РЕГЕНЕРАЦІЯ ПЕРИФЕРІЙНОЇ Нервова система хребетних
Відновлення пошкоджених аксонів
Шванівські клітини периферичної нервової системи забезпечують оточення, що сприяє регенерації аксона. Стимулююча зростання нейронів активність шванівських клітин є наслідком секреції багатьох трофічних факторів, експресії на поверхні клітин молекул адгезії і інтегринів, а також продукції компонентів позаклітинного матриксу, таких як ламінін. Наприклад, експерименти, в яких ушкоджувався сідничний нерв, показали, що в той час, як периферичний ділянку аксона дегенерує, вцілілі шванівські клітини в цій області синтезують у високих концентраціях два нейротрофічних чинники: BDNF (нейротрофічний фактор, отриманий з мозку) і NGF. Таким чином, шваннівські клітини можуть постачати трофічними факторами BDNF і NGF рухові, чутливі і симпатичні аксони, регенеруючі до своїх периферичним мішенях. Цікаво, що такі «денервированного» шванівські клітини експресують на своїй поверхні велика кількість нізкоаффінних рецепторів для NGF і BDNF. Можливо, це підтримує деяку тонічну концентрацію цих нейротрофінів, які служать для вибору правильного напрямку для зростання регенеруючих аксонів 84). Після регенерації нервів шванівські клітини припиняють продукцію NGF і BDNF і знову забезпечують ізоляцію аксонів.
ApoE ), синтезируемый шванновскими клетками и макрофагами, также накапливается в дистальном участке поврежденных периферических нервов и связывается с базальной мембраной шванновских клеток (см. рис. 2 ).
Аполіпопротеїн E (ApoE), який синтезується клітинами шванівськими і макрофагами, також накопичується в дистальному ділянці пошкоджених периферичних нервів і зв'язується з базальною мембраною шванівських клітин (див. рис. 2). АроЕ підтримує життєздатність нейронів за рахунок захисту клітин від окислювального пошкодження, а також стимуляції росту та адгезії клітин.
Рис.1. Спраутінг аксонів в ЦНС ссавців. (А) Типова гранулярная клітина зубчастої фасції на її дендритах в зовнішньому молекулярному шарі (OML) отримує множинні сина птіческіе входи від іпсилатеральний енторінальной кори головного мозку і одиничні входи від контралатеральной кори і медіальної перегородки. Дендрити внутрішнього молекулярного шару (IML) отримують входи від медіальної перегородки і комміссуральних / асоціативних волокон. GCL = гранулярний клітинний шар. (В) Видалення іпсилатеральний енторінальной кори призводить до інтенсивного росту аксонів нервових клітин енторінальной кори з контралатеральной боку і заміщенню іпсилатеральний енторінального входу в OML. Спостерігається також спраутінг аксонів, що приходять у DML від медіальної перегородки. Комміссуральние / асоціативні волокна в IML розширюють зону іннервації. (С, D) Приклади термінальних розгалужень аксонів від контралатеральной енторінальной кори в OML зубчастої фасції. (С) Норма. (D) Два місяці після пошкодження іпсилатеральний енторінальной кори. |
Тим не менш, у нокаутних мишей, позбавлених АроЕ, регенерація і ремієлінізації периферичних аксонів істотно не змінюється. Проте миші з відсутністю АроЕ мають знижене число неміелінізірованних аксонів і, відповідно, знижену чутливість до ушкоджувальних тепловим стимулам.
При пошкодженні периферичного нерва в зоні пошкодження активуються фактори, що стимулюють проліферацію шванівських клітин. Вони включають два цитокіну: фактор, що інгібує лейкемію (ФІЛ), і Reg-2, що є потенційним мітогеном шванівських клітин (див. рис. 2). Reg-2 специфічно експресується у розвиваються і регенеруючих рухових і чутливих нейронах, і ця експресія посилюється ФІЛ. Антитіла до Reg-2 уповільнюють регенерацію після передавлювання сідничного нерва.
Специфічність реіннерваціі
Для повного відновлення функції після пошкодження нервової системи регенеруючі аксони повинні відновити зв'язки зі своїми колишніми мішенями. Класичні експерименти Ленглі, підтверджені пізніше дослідженнями поодиноких клітин, показали, що регенеруючі прегангліонарних аксони нейронів автономної нервової системи реіннервіруют відповідні постгангліонарні нейрони. У цьому механізмі має значення, мабуть, сигнал про позицію нейрона, який впливає на формування синапсу між нейроном і клітиною-мішенню.
