Курсова робота
на тему: «Отримання сорбційних матеріалів
з біогенними елементами ».
Виконала студентка МБХФ отд. хімія
5 курсу групи Бекдурдиева К.
Науковий керівник
к.б.н. Філь О.А.
ЗМІСТ
Вступ 3
Теоретична частина
1.1. Особливості органічних полімерних носіїв, використовуваних для іммобілізації біологічно активних речовин 5
1.2. Модифікування поверхні твердих носіїв макромолекулами біополімерів 10
1.3. Використання сорбційних матеріалів у медицині та медичної промисловості 14
Методична частина
2.1.Характеристика реагентів використовуються для отримання 18
сорбентів
2.2. Отримання казеїну 18
2.3. Метод визначення питомої адсорбції ентеросорбенту по іону кобальту (II) 19
Експериментальна частина
3.1. Синтез ентеросорбентів 20
3.2. Дослідження сорбційної ємності розроблених сорбентів щодо іонів кобальту (II) 24
Висновок 26
Список використовуваної літератури 27
Введення
Одне з основних напрямів біотехнології передбачає розробку сорбційних матеріалів і подальше їх застосування в біохімії (поділ та очищення речовин), екології (моніторинг навколишнього середовища), в медицині та медичної промисловості як незамінних матеріалів для гемо - і ентеросорбції.
Метод ентеросорбції почав активно змагатися з гемосорбцією (кероване виділення з крові небажаних компонентів-токсинів, екзогенних отрут, шкідливих продуктів метаболізму) у зв'язку з низкою переваг, основними з яких є:
- Відсутність необхідності оперативного втручання і пов'язаного з цим ризику можливих ускладнень, характерних для гемосорбції;
- Відсутність прямого пошкоджуючого контакту з біологічними рідинами (кров, лімфа);
- Можливість широкого використання сорбційної терапії при амбулаторному лікуванні в польових і звичайних домашніх умовах.
У зв'язку з високими вимогами до чистоти біотехнологічних продуктів все більш актуальною стає задача використання нових сорбційних матеріалів в хроматографії. Ключовим моментом у цьому питанні є створення механічно стабільних сорбентів, здатних забезпечувати високий вихід біологічно активних цільових продуктів і мають здатність до багаторазового використання.
Для вирішення вище викладених завдань найбільш перспективними є ентеросорбенти, наприклад білки, які в організмі вищих тварин виконують транспортні функції. Білки, будучи полісорбенти через присутність великої кількості можливих центрів зв'язування, розташованих в бічних радикалах амінокислот мають разом з тим певної специфічністю. Блокування окремих функціональних груп білків за допомогою використання розчинів з блокаторами (інгібіторами або лігандами), а так само іммобілізація їх на жорсткій матриці дозволить отримати ентеросорбенти володіють специфічністю, стабільністю і високою сорбційною ємністю.
Таким чином, мета даної науково-дослідної роботи - розробка біотехнології сорбційних матеріалів на основі білкових систем, іммобілізованих на жорсткій матриці з введенням в них біогенних елементів.
У зв'язку з поставленою метою нами вирішувалися такі завдання:
- Синтез сорбенту на основі мікрокристалічної целюлози, модифікованої білковим комплексом казеїну;
- Дослідження сорбційних властивостей розроблених сорбентів на прикладі іонів кобальту (II);
Теоретична частина
1.1. Особливості органічних полімерних носіїв, використовуваних для іммобілізації біологічно активних речовин
Целюлоза - найбільш високомолекулярний полісахарид, лінійний β-1 ,4-глюкан (С 6 Н 10 О 5) n з видовою специфічністю і ступенем полімеризації [23].
Додаткові дані, отримані методами часткового гідролізу і ацідоліза [11] дозволяють стверджувати, що ймовірність появи інших типів зв'язків у молекулі целюлози не перевищують одного зв'язку на 1000 моноглюкозідних ланок. Ступінь полімеризації природних препаратів целюлози, отриманих в м'яких умовах, може перевищувати 10000, що відповідає рівню значень молекулярної маси близько 10 6 [24] .. При більш жорстких режимах обробки, що мають місце при виділенні целюлози з деревини, величина ступеня полімеризації істотно падає і зазвичай коливається в межах 300-5500 [4], приводячи до відповідного зниження середнього значення молекулярної маси.
Аналіз експериментальних теплот згоряння свідчить про фізичний та хімічної неоднорідності целюлози. Хімічна неоднорідність обумовлена в основному наявністю в макромолекулах целюлози "чужих" ланок, що представляють собою залишки ізомерних полісахаридів (манна, галактани) або окислених фрагментів полімерного ланцюга [19] .. Фізична ж неоднорідність викликана головним чином адсорбированной водою [17].
Для целюлози характерні висока ступінь гідрофільності і схильність до утворення численних водневих зв'язків між нитками полімерів. Наявність безлічі гідроксильних груп дозволяє легко модифікувати целюлозу шляхом хімічного приєднання різноманітних заступників (таблиця 1). Так відомий спосіб отримання імуносорбент, що включає обробку пористих целюлозних кульок метаперіодатом натрію [10]. У результаті обробки на поверхні сорбенту утворюються альдегідні групи, кількість яких не знижується при зберіганні протягом двох років. Автори [9] запропонували отримувати сорбент шляхом хлорування целюлозного волокнистого матеріалу хлорокисом фосфату в середовищі диметилформаміду при нагріванні. Даний носій може знайти застосування при очищенні стічних вод, фармакологічних розчинів від важких металів, а також для концентрування важких металів при аналізі об'єктів навколишнього середовища.
Особливий інтерес представляє введення в макромолекулу целюлози або інших полісахаридів сульфгідрильної групи, що надає препаратів целюлози електронно-обмінні властивості. Були також синтезовані похідні, що містять хлор, йод, нітрильних, амідні і аліфатичні аміногрупи [15].
Запропоновано спосіб [20] модифікації полісахаридів обробкою диизоцианатом з наступною додатковою обробкою біфункціональність або монофункціональним сполуками в стехіометричному надлишку. Як біфункціональних сполук використовують аліфатичні діаміни і дикарбонові кислоти З 2-З 8, а в якості монофункціональних сполук - аліфатичні спирти С 2-С 8.
Як нерозчинного полісахариду застосовували целюлозу, агарози, декстран, хітин, крохмаль і їх похідні у вигляді порошків або гранул. Реакція з диизоцианатом проводилася в безводних органічних розчинниках, не містять рухомих атомів водню, наприклад, в діоксані, ацетоні, хлороформі. У залежності від довжини алифатической ланцюжка отримували носії з різною віддаленістю функціональних груп (-NH 2, СООН та ін) від полисахаридной матриці.
