Зміст
Введення
1. Типи інсуліну
2. Отримання інсуліну
Висновок
Список літератури
Введення
Інсулін (від лат. Insula - острів) - гормон пептидної природи, що утворюється в бета-клітинах острівців Лангерганса підшлункової залози. Робить багатогранний вплив на обмін речовин практично у всіх тканинах.
Основна функція інсуліну - забезпечувати проникність клітинних мембран для молекул глюкози. У спрощеному вигляді можна сказати, що не тільки вуглеводи, а й будь-які поживні речовини в кінцевому рахунку розщеплюються до глюкози, яка і використовується для синтезу інших містять вуглець молекул, і є єдиним видом палива для клітинних енергостанцій - мітохондрій. Без інсуліну проникність клітинної мембрани для глюкози падає в 20 разів, і клітини помирають від голоду, а розчинений у крові надлишок цукру отруює організм.
Порушення секреції інсуліну унаслідок деструкції бета-клітин - абсолютна недостатність інсуліну - є ключовою ланкою патогенезу цукрового діабету 1-го типу. Порушення дії інсуліну на тканини - відносна інсулінова недостатність - має важливе місце у розвитку цукрового діабету 2-го типу.
Історія відкриття інсуліну пов'язана з іменем російського лікаря І.М. Соболєва (друга половина 19 століття), який довів, що рівень цукру в крові людини регулюється спеціальним гормоном підшлункової залози.
У 1922 році інсулін, виділений з підшлункової залози тварини, був вперше введений десятирічному хлопчикові, хворому на діабет. результат перевершив всі очікування, і вже через рік американська фірма «Eli Lilly» випустила перший препарат тваринного інсуліну.
Після отримання першої промислової партії інсуліну в наступні кілька років пройдено великий шлях його виділення та очищення. У результаті гормон став доступний для хворих на цукровий діабет 1 типу.
У 1935 році датський дослідник Хагедорн оптимізував дію інсуліну в організмі, запропонувавши пролонгований препарат.
Перші кристали інсуліну були отримані в 1952 році, а в в1954 році англійський біохімік Г. Сенджер розшифрував структуру інсуліну. Розвиток методів очищення гормону від інших гормональних речовин і продуктів деградації інсуліну дозволили отримати гомогенну інсулін, званий однокомпонентним.
На початку 70-х р.р. радянськими вченими А. Юдаєв і С. Швачкін був запропонований хімічний синтез інсуліну, проте здійснення даного синтезу в промисловому масштабі було дорогим і нерентабельним.
Надалі йшло прогресуюче поліпшення ступеня очищення інсулінів, що зменшувало проблеми, зумовлені інсулінової алергією, порушеннями роботи нирок, розладом зору й імунної резистентністю до інсуліну. Був необхідний найбільш ефективний гормон для замісної терапії при цукровому діабеті - гомологічний інсулін, тобто інсулін людини.
У 80 - роках досягнення молекулярної біології дозволили синтезувати за допомогою E.coli обидві ланцюга людського інсуліну, які були потім з'єднані в молекулу біологічно активного гормону, а в Інституті біоорганічної хімії РАН отриманий рекомбінантний інсулін з використанням генно-інженерних штамів E.coli.
Використання афінної хромотографії значно знизило вміст у препараті забруднюючих білків з більш високою м.м., ніж у інсуліну. До таких білків відносяться проінсулін і частково розщеплені проінсулін, які здатні індукувати вироблення антиінсулінових антитіл.
Використання людського інсуліну з самого початку терапії зводить до мінімуму виникнення алергічних реакцій. Людський інсулін швидше абсорбується і незалежно від форми препарату має коротшу тривалість дії, ніж тварини інсуліни. Людські інсуліни менш іммуногена, ніж свинячі, особливо змішані бичачі і свинячі інсуліни.
Препарати інсуліну розрізняються за джерелом отримання. Інсулін свині та бика відрізняється від людського за амінокислотним складом: бичачий - за трьома амінокислотам, а свинячий - по одній. Не дивно, що при лікуванні бичачим інсуліном побічні реакції розвиваються набагато частіше, ніж при терапії свинячим або людським інсуліном. Ці реакції виражаються в імунологічній інсулінорезистентності, алергії до інсуліну, ліподистрофія (зміні подкожножировой клітковини у місці ін'єкції).
Незважаючи на явні недоліки бичачого інсуліну, він все ще широко використовується в світі. І все ж недоліки бичачого інсуліну в імунологічному плані очевидні: його ні в якому разі не рекомендується призначати хворим вперше виявленим цукровим діабетом, вагітним або для короткочасної інсулінотерапії, наприклад в періопераційному періоді. Негативні якості бичачого інсуліну зберігаються і при використанні їх у суміші зі свинячим, тому змішані (свинячий + бичачий) інсуліни також не варто використовувати для терапії зазначених категорій хворих.
Препарати інсуліну людини за хімічною структурою повністю ідентичні людському інсуліну.
