки через другу трубочку розчин модифікованої амінокислоти надходить у колектор фракцій. Обложений на стінки білок там же промивається і висушується, а потім знову розчиняється в злегка лужний водному середовищі. Далі весь цикл повторюється ...
За наступні роки прилад Ердмана і Бегг був технічно удосконалений і переведений на комп'ютерний контроль, але первинний принцип його пристрою зберігся.
Штучний хімічний синтез заданої послідовності рибо-або дезоксірібонуклеозідов (типу РНК і ДНК).
Перший нуклеотид послідовності через його 5'-фосфатну групу хімічно закріплюють на твердій основі, наприклад, полістиролу. Всі потенційно хімічно активні групи і атоми його нуклеїнового підстави (аміногрупи, кисень) тимчасово блокуються приєднанням інертної «захисту». 3'-ОН група цукру не блокується.
Всі нуклеотиди, що підлягають послідовному приєднання теж завчасно захищаються не тільки по нуклеїнових підставах, але і по 3'-ОН групи рибози або дезоксирибози. Активність фосфорної кислоти, приєднаної по 5'-положенню цукру приборкується «навішуванням» хлорбензолу по одному з її киснем. Таким чином, для реакції залишається вільною тільки ОН-група цієї кислоти.
Тепер в реакційне середовище вносять другий за заданому порядку нуклеотид послідовності - захищений, як це було тільки що описано. В реакції між двома ОН-групами відщеплюється вода і встановлюється ковалентний фосфодіефірних зв'язок двох нуклеотидів. Потім знімається хімічний захист з 3'-ОН групи тільки що приєдналася другого нуклеотиду і в реакційне середовище вносять третій захищений нуклеотид ... І так далі. Зрозуміло, відщеплення води та освіта фосфодіефірних зв'язку відбувається не саме собою, а в присутності складного хімічного каталізатора реакції.
Після закінчення синтезу заданої ланцюжка олігонуклеотиду все захисту знімаються і олігонуклеотиди відділяється від твердої підкладки.
Сучасні автоматичні синтезатори виробляють таку «збірку» олігонуклеотидів за заданою програмою на довжину до сотні нуклеїнових основ.
Згадаю ще, що недавно знайдений спосіб нарощування штучної ланцюга олігонуклеотидів із заміною хімічного каталізатора на опромінення цього ланцюга променем лазера на кожній наступній ступені синтезу. Це згадка незабаром нам стане в нагоді.
Отримавши описаним способом відрізок однієї нитки потрібного фрагмента ДНК, побудова другої нитки по ньому, як по матриці, можна доручити ДНК-полімеразі.
1.1 секвенатори білків
Залишається сказати кілька слів про ще один автоматі, що надає в розпорядження дослідника необхідну для всього подальшого послідовність амінокислот у вихідному білку. Перший варіант такого автомата був запропонований ще в 1967 році Ердманом і Бегг. Він настільки добре зарекомендував себе, що в основних рисах зберігся до цих пір. Єдине, але не менш важливе його поліпшення полягає в тому, що сучасні секвенатори можуть аналізувати амінокислотну послідовність з обох кінців білкової молекули (N-кінця і С-кінця), в той час, як ланцюг реакцій, запропонованих Ердманом вирішувала тільки першу з цих двох завдань .
Згадана ланцюг хімічних реакцій в деталях нам ще не доступна, тому я обмежуся загальної словесною характеристикою її 3-х етапів, звертаючи увагу на фізичний стан і характеристики реагентів.
На 1-му етапі якась складна органічна речовина у водному, злегка лужному середовищі приєднується до досліджуваного білку з його N-кінця. На 2-му етапі воно відокремлюється від білка, «прихопивши» з собою кінцеву амінокислоту. Цей етап доводиться проводити в кислому безводній середовищі. У результаті виходить складне і дуже гідрофобна похідне кінцевої амінокислоти та скорочений на одну ланку білок. Їх можна розділити між собою переводячи в такий органічний розчинник, у якому укорочений білок випадає в осад, а модифікована амінокислота в цьому розчиннику може бути виведена з приладу для її подальшої (хроматографічної) ідентифікації. . Перед початком наступного циклу осад білка повинен бути знову розчинений у водному, злегка лужного середовища.
Зі сказаного ясно, що в ході повного циклу реакції необхідно міняти розчинники, осаджувати один з компонентів (білок), екстрагувати інший, промивати осад, сушити його і знову розчиняти. Всі ці операції за певною програмою вдається здійснити за допомогою швидко обертається (> 1500 об / хв) скляною чашечки, яка служить реакційним посудиною (рис. 32).