Таблиця 1
Деякі похідні целюлози
Разом з тим сама целюлоза хімічно досить інертна і не вступає в реакцію з білками, нуклеїновими кислотами та їх компонентами. Цього не можна сказати про можливість сорбції біологічних молекул на целюлозі [5]. Целюлоза нестійка до впливу сильних кислот, лугів і окисників. Робочий інтервал рН становить 3-10. Целюлоза охоче атакується мікроорганізмами навіть на холоду, тому її водні суспензії зберігають у присутності антисептиків.
Згідно результатів рентгенографічних досліджень мікрофібрил целюлози утворена протяжними, висококрісталліческімі елементарними фибриллами, що знаходяться у своєрідній матриці із значно менш впорядкованих макромолекулярних утворень. Водневі зв'язки між лінійними ланцюгами целюлози на окремих ділянках можуть утворювати псевдокрісталліческіе структури, які чергуються з більш пухкими, аморфними областями - "порами". Так формуються макроскопічні нитки целюлози, легко набухають у поперечному напрямку. "Кристалічні" ділянки мало доступні для приєднання модифікуючих заступників, які через це розташовуються головним чином на поверхні ниток і в порах. В цілому виходить мікрогетерогенні структура, характер якої залежить від початкового матеріалу і технології обробки целюлози.
Вельми істотно вплив сушіння на властивості целюлози. При видаленні води утворюється безліч додаткових водневих зв'язків на аморфних ділянках матриці, так що об'єм пор різко зменшується.
Для підвищення жорсткості проводять частковий кислотний гідроліз целюлози, що руйнує аморфні ділянки матриці. На місце зруйнованих аморфних ділянок для збереження пористості між "кристалічними" ділянками вводять хімічні зшивання, одночасно збільшуючи ступінь "кристалічності" і розміри пор. Така мікрокристалічна целюлоза (МКЦ) окрім підвищеної жорсткості, більш гомогенна, що забезпечує більш високу в порівнянні із звичайною (волокнистої) целюлозою сорбційну ємність. Існують різні способи гідролізу целюлози. У роботі Бриляков В.М., Хасанханова М.М., Шаповалов О.І. (1974) з метою підвищення виходу та якості сорбенту обробку целюлози розчином кислоти проводили у присутності 40-70% розчину диметилсульфоксиду. Інші автори пропонують обробку целюлозного сировини 3-5% водним розчином азотної, сірчаної або соляної кислоти з фракцією синтетичних жирних кислот З 17-З 20, взятої у кількості 0,2-0,5% від маси целюлозного сировини, при 96-98 ○ З [12].
Високий попит на МКЦ в хімічній, фармацевтичній промисловості вимагає розширення сировинної бази. У роботі [16] запропоновано спосіб, що дозволяє підвищити вихід МКЦ за рахунок використання відходів фільтруючих матеріалів, виробництва тріацетатцеллюлозной основи фотоплівок, які обробляються 9-12% розчином азотної кислоти протягом 6 годин з подальшою обробкою 12% розчином натрієвої лугу при (-7 ° ) - (-10 °) С.
З метою отримання тонкодисперсної МКЦ запропонований спосіб [18] зменшення розмірів частинок і збільшення їх однорідності за рахунок того, що целюлозу попередньо обробляють 67-73% азотною кислотою, а потім - водою до утворення 3-12% концентрації залишилася в ній кислоти і витримують отриману систему при 18-20 ° С 10-20 хвилин. Отриману таким способом целюлозу піддають гідролітичної деструкції при температурі кипіння кислоти протягом 10-25 хвилин.
МКЦ за своїми властивостями близька до натуральної целюлозі, що зустрічається у вигляді природного компонента в харчових продуктах, вона нетоксична і абсолютно нешкідлива, не має побічних явищ і протипоказань [21]. МКЦ, як і інші харчові волокна, діє на організм людини двома шляхами: механічним і сорбційним. У шлунку МКЦ вбирає рідину, розбухає. У тонкому кишечнику МКЦ очищає механічним шляхом його слизову оболонку від "грязьовий" плівки. Крім цього протягом всього шлунково-кишкового тракту МКЦ сорбує шкідливі для організму речовини, важкі метали, радіонукліди і т.п. МКЦ використовують при отруєнні (замість активованого вугілля), з метою нормалізації травлення, при діабеті, атеросклерозі, ішемічній хворобі серця, гастроентерологічних захворюваннях, для профілактики і призупинення зростання новоутворень, утворення каменів у шлунковому міхурі, нирках та ін
1.2. Модифікування поверхні твердих носіїв макромолекулами біополімерів
Білки, будучи одним з найважливіших класів сполук, з хімічної точки зору являє собою високомолекулярні сполуки, які з a-амінокислот. Саме цей факт послужив основою для використання їх у якості компоненту для модифікування поверхні сорбентів. Вирішення цього питання грунтується на застосуванні казеїну в якості білкового компоненту для іммобілізації на твердому носії.
Казеїн - білок молока, фосфопротеинов. У чистому вигляді являє собою білий аморфний гігроскопічний порошок без запаху і смаку. Казеїн проявляє широкий діапазон функціональних властивостей, наприклад, термостабільність, здатність зв'язувати воду, коагулювати. Крім того, його адгезійні та поверхнево-активні властивості в більшій мірі обумовлені унікальним розташуванням гідрофобно-гідрофільних структур у молекулі білка, що грає істотну роль в питанні іммобілізації.
Казеїн складається з суміші різних фракцій, поділ яких здійснюють за ступенем розчинності в різних речовинах при різній температурі, а також по електрофоретичної рухливості (Тетін А., 1979).
Чи не фракціонований казеїн.
Група білків - фосфопротеіди, осаджується з сирого молока при підкисленні його до рН 4,6 при 20 0 С. Містить фосфор.
Група a S-казеїну.
Основна група білків казеїну, осідає в 0,4 М розчині CaCl 2 при рН = 7 і температурі 0 - 4 0 С, нерастворима в 406 М розчині сечовини. Володіє найбільшою з усіх фракцій казеїну електрофоретичною рухливістю, підрозділяється на a S 1 -, a S 2 - і a S 0-казеїни.
a S 1 - основна фракція a S-казеїну, подібно b-казеїну не містить цистеїну.
a S 2-має спільні властивості як з a S 1-казеїном, так і c-казеїном. Подібно c-казеїну a S 2 містить два залишки цистеїну, але як і a S 1-казеїн a S 2 - казеїн розчиняється у присутності іонів кальцію.
a S 0 - зміст цієї фракції близько 10% вмісту a S 1-казеїну. Структура ідентична структурі a S 1-казеїну (виняток становить розташування фосфатної групи).
Вміст фракцій казеїну наведено у відсотках від змісту загальної казеїну.
b-казеїн.