Основною проблемою біосінтетіческіго методу отримання інсуліну людини є повне очищення кінцевого продукту від найменших домішок використаних мікроорганізмів і продуктів їх життєдіяльності. Нові методи контролю якості гарантують, що біосинтетичні інсуліни людини вищеперелічених виробників вільні від будь-яких шкідливих домішок; таким чином, їх ступінь очищення і цукрознижуючих ефективність відповідають найвищим вимогам і є практично однаковими. Яких-небудь небажаних побічних дій, що залежать від домішок, ці препарати інсуліну не мають.
В даний час у медичній практиці використовують інсуліни трьох типів:
- Короткодіючі з швидким початком ефекту;
- Середньої тривалості дії;
- Тривалої дії з повільним проявом ефекту.
Таблиця 1. Характеристики комерційних препаратів інсуліну
Інсулін короткої дії (ІКД) - регулярний інсулін - представляє собою короткодействующих розчинна при нейтральному значенні рН кристалічний цинк-інсулін, ефект якого розвивається протягом 15 хвилин після підшкірного введення і триває 5-7 годин.
Перший інсулін продовженої дії (ВПС) було створено наприкінці 30-х рр.., Щоб хворі змогли робити ін'єкції рідше, ніж це було при використанні тільки ІКД, - по можливості один раз на добу. З метою збільшення тривалості дії всі інші препарати інсуліну модифіковані і при розчиненні в нейтральному середовищі утворюють суспензію. Вони містять протамін у фосфатному буфері - протамін-цинк-інсулін і НПХ (нейтральний протамін Хагедорна) - НПХ-інсулін або різні концентрації цинку в ацетатному буфері - інсуліни ультраленте, стрічці, Семиленте.
Препарати інсуліну середньої тривалості дії містять протамін, що представляє білок середньої м.м. 4400, багатий аргініном і одержуваний з молок райдужної форелі. Для утворення комплексу потрібно співвідношення протаміну та інсуліну 1:10. після підшкірного введення протеолітичні ферменти руйнують протамін, дозволяючи інсуліну всмоктуватися.
НПХ-інсулін не змінює фармакокінетичний профіль змішуваного з ним регуляторного інсуліну. НПХ-інсулін краще інсуліну стрічці як компонент середньої тривалості дії в терапевтичних сумішах, що містять регулярний інсулін.
У фосфатному буфері всі інсуліни легко утворюють кристали з цинком, але тільки кристали бичачого інсуліну мають достатньої гідрофобністю, щоб забезпечити уповільнене і стабільне вивільнення інсуліну, характерного для ультраленте. Цинкові кристали свинячого інсуліну розчиняються швидше, ефект настає раніше, тривалість дії коротше. Тому не існує препарату ультраленте, що містить лише свинячий інсулін. Монокомпонентний свинячий інсулін випускають під назвою інсулін-суспензія, інсулін-нейтрал, інсулін-НПХ, інсулін-амінохінурід.
Інсулін стрічці - це суміш 30% інсуліну Семиленте (аморфний преципітат інсуліну з іонами цинку в ацетатному буфері, ефект якого розвіюється відносно швидко) з 70% інсуліну ультраленте (погано розчинний кристалічний цинк-інсулін, має уповільнене початок і пролонговану дію). Ці два компоненти забезпечують комбінацію з відносно швидкої абсорбцією і стабільним тривалою дією, роблячи інсулін-стрічці зручним терапевтичним засобом.
1) повним хімічним синтезом;
2) екстракцією з підшлункових залоз людини (обидва ці способи не підходять через неекономічність: недостатньою розробленості першого способу і нестачу сировини для масового виробництва другим способом);
3) напівсинтетичним методом з допомогою ферментно-хімічної заміни в положенні 30 В-ланцюга амінокислоти аланіну у свинячому інсуліні на треонін;
4) биосинтетическим способом за генно-інженерної технології. Два останніх методу дозволяють отримати людський інсулін високого ступеня очищення.
В даний час інсулін людини, в основному, отримують двома способами: модифікацією свинячого інсуліну синтетика-ферментативним методом і генно-інженерних способом.
Інсулін виявився першим білком, отриманими для комерційних цілей з використанням технології рекомбінантної ДНК. Існує два основних підходи для отримання генно-інженерного інсуліну людини.
У першому випадку здійснюють роздільне (різні штами-продуценти) отримання обох ланцюгів з подальшим фолдінга молекули (утворення дисульфідних містків) і поділом ізоформ.
У другому - отримання у вигляді попередника (протоінсуліну) з наступним ферментативним розщепленням трипсином і карбоксипептидази В до активної форми гормону. Найбільш доцільним в даний час є отримання інсуліну у вигляді попередника, що забезпечує правильність замикання дисульфідних містків (у разі роздільного отримання ланцюгів проводять послідовні цикли денатурації, поділу ізоформ і ренатурації).