Рис. 32.
У неї вносять вихідний препарат розчину білка. По центральній трубці на конічне дно чашечки один за іншим подаються необхідні рідкі реагенти. Завдяки обертанню вони тонким шаром піднімаються по стінках чашки. Їх кількість і швидкість обертання можна підібрати так, що шар не досягає канавки, виконаної у верхній частині внутрішньої поверхні. Тонка плівка прилеглої до стінки рідини ідеально підходить для екстракції з неї речовини в іншу тонку плівку. Її утворює не змішується з попередньою рідиною органічний розчинник, який піднімається по поверхні першого плівки. Тут же здійснюється центрифугування. На стінках чашки осідають укорочені поліпептидні ланцюги білка, в той час, як органічний розчинник вимиває з реакційної суміші відщепилися гідрофобну похідну черговий амінокислоти. Для цієї мети розчинник подається в надлишку, шар його піднімається до канавки, звідки через другу трубочку розчин модифікованої амінокислоти надходить у колектор фракцій. Обложений на стінки білок там же промивається і висушується, а потім знову розчиняється в злегка лужний водному середовищі. Далі весь цикл повторюється ...
За наступні роки прилад Ердмана і Бегг був технічно удосконалений і переведений на комп'ютерний контроль, але первинний принцип його пристрою зберігся.
2. Множення кількості індивідуального білка
Перспектива напрацювання великої кількості індивідуального білка як продукту діяльності вторгнувшегося з плазміди в бактерію гена. Цей ген повинен бути тим самим геном, який спочатку кодував синтез потрібного нам білка. Тільки і всього! Але подивимося, чи так просто отримати цей ген, виходячи тільки з наявності в нашому розпорядженні самого білка? Будемо вирішувати це завдання для білка тваринного походження. Тут вона в певній мірі складніше через сплайсингу мРНК і практично важливіше. В її рішенні явно проглядаються два етапи:
1) Отримати індивідуальну іРНК, відповідальну за синтез даного нас білка.
2) На базі цієї іРНК створити двунітевих структуру ДНК, відтворюючу якщо і не весь ген, то його «значущу» частина - ту сукупність послідовних ділянок, які диктують синтез відповідних екзонів іРНК. Такий «раціонально укорочений» ген можна вбудовувати в плазміду. Він в бактерії-реципієнті забезпечить синтез повноцінної іРНК, а слідом за нею і напрацювання потрібного нам білка. Мені зручніше буде почати з цього другого етапу.
2.1 Відтворення «значущою» частини гена за відомою іРНК
Припустимо, що ми маємо в своєму розпорядженні достатню кількість нашої індивідуальної іРНК. Розглянемо послідовність операцій, що дозволяє провести метаморфозу цієї іРНК у відповідну їй частину гена прямо в пробірці.
Нам відомо, що іРНК тваринного походження на своєму 3'-кінці несе довгий «хвіст» аденінових нуклеотидів (полі А).
1 етап. Додамо до розчину нашої іРНК в достатній кількості олігонуклеотиди довжиною в десяток-другий дезоксіріботі-мідінов (оліго ДТ). Ми вже знаємо, як його можна синтезувати. Олиго дт може гібрідізоваться з полі А. Створимо для цього оптимальні умови (буфер, концентрація солі, помірно підвищена температура). Ми отримаємо структуру, з якої почнеться 2-й етап.
2 етап. Додамо в розчин нам ще не зустрічався фермент - «зворотну транскриптазу». У присутності 4-х дезоксирибонуклеотидів цей фермент здатний вести комплементарний синтез ДНК по матриці РНК в нормальному напрямку від 3 "до 5'-кінця матриці. Він теж потребує праймера, яким для нього послужить вже сидить на 3'-кінці іРНК оліго дт
3 етап. Обробимо отриманий РНК-ДНК гібрид згаданої раніше рибонуклеаза М. Вона якраз руйнує РНК, що знаходиться в двунітевих гібридному комплексі з ДНК (див. там же). Однак поставимо цей фермент в такі умови, щоб наша іРНК була зруйнована не до кінця - залишилися невеликі її ділянки.
4 етап. Від цих ділянок, як від праймерів, почне працювати вноситься на цьому етапі ДНК-полімераза I. Вона, як нам відомо, не тільки веде матричний синтез ДНК, але і володіє S'-S * екзо-нуклеазну активністю. Завдяки цьому вона руйнує залишки іРНК і утворює з синтезованих нею фрагментів, не без допомоги все тієї ж ДНК-лігази, повноцінну нитка ДНК.