Рис. 2. Шванівські клітини сприяють регенерації аксонів в периферичної нервової системи хребетних. Після аксотоміі дистальний ділянку аксона і мієлінова оболонка дегенерують і фагоцитуються. Проліферація шванівських клітин стимулюється двома цитокінами: фактором, інгібуючим лейкемію (LIF), з макрофагів і Reg-2 з закінчень аксонів. Експресія Reg-2 посилюється LIF. Проліферуючі шванном ські клітини синтезують два нейротрофічних чинника, BDNF і NGF, які зберігаються на клітинній поверхні їх нізкоаффіннимі рецепторами. Нейротрофінів підтримують процес регенерації аксонів і направляють їх до відповідних мішенях. который способствует выживанию нейронов и регенерации их аксонов. Шванівські клітини і макрофаги синтезують також аполіпопротеїн Ε (ΑροΕ), який сприяє виживанню нейронів і регенерації їх аксонів. |
|
Цей механізм справедливий як для симпатичної, так і рухової системи. Так, якщо міжреберна м'яз, витягнута з передньої частини грудної клітки, трансплантують в область шиї, то вона переважно реіннервіруется аксонами шийного симпатичного стовбура, розташованими в самих передніх ділянках спинного мозку (рис. 3). Навпаки, м'язи, трансплантовані із задніх областей тіла, мають тенденцію до реіннерваціі аксонами більш дорзальньгх нейронів. Подібна тенденція встановлена і для трансплантації симпатичних гангліїв різного вихідного розташування. У молодих щурів залежність від позиції нейрона показана в реіннерваціі м'язів, що мають множинну іннервацію декількома сегментами.
Нервово-м'язові синапси у новонароджених щурів, пуголовків і дорослих тритонів після поперечного перетину рухового нерва з високою точністю возз'єднуються з вихідною синаптичної зоною. Одним з механізмів виборчого відновлення синапсів є конкуренція між аксонами. У м'язах саламандри, іннервіровани чужим аксонів, чужорідний синапс елімінується після того, як нормальний нерв відновив свій синаптичний контакт. У дорослих ссавців чутливі, рухові і постгангліонарні аксони показують більш низьку вибірковість по відношенню до їх вихідних мішенях. Чужі нерви при іннервації м'язових волокон можуть бути настільки ж ефективними, як і оригінальні нервові волокна. Більш того, чужий нерв може навіть витіснити вихідний аксон в інтактних м'язах дорослої щури). Виборча регенерація у дорослих ссавців можлива, якщо периферичний нерв був не перерізаний, а перетиснутий так, щоб збереглися ендоневрій і базальна мембрана шванівських клітин, що оточували інтактні аксони (див. рис. 4)). За таких умов регенеруючі аксони направляються знову до своїх вихідним мішенях. Якщо ендоневрій був зруйнований, наприклад при перерезке нерва, регенерація відбувається безладно і аксони часто створюють синапси з невідповідними мішенями.
|
Рис. 3. Селективна реіннерваціі м'язів, заснована на сегментарному походження. (А) Міжреберна м'яз з грудного сегмента ТЗ, Т4 або Т5 була трансплантована на шию дорослої пацюки і після видалення верхнього шийного ганглія була реіннервірована прегангліонарних аксонами шийного симпатичного стовбура. Сегментарне походження входів було визначено реєстрацією активності м'язів при стимуляції окремих вентральних корінців, які з'єднують прегангліальние аксони з нервовим стволом. (В) Розподіл входів до трансплантованих ТЗ, Т4 і Т5 м'язам. Передні м'язи схильні до реіннерваціі передніми прегангліальнимі аксонами. |
Властивості нерва і м'язи після утворення синапсу чужим нервом
Перші спостереження про наслідки формування синапсів чужим нервом відносяться до 1904 року, коли Ленглі і Андерсон провели видатне дослідження, яке показало, що м'язи кішки можуть іннервувати прегангліонарних холинергическими симпатичними волокнами, які в нормі створюють синапси в автономному ганглії. Було також показано формування подібних синапсів між автономними нервами жаби і скелетними м'язами щури (рис. 4.). Багато властивостей нерва і м'язи у таких експериментах залишалися без змін, незважаючи на незвичайну іннервацію.