При обох підходах можливо як індивідуальне отримання вихідних компонентів (А-і В-ланцюга або проінсулін), так і в складі гібридних білків. Крім А-і В-ланцюга або проінсуліну, у складі гібридних білків можуть бути присутніми:
- Білок носій, що забезпечують транспортування гібридного білка в періплазматіческое простір клітини або культуральне середовище;
- Афінних компонент, істотно полегшує виділення гібридного білка.
При цьому обидва ці компоненти можуть одночасно бути присутнім у складі гібридного білка. Крім цього, при створенні гібридних білків може використовуватися принцип мультімерності, (тобто, в гібридному білку присутня кілька копій цільового поліпептиду), що дозволяє істотно підвищити вихід цільового продукту.
У Великобританії за допомогою E.coli синтезовані обидві ланцюга людського інсуліну, які потім були сполучені в молекулу біологічно активного гормону. Щоб одноклітинний організм міг синтезувати на своїх рибосомах молекули інсуліну, необхідно забезпечити його потрібної програмою, тобто ввести йому ген гормону.
Хімічним способом отримують ген, що програмує біосинтез попередника інсуліну або два гени, що програмують окремо біосинтез ланцюгів А і В інсуліну.
Наступний етап - включення гена попередника інсуліну (або гени ланцюгів порізно) в геном E.coli - особливого штаму кишкової палички, вирощеного в лабораторних умовах. Це завдання виконує генна інженерія.
З E.coli виокремлює плазміду відповідної рестриктазою. синтетичний ген вбудовується в плазміду (клонуванням з функціонально активної С-кінцевий частиною β-галактозидази E.coli). У результаті E.coli набуває здатність синтезувати білкову ланцюг, що складається з галактозидази та інсуліну. Синтезовані поліпептиди отщепляют від ферменту хімічним шляхом, потім проводять і очищення. У бактеріях сінезіруется около100000 молекул інсуліну на бактеріальну клітину.
Природа гормонального речовини, що продукується E.coli, обумовлена тим, який ген вбудовується в геном одноклітинного організму. Якщо клонований ген попередника інсуліну, бактерія синтезує попередник інсуліну, який піддається потім обробці рестріктазами для відщеплення препітіда з виокремлення С-пептиду, внаслідок чого виходить біологічно активний інсулін.
Для отримання очищеного інсуліну людини виділений з біомаси гібридний білок піддають Хімкі-ферментативної трансформації та відповідної хроматографічної очищенню (фпрнтальной, гельпронікающей, аніонообмінної).
В Інституті РАН отриманий рекомбінантний інсулін з використанням генно-інженерних штамів E.coli. з вирощеної біомаси виділяється попередник, гібридний білок, експресуються в кількості 40% від усього клітинного білка, що містить препроїнсулін. Перетворення його в інсулін in vitroосуществляется в тій же послідовності, що і in vivо - відщеплюється лідируючий поліпептид, препроїнсулін перетворюється на інсулін через стадії окислювального сульфітоліза з наступним відновним замиканням трьох дисульфідних зв'язків і ферментативним вичленовуванням зв'язує С-пептиду. Після низки хромотографіческіх очищень, що включають іонообмінні, гелеві та ВЕРХ, отримують людський інсулін високої чистоти і природної активності.
Можна використовувати штам з вбудованою в плазміду нуклеотидної послідовністю, що експресують гібридний білок, який складається з лінійного проінсуліну і приєднаного до його N-кінця через залишок метіоніну фрагмента білка А Staphylococcus aureus.
Культивування насиченою біомаси клітин рекомбінантного штаму забезпечує початок виробництва гібридного білка, виділення і послідовна трансформація якого in tube призводять до інсуліну.
Можливий і інший шлях: виходить в бактеріальної системі експресії злитої рекомбінантний білок, що складається з проінсуліну людини і приєднаного до нього через залишок метіоніну полігістідінового "хвоста". Його виділяють, використовуючи хелатних хроматографію на колонках з Ni-агарози з тілець включення і розщеплювали бромцианом.
Виділений білок є S-сульфонірованним. Картування і мас-спектрометричний аналіз отриманого проінсуліну, очищеного іонообмінних хроматографією на аніонних та ОФ (обращеннофазовой) ВЕРХ (високоефективної рідинної хроматографією), показують наявність дисульфідних містків, відповідних дисульфідними містками нативного проінсуліну людини.
Останнім часом пильна увага приділяється спрощенню процедури отримання рекомбінантного інсуліну методами генної інженерії. Так, наприклад, можна отримати злитої білок, що складається з лідерного пептиду інтерлейкіну 2 приєднаного до N-кінця проінсуліну, через залишок лізину. Білок ефективно експресується і локалізується в тільцях включення. Після виділення білок розщеплюється трипсином з отриманням інсуліну і С-пептиду.
