Кількісний аналіз здійснюють безпосередньо на хроматограмі (на шарі сорбенту або папері). Часто аналізоване речовина вимивають із шару сорбенту і отриманий розчин аналізують будь-яким методом. В обох випадках використовують перераховані вище спектральні, а також радіометричні методи. Перевага віддається першому способу, оскільки при цьому значно підвищуються експресність і чутливість визначення. Слід зазначити, що чутливість визначення залежить не тільки від умов поділу. Наприклад, чим менше Rf аналізованого речовини, тим менш розмита зона. Для рутинних кількісних визначень в ТШХ широко використовують денситометри, які вимірюють інтенсивність поглинання електромагнітного випромінювання при скануванні хроматографічної пластинки. У результаті реєструється хроматограмма, яка має форму, аналогічну для газової і інших видів рідинної хроматографії [3].
У багатьох випадках для визначення вмісту речовин після поділу на платівках ТШХ використовують напівкількісний метод, застосовний і в шкільній лабораторії. Він полягає у візуальному порівнянні розміру плями (а також зіставленні їх інтенсивностей) з розмірами серії плям цієї ж речовини з відомими концентраціями (стандартні розчини). Незважаючи на простоту підходу, він забезпечує правильність визначення 5-10% при вмісті 1-5 мкг.
Сучасний стан та перспективи планарної хроматографії. Як це часто буває в історії розвитку будь-якого інструментального методу, після бурхливого розвитку в 60-70-х роках планарную хроматографію потіснив новий метод - високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ). Однак в останні роки тонкошаровий варіант планарної хроматографії отримав новий імпульс для розвитку і спостерігається зростання його ролі в хроматографічних методах. Це пов'язано з меншою вартістю устаткування для ТШХ, розробкою двовимірного і радіального варіантів поділу, впровадженням пластин для високоефективної хроматографії, появою систем автоматизованого багаторазового хроматографічного прояви (АМХП). У двовимірної хроматографії аналізовану суміш елюіруют одним розчинником (або сумішшю), потім пластинку сушать і під кутом 90 ° елюіруют другий розчинником. У радіальній хроматографії розчинник з регульованою швидкістю подається до центру платівки, змушуючи зони переміщатися від центру до периферії. Це дозволяє істотно прискорити процес поділу.
Особливо перспективною є методика АМХП. Вона зручна для визначення пестицидів та продуктів їх метаболізму в грунтах, грязьових шламах і грунтових водах, а також в питній воді і водах мінеральних джерел. Хроматографічне розділення проводять у АМХП-системі, робота якої управляється і контролюється за допомогою комп'ютера. Проводять багаторазове хроматографічне прояв (прогін розчинника). За таких багатоступеневих проявах (до 25 кроків) із зростаючою довжиною смуги поділу і градієнтним ступінчастим зменшенням полярності розчинника можливе розділення до 40 речовин на розділовій смузі довжиною 8 см.
Важливе значення має розвиток високоефективної тонкошарової хроматографії (ВЕТСХ). За рахунок створення примусового руху рухомої фази з регульованою швидкістю, зменшення розміру часток сорбенту (до 5-7 мкм) і насичення простору над пластиною парами розчинника вдається істотно прискорити процес і підвищити чіткість поділу.
Широко використовується поєднання ТШХ з іншими методами, зокрема з високоефективної рідинної хроматографією. Наприклад, такий прийом застосовують при аналізі стічних вод. Спочатку аналізований зразок можна розділити на шпальтах ВЕРХ. Після цього окремі фракції наносять на платівки ТШХ і проводять розділення з використанням методики АМХП. Таким чином в аналізованій суміші розділяється до 30 окремих фракцій. У кожній з цих фракцій, у свою чергу, на платівці ТШХ визначається до десяти сполук. В окремих випадках у зразках таким чином виявляли присутність до 300 речовин. Такий прийом продемонстрував ефективність сумісного використання двох методів при визначенні речовин в діапазоні концентрацій від нанограмів до пікограмів.
Застосування планарної хроматографії в аналізі складних сумішей органічних сполук. Можливості тонкошарової хроматографії в аналізі різних об'єктів можна проілюструвати на прикладі аналізу поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАВ), гербіцидів на основі фенілмочевіни і стеролів у харчових продуктах.