Фракція розчинна в 4,6 М розчині сечовини, але нерастворима в 3,3 М розчині сечовини при рН 4,6. На відміну від a S 1 - і a S 2-казеїном ця фракція розчинна при низьких температурах і може в значних кількостях переходити з міцел казеїну в плазму. Це найбільш гідрофобна фракція казеїну.
c-казеїн. на тему: «Отримання сорбційних матеріалів
з біогенними елементами ».
Виконала студентка МБХФ отд. хімія
5 курсу групи Бекдурдиева К.
Науковий керівник
к.б.н. Філь О.А.
ЗМІСТ
Вступ 3
Теоретична частина
1.1. Особливості органічних полімерних носіїв, використовуваних для іммобілізації біологічно активних речовин 5
1.2. Модифікування поверхні твердих носіїв макромолекулами біополімерів 10
1.3. Використання сорбційних матеріалів у медицині та медичної промисловості 14
Методична частина
2.1.Характеристика реагентів використовуються для отримання 18
сорбентів
2.2. Отримання казеїну 18
2.3. Метод визначення питомої адсорбції ентеросорбенту по іону кобальту (II) 19
Експериментальна частина
3.1. Синтез ентеросорбентів 20
3.2. Дослідження сорбційної ємності розроблених сорбентів щодо іонів кобальту (II) 24
Висновок 26
Список використовуваної літератури 27
Введення
Одне з основних напрямів біотехнології передбачає розробку сорбційних матеріалів і подальше їх застосування в біохімії (поділ та очищення речовин), екології (моніторинг навколишнього середовища), в медицині та медичної промисловості як незамінних матеріалів для гемо - і ентеросорбції.
Метод ентеросорбції почав активно змагатися з гемосорбцією (кероване виділення з крові небажаних компонентів-токсинів, екзогенних отрут, шкідливих продуктів метаболізму) у зв'язку з низкою переваг, основними з яких є:
- Відсутність необхідності оперативного втручання і пов'язаного з цим ризику можливих ускладнень, характерних для гемосорбції;
- Відсутність прямого пошкоджуючого контакту з біологічними рідинами (кров, лімфа);
- Можливість широкого використання сорбційної терапії при амбулаторному лікуванні в польових і звичайних домашніх умовах.
У зв'язку з високими вимогами до чистоти біотехнологічних продуктів все більш актуальною стає задача використання нових сорбційних матеріалів в хроматографії. Ключовим моментом у цьому питанні є створення механічно стабільних сорбентів, здатних забезпечувати високий вихід біологічно активних цільових продуктів і мають здатність до багаторазового використання.
Для вирішення вище викладених завдань найбільш перспективними є ентеросорбенти, наприклад білки, які в організмі вищих тварин виконують транспортні функції. Білки, будучи полісорбенти через присутність великої кількості можливих центрів зв'язування, розташованих в бічних радикалах амінокислот мають разом з тим певної специфічністю. Блокування окремих функціональних груп білків за допомогою використання розчинів з блокаторами (інгібіторами або лігандами), а так само іммобілізація їх на жорсткій матриці дозволить отримати ентеросорбенти володіють специфічністю, стабільністю і високою сорбційною ємністю.
Таким чином, мета даної науково-дослідної роботи - розробка біотехнології сорбційних матеріалів на основі білкових систем, іммобілізованих на жорсткій матриці з введенням в них біогенних елементів.
У зв'язку з поставленою метою нами вирішувалися такі завдання:
- Синтез сорбенту на основі мікрокристалічної целюлози, модифікованої білковим комплексом казеїну;
- Дослідження сорбційних властивостей розроблених сорбентів на прикладі іонів кобальту (II);
Теоретична частина
1.1. Особливості органічних полімерних носіїв, використовуваних для іммобілізації біологічно активних речовин
Целюлоза - найбільш високомолекулярний полісахарид, лінійний β-1 ,4-глюкан (С 6 Н 10 О 5) n з видовою специфічністю і ступенем полімеризації [23].
Додаткові дані, отримані методами часткового гідролізу і ацідоліза [11] дозволяють стверджувати, що ймовірність появи інших типів зв'язків у молекулі целюлози не перевищують одного зв'язку на 1000 моноглюкозідних ланок. Ступінь полімеризації природних препаратів целюлози, отриманих в м'яких умовах, може перевищувати 10000, що відповідає рівню значень молекулярної маси близько 10 6 [24] .. При більш жорстких режимах обробки, що мають місце при виділенні целюлози з деревини, величина ступеня полімеризації істотно падає і зазвичай коливається в межах 300-5500 [4], приводячи до відповідного зниження середнього значення молекулярної маси.
Аналіз експериментальних теплот згоряння свідчить про фізичний та хімічної неоднорідності целюлози. Хімічна неоднорідність обумовлена в основному наявністю в макромолекулах целюлози "чужих" ланок, що представляють собою залишки ізомерних полісахаридів (манна, галактани) або окислених фрагментів полімерного ланцюга [19] .. Фізична ж неоднорідність викликана головним чином адсорбированной водою [17].
Для целюлози характерні висока ступінь гідрофільності і схильність до утворення численних водневих зв'язків між нитками полімерів. Наявність безлічі гідроксильних груп дозволяє легко модифікувати целюлозу шляхом хімічного приєднання різноманітних заступників (таблиця 1). Так відомий спосіб отримання імуносорбент, що включає обробку пористих целюлозних кульок метаперіодатом натрію [10]. У результаті обробки на поверхні сорбенту утворюються альдегідні групи, кількість яких не знижується при зберіганні протягом двох років. Автори [9] запропонували отримувати сорбент шляхом хлорування целюлозного волокнистого матеріалу хлорокисом фосфату в середовищі диметилформаміду при нагріванні. Даний носій може знайти застосування при очищенні стічних вод, фармакологічних розчинів від важких металів, а також для концентрування важких металів при аналізі об'єктів навколишнього середовища.
Особливий інтерес представляє введення в макромолекулу целюлози або інших полісахаридів сульфгідрильної групи, що надає препаратів целюлози електронно-обмінні властивості. Були також синтезовані похідні, що містять хлор, йод, нітрильних, амідні і аліфатичні аміногрупи [15].
Запропоновано спосіб [20] модифікації полісахаридів обробкою диизоцианатом з наступною додатковою обробкою біфункціональність або монофункціональним сполуками в стехіометричному надлишку. Як біфункціональних сполук використовують аліфатичні діаміни і дикарбонові кислоти З 2-З 8, а в якості монофункціональних сполук - аліфатичні спирти С 2-С 8.
Як нерозчинного полісахариду застосовували целюлозу, агарози, декстран, хітин, крохмаль і їх похідні у вигляді порошків або гранул. Реакція з диизоцианатом проводилася в безводних органічних розчинниках, не містять рухомих атомів водню, наприклад, в діоксані, ацетоні, хлороформі. У залежності від довжини алифатической ланцюжка отримували носії з різною віддаленістю функціональних груп (-NH 2, СООН та ін) від полисахаридной матриці.