Отриману таким чином двухнитевой молекулу прийнято іменувати «кДНК», маючи на увазі, що вона є комплементарно збудованим відображенням вихідної іРНК. Ця ДНК відповідає значущої послідовності нашого гена, оскільки всі інтрони (повторю це ще раз) були «вирізані» вже при виході вихідної іРНК з ядра в цитоплазму. РНК-полімераза бактерії, якій доведеться транскрибувати плазмідну ДНК, на ділянці цієї вбудованої кДНК справить повноцінну іРНК для синтезу даного нас білка.
2.2 ЧІП-методика
Більш проста частина завдання отримання гена, коли в нашому розпорядженні є потрібна індивідуальна іРНК. Але як її здобути, якщо ми маємо лише деякою кількістю клітин тваринного походження, в яких синтезувався цікавить нас білок, і, отже, є відповідна йому іРНК?
Очевидно почати треба з того, що відокремити сумарну фракцію всіх іРНК цих клітин від всіх інших РНК. Для цього достатньо закріпити на нерухомій твердій основі в достатній кількості молекули все того ж оліго ДТ і пропустити повз них розчин всіх виділених РНК клітин. Це робиться методом колонкової «афінної» хроматографії, з яким ми свого часу будемо знайомитися докладно. Але і так ясно, що неважко створити умови, при яких закріплені нерухомо оліго БТ «вихоплять» з протікає повз розчину сумарних РНК всі молекули іРНК шляхом гібридизації з їх полі А «хвостами». Всі інші РНК спокійно протекут мимо. Після чого будь-яким досить м'яким способом (нагріванням або дією слабкої лугу) можна буде розірвати водневі зв'язку полі А - оліго дт гібридів і отримати в розчині сумарну фракцію всіх іРНК.
Тепер справа за тим, щоб з цієї сумарної фракції виловити потрібну нам індивідуальну іРНК, відповідальну за синтез даного нас білка. Здавалося б це зробити не так вже й складно.
Ми можемо без особливих зусиль за допомогою секвенатори білків встановити амінокислотну послідовність (хоча б і неповну) нашого білка. Далі, використовуючи генетичний код, встановити якусь послідовність нуклеотидів (не менше 20-ти), що відповідає певній послідовності амінокислот (не менше семи) в нашому білку. Синтезувати цю послідовність, як описано вище, знову закріпити на нерухомій основі і пропустити повз неї сумарний розчин всіх іРНК. Завдяки гібридизації з досить протяжним ділянкою свого гена (нехай і штучно синтезованого) ми можемо знову виловити тепер вже нашу індивідуальну іРНК. Помилки тут бути не може. Імовірність того, що в двох різних іРНК виявляться однакові послідовності, комплементарні до одного й того ж ділянці гена довжиною в 20 нуклеотидів практично дорівнює нулю.
Ніби все просто, але ... згадаємо, що генетичний код-то вироджений. Нам нізвідки дізнатися як в даному конкретному випадку була використана ця вирожденність. І це раптом надзвичайно ускладнює завдання. Верхня строчка позначає послідовність із семи амінокислот, яку ми, припустимо, вибрали з відомої амінокислотної послідовності нашого білка. Вибрали далеко не найважчий випадок. Із семи амінокислот тільки двом відповідає по 4 кодони. Немає ні однієї «шестікодонной» амінокислоти і навіть фігурує триптофан, яка має лише один кодон. Навіть і в цьому випадку для того, щоб напевно «зловити» потрібну нам іРНК доведеться перепробувати всі варіанти. Тобто синтезувати не одну послідовність з 21-го нуклеотиду, а всі можливі послідовності, вичерпні всі допустимі комбінації використання дозволених кодонів. Неважко підрахувати число: 4-2'2'2-4'1-2 = 256.
Отже, треба буде синтезувати 256 21-членних олігонуклеотидів і 256 разів повторити досліди по гібридизації із сумарною фракцією всіх іРНК. Це - величезна робота (хоча і дріб'язкова в порівнянні з деякими іншими сучасними дослідженнями, коли доводиться ставити тисячі паралельних дослідів по гібридизації).
Не будемо поки думати про синтез 256-ти олігонуклеотидів. Все-таки, їх буде виконувати машина. Але 256 разів повторювати досліди по гібридизації! З усіма необхідними промивками і контролями. Тут вкрай потрібна автоматизація. А раз так, то відповідний прилад повинен з'явитися на ринку наукової апаратури. І він з'являється.