Добре відомо, що деякі ПАУ володіють канцерогенною активністю. Їх аналіз актуальний з екологічної точки зору: вони присутні в слідових кількостях у мінеральному маслі, повітрі, воді, вихлопних газах, а також у харчових продуктах. Норми по питній воді встановлюють їх граничну концентрацію в 0,2 мкг / л для шести ПАУ, одним з яких є бензо (а) пірен
Для розділення ПАУ та кількісного визначення їх у питній воді була використана ВЕТСХ з флуоріметріческім детектуванням. Специфічність флуоріметріческого визначення досягалася дуже тонким вибором довжин хвиль збудження і реєстрації, що дозволило детектувати кожен окремий компонент на пікограммовом рівні навіть при неповному розділенні речовин.
Визначення гербіцидів на основі фенілмочевіни використовуваних для обробки рослин, за однією з нормованих методик проводиться методом ТШХ. Швидкість переміщення речовин на платівках визначається природою замісників в них. На рис. 5 наведені результати фотометричного детектування (l = 254 нм) визначених з'єднань після одно-та дворазового елюювання.
Стероли - похідні вуглеводнів стерана, що має гідроксильну групу у третій позиції. Вони широко поширені в природі і (залежно від походження) поділяються на зоостероли і фітостероли. Найбільш важливими з них є холестерол (в російській літературі холестерин), 7-дігідрохолестерол, b-ситостерол, стігмастерол і ергостерол
Стероли мають важливе значення для характеристики жирів (рослинні і тваринні), а холестерол, як відомо, за певних умов може підвищувати ризик появи інфаркту. Рослинні жири містять здебільшого поліненасичені жирні кислоти і лише сліди холестеролу. На підставі фізіологічних аспектів харчування рекомендується вживати більше рослинних жирів, зокрема маргарину, та визначення стеролів в маргарині є важливою характеристикою його якості. Для контролю його змісту можна використовувати різні види хроматографії, в тому числі і ТШХ. Після екстракції стероли можна поділити в ВЕТСХ камері на платівці імпрегнованої нітратом срібла. Для детектування використовується флуоресцентний детектор. Межа виявлення при цьому становить 3 нг / зону. [5, 6]
Розвиток процесу хроматографування у часі:
Глава 3. ПРИКЛАДИ ВИКОРИСТАННЯ тонкошарової хроматографії в АНАЛІЗІ ПРИРОДНИХ ВОД
Метод тонкошарової хроматографії визначення ХОП у природних водах. [11]
Метод заснований на виведенні ХОП з води гексаном, сернокислотной очищення екстракту і визначенні в тонкому шарі сорбенту на оксиді алюмінію, силікагелі або платівках Силуфол в різних системах рухливих розчинників з проявом місць локалізації пестицидів різними проявляють реагентами.
Підготовка до визначення. Ретельно промиту хромовою сумішшю, содою, дистильованою водою і висушену платівку протирають етиловим спиртом або ефіром і покривають сорбційної масою. Масу готують наступним чином. Змішують 50 г просіяного через сито з розміром отворів 0,149 мм оксиду алюмінію у фарфоровій ступці з 5 г сульфату кальцію, додають 75 мл дистильованої води і перемішують у ступці або колбі до утворення однорідної маси. На платівку 9 * 12 см наносять 10 г сорбційної маси (на платівку 13 Х 18 см - 20 г) і, похитуючи, рівномірно розподіляють по всій платівці. Платівки сушать при кімнатній температурі 18-20 год, можна сушити 20 хв при кімнатній температурі, а потім 45 хв в сушильній шафі при 110 ° С.
Змішують 35 г силікагелю КСК, просіяного через сито з розміром отворів 0,149 мм, з 2 г сульфату кальцію і 90 мл дистильованої води і перемішують у ступці або колбі до однорідної маси. Наносять на платівки і сушать, як зазначено вище. Порція розрахована на 10 платівок.