Отримані інсулін і С-пептид очищалися ОФ ВЕРХ. При створенні злитих конструкцій вельми істотним є співвідношення мас білка носія та цільового поліпептиду. З-пептиди з'єднуються за принципом "голова-хвіст" за допомогою амінокислотних спейсерів, несучих сайт рестрикції Sfi I і два залишку аргініну на початку і в кінці спейсера для подальшого розщеплення білка трипсином. ВЕРХ продуктів розщеплення показує, що відщеплення С-пептиду проходить кількісно, а це дозволяє використовувати спосіб мультімерних синтетичних генів для отримання цільових поліпептидів в промисловому масштабі.
Висновок
Цукровий діабет - хронічне захворювання, обумовлене абсолютною або відносною недостатністю інсуліну. Воно характеризується глибоким порушенням обміну вуглеводів з гіперглікемією і глюкозурією, а також іншими порушеннями обміну речовин в результаті впливу ряду генетичних і зовнішніх чинників.
Інсулін до теперішнього часу служить радикальним, а в більшості випадків єдиним засобом для підтримання життя і працездатності хворих на цукровий діабет. До отримання та впровадження інсуліну в клініку в 1922-1923 рр.. хворих на цукровий діабет I типу чекав летальний результат протягом одного-двох років з початку захворювання, незважаючи на застосування найбільш виснажливих дієт. Хворі на цукровий діабет I типу потребують у довічній замісній терапії препаратами інсуліну. Припинення чинності тих чи інших причин регулярного введення інсуліну веде до швидкого розвитку ускладнень і швидкої загибелі хворого.
В даний час цукровий діабет за поширеністю знаходиться на 3-му місці після серцево-судинних і онкологічних захворювань. За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я, поширеність цукрового діабету серед дорослого населення в більшості регіонів світу становить 2-5% і є тенденція збільшення кількості хворих майже в два рази кожні 15 років. Незважаючи на очевидний прогрес в області охорони здоров'я, чисельність інсулінзавісимих хворих збільшується з кожним роком і на поточний момент тільки в Росії становить близько 2 мільйонів чоловік.
Створення препаратів вітчизняного генно-інженерного інсуліну людини відкриває нові можливості вирішення багатьох проблем діабетології Росії для порятунку життя мільйонів людей, які страждають на цукровий діабет.
Список літератури
1. Біотехнологія: Навчальний посібник для ВНЗ / За ред. Н.С. Єгорова, В.Д. Самуїлова .- М.: Вища школа, 1987, стор 15-25.
2. Генно-інженерний інсулін людини. Підвищення ефективності хроматографічного розділення при використанні принципу біфункціональність. / Романчиків А.Б., Якимів С.А., Клюшніченко В.Є., Арутунян А.М., Вульфсон О.М. / / Біоограніческая Хімія, 1997 - 23, № 2
3. Глік Б., Пастернак Дж. Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування. М.: Світ, 2002.
4. Єгоров Н. С., Самуїлом В. Д. Сучасні методи створення промислових штамів мікроорганізмів / / Біотехнологія. Кн. 2. М.: Вища школа, 1988. 208 с.
5. Іммобілізація трипсину і карбоксипептидази В на модифікованих кремнеземах та їх застосування в перетворенні рекомбінантного проінсуліну людини в інсулін. / Кудрявцева Н.Є., Жігіс Л.С., Зубов В.П., Вульфсон А.І., Мальцев К.В., Румш Л.Д. / / Хім.-фармац. ж., 1995 - 29, № 1 стор 61 - 64.
6. Молекулярна біологія. Структура та функції білків. / Степанов В. М. / / Москва, Вища школа, 1996.
7. Основи фармацевтичної біотехнології: Навчальний посібник / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалін, К.Л. Зайков, Л.К. Михальова. - Ростов-на-Дону.: Фенікс; Томськ: Видавництво НТЛ, 2006.
8. Синтез фрагментів інсуліну та вивчення їх фізико-хімічних і імунологічних властивостей. / Панін Л.Є., Тузіков Ф.В., Потеряева О.М., Максюта О.З., Тузікова Н.А., Сабіров О.М. / / Біоорганічна Хімія, 1997 - 23, № 12 стор 953 - 960.
Введення
1. Типи інсуліну
2. Отримання інсуліну
Висновок
Список літератури
Введення
Інсулін (від лат. Insula - острів) - гормон пептидної природи, що утворюється в бета-клітинах острівців Лангерганса підшлункової залози. Робить багатогранний вплив на обмін речовин практично у всіх тканинах.
Основна функція інсуліну - забезпечувати проникність клітинних мембран для молекул глюкози. У спрощеному вигляді можна сказати, що не тільки вуглеводи, а й будь-які поживні речовини в кінцевому рахунку розщеплюються до глюкози, яка і використовується для синтезу інших містять вуглець молекул, і є єдиним видом палива для клітинних енергостанцій - мітохондрій. Без інсуліну проникність клітинної мембрани для глюкози падає в 20 разів, і клітини помирають від голоду, а розчинений у крові надлишок цукру отруює організм.