Таблиця 1
Деякі похідні целюлози
| Заступник з ОН-групі | Назва препарату |
| O (CH 2) 2 NH 2 | Аміноетілцеллюлоза |
| OPO 3 H | Фосфорілцеллюлоза |
| O (CH 2) 2 N (C 2 H 5) 2 | Діетіламіноетілцеллюлоза (ДЕАЕ) |
| OCH 2 COOH | Карбоксиметилцелюлоза (КМЦ) |
| OCO ¾ C 6 H 4 ¾ NH 2 | п-Амінобензоілцеллюлоза |
| OCOCH 2 Br | Бромацетілцеллюлоза |
| OCH 2 CONHNH 2 | Гидразидкарбоксиметилцеллюлоза |
| O (CH 2) 2 SO 3 H | Сульфоетілцеллюлоза |
Згідно результатів рентгенографічних досліджень мікрофібрил целюлози утворена протяжними, висококрісталліческімі елементарними фибриллами, що знаходяться у своєрідній матриці із значно менш впорядкованих макромолекулярних утворень. Водневі зв'язки між лінійними ланцюгами целюлози на окремих ділянках можуть утворювати псевдокрісталліческіе структури, які чергуються з більш пухкими, аморфними областями - "порами". Так формуються макроскопічні нитки целюлози, легко набухають у поперечному напрямку. "Кристалічні" ділянки мало доступні для приєднання модифікуючих заступників, які через це розташовуються головним чином на поверхні ниток і в порах. В цілому виходить мікрогетерогенні структура, характер якої залежить від початкового матеріалу і технології обробки целюлози.
Вельми істотно вплив сушіння на властивості целюлози. При видаленні води утворюється безліч додаткових водневих зв'язків на аморфних ділянках матриці, так що об'єм пор різко зменшується.
Для підвищення жорсткості проводять частковий кислотний гідроліз целюлози, що руйнує аморфні ділянки матриці. На місце зруйнованих аморфних ділянок для збереження пористості між "кристалічними" ділянками вводять хімічні зшивання, одночасно збільшуючи ступінь "кристалічності" і розміри пор. Така мікрокристалічна целюлоза (МКЦ) окрім підвищеної жорсткості, більш гомогенна, що забезпечує більш високу в порівнянні із звичайною (волокнистої) целюлозою сорбційну ємність. Існують різні способи гідролізу целюлози. У роботі Бриляков В.М., Хасанханова М.М., Шаповалов О.І. (1974) з метою підвищення виходу та якості сорбенту обробку целюлози розчином кислоти проводили у присутності 40-70% розчину диметилсульфоксиду. Інші автори пропонують обробку целюлозного сировини 3-5% водним розчином азотної, сірчаної або соляної кислоти з фракцією синтетичних жирних кислот З 17-З 20, взятої у кількості 0,2-0,5% від маси целюлозного сировини, при 96-98 ○ З [12].
Високий попит на МКЦ в хімічній, фармацевтичній промисловості вимагає розширення сировинної бази. У роботі [16] запропоновано спосіб, що дозволяє підвищити вихід МКЦ за рахунок використання відходів фільтруючих матеріалів, виробництва тріацетатцеллюлозной основи фотоплівок, які обробляються 9-12% розчином азотної кислоти протягом 6 годин з подальшою обробкою 12% розчином натрієвої лугу при (-7 ° ) - (-10 °) С.
З метою отримання тонкодисперсної МКЦ запропонований спосіб [18] зменшення розмірів частинок і збільшення їх однорідності за рахунок того, що целюлозу попередньо обробляють 67-73% азотною кислотою, а потім - водою до утворення 3-12% концентрації залишилася в ній кислоти і витримують отриману систему при 18-20 ° С 10-20 хвилин. Отриману таким способом целюлозу піддають гідролітичної деструкції при температурі кипіння кислоти протягом 10-25 хвилин.
МКЦ за своїми властивостями близька до натуральної целюлозі, що зустрічається у вигляді природного компонента в харчових продуктах, вона нетоксична і абсолютно нешкідлива, не має побічних явищ і протипоказань [21]. МКЦ, як і інші харчові волокна, діє на організм людини двома шляхами: механічним і сорбційним. У шлунку МКЦ вбирає рідину, розбухає. У тонкому кишечнику МКЦ очищає механічним шляхом його слизову оболонку від "грязьовий" плівки. Крім цього протягом всього шлунково-кишкового тракту МКЦ сорбує шкідливі для організму речовини, важкі метали, радіонукліди і т.п. МКЦ використовують при отруєнні (замість активованого вугілля), з метою нормалізації травлення, при діабеті, атеросклерозі, ішемічній хворобі серця, гастроентерологічних захворюваннях, для профілактики і призупинення зростання новоутворень, утворення каменів у шлунковому міхурі, нирках та ін
1.2. Модифікування поверхні твердих носіїв макромолекулами біополімерів
Білки, будучи одним з найважливіших класів сполук, з хімічної точки зору являє собою високомолекулярні сполуки, які з a-амінокислот. Саме цей факт послужив основою для використання їх у якості компоненту для модифікування поверхні сорбентів. Вирішення цього питання грунтується на застосуванні казеїну в якості білкового компоненту для іммобілізації на твердому носії.
Казеїн - білок молока, фосфопротеинов. У чистому вигляді являє собою білий аморфний гігроскопічний порошок без запаху і смаку. Казеїн проявляє широкий діапазон функціональних властивостей, наприклад, термостабільність, здатність зв'язувати воду, коагулювати. Крім того, його адгезійні та поверхнево-активні властивості в більшій мірі обумовлені унікальним розташуванням гідрофобно-гідрофільних структур у молекулі білка, що грає істотну роль в питанні іммобілізації.
Казеїн складається з суміші різних фракцій, поділ яких здійснюють за ступенем розчинності в різних речовинах при різній температурі, а також по електрофоретичної рухливості (Тетін А., 1979).
Чи не фракціонований казеїн.
Група білків - фосфопротеіди, осаджується з сирого молока при підкисленні його до рН 4,6 при 20 0 С. Містить фосфор.
Група a S-казеїну.
Основна група білків казеїну, осідає в 0,4 М розчині CaCl 2 при рН = 7 і температурі 0 - 4 0 С, нерастворима в 406 М розчині сечовини. Володіє найбільшою з усіх фракцій казеїну електрофоретичною рухливістю, підрозділяється на a S 1 -, a S 2 - і a S 0-казеїни.
a S 1 - основна фракція a S-казеїну, подібно b-казеїну не містить цистеїну.
a S 2-має спільні властивості як з a S 1-казеїном, так і c-казеїном. Подібно c-казеїну a S 2 містить два залишки цистеїну, але як і a S 1-казеїн a S 2 - казеїн розчиняється у присутності іонів кальцію.
a S 0 - зміст цієї фракції близько 10% вмісту a S 1-казеїну. Структура ідентична структурі a S 1-казеїну (виняток становить розташування фосфатної групи).