Уявіть собі настільний прилад, не набагато більше звичайного телевізора. На масивній, строго горизонтально встановленої сталевий плиті є гніздо для точної фіксації якоїсь «плашки». Остання являє собою прямокутну пластинку з плексигласу розміром 95 х 130 мм. У ній рівномірно розташовані 24 ряду лунок, по 16 у кожному ряду, місткістю по 50 мікролітрів. Ряди і стовпчики лунок пронумеровані. У них попередньо заливають по 10 мікролітрів суміші водного розчину мономерів, які потім перетворяться в пористий поліакріламідний гель, світлочутливий каталізатор цього перетворення і необхідні нам синтетичні олігонуклеотиди. У даному прикладі 256 різних олігонуклеотидів треба буде внести в 256 лунок - відповідно до програми, зазначеної комп'ютером, який буде керувати всіма подальшими маніпуляціями приладу.
В іншому місці на тій же масивної плиті за допомогою пружних упорів у певні положення можуть бути укладені до восьми предметних стекол від мікроскопа. Верхня поверхня цих стекол покрита гідрофобною плівкою, що несе в собі активні хімічні речовини, здатні під дією ультрафіолетового світла зв'язуватися з поліакриламідними гелем. Крім того на цій же пластині є два великих колодязя діаметром 2 см. Через один з них по команді від комп'ютера може прокачуватися дистильована вода. У другу криницю заливають етанол. Нарешті, ще в цій же плиті зроблено отвір, що веде в сушильну камеру, що знаходиться під плитою.
На нижній поверхні другої масивної плити, розташованої півметрів вище першої, змонтована вся рухома система. Вона складається з двох прецизійних ходових гвинтів, обертанням яких укріплена на них «каретка» може бути доставлена в будь-яке місце над нижньою плитою. Обертанням гвинтів, природно, теж керує комп'ютер.
На каретці змонтована вертикальна сталева голка діаметром 0,3 мм з плоским нижнім торцем. До неї встановлено на стійці сталеве кільце діаметром в 1 мм. Голка може опускатися і підніматися - разом з кільцем або окремо від нього так, що її торець перетинає площину кільця.
За заданою програмою механічний привід за 1 секунду переносить голку і кільце в положення точно над черговою лункою плашки. Торець голки під час цього перенесення піднімається вище кільця. Потім кільце миттєво опускається в лунку. Завдяки малому діаметру кільця рідина утворює у його площині стійку плівку. Потім, також за 1 секунду, каретка переносить голку з кільцем в задане положення над одним із предметних скла - з точністю в ± 10 мікрон! Сухий стрижень голки опускається, пронизує плівку, змочується і з легким ударом (пружінка!) стосується своїм торцем скла. Рідина з нього струшується. На поверхні скла утворюється крихітна крапля, діаметром 0,3 мм, яка не розтікається завдяки гідрофобності покриття на склі.
Потім голка і кільце так само швидко переносяться в положення над колодязем з водою і опускаються в нього. Одночасно включається насосик, кільце і голка енергійно споліскувати. Потім вони точно так само переносяться в колодязь з етанолом, потім у сушильну камеру ... Через приблизно 5 секунд після початку серії описаних операцій голка і кільце знову виявляються вже над іншою лункою (відповідно до програми) і все повторюється знову. Легко підрахувати, що для розкопування всіх наших 256-ти проб буде потрібно не більше 25-ти хвилин. Інтервали між краплями на склі рівні 0,2 мм. Таким чином, на площі квадрата зі стороною 8 мм розмістяться всі наші олігонуклеотидно «зонди», як їх прийнято називати. (Якби їх було дві тисячі, то довелося б зайняти всі вісім предметних стекол, а на розкопування прилад витратив би трохи більше 3-х годин.)
Така економія місця на склі (8х8 мм) потрібна для того, щоб всі 256 крапель помістилися в поле зору бінокулярної лупи (для візуального контролю якості нанесення), а потім перед екраном передавальної телевізійної камери, пов'язаної з комп'ютером і його монітором.
Описаний прилад (марки GMS-417 Arrayer) з'явився на ринку порівняно недавно (у 1998 році) і поки не отримав кращої назви, ніж «ЧІП-прилад». Chip в англійській мові означає стружку, тонкий шматочок. Звідси і досить ціновані молоддю картопляні «Чіпси» і «чіпи» в мікроелектроніці - крихітні пластинки, на яких розміщуються тисячі транзисторів. Взагалі, разючі успіхи технології електронної промисловості справили величезний вплив на вдосконалення сучасної науково-дослідницької апаратури.