Порушення секреції інсуліну унаслідок деструкції бета-клітин - абсолютна недостатність інсуліну - є ключовою ланкою патогенезу цукрового діабету 1-го типу. Порушення дії інсуліну на тканини - відносна інсулінова недостатність - має важливе місце у розвитку цукрового діабету 2-го типу.
Історія відкриття інсуліну пов'язана з іменем російського лікаря І.М. Соболєва (друга половина 19 століття), який довів, що рівень цукру в крові людини регулюється спеціальним гормоном підшлункової залози.
У 1922 році інсулін, виділений з підшлункової залози тварини, був вперше введений десятирічному хлопчикові, хворому на діабет. результат перевершив всі очікування, і вже через рік американська фірма «Eli Lilly» випустила перший препарат тваринного інсуліну.
Після отримання першої промислової партії інсуліну в наступні кілька років пройдено великий шлях його виділення та очищення. У результаті гормон став доступний для хворих на цукровий діабет 1 типу.
У 1935 році датський дослідник Хагедорн оптимізував дію інсуліну в організмі, запропонувавши пролонгований препарат.
Перші кристали інсуліну були отримані в 1952 році, а в в1954 році англійський біохімік Г. Сенджер розшифрував структуру інсуліну. Розвиток методів очищення гормону від інших гормональних речовин і продуктів деградації інсуліну дозволили отримати гомогенну інсулін, званий однокомпонентним.
На початку 70-х р.р. радянськими вченими А. Юдаєв і С. Швачкін був запропонований хімічний синтез інсуліну, проте здійснення даного синтезу в промисловому масштабі було дорогим і нерентабельним.
Надалі йшло прогресуюче поліпшення ступеня очищення інсулінів, що зменшувало проблеми, зумовлені інсулінової алергією, порушеннями роботи нирок, розладом зору й імунної резистентністю до інсуліну. Був необхідний найбільш ефективний гормон для замісної терапії при цукровому діабеті - гомологічний інсулін, тобто інсулін людини.
У 80 - роках досягнення молекулярної біології дозволили синтезувати за допомогою E.coli обидві ланцюга людського інсуліну, які були потім з'єднані в молекулу біологічно активного гормону, а в Інституті біоорганічної хімії РАН отриманий рекомбінантний інсулін з використанням генно-інженерних штамів E.coli.
Використання афінної хромотографії значно знизило вміст у препараті забруднюючих білків з більш високою м.м., ніж у інсуліну. До таких білків відносяться проінсулін і частково розщеплені проінсулін, які здатні індукувати вироблення антиінсулінових антитіл.
Використання людського інсуліну з самого початку терапії зводить до мінімуму виникнення алергічних реакцій. Людський інсулін швидше абсорбується і незалежно від форми препарату має коротшу тривалість дії, ніж тварини інсуліни. Людські інсуліни менш іммуногена, ніж свинячі, особливо змішані бичачі і свинячі інсуліни.
1. Типи інсуліну
Препарати інсуліну відрізняються один від одного за ступенем очищення; джерела отримання (бичачий, свинячий, людський); речовин, що додається до розчину інсуліну (подовжує його дію, бактеріостатиками і т.д.); концентрації; величиною рН; можливості змішування ІКД з ІПД.Препарати інсуліну розрізняються за джерелом отримання. Інсулін свині та бика відрізняється від людського за амінокислотним складом: бичачий - за трьома амінокислотам, а свинячий - по одній. Не дивно, що при лікуванні бичачим інсуліном побічні реакції розвиваються набагато частіше, ніж при терапії свинячим або людським інсуліном. Ці реакції виражаються в імунологічній інсулінорезистентності, алергії до інсуліну, ліподистрофія (зміні подкожножировой клітковини у місці ін'єкції).
Незважаючи на явні недоліки бичачого інсуліну, він все ще широко використовується в світі. І все ж недоліки бичачого інсуліну в імунологічному плані очевидні: його ні в якому разі не рекомендується призначати хворим вперше виявленим цукровим діабетом, вагітним або для короткочасної інсулінотерапії, наприклад в періопераційному періоді. Негативні якості бичачого інсуліну зберігаються і при використанні їх у суміші зі свинячим, тому змішані (свинячий + бичачий) інсуліни також не варто використовувати для терапії зазначених категорій хворих.
Препарати інсуліну людини за хімічною структурою повністю ідентичні людському інсуліну.
Основною проблемою біосінтетіческіго методу отримання інсуліну людини є повне очищення кінцевого продукту від найменших домішок використаних мікроорганізмів і продуктів їх життєдіяльності. Нові методи контролю якості гарантують, що біосинтетичні інсуліни людини вищеперелічених виробників вільні від будь-яких шкідливих домішок; таким чином, їх ступінь очищення і цукрознижуючих ефективність відповідають найвищим вимогам і є практично однаковими. Яких-небудь небажаних побічних дій, що залежать від домішок, ці препарати інсуліну не мають.