Казеїн |
Група a S-казеїну (43-45%) |
b-Казеїн (24-35%) |
Група g-казеїну (3-7%) |
c-Казеїн (8-15%) |
a S1 |
a S2 |
a S0 |
g 1 |
g 2 |
g 3 |
Вміст фракцій казеїну наведено у відсотках від змісту загальної казеїну.
b-казеїн.
Фракція розчинна в 4,6 М розчині сечовини, але нерастворима в 3,3 М розчині сечовини при рН 4,6. На відміну від a S 1 - і a S 2-казеїном ця фракція розчинна при низьких температурах і може в значних кількостях переходити з міцел казеїну в плазму. Це найбільш гідрофобна фракція казеїну.
Фракція розчинна в 0,4 М розчині CaCl 2 при рН 7,0 і температурі 0-4 0 С. Відмінні властивості: має гарну розчинність, не осідає іонами кальцію, що пояснюється наявністю в його молекулі великої кількості ліофільних ОН-груп. Містить три вуглеводу: галактозу, галактозамін і N-ацетилнейрамінових (сіалових) кислоту.
Група g - казеїн.
Фракція розчинна в3, 3 М розчині сечовини, але нерастворима в1, 7М розчині сечовини при рН 4,7 після додавання (NH 4) 2 SO 4.
g 1-фракція ідентична фрагменту b - казеїну, що складається з амінокислотних залишків у положенні 29-209.
g 2-ідентичний фрагменту b - казеїну, що складається з амінокислотних залишків у положенні 106-209.
g 3-ідентичний фрагменту b-казеїну, що складається з амінокислотних залишків у положенні 108-209 (Дьяченко П.Ф., 1959).
У нативному казеїну [3] міститься 15,4% азоту і 0,11% фосфору; багато незамінних амінокислот, таких як лейцин (9,2 г), лізин (8,2 г), аланін (маса вказана в грамах амінокислоти на 100 г білка ).
У деяких роботах іммобілізацію молекул білка здійснювали на похідних целюлози (сульфанілетілового ефіру целюлози, аміноетілцеллюлози, діальдегідцеллюлози), поверхня яких була модифікована глутаровий альдегідом. В якості білка використовували інсулін, рібозофосфатізомеразу, желатину, фермент протеазу Bacillus subtilis. Отримані іммобілізовані препарати відрізнялися стабільністю і досить високим відсотком збереження активності.
Спосіб отримання іммобілізованого осахаривают ферментного препарату включає в себе зв'язування осахаривают ферменту з нерозчинним носієм з допомогою глутарового альдегіду.
В якості носія використовуються гранульований казеїн, а зв'язування здійснювали у водному середовищі в присутності яєчного альбуміну при співвідношенні компонентів: носій (0,02-0,2): 1; фермент: альбумін (0,2-1,5): 1; глутаровий альдегід: фермент з альбуміном (0,2-0,4): 1. Для іммобілізації використовували аміноглюкозідазу або - амілазу. Глутаровий альдегід використовують у вигляді 50% водного розчину. Бажаний розмір часток казеїну склав 100-500 мкм.
Таблиця 2
Зміст амінокислотних залишків
в окремих фракціях казеїну
| Амінокислота | a S 1 | b | g | c |
| Аспарагінова кислота | 14-16 | 9-10 | 9 | 11-12 |
| Глутамінова кислота | 38-41 | 37-39 | 39 | 27 |
| Гістидин | 5 | 5-6 | 6-7 | 3 |
| Аргінін | 5-6 | 4-5 | 3-4 | 5 |
| Лізин | 14-15 | 11-12 | 12 | 9 |
| Гліцин | 9-10 | 5 | 5 | 3 |
| Серін | 13-14 | 13-15 | 12-13 | 12-13 |
| Треонін | 5 | 9 | 10 | 13-14 |
| Аланін | 8-9 | 5-6 | 6 | 13-14 |
| Цистин | 0 | 0 | 0 | 2 |
| Метіонін | 5 | 6 | 7 | 2 |
| Валін | 10-11 | 18-19 | 20 | 11 |
| Лейцин | 14-17 | 21 | 23 | 8 |
| Ізолейцин | 11 | 10 | 8 | 11-12 |
| Пролін | 17-18 | 33-35 | 40-41 | 19 |
| Фенілаланін | 6-8 | 9 | 11 | 4 |
| Тирозин | 10 | 3-4 | 5 | 8 |
| Триптофан | 2 | 1 | 1 | 1 |
1.3. Використання сорбційних матеріалів у медицині та медичної промисловості
Одне з основних напрямів біотехнології передбачає розробку сорбційних матеріалів і подальше їх застосування в медицині та медичної промисловості як незамінних матеріалів для гемо - і ентеросорбції.
У залежності від того, яким комплексом характеристик має той чи інший сорбент виявляються його терапевтичні властивості як ентеросорбенту. Аналізуючи запропоновані нормативними документами і клінічною практикою вимоги до ентеросорбенту, можна виділити комплекс властивостей, властивих як би "ідеального" ентеросорбенти:
- Повна нешкідливість і нетоксичність;
- Висока біосумісність з тканинами, кров'ю та іншими біосубстратах організму;
- Неповреждающийся дію на слизові оболонки ротової порожнини, стравоходу, шлунково-кишкового тракту;
- Виборча сорбція середньомолекулярних токсичних метаболітів;
- Висока адсорбційна ємність;
Проблему створення ефективного і безпечного ентеросорбенту, призначеного для очищення організму від токсичних речовин (шлаків), які продукуються при різних захворюваннях, вже протягом багатьох років вирішують вчені різних країн.
Ентеросорбенти - продукти, використовувані для зв'язування метаболітів, токсинів і інших речовин у травному тракті. Вони перспективні при вирішенні проблем регулювання харчування людини, для зниження надходження в організм екологічно шкідливих речовин (у тому числі радіонуклідів, пестицидів, важких металів), профілактики і лікування ряду захворювань.
Розроблено спосіб ентеросорбції з водних розчинів таких шкідливих речовин і сполук, як формальдегід, фенол, нітрати, нітрити, іони свинцю та інших, в якому як ентеросорбентів використані харчові волокна з різної рослинної сировини. Було встановлено, що за процес зв'язування зазначених речовин відповідальні позитивно і негативно заряджені угруповання лігніну, геміцеллюлоз, пектинових і білкових речовин, що входять до складу харчових волокон (ПВ).