Про це ще яскравіше свідчить принцип устрою нового приладу того ж призначення, що описаний. У ньому синтез олігонуклеотидних зондів ведеться прямо на склі під управлінням лазерного променя. (Така можливість була згадана при викладенні ідеї хімічного синтезу олігонуклеотидів.) Стверджується, що з використанням цього методу на площі в 1 квадратний сантиметр можна розмістити мільйон зондів!
Але повернемося до нашого досвіду. Подальша обробка крапель на предметному склі відбувається поза ЧІП-приладу. Скло переносять у камеру для опромінення ультрафіолетовим світлом. Під його впливом полімеризується і «пришивається» до скла поліак-ріламідний гель. У ньому виявляються заполімерізовани і оліго-нуклеотиди. Однак завдяки крупнопористого гелю значна їх частина залишається доступною для гібридизації. Гель підсушується.
До молекулам всіх іРНК попередньо хімічно, до кінця ланцюга прикріплюється флюоресцентна мітка. Потім скло покривають тонким шаром розчину, що містить суміш всіх мічених таким чином іРНК. Витримують в умовах, сприятливих для гібридизації. Потім відмивають від всіх іРНК, не зв'язалися з зондами. Тільки молекули потрібної іРНК «відшукають» в одній з колишніх крапель олігонуклеотиди, які точно відповідають одній з ділянок геному, кодованого цікавить нас білок. За флюоресценції під дією лазерного променя відповідну краплю з розряджені на неї молекулами іРНК зафіксує об'єктив телевізійної камери. Комп'ютер вкаже їх координати і покаже крапку, що світиться на екрані монітора.
Після чого знайдену таким чином іРНК можна звільнити з гібрида і використовувати для отримання кДНК, як це було описано вище. Таким чином завдання, позначена перша на початку цієї глави, вирішена. Не біда, якщо кількість отриманої таким чином кДНК виявиться недостатнім для того, щоб забезпечити весь наступний експеримент, який розпочинається від вбудовування в плазміду. Є відносно простий спосіб багаторазово збільшити цю кількість за отриманим зразком.
Перспектива напрацювання великої кількості індивідуального білка як продукту діяльності вторгнувшегося з плазміди в бактерію гена. Цей ген повинен бути тим самим геном, який спочатку кодував синтез потрібного нам білка. Тільки і всього! Але подивимося, чи так просто отримати цей ген, виходячи тільки з наявності в нашому розпорядженні самого білка? Будемо вирішувати це завдання для білка тваринного походження. Тут вона в певній мірі складніше через сплайсингу мРНК і практично важливіше. В її рішенні явно проглядаються два етапи:
1) Отримати індивідуальну іРНК, відповідальну за синтез даного нас білка.
2) На базі цієї іРНК створити двунітевих структуру ДНК, відтворюючу якщо і не весь ген, то його «значущу» частина - ту сукупність послідовних ділянок, які диктують синтез відповідних екзонів іРНК. Такий «раціонально укорочений» ген можна вбудовувати в плазміду. Він в бактерії-реципієнті забезпечить синтез повноцінної іРНК, а слідом за нею і напрацювання потрібного нам білка. Мені зручніше буде почати з цього другого етапу.
2.1 Відтворення «значущою» частини гена за відомою іРНК
Припустимо, що ми маємо в своєму розпорядженні достатню кількість нашої індивідуальної іРНК. Розглянемо послідовність операцій, що дозволяє провести метаморфозу цієї іРНК у відповідну їй частину гена прямо в пробірці.
Нам відомо, що іРНК тваринного походження на своєму 3'-кінці несе довгий «хвіст» аденінових нуклеотидів (полі А).
1 етап. Додамо до розчину нашої іРНК в достатній кількості олігонуклеотиди довжиною в десяток-другий дезоксіріботі-мідінов (оліго ДТ). Ми вже знаємо, як його можна синтезувати. Олиго дт може гібрідізоваться з полі А. Створимо для цього оптимальні умови (буфер, концентрація солі, помірно підвищена температура). Ми отримаємо структуру, з якої почнеться 2-й етап.