Якщо пластинки з тонким шаром силікагелю темніють після УФ-опромінення, силікагель перед застосуванням треба очистити від домішок. Для цього силікагель заливають на 18-20 год розведеною соляною кислотою (1: 1), кислоту зливають, промивають силікагель водою і кип'ятять в круглодонні колбі 2-3 год з розведеною азотною кислотою (1:1), промивають проточною водопровідною, потім дистильованою водою до нейтральної реакції промивних вод, сушать у сушильній шафі 4-6 год при 130 ⁰ з. Силікагель подрібнюють і просіюють через сито з розміром отворів 0,149 мм.
Пластинки для хроматографії Силуфол UV-254 (ЧССР) перед використанням импрегнирующими о-толідіном. Для цього кожну платівку опускають на 0,5 см в 0,1%-ний розчин про-толідіна в ацетоні, налитий у камеру для хроматографування. Пост того як фронт розчинника підніметься до верхнeгo краю пластинки, її виймають і сушать на повітрі, уникаючи прямого сонячного світла. Після цього пластинки готові до роботи. Платівки, насичені о-толідіном, зберігають в ексикаторі.
Платівки Силуфол UV-254 попередньо промивають дистильованою водою в хроматографічної камері, висушую на повітрі і безпосередньо перед використанням активують в сушильній шафі 4 хв при 65 ОС.
Хід визначення. Екстракцію ХОП і концентрування екстракту проводять за схемою, викладеної вище, при визначенні ХОП методом ГЖХ. При необхідності екстракти обробляють концентрованою сірчаною кислотою, як вказано в тому ж розділі.
Сконцентрований до 1-2 мл екстракт (без очищення або після сернокислотной очищення) кількісно за допомогою ацетону переносять у конічну пробірку місткістю 5 мл. У пробірку поміщають заплавленний у верхній частині скляний капіляр і видаляють розчинник на гарячій водяній бані до обсягу 0,2-0,3 мл. Залишок кількісно, ​​за допомогою того ж скляного капіляра, але з відламати запаяним кінцем, наносять на хроматографічну платівку в одну точку, так щоб діаметр плями не перевищував 1 см. Залишок екстракту в колбі змивають трьома порціями по 0,2 Мл діетилового ефіру, які завдають в центр першого плями. Праворуч і ліворуч від проби на відстані 2 см наносять стандартні розчини, що містять 1, 3, 5, ... , 10 мкг досліджуваних препаратів (або інші кількості препаратів, близькі до обумовлених концентрацій препаратів).
Платівки з нанесеними розчинами поміщають в хроматографічну камеру, на дно якої за 30 хв до початку хроматографування наливають рухливий розчинник. При використанні пластинок з тонким шаром оксиду алюмінію або силікагелю в якості рухомого розчинника застосовують н-гексан або суміш гексану з ацетоном у співвідношенні 6: 1 для препаратів, R, яких в гексані нижче 0,3. При використанні платівок Силуфол рухомим розчинником є ​​'1%-ний розчин ацетону в гексані, а при використанні платівок Силуфол, насичені о-толідіном, - гексан з діетіловим ефіром у співвідношенні 49: 1. Край пластинки з нанесеними розчинами може бути по груже в рухомий розчинник не більш ніж на 0,5 см.
Після того як фронт розчинника підніметься на 1О см, платівку виймають з камери і залишають на кілька хвилин для випаровування розчинника. Далі платівку зрошують одним з виявляють реактивів і піддають дії УФ-променів 10 - 15 хв (лампа ПРК-4). Платівки слід розташовувати на відстані 20 см від джерела світла.
При обробці хроматограм проявляють реактивами на основі нітрату срібла ХОП проявляються на хроматограмі у вигляді сіро-чорних плям на білому тлі. Забарвлення плям стійка кілька днів.
Після обробки платівок ортотолідіновим реактивом і УФ - опроміненням гексахлоран та ефіросульфонат проявляються через 20-35 хвилин у вигляді зелено-помаранчевих плям, стійких 2-3 дні.
Визначення поліароматичних вуглеводнів в об'єктах навколишнього середовища методами рідинної і тонкошарової хроматографії. [7]
Було визначено зміст поліароматичних вуглеводнів (ПАВ), зокрема, бенз (а) пірену в сніжному покриві. Пробопідготовка здійснювали екстракцією діетіловим ефіром. Якісний аналіз здійснювали методом тонкошарової хроматографії. Проби наносили на пластину Silufol UV-254 і здійснювали хроматографічний аналіз у двох системах: система 1 - розчин кофеїну в хлороформі; система 2 - суміш циклогексану і н-гексану. Використання системи 1 дозволило знизити нижню межу виявлення.