В даний час у медичній практиці використовують інсуліни трьох типів:
- Короткодіючі з швидким початком ефекту;
- Середньої тривалості дії;
- Тривалої дії з повільним проявом ефекту.
Таблиця 1. Характеристики комерційних препаратів інсуліну
| Тип інсуліну | Синоніми | Подовжувач | Консервант | Буфер / солі | Bіди | Приклади (торгові назви) |
| Короткої дії | "Простий", розчинна | Ні | Метилпарабен m-Крезол Фенол | NaCl Гліцерин Na (H) PO4 Ацетат Na | Чоловіче. Свинячий Бичачий | Актрапід-НМ, Хумулін-Р Актрапід, Актрапід-МС Інсулін для ін'єкцій (СРСР, більше не виробляється) |
| НПХ (NPH) | НПХ | Протамін | m-Крезол Фенол | Гліцерин Na (H) PO4 | Чоловіче. Свинячий Бичачий | Протафан-НМ, Хумулін-Н Протафан-МС Протамін-інсулін (СРСР, більше не виробляється) |
| Стрічці | Інсулін-цинк-суспензія (смешанн.) | Цинк | Метилпарабен | NaCl Ацетат Na | Чоловіче. Свинячий Бичачий | Монотард-НМ, Хумулін-цинк Монотард-МС, Стрічці-МС Стрічці |
| Ультра-стрічці | Інсулін-цинк-суспензія (крісталл.) | Цинк | Метилпарабен | NaCl Ацетат Na | Чоловіче. Бичачий | Ультраленте Ультратард |
Інсулін короткої дії (ІКД) - регулярний інсулін - представляє собою короткодействующих розчинна при нейтральному значенні рН кристалічний цинк-інсулін, ефект якого розвивається протягом 15 хвилин після підшкірного введення і триває 5-7 годин.
Перший інсулін продовженої дії (ВПС) було створено наприкінці 30-х рр.., Щоб хворі змогли робити ін'єкції рідше, ніж це було при використанні тільки ІКД, - по можливості один раз на добу. З метою збільшення тривалості дії всі інші препарати інсуліну модифіковані і при розчиненні в нейтральному середовищі утворюють суспензію. Вони містять протамін у фосфатному буфері - протамін-цинк-інсулін і НПХ (нейтральний протамін Хагедорна) - НПХ-інсулін або різні концентрації цинку в ацетатному буфері - інсуліни ультраленте, стрічці, Семиленте.
Препарати інсуліну середньої тривалості дії містять протамін, що представляє білок середньої м.м. 4400, багатий аргініном і одержуваний з молок райдужної форелі. Для утворення комплексу потрібно співвідношення протаміну та інсуліну 1:10. після підшкірного введення протеолітичні ферменти руйнують протамін, дозволяючи інсуліну всмоктуватися.
НПХ-інсулін не змінює фармакокінетичний профіль змішуваного з ним регуляторного інсуліну. НПХ-інсулін краще інсуліну стрічці як компонент середньої тривалості дії в терапевтичних сумішах, що містять регулярний інсулін.
У фосфатному буфері всі інсуліни легко утворюють кристали з цинком, але тільки кристали бичачого інсуліну мають достатньої гідрофобністю, щоб забезпечити уповільнене і стабільне вивільнення інсуліну, характерного для ультраленте. Цинкові кристали свинячого інсуліну розчиняються швидше, ефект настає раніше, тривалість дії коротше. Тому не існує препарату ультраленте, що містить лише свинячий інсулін. Монокомпонентний свинячий інсулін випускають під назвою інсулін-суспензія, інсулін-нейтрал, інсулін-НПХ, інсулін-амінохінурід.
Інсулін стрічці - це суміш 30% інсуліну Семиленте (аморфний преципітат інсуліну з іонами цинку в ацетатному буфері, ефект якого розвіюється відносно швидко) з 70% інсуліну ультраленте (погано розчинний кристалічний цинк-інсулін, має уповільнене початок і пролонговану дію). Ці два компоненти забезпечують комбінацію з відносно швидкої абсорбцією і стабільним тривалою дією, роблячи інсулін-стрічці зручним терапевтичним засобом.
2. Отримання інсуліну
Інсулін людини можна виробляти чотирма способами:1) повним хімічним синтезом;
2) екстракцією з підшлункових залоз людини (обидва ці способи не підходять через неекономічність: недостатньою розробленості першого способу і нестачу сировини для масового виробництва другим способом);
3) напівсинтетичним методом з допомогою ферментно-хімічної заміни в положенні 30 В-ланцюга амінокислоти аланіну у свинячому інсуліні на треонін;
4) биосинтетическим способом за генно-інженерної технології. Два останніх методу дозволяють отримати людський інсулін високого ступеня очищення.
В даний час інсулін людини, в основному, отримують двома способами: модифікацією свинячого інсуліну синтетика-ферментативним методом і генно-інженерних способом.