2 етап. Додамо в розчин нам ще не зустрічався фермент - «зворотну транскриптазу». У присутності 4-х дезоксирибонуклеотидів цей фермент здатний вести комплементарний синтез ДНК по матриці РНК в нормальному напрямку від 3 "до 5'-кінця матриці. Він теж потребує праймера, яким для нього послужить вже сидить на 3'-кінці іРНК оліго дт
3 етап. Обробимо отриманий РНК-ДНК гібрид згаданої раніше рибонуклеаза М. Вона якраз руйнує РНК, що знаходиться в двунітевих гібридному комплексі з ДНК (див. там же). Однак поставимо цей фермент в такі умови, щоб наша іРНК була зруйнована не до кінця - залишилися невеликі її ділянки.
4 етап. Від цих ділянок, як від праймерів, почне працювати вноситься на цьому етапі ДНК-полімераза I. Вона, як нам відомо, не тільки веде матричний синтез ДНК, але і володіє S'-S * екзо-нуклеазну активністю. Завдяки цьому вона руйнує залишки іРНК і утворює з синтезованих нею фрагментів, не без допомоги все тієї ж ДНК-лігази, повноцінну нитка ДНК.
Отриману таким чином двухнитевой молекулу прийнято іменувати «кДНК», маючи на увазі, що вона є комплементарно збудованим відображенням вихідної іРНК. Ця ДНК відповідає значущої послідовності нашого гена, оскільки всі інтрони (повторю це ще раз) були «вирізані» вже при виході вихідної іРНК з ядра в цитоплазму. РНК-полімераза бактерії, якій доведеться транскрибувати плазмідну ДНК, на ділянці цієї вбудованої кДНК справить повноцінну іРНК для синтезу даного нас білка.
2.2 ЧІП-методика
Більш проста частина завдання отримання гена, коли в нашому розпорядженні є потрібна індивідуальна іРНК. Але як її здобути, якщо ми маємо лише деякою кількістю клітин тваринного походження, в яких синтезувався цікавить нас білок, і, отже, є відповідна йому іРНК?
Очевидно почати треба з того, що відокремити сумарну фракцію всіх іРНК цих клітин від всіх інших РНК. Для цього достатньо закріпити на нерухомій твердій основі в достатній кількості молекули все того ж оліго ДТ і пропустити повз них розчин всіх виділених РНК клітин. Це робиться методом колонкової «афінної» хроматографії, з яким ми свого часу будемо знайомитися докладно. Але і так ясно, що неважко створити умови, при яких закріплені нерухомо оліго БТ «вихоплять» з протікає повз розчину сумарних РНК всі молекули іРНК шляхом гібридизації з їх полі А «хвостами». Всі інші РНК спокійно протекут мимо. Після чого будь-яким досить м'яким способом (нагріванням або дією слабкої лугу) можна буде розірвати водневі зв'язку полі А - оліго дт гібридів і отримати в розчині сумарну фракцію всіх іРНК.
Тепер справа за тим, щоб з цієї сумарної фракції виловити потрібну нам індивідуальну іРНК, відповідальну за синтез даного нас білка. Здавалося б це зробити не так вже й складно.
Ми можемо без особливих зусиль за допомогою секвенатори білків встановити амінокислотну послідовність (хоча б і неповну) нашого білка. Далі, використовуючи генетичний код, встановити якусь послідовність нуклеотидів (не менше 20-ти), що відповідає певній послідовності амінокислот (не менше семи) в нашому білку. Синтезувати цю послідовність, як описано вище, знову закріпити на нерухомій основі і пропустити повз неї сумарний розчин всіх іРНК. Завдяки гібридизації з досить протяжним ділянкою свого гена (нехай і штучно синтезованого) ми можемо знову виловити тепер вже нашу індивідуальну іРНК. Помилки тут бути не може. Імовірність того, що в двох різних іРНК виявляться однакові послідовності, комплементарні до одного й того ж ділянці гена довжиною в 20 нуклеотидів практично дорівнює нулю.
Ніби все просто, але ... згадаємо, що генетичний код-то вироджений. Нам нізвідки дізнатися як в даному конкретному випадку була використана ця вирожденність. І це раптом надзвичайно ускладнює завдання. Верхня строчка позначає послідовність із семи амінокислот, яку ми, припустимо, вибрали з відомої амінокислотної послідовності нашого білка. Вибрали далеко не найважчий випадок. Із семи амінокислот тільки двом відповідає по 4 кодони. Немає ні однієї «шестікодонной» амінокислоти і навіть фігурує триптофан, яка має лише один кодон. Навіть і в цьому випадку для того, щоб напевно «зловити» потрібну нам іРНК доведеться перепробувати всі варіанти. Тобто синтезувати не одну послідовність з 21-го нуклеотиду, а всі можливі послідовності, вичерпні всі допустимі комбінації використання дозволених кодонів. Неважко підрахувати число: 4-2'2'2-4'1-2 = 256.