Кількісний аналіз здійснювали методом газорідинної хроматографії (ГЖХ). Дослідження проводили на хроматографі «Колір-500» з полум'яно-іонізаційним детектором. В якості сорбенту використовували силіконовий каучук SE-54 з нанесеною на нього нерухомою фазою OV-101. Аналіз проводили в режимі програмування температури від 200 до 310 ° С зі швидкістю 4  С / хв. В якості газу-носія використовували азот. Метод дозволив визначити ПАУ на рівні ГДК.
Денситометр «Сорбфіл» для кількісної ТШХ. [8]
Денситометрія є найбільш зручним методом кількісних розрахунків у тонкошарової хроматографії (ТШХ). Для її реалізації використовуються денситометри, скануючі ТШХ пластину вузьким променем світла певної довжини хвилі, і відеоденсітометри, проводять розрахунки за відеозображень хроматограм. Основними перевагами останніх є висока швидкість обробки і простота документування.
Денситометр «Сорбфіл» (виробництво ЗАТ «Сорбполімер») дозволяє обробляти будь-яку ТШХ, видиму в денному або УФ світлі з довжиною хвилі 254 або 365 нм. Зображення пластини, отримане за допомогою сканера, цифрової або відеокамери передається в комп'ютер. Виходячи з базового положення денситометрії, що розмір та інтенсивність забарвлення плями є функція кількості речовини в плямі, програма «Денситометр Сорбфіл» проводить розрахунок процентного складу речовин в суміші і концентрації речовини в пробі. Відтворюваність вимірювань складає 98% при відносному среднеквадратичном відхилення площі хроматографічних зон менше 4%, що не перевищує значення звичайне для скануючих денситометрів. Результати розрахунків (графіки, таблиці), текстові пояснення, а також зображення хроматограми, можуть бути збережені і віддруковані у вигляді звіту.
Простота конструкції і досить висока точність результатів орієнтовані на лабораторії будь-якого типу. Застосування денситометра «Сорбфіл» не вимагає зміни існуючих методик ТШХ аналізу.
Денситометр «Сорбфіл» сертифікований (сертифікат Держстандарту Росії RU.C.31.001.А № 6488, реєстраційний № 23965-02 в Державному реєстрі засобів вимірювань).
Метод визначення нафтопродуктів тонкошарової
хроматографією з люмінесцентним закінченням. [9,10]
Принцип методу. Метод заснований на виділенні нафтопродуктів з води екстракцією чотирьоххлористим вуглецем, концентруванні екстрак-та і хроматографічному відділенні нафтопродуктів в тонкому шарі окису алюмінію в суміші органічних розчинників: петролейний ефір: чоти-реххлорітстий вуглець: оцтова кислота (70:30:2). Кількісне визна-ня нафтопродуктів проводиться люмінесцентним методом. Метод призначений для аналізу вод із вмістом нафтопродуктів вище 0,02 мг / л. Люмінесцентне визначення засноване на здатності входять до со-ставши нафтопродуктів ароматичних, особливо поліциклічних конденсату ваних вуглеводнів під дією ультрафіолетових променів (λ _возб. = 300-400 нм) інтенсивно люминесцировать в короткохвильовій області спектру (λ _вимір. = 343 нм, ν = 23040 см ^-1).
Реактиви
1. Окис алюмінію, безводна
2. Чотирихлористий вуглець, CСl _4, ч.д.а.
3. Сірчанокислий натрій Na ₂ SO _4, безводний, х.ч.
4. Петролейний ефір, х.ч.
5. Гексан, С ₆ Н _14, х.ч.
6. Оцтова кислота, СН ₃ СООН, крижана, х.ч.
7. Рухомий розчинник (петролейний ефір (чи гексан): чотирихлористий вуглець: крижана оцтова кислота)
70 г петролейного ефіру або гексану, 30 мл чотирихлористого вугле-роду і 2 мл крижаної оцтової кислоти струшують в склянці з притертою пробкою. Готують безпосередньо перед вживанням, використовують Протя-гом робочого дня.