Харчові волокна являють собою складний комплекс біополімерів лінійної і розгалуженої структури з великою молекулярною масою. Присутність первинних і вторинних гідроксильних (целюлоза, геміцелюлози), фенольних (лігнін), карбоксильних груп (геміцелюлози, пектинові речовини) обумовлює міжмолекулярної взаємодії (водневі зв'язки) різної щільності упаковки, здатність сорбувати воду та інші полярні молекули та іони. Тому для ПВ характерні водоутримуюча здатність, іонообмінні й інші особливості. ПВ здатні взаємодіють з білками, ферментами, гормонами, продуктами розпаду вуглеводів, пептидами і амінокислотами, жирними та іншими кислотами в процесі травлення в шлунково-кишковому тракті людини. Характер цих перетворень залежить від складу ПВ, вмісту в них полімерів, їх будови, взаємозв'язку і щільності міжмолекулярної упаковки, співвідношення аморфних і кристалічних ділянок волокон [6].
Результати оцінки сорбційної здатності ПВ, виділених з різних видів рослинної сировини, показують, що знайдена нова група ентеросорбентів, що володіють як іонітні, так і молекулярної сорбцією. Вони здатні зв'язувати іони свинцю, кадмію та інших важких металів, нітрати, нітрити, аміак, радіонукліди (стронцій, цезій) і цілий ряд органічних речовин, в тому числі феноли, формальдегід, карбамід та інші.
Якщо препарати поліфепан, билигнин, активоване вугілля рекомендується використовувати тільки періодично, то ПВ можливо додавати в їжу систематично. Крім сорбції екологічно шкідливих речовин (ЕВР), харчові волокна роблять і загальне позитивне дію на роботу шлунково-кишкового тракту, знижують надходження в організм холестерину, використовуються при [6]. Концентрати ПВ, виділені з різних видів рослинної сировини, володіють різною здатністю пов'язувати ЕВР. Очевидно, ПВ оболонок гороху, жому цукрового буряка, макухи насіння винограду і люцерни значно перевершують по сорбції свинцю такі відомі ентеросорбенти, як билигнин, поліфепан, карболен. У меншій мірі вони пов'язують нітрати, нітрити і значною - формальдегід, карбамід та інші речовини.
Основним сорбирующих початком у ПВ є лігнін. Ефективний комплекс целюлози з геміцелюлозами. Целюлоза має гарну сорбційною здатністю по відношенню до нітратів, карбаміду, меншою - до інших ЕВР [6].
В даний час в біології та медицині активно розвивається вчення про мікроелементози. Медики вже давно звернули увагу на те, що багато хвороб пов'язані з недостатністю надходження і вмісту в організмі певних макро-і мікроелементів. Мікроелементи - це група хімічних елементів, які містяться в організмі людини в дуже малих кількостях.
Мікроелементи є найважливішими каталізаторами різних біохімічних процесів, обміну речовин, відіграють значну роль в адаптації організму. З 92 зустрічаються в природі елементів 81 виявлений в організмі людини.
Одним із життєво необхідних елементів є кобальт. Кобальт відноситься до числа біологічно активних елементів і завжди міститься в організмі людини і тварин. Він робить істотний вплив на процеси кровотворення. Входячи до складу водорозчинного вітаміну В12 (ціанокобаламін), кобальт вельми активно впливає на надходження азотистих речовин, збільшення змісту хлорофілу і аскорбінової кислоти. Кобальт активує ряд ферментів, підсилює біосинтез білків і нуклеїнових кислот. Кобальт впливає на синтез м'язових білків, на миелинизация нервових волокон. Недостатнє надходження солей кобальту в організм призводить до неповного засвоєнню кальцію і фосфору. Він сприяє включенню іона заліза в молекулу гемоглобіну.
На відміну від деяких інших мікроелементів кобальт не може накопичуватися в організмі, і тому він постійно повинен надходити з їжею. Компенсувати нестачу кобальту можна з допомогою деяких харчових продуктів, наприклад винограду. Вміст кобальту в різних харчових продуктах незначно. Проте зазвичай змішані харчові раціони цілком задовольняють організм в кобальті. Кобальт міститься в незначних кількостях у м'ясі, рибі, яйцях, молочних продуктах, картоплі, воді. Більш багаті кобальтом печінка, нирки, а також буряк, горох, суниця, полуниця. Добова потреба організму людини 0,1 - 0,2 мг.
Медики переконливо показують, що макро-і мікроелементи, що надходять з їжею, не компенсують їх дефіцит в організмі, і для забезпечення поповнення потрібні спеціальні препарати - біологічно активні добавки.
Методична частина
2.1.Характеристика реагентів використовуються для отримання
сорбентів
Казеїн - білок молока, фосфопротеинов. У чистому вигляді являє собою білий аморфний гігроскопічний порошок без запаху і смаку, нерозчинний у воді, спирті і ефірі, але розчинний у деяких органічних солях.
З матеріалів органічної природи нами використовувався неіоногенні гідрофільний полісахарид - мікрокристалічна целюлоза виробництва Lachema (Chemapol, Praha-Сechoslovakia), (C 6 H 10 O 5) n, з молекулярною вагою (162,14) n.
Вибір мікрокристалічної целюлози (МКЦ) як носій обумовлений, перш за все, її доступністю і наявністю реакційно-здатних груп, легко вступають в хімічні реакції. МКЦ - продукт модифікації природної целюлози, одержуваний шляхом гідролітичної деструкції.
МКЦ нерозчинна у воді, але розчинна в аміачних розчинах солей міді, відрізняється високою гідрофільність і хорошими сорбційними властивостями. МКЦ - легкосипких порошок білого кольору, по своїх властивостях близька до природної целюлозі, абсолютно нешкідлива і нетоксична.
2.2. Отримання казеїну.
50 г сухого молока розтирають в 450 мл води, де вже розчинено 3 г лимонної кислоти. Розчин збивають, потім центрифугують. Так повторюють кілька разів (відмивання). Отриманий осад висушують у сушильній шафі.
2.3. Метод визначення питомої адсорбції ентеросорбенту по іону кобальту (II).
Адсорбційну ємність ентеросорбентів щодо іонів Co 2 + визначали за кількістю сорбованих іонів металу із стандартних розчинів хлориду кобальту [2].
Для кількісного визначення іонів кобальту в розчині будували градуювальний графік. Для цього в пробірки об'ємом по 10 см 3 вносили по 0,005 см 3 стандартних водних розчинів хлориду кобальту, що містять 2, 4, 6, і 8 см 3 в 1 мл розчину, 0,3 г сухого роданида амонію, 2 см 3 води і доводили об'єм суміші до 5 см 3 пропилові спиртом. Після перемішування вимірювали оптичну щільність щодо контролю у ролі, якого виступав розчин, не містить іонів кобальту, на ФЕК-М при довжині хвилі 590 нм.