Отже, треба буде синтезувати 256 21-членних олігонуклеотидів і 256 разів повторити досліди по гібридизації із сумарною фракцією всіх іРНК. Це - величезна робота (хоча і дріб'язкова в порівнянні з деякими іншими сучасними дослідженнями, коли доводиться ставити тисячі паралельних дослідів по гібридизації).
Не будемо поки думати про синтез 256-ти олігонуклеотидів. Все-таки, їх буде виконувати машина. Але 256 разів повторювати досліди по гібридизації! З усіма необхідними промивками і контролями. Тут вкрай потрібна автоматизація. А раз так, то відповідний прилад повинен з'явитися на ринку наукової апаратури. І він з'являється.
Уявіть собі настільний прилад, не набагато більше звичайного телевізора. На масивній, строго горизонтально встановленої сталевий плиті є гніздо для точної фіксації якоїсь «плашки». Остання являє собою прямокутну пластинку з плексигласу розміром 95 х 130 мм. У ній рівномірно розташовані 24 ряду лунок, по 16 у кожному ряду, місткістю по 50 мікролітрів. Ряди і стовпчики лунок пронумеровані. У них попередньо заливають по 10 мікролітрів суміші водного розчину мономерів, які потім перетворяться в пористий поліакріламідний гель, світлочутливий каталізатор цього перетворення і необхідні нам синтетичні олігонуклеотиди. У даному прикладі 256 різних олігонуклеотидів треба буде внести в 256 лунок - відповідно до програми, зазначеної комп'ютером, який буде керувати всіма подальшими маніпуляціями приладу.
В іншому місці на тій же масивної плиті за допомогою пружних упорів у певні положення можуть бути укладені до восьми предметних стекол від мікроскопа. Верхня поверхня цих стекол покрита гідрофобною плівкою, що несе в собі активні хімічні речовини, здатні під дією ультрафіолетового світла зв'язуватися з поліакриламідними гелем. Крім того на цій же пластині є два великих колодязя діаметром 2 см. Через один з них по команді від комп'ютера може прокачуватися дистильована вода. У другу криницю заливають етанол. Нарешті, ще в цій же плиті зроблено отвір, що веде в сушильну камеру, що знаходиться під плитою.
На нижній поверхні другої масивної плити, розташованої півметрів вище першої, змонтована вся рухома система. Вона складається з двох прецизійних ходових гвинтів, обертанням яких укріплена на них «каретка» може бути доставлена в будь-яке місце над нижньою плитою. Обертанням гвинтів, природно, теж керує комп'ютер.
На каретці змонтована вертикальна сталева голка діаметром 0,3 мм з плоским нижнім торцем. До неї встановлено на стійці сталеве кільце діаметром в 1 мм. Голка може опускатися і підніматися - разом з кільцем або окремо від нього так, що її торець перетинає площину кільця.
За заданою програмою механічний привід за 1 секунду переносить голку і кільце в положення точно над черговою лункою плашки. Торець голки під час цього перенесення піднімається вище кільця. Потім кільце миттєво опускається в лунку. Завдяки малому діаметру кільця рідина утворює у його площині стійку плівку. Потім, також за 1 секунду, каретка переносить голку з кільцем в задане положення над одним із предметних скла - з точністю в ± 10 мікрон! Сухий стрижень голки опускається, пронизує плівку, змочується і з легким ударом (пружінка!) стосується своїм торцем скла. Рідина з нього струшується. На поверхні скла утворюється крихітна крапля, діаметром 0,3 мм, яка не розтікається завдяки гідрофобності покриття на склі.
Потім голка і кільце так само швидко переносяться в положення над колодязем з водою і опускаються в нього. Одночасно включається насосик, кільце і голка енергійно споліскувати. Потім вони точно так само переносяться в колодязь з етанолом, потім у сушильну камеру ... Через приблизно 5 секунд після початку серії описаних операцій голка і кільце знову виявляються вже над іншою лункою (відповідно до програми) і все повторюється знову. Легко підрахувати, що для розкопування всіх наших 256-ти проб буде потрібно не більше 25-ти хвилин. Інтервали між краплями на склі рівні 0,2 мм. Таким чином, на площі квадрата зі стороною 8 мм розмістяться всі наші олігонуклеотидно «зонди», як їх прийнято називати. (Якби їх було дві тисячі, то довелося б зайняти всі вісім предметних стекол, а на розкопування прилад витратив би трохи більше 3-х годин.)