Інсулін виявився першим білком, отриманими для комерційних цілей з використанням технології рекомбінантної ДНК. Існує два основних підходи для отримання генно-інженерного інсуліну людини.
У першому випадку здійснюють роздільне (різні штами-продуценти) отримання обох ланцюгів з подальшим фолдінга молекули (утворення дисульфідних містків) і поділом ізоформ.
У другому - отримання у вигляді попередника (протоінсуліну) з наступним ферментативним розщепленням трипсином і карбоксипептидази В до активної форми гормону. Найбільш доцільним в даний час є отримання інсуліну у вигляді попередника, що забезпечує правильність замикання дисульфідних містків (у разі роздільного отримання ланцюгів проводять послідовні цикли денатурації, поділу ізоформ і ренатурації).
При обох підходах можливо як індивідуальне отримання вихідних компонентів (А-і В-ланцюга або проінсулін), так і в складі гібридних білків. Крім А-і В-ланцюга або проінсуліну, у складі гібридних білків можуть бути присутніми:
- Білок носій, що забезпечують транспортування гібридного білка в періплазматіческое простір клітини або культуральне середовище;
- Афінних компонент, істотно полегшує виділення гібридного білка.
При цьому обидва ці компоненти можуть одночасно бути присутнім у складі гібридного білка. Крім цього, при створенні гібридних білків може використовуватися принцип мультімерності, (тобто, в гібридному білку присутня кілька копій цільового поліпептиду), що дозволяє істотно підвищити вихід цільового продукту.
У Великобританії за допомогою E.coli синтезовані обидві ланцюга людського інсуліну, які потім були сполучені в молекулу біологічно активного гормону. Щоб одноклітинний організм міг синтезувати на своїх рибосомах молекули інсуліну, необхідно забезпечити його потрібної програмою, тобто ввести йому ген гормону.
Хімічним способом отримують ген, що програмує біосинтез попередника інсуліну або два гени, що програмують окремо біосинтез ланцюгів А і В інсуліну.
Наступний етап - включення гена попередника інсуліну (або гени ланцюгів порізно) в геном E.coli - особливого штаму кишкової палички, вирощеного в лабораторних умовах. Це завдання виконує генна інженерія.
З E.coli виокремлює плазміду відповідної рестриктазою. синтетичний ген вбудовується в плазміду (клонуванням з функціонально активної С-кінцевий частиною β-галактозидази E.coli). У результаті E.coli набуває здатність синтезувати білкову ланцюг, що складається з галактозидази та інсуліну. Синтезовані поліпептиди отщепляют від ферменту хімічним шляхом, потім проводять і очищення. У бактеріях сінезіруется около100000 молекул інсуліну на бактеріальну клітину.
Природа гормонального речовини, що продукується E.coli, обумовлена тим, який ген вбудовується в геном одноклітинного організму. Якщо клонований ген попередника інсуліну, бактерія синтезує попередник інсуліну, який піддається потім обробці рестріктазами для відщеплення препітіда з виокремлення С-пептиду, внаслідок чого виходить біологічно активний інсулін.
Для отримання очищеного інсуліну людини виділений з біомаси гібридний білок піддають Хімкі-ферментативної трансформації та відповідної хроматографічної очищенню (фпрнтальной, гельпронікающей, аніонообмінної).
В Інституті РАН отриманий рекомбінантний інсулін з використанням генно-інженерних штамів E.coli. з вирощеної біомаси виділяється попередник, гібридний білок, експресуються в кількості 40% від усього клітинного білка, що містить препроїнсулін. Перетворення його в інсулін in vitroосуществляется в тій же послідовності, що і in vivо - відщеплюється лідируючий поліпептид, препроїнсулін перетворюється на інсулін через стадії окислювального сульфітоліза з наступним відновним замиканням трьох дисульфідних зв'язків і ферментативним вичленовуванням зв'язує С-пептиду. Після низки хромотографіческіх очищень, що включають іонообмінні, гелеві та ВЕРХ, отримують людський інсулін високої чистоти і природної активності.
Можна використовувати штам з вбудованою в плазміду нуклеотидної послідовністю, що експресують гібридний білок, який складається з лінійного проінсуліну і приєднаного до його N-кінця через залишок метіоніну фрагмента білка А Staphylococcus aureus.
Культивування насиченою біомаси клітин рекомбінантного штаму забезпечує початок виробництва гібридного білка, виділення і послідовна трансформація якого in tube призводять до інсуліну.
Можливий і інший шлях: виходить в бактеріальної системі експресії злитої рекомбінантний білок, що складається з проінсуліну людини і приєднаного до нього через залишок метіоніну полігістідінового "хвоста". Його виділяють, використовуючи хелатних хроматографію на колонках з Ni-агарози з тілець включення і розщеплювали бромцианом.