Питому адсорбцію Co 2 + з розчину на поверхню ентеросорбенту визначали наступним чином: в колби на 100 см 3 поміщали по дві частини сухого ентеросорбенту і додавали десятикратний розчин хлориду кобальту відомої концентрації (0,2 М, 0,4 М; 0,6 М) . Кількість непов'язаних з ентеросорбентом іонів Co 2 + визначали спектрофотометричним методом, описаним вище.
Питому адсорбцію ентеросорбентів розраховували за формулою:
де З поч і С равн - вихідна і рівноважна концентрації іона кобальту, моль / л;
V-обсяг розчину CoCl 2, см 3;
m-маса наважки ентеросорбенту, м.
2.4. Метод визначення питомої адсорбції ентеросорбенту по іону заліза (III).
Адсорбційну ємність ентеросорбентів щодо іонів Fe визначали за кількістю сорбованих іонів металу із стандартних розчинів хлориду заліза.
Для кількісного визначення іонів заліза в розчині проводили титрування. Для цього відбирали піпеткою 5 мл розчину хлориду заліза і переносили в колбу для титрування ємністю 100 мл. Обережно нейтралізували розчин, додаючи по краплях при енергійному перемішуванні 25%-ний розчин аміаку до появи слабкої каламуті, яку розчиняли в 1-2 краплях 6 М соляної кислоти. Потім додавали до розчину 2 мл 4 М розчину соляної кислоти, розчиняли дистильованою водою до об'єму 25 мл, нагрівали, додали 2 краплі розчину сульфосаліцилової кислоти і титровали розчином ЕДТА до переходу червоно-фіолетового забарвлення сульфосаліцилату заліза в світло-жовту (або безбарвну) характерну для комплексонату заліза.
Питому адсорбцію розраховували за формулою:
де З поч і С равн - вихідна і рівноважні концетраціі іона заліза, моль / л;
V-обсяг розчину хлориду заліза, см 3;
m-маса наважки ентеросорбенту, м.
2.5. Метод визначення питомої адсорбції ентеросорбенту по іону магнію (II).
S = адсорбційну ємність ентеросорбентів щодо іонів Mg визначали за кількістю сорбованих іонів металу із стандартних розчинів сульфату магнію.
Для кількісного визначення іонів магнію в розчині проводили титрування. Для цього відбирали піпеткою 5 мл розчину сульфату магнію, переносили в колбу для титрування ємністю 100 мл, додавали 2 мл аміачного буферного розчину і рівну кількість дистильованої води. Додавали на кінчику шпателя 20-30 мг еріохромого чорного Т, перемішували до повного розчинення індикатора. Титровали отриманий розчин розчином ЕДТА до зміни забарвлення розчину з винно-червоного на синю.
Розраховували питому адсорбцію за формулою:
де З поч і С равн - вихідна і рівноважна концентрації іона магнію, моль / л;
V-об'єм розчину сульфату магнію, см 3;
m-маса наважки ентеросорбенту, м.
Експериментальна частина
3.1. Синтез ентеросорбентів
На початковому етапі метою дослідження стало отримання сорбційних матеріалів та використання їх як ентеросорбентів в медичних цілях.
Отримання ентеросорбентів передбачає правильний вибір носія для іммобілізації. При цьому важливо враховувати наявність таких позитивних властивостей твердих матриць як: розвинена питома поверхня, термостабільність, механічна стійкість, мала зміна обсягу гранул при зміні рН або іонної сили, наявність функціональних груп, придатних для селективної хімічної модифікації і стійкість до впливу мікроорганізмів.
В даний час пропонується величезний вибір біокаталізаторів, які можуть бути використані в біотехнології і медицині як ентеросорбентів, а також для селективного вилучення катіонів та аніонів з водних (або рідких) середовищ [13].
На даному етапі досліджень перед нами стояло завдання отримання базової поліфункціонального сорбенту, володіє високою сорбційною ємністю і специфічністю, який задовольняв би всім перерахованим вище вимогам, що пред'являються до сорбційним матеріалами.
Поставлена задача вирішується способом, що включає гетерогенізації поверхні мікрокристалічної целюлози (МКЦ) природним високомолекулярним з'єднанням казеїном.
Технологія отримання казеїну представлена у вигляді схеми на рисунку 1.
Малюнок 1 - Схема отримання казеїну з сухого молока
Вибір мікрокристалічної целюлози (МКЦ) як носій обумовлений, перш за все, її доступністю і наявністю реакційно-здатних груп, легко вступають в хімічні реакції, а також тим, що вона природним чином покращує самоочищення кишечника. Володіючи тонізуючу дію на тканини кишечника, посилює перистальтику і допомагає позбавитися від контаменантов і слизу, тим самим, покращуючи засвоєння поживних речовин і води.
Високорозвинена поверхню МКЦ, активні кінцеві групи, які утворюються при гидролитическом розщепленні глюкозидним зв'язків високополімерний целюлози, наявність силанольних груп ≡ Si-OH на поверхні аеросилу, є визначальним чинником у процесі модифікації поверхні носія білковими лігандами.
Використання казеїну для активації поверхні носія обумовлено рядом позитивних властивостей білкового комплексу: присутність фосфору у вигляді фосфосерінових груп, які визначають аніонний характер казеїну в нейтральному середовищі, високий вміст деяких амінокислот (глутамінова кислота, лейцин, пролін) і неполярних залишків відповідає за нерозчинність казеїну у воді на рівні ізоелектричної точки (рН 4,6) [1]. Крім того, первинна структура пептидного ланцюга відрізняється присутністю двох контрастних зон: кінцева послідовність-NH 2 має в цілому основний і гідрофобний характер; кінцева послідовність-СООН є кислої і гідрофільної; і обумовлює ряд важливих фізико-хімічних властивостей казеїном [7], одне з яких полягає у високій адсорбційної здатності.
Згідно з фізико-хімічними властивостями, казеїн є кислотним білком, тому добре розчиняється в розчинах лугів з утворенням казеїнатів. При концентрації гідроксиду натрію нижче 5% неможливо досягти повного розчинення казеїну, вище 15% - може настати необоротна денатурація білка.
Концентрація казеїну для модифікації поверхні аеросилу вибирається з урахуванням стеричного фактора. Менше 1 мас.% Казеїну використовувати недоцільно, тому що залишаються не задіяні в процесі модифікації всі функціональні групи аеросилу. Використання понад 15 мас.% Казеїну неприпустимо у зв'язку з конкуренцією молекул казеїну за право володінням центрами зв'язування, які знаходяться на поверхні кремнезему.
Проведено синтез ентеросорбентів на основі мікрокристалічної целюлози та казеїну.
Технологія отримання ентеросорбенту включає в себе 6 стадій і представлена на малюнку 2.
Жорсткої матриці для іммобілізації казеїну служила МКЦ - неіоногенні гідрофільний полісахарид. Модифікацію поверхні МКЦ казеїном проводили згідно з методикою викладеної в роботі [14].