Така економія місця на склі (8х8 мм) потрібна для того, щоб всі 256 крапель помістилися в поле зору бінокулярної лупи (для візуального контролю якості нанесення), а потім перед екраном передавальної телевізійної камери, пов'язаної з комп'ютером і його монітором.
Описаний прилад (марки GMS-417 Arrayer) з'явився на ринку порівняно недавно (у 1998 році) і поки не отримав кращої назви, ніж «ЧІП-прилад». Chip в англійській мові означає стружку, тонкий шматочок. Звідси і досить ціновані молоддю картопляні «Чіпси» і «чіпи» в мікроелектроніці - крихітні пластинки, на яких розміщуються тисячі транзисторів. Взагалі, разючі успіхи технології електронної промисловості справили величезний вплив на вдосконалення сучасної науково-дослідницької апаратури.
Про це ще яскравіше свідчить принцип устрою нового приладу того ж призначення, що описаний. У ньому синтез олігонуклеотидних зондів ведеться прямо на склі під управлінням лазерного променя. (Така можливість була згадана при викладенні ідеї хімічного синтезу олігонуклеотидів.) Стверджується, що з використанням цього методу на площі в 1 квадратний сантиметр можна розмістити мільйон зондів!
Але повернемося до нашого досвіду. Подальша обробка крапель на предметному склі відбувається поза ЧІП-приладу. Скло переносять у камеру для опромінення ультрафіолетовим світлом. Під його впливом полімеризується і «пришивається» до скла поліак-ріламідний гель. У ньому виявляються заполімерізовани і оліго-нуклеотиди. Однак завдяки крупнопористого гелю значна їх частина залишається доступною для гібридизації. Гель підсушується.
До молекулам всіх іРНК попередньо хімічно, до кінця ланцюга прикріплюється флюоресцентна мітка. Потім скло покривають тонким шаром розчину, що містить суміш всіх мічених таким чином іРНК. Витримують в умовах, сприятливих для гібридизації. Потім відмивають від всіх іРНК, не зв'язалися з зондами. Тільки молекули потрібної іРНК «відшукають» в одній з колишніх крапель олігонуклеотиди, які точно відповідають одній з ділянок геному, кодованого цікавить нас білок. За флюоресценції під дією лазерного променя відповідну краплю з розряджені на неї молекулами іРНК зафіксує об'єктив телевізійної камери. Комп'ютер вкаже їх координати і покаже крапку, що світиться на екрані монітора.
Після чого знайдену таким чином іРНК можна звільнити з гібрида і використовувати для отримання кДНК, як це було описано вище. Таким чином завдання, позначена перша на початку цієї глави, вирішена. Не біда, якщо кількість отриманої таким чином кДНК виявиться недостатнім для того, щоб забезпечити весь наступний експеримент, який розпочинається від вбудовування в плазміду. Є відносно простий спосіб багаторазово збільшити цю кількість за отриманим зразком.
Література
1 Душкін М.П., Іванова М.В. Трансформація перітоніческіх макрофагів у пінисті клітини при внутрішньочеревних введенні мишам ліпопротеїдів низької щільності, холестерину і його продуктів окислення. / / Патофізіологія і експеримент. терапія. -1993. -N 2. -С.9-11.
2 Дятловського Е.В., Безуглов В.В. Ліпіди як біоеффектори. Біохімія. 1998. Т. 67. вип. 1.-С.-3-6.
3 Єршова Л.П., Курбанова Г.М., Горбунова Н.А. Про механізми посттравматичної анемії. / / Пат.фізіологія. 1992. -N 2.-С.-54-55.
1 Душкін М.П., Іванова М.В. Трансформація перітоніческіх макрофагів у пінисті клітини при внутрішньочеревних введенні мишам ліпопротеїдів низької щільності, холестерину і його продуктів окислення. / / Патофізіологія і експеримент. терапія. -1993. -N 2. -С.9-11.
2 Дятловського Е.В., Безуглов В.В. Ліпіди як біоеффектори. Біохімія. 1998. Т. 67. вип. 1.-С.-3-6.
3 Єршова Л.П., Курбанова Г.М., Горбунова Н.А. Про механізми посттравматичної анемії. / / Пат.фізіологія. 1992. -N 2.-С.-54-55.