В інших експериментах було показано, що властивості м'язів з чужорідної іннервацією помітно змінюються. Яскравим прикладом є повільні скелетні м'язові волокна жаби: вони іннервіровани дифузно, мають характерні деталі будови і не генерують регенеративних потенціалів дії або швидких м'язових скорочень. Після денервації повільні волокна можуть бути реіннервіровани нервами, які в нормі іннервують швидкі м'язи. У цих умовах повільні волокна стають здатними генерувати потенціали дії та здійснювати швидке м'язове скорочення. Екклс і колеги після перерізання міняли місцями нерви, що іннервують два типи м'язів кошенят і щурів, що розрізняються за швидкістю скорочення. Обидва цих типу м'язових волокон генерують поширюються потенціали дії і називаються повільно-і швидко-скорочуються волокнами, відповідно. Після реіннерваціі чужим нервом повільно-скорочуються м'язи ставали швидше, а швидко-скорочуються - повільніше. Головним чинником трансформації був патерн імпульсів в нерві і результуючі м'язові скорочення; мотонейрони, що іннервують повільно-і швидко-скорочуються м'язові волокна, порушуються з різною частотою Роль базальної мембрани в регенерації нервово-м'язових синапсів
Структурою, яка відіграє ключову роль в регенерації нервово-м'язових синапсів, є синаптична базальна мембрана, яка знаходиться між нервовим закінченням і м'язової мембраною. Синаптична базальна мембрана являє собою інтенсивно забарвлюється позаклітинне речовина, що складається з протеогліканів і глікопротеїнів. Як показано на рис. 3А, базальна мембрана оточує м'яз, нервове закінчення і шванівську клітку і занурюється в складки постсинаптичної мембрани.
МакМахан і його колеги провели серію елегантних досліджень ролі синаптичної базальної мембрани в диференціювання нерва і м'язи. Успіх їхньої роботи базувався на використанні дуже зручною експериментальної моделі тонкої шкірно-грудного м'яза жаби, в якій положення кінцевих пластинок легко помітна в живій м'язі. На першому етапі клітини в певній ділянці м'язи локально руйнували або перерезкой нерва і м'язових волокон, або повторним додатком металевої пластини, охолодженої рідким азотом (рис. 3В). Протягом кількох днів частина м'язових волокон в ділянці пошкодження дегенерували разом з нервовими закінченнями і була фагоцитувати, але базальна мембрана залишалася при цьому інтактною (рис. 3C). Місце вихідного нервово-м'язового з'єднання могло бути легко розпізнати по характерному морфології базальної мембрани м'язи і шванівських клітин, які залишаються в зоні синапсу, а також по наявності холінестерази, що зберігається на синаптичної базальної мембрані і в синаптичних складках.
Через два тижні після пошкодження в зоні синаптичної базальної мембрани формувалися нові м'язові волокна, що контактують з регенеруючі аксональні закінченнями. Стимуляція нервів викликала скорочення новостворених м'язових волокон. Майже всі регенеровані синапси локалізувалися точно на вихідних синаптичних зонах, що виявлялося після фарбування м'язи на присутність холінестерази. Таким чином, був зроблений висновок про наявність сигналів, асоційованих з синаптичної базальної мембраною, які визначають успіх регенерації синапсів.
Синаптична базальна мембрана і формування синаптичної спеціалізації
Для подальшого дослідження природи сигналів, асоційованих з синаптичної базальної мембраною, м'язи пошкоджували, нерв розчавлювали, а регенерацію м'язового волокна запобігали рентгенівським опроміненням. Регенеруючі аксони росли до вихідних синаптическим зонам, що виявлялося забарвленням на холіноестеразу, і формували активні зони для звільнення медіатора точно навпроти ділянок базальної мембрани, пов'язаних з вторинними синаптичними складками, - і все це відбувалося за відсутності клітинних елементів постсинаптической мішені (ріс.3D).
У паралельній серії експериментів МакМахан і його колеги продемонстрували, що синаптична базальна мембрана в регенеруючих м'язових волокнах містить фактори, що запускають диференціювання постсинаптичної мембрани. М'язи пошкоджувалися, як було описано раніше, а реіннерваціі запобігалася видаленням великого сегменту нерва. При регенерації нові м'язові волокна утворювали вторинні складки і кластери АХ рецепторів і ацетилхолінестерази точно в зоні контакту з вихідною синаптичної базальної мембраною (рис. 4). Таким чином, сигнали, ассоцірованние з синаптичної базальної мембраною, при регенерації можуть ініціювати формування синаптичних спеціалізацій як у м'язових волокнах, так і в нервових закінченнях.