Виділений білок є S-сульфонірованним. Картування і мас-спектрометричний аналіз отриманого проінсуліну, очищеного іонообмінних хроматографією на аніонних та ОФ (обращеннофазовой) ВЕРХ (високоефективної рідинної хроматографією), показують наявність дисульфідних містків, відповідних дисульфідними містками нативного проінсуліну людини.
Останнім часом пильна увага приділяється спрощенню процедури отримання рекомбінантного інсуліну методами генної інженерії. Так, наприклад, можна отримати злитої білок, що складається з лідерного пептиду інтерлейкіну 2 приєднаного до N-кінця проінсуліну, через залишок лізину. Білок ефективно експресується і локалізується в тільцях включення. Після виділення білок розщеплюється трипсином з отриманням інсуліну і С-пептиду.
Отримані інсулін і С-пептид очищалися ОФ ВЕРХ. При створенні злитих конструкцій вельми істотним є співвідношення мас білка носія та цільового поліпептиду. З-пептиди з'єднуються за принципом "голова-хвіст" за допомогою амінокислотних спейсерів, несучих сайт рестрикції Sfi I і два залишку аргініну на початку і в кінці спейсера для подальшого розщеплення білка трипсином. ВЕРХ продуктів розщеплення показує, що відщеплення С-пептиду проходить кількісно, а це дозволяє використовувати спосіб мультімерних синтетичних генів для отримання цільових поліпептидів в промисловому масштабі.
Висновок
Цукровий діабет - хронічне захворювання, обумовлене абсолютною або відносною недостатністю інсуліну. Воно характеризується глибоким порушенням обміну вуглеводів з гіперглікемією і глюкозурією, а також іншими порушеннями обміну речовин в результаті впливу ряду генетичних і зовнішніх чинників.
Інсулін до теперішнього часу служить радикальним, а в більшості випадків єдиним засобом для підтримання життя і працездатності хворих на цукровий діабет. До отримання та впровадження інсуліну в клініку в 1922-1923 рр.. хворих на цукровий діабет I типу чекав летальний результат протягом одного-двох років з початку захворювання, незважаючи на застосування найбільш виснажливих дієт. Хворі на цукровий діабет I типу потребують у довічній замісній терапії препаратами інсуліну. Припинення чинності тих чи інших причин регулярного введення інсуліну веде до швидкого розвитку ускладнень і швидкої загибелі хворого.
В даний час цукровий діабет за поширеністю знаходиться на 3-му місці після серцево-судинних і онкологічних захворювань. За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я, поширеність цукрового діабету серед дорослого населення в більшості регіонів світу становить 2-5% і є тенденція збільшення кількості хворих майже в два рази кожні 15 років. Незважаючи на очевидний прогрес в області охорони здоров'я, чисельність інсулінзавісимих хворих збільшується з кожним роком і на поточний момент тільки в Росії становить близько 2 мільйонів чоловік.
Створення препаратів вітчизняного генно-інженерного інсуліну людини відкриває нові можливості вирішення багатьох проблем діабетології Росії для порятунку життя мільйонів людей, які страждають на цукровий діабет.
Список літератури
1. Біотехнологія: Навчальний посібник для ВНЗ / За ред. Н.С. Єгорова, В.Д. Самуїлова .- М.: Вища школа, 1987, стор 15-25.
2. Генно-інженерний інсулін людини. Підвищення ефективності хроматографічного розділення при використанні принципу біфункціональність. / Романчиків А.Б., Якимів С.А., Клюшніченко В.Є., Арутунян А.М., Вульфсон О.М. / / Біоограніческая Хімія, 1997 - 23, № 2
3. Глік Б., Пастернак Дж. Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування. М.: Світ, 2002.
4. Єгоров Н. С., Самуїлом В. Д. Сучасні методи створення промислових штамів мікроорганізмів / / Біотехнологія. Кн. 2. М.: Вища школа, 1988. 208 с.
5. Іммобілізація трипсину і карбоксипептидази В на модифікованих кремнеземах та їх застосування в перетворенні рекомбінантного проінсуліну людини в інсулін. / Кудрявцева Н.Є., Жігіс Л.С., Зубов В.П., Вульфсон А.І., Мальцев К.В., Румш Л.Д. / / Хім.-фармац. ж., 1995 - 29, № 1 стор 61 - 64.
6. Молекулярна біологія. Структура та функції білків. / Степанов В. М. / / Москва, Вища школа, 1996.
7. Основи фармацевтичної біотехнології: Навчальний посібник / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалін, К.Л. Зайков, Л.К. Михальова. - Ростов-на-Дону.: Фенікс; Томськ: Видавництво НТЛ, 2006.
8. Синтез фрагментів інсуліну та вивчення їх фізико-хімічних і імунологічних властивостей. / Панін Л.Є., Тузіков Ф.В., Потеряева О.М., Максюта О.З., Тузікова Н.А., Сабіров О.М. / / Біоорганічна Хімія, 1997 - 23, № 12 стор 953 - 960.