Ідентифікація Агрін
Для ідентифікації сигналу, пов'язаного з базальною мембраною та ініціює постсннаптіческую диференціювання, МакМахан і його колеги використовували морського ската Torpedo califomica. З електричних органів цієї тварини, родинних скелетному м'язі, вони приготували екстракти, що містять базальні мембрани. Додані до культури м'язових волокон, екстракти симулювали ефекти синаптичної базальної мембрани на регенерацію м'язових волокон, а саме индуцировали формування кластерів АХ рецепторів разом з іншими компонентами постсинаптичної мембрани (рис. 5).
Активний компонент екстрактів, названий Агрін, був очищений і охарактеризований, а у курчати, пацюки і ската клонована відповідна кДНК.
|
Рис. 4. Базальна мембрана і регенерація синапсів. (А) Мікрофотографія нормального нервово-м'язового синапсу жаби, пофарбованого рутенієм червоним, що показує базальну мембрану, занурену в постсинаптичні складки і навколишнє шванівську клітину (S) і нервове закінчення (N). (В) Зображення шкірно-грудного м'яза, що показує заморожена (праворуч) або перерізаний (ліворуч) ділянку, з метою викликати локальне пошкодження м'язових волокон. (С) Заморожування призводить до дегенерації та фагоцитозу всіх клітинних елементів нервово-м'язового з'єднання, залишаючи цілою лише базальну мембрану м'язового волокна і шваннівською клітини. Нові нервово-м'язові синапси створюються регенеруючі аксонами і м'язовими волокнами. (D) Нерв і м'яз були пошкоджені, регенерація м'язових волокон попереджена рентгенівським опроміненням. У відсутність м'язових волокон аксони регенерували, відновлювали зв'язок з вихідними синаптичними зонами і формували активні зони. |
Результати гібридизації in situ та імуногістохімічних досліджень продемонстрували, що Агрін синтезується мотонейронами, транспортується по аксона і, звільняючись, індукує диференціювання постсинаптичного апарату в розвиваються нервово-м'язових синапсах. Потім Агрін стає частиною синаптичної базальної мембрани, де бере участь у збереженні постсинаптичного апарату і запускає диференціювання під час регенерації.
Рис. 5. Акумуляція AX рецепторів і ацетилхолінестерази у вихідних синаптичних зонах м'язових волокон, що регенерують у відсутність нерва. М'яз була заморожена, як на рис. 24.13В, але регенерація нерва була блокована. Нові м'язові волокна сформувалися в межах оболонок базальної мембрани. (А і В) ауторадіографії регенерованої м'язи з фарбуванням на холінестераеу, для того щоб виділити вихідну синаптичну зону (у фокусі в частині А), і поміченої радіоактивним -бунгаротоксіном, щоб визначити положення АХ рецепторів (срібні зерна у фокусі в частині В). (С) Електронна мікрофотографія вихідної синаптичної зони в регенерованої м'язі, зазначена пероксидазою хрону (HRP), кон'югованій з -бунгаротоксіном. Розподіл АХ рецепторів виявляється по високій щільності продукту реакції з HRP, який дозволяє розрізняти поверхню м'язового волокна і синаптичні складки. (D) Електронна мікрофотографія вихідної синаптичної зони в регенеруючої м'язі з фарбуванням на холіноестеразу. |
Вихідна холіноестераза деградувала після заморожування м'язи. Таким чином, виявляються продукт реакції обумовлений холінестеразою, синтезованої і акумульованої у вихідній синаптичної зоні регенеруючою м'язовим волокном. |
Специфічний для м'яза рецептор тирозинкінази, званий MuSK, утворює частина агрінового рецептора. Активація MuSK ініціює внутрішньоклітинне фосфорилювання, що служить пусковим сигналом для агрегації АХ рецепторів.
Література:
Sanes, JR, and Lichtman, JW 1999. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22: 389-442.
Song, HJ., and Poo, MM. 1999. Signal transduc-tion underlying growth cone guidance by diffusible factors. Curr. Opin. Neurobiol. 9: 355-363.
Walsh, FS, and Doherty, P. 1997. Neural cell adhesion molecules of the immunoglobulin super-family: Role in axon growth and guidance. Annu Rev. Cell Dev. ВЫ . 1 3: 425-456.
Zigmond, MJ, Bloom, FE, Landis, SC, Roberts, JL, and Squire, LR (eds.). 1999. Fundamental Neuroscience. Academic Press, New York.