Стадія 1 характеризує процес отримання казеїну з сухого молока.
Стадія 2 включає розчинення наважки казеїну в розчиннику. На цій стадії в розчин казеїну вводиться неорганічний газоутворювач гідрокарбонат амонію в кількості не більше 1-3% за масою. Введення гідрокарбонату амонію дозволить виключити забруднення сорбенту контаменантамі.
Рисунок 2 - Схема отримання сорбенту на основі мікрокристалічної целюлози
Стадія 3 включає суспензірованіе навішування МКЦ і розчину казеїну з неорганічним газоутворювачем.
Стадії 4,5 відображають сушку сорбенту під вакуумом при t = 50 0 С до випаровування розчинника.
Стадія 6 включає стабілізацію сорбенту підкисленим розчином ацетону.
3.2. Дослідження сорбційної ємності розроблених сорбентів щодо іонів кобальту (II)
Для синтезованих сорбентів були проведені аналізи сорбційної ємності щодо іонів кобальту.
Кобальт в якості мікроелемента вельми активно впливає на надходження в організм азотистих речовин, збільшення змісту хлорофілу і аскорбінової кислоти, активує ряд ферментів, підсилює біосинтез білків і нуклеїнових кислот. Він є сполучною ланкою між сорбентом і сорбованих препаратом. Саме тому, нами були проведені дослідження щодо отримання кобальтвмісних ентеросорбентів. На малюнку 3 представлені дані за питомою адсорбції вище представлених сорбентів щодо іонів кобальту.
\ S
Малюнок 3 - Питома адсорбція щодо іонів Со 2 + компонентів, що складають структуру сорбенту і самого сорбенту на основі мікрокристалічної целюлози (МКЦ) і казеїну
Для даних кривих було отримано критеріальне рівняння і розрахована ймовірність ступеня апроксимації.
Y =-75397x 5 + 64191x 4 - 20021x 3 + 2761,9 x 2 - 157,67 x + 3,2388
R 2 = 0,8572
Аналізуючи криві адсорбції щодо іонів З 2 + (рис.3) на поверхню сорбенту з розчину можна зробити висновок, що відсоток зв'язування іонів кобальту з сорбентом на основі МКЦ та казеїну вище, ніж окремих компонентів сорбенту. Дана обставина можна пояснити не тільки процесами, пов'язаними з наявністю активних груп, що входять до складу казеїнового комплексу, а й самою структурою сорбційної матриці. Крім того, іони кобальту мають незначний вплив на міцел казеїну, тим самим, не порушуючи мають місце міжмолекулярних взаємодій. При цьому адсорбційні процеси протікають за класичною схемою локалізованої адсорбції (крива адсорбції казеїну щодо іонів Со 2 + рис. 3).
Зіставляючи отримані результати адсорбційних процесів, що протікають на поверхні компонентів, що входять до складу сорбенту МКЦ + казеїн, і самого сорбенту можна зробити висновки, що казеїн, гетерогенізованих на поверхні носія, значно збільшує відсоток адсорбції. Цей результат наочно демонструє рис.3.
3.3 Дослідження сорбційної ємності сорбентів
щодо іонів заліза (II).
Для дослідження брали 2г сорбенту МКЦ +5 мас.% Казеїн, заливали 5мл хлориду заліза (III) відомої концентрації (0,1 М, 0,5 М; 1М). Після закінчення 24г розчин відфільтрували.
Нами була розрахована питома адсорбція, дані якої представлені на малюнку.
\ S
Малюнок 4 - Питома адсорбція сорбентів на основі МКЦ з різним вмістом казеїну щодо іонів Fe (III)
Для даних кривих було отримано критеріальне рівняння і розрахована ймовірність ступеня апроксимації.
Y =-34701x 4 + 7206,5 x 3 - 494,08 x 2 + 13,629 x - 0,1088
R 2 = 1
Аналізуючи криві адсорбції щодо іонів Fe (рис.4) на поверхню сорбенту з розчину можна зробити висновок, що відсоток зв'язування іонів заліза з сорбентом на основі МКЦ та казеїну вище, ніж окремих компонентів сорбенту. Ця обставина пояснюється структурою сорбційної матриці. Крім того, іони заліза мають незначний вплив на міцел казеїну, не порушуючи міжмолекулярних взаємодій.
Нами була розрахована сорбційна ємність розроблених сорбентів щодо різних концентрацій іонів заліза. Дані сорбційної ємності представлені в таблиці 1.
Таблиця 1 - Сорбційна ємність ентеросорбентів, щодо різних концентрацій іонів заліза
3.4 Дослідження сорбційної ємності сорбентів
щодо іонів магнію (II).
Для дослідження брали 2г сорбенту з 5%-вим змістом казеїну залили 5мл сульфату магнію відомої концентрації (0,1 М, 0,5 М; 1М). Після закінчення 24г досліджуваний розчин відфільтрували і проводили титрування. Нами була розрахована питома адсорбція. На малюнку 5 представлені дані за питомою адсорбції представлених сорбентів щодо іонів магнію (II).
\ S
ВИСНОВОК
У відповідності з метою та поставленими завданнями проведених досліджень по одному з основних напрямів біотехнології - розробці нових сорбційних матеріалів із заданими властивостями-вдалося розробити матриці, які мають низку переваг: розвинутій питомою поверхнею, термостабильностью, механічної стійкістю, малим зміною обсягу гранул при зміні рН або іонної сили, наявністю функціональних груп, придатних для селективної іммобілізації.
Розроблено технологію отримання ентеросорбентів на основі мікрокристалічної целюлози (МКЦ) шляхом гетерогенізації поверхні природних високомолекулярних сполук білкової природи - казеїном.
Досліджено сорбційна ємність розроблених сорбентів щодо іонів кобальту. Отримані дані показали, що сорбційна ємність більше у самого сорбенту, на відміну від компонентів сорбенту. Дана обставина можна пояснити не тільки процесами, пов'язаними з наявністю активних груп, що входять до складу казеїнового комплексу, а й самою структурою сорбційної матриці.
Список використаної літератури
1. Алексєєва Н.Ю., Арістова В.П., Патратій А.П. Склад і властивості молока як сировини для молочної промисловості: Довідник. - М.: Агропромиздат, 1986. - С.238.
2. Білявська Т.А., Большова Т.А., Брикіна Г.Д. Хроматографія неорганічних речовин. М.: Вища школа, 1986 р. - 296 с.
3. Горбатова К.К. Біохімія молока. - М.: Харчова пром-ть, 1980. - 354 с.
4. Глегг Р.Е., Танг Л.Дж., Бруер Р.Дж.Д. Фракціонування .- Целюлоза та її похідні. Під ред. Н. Байклза, Л. Сегала. - М.: Світ, 1974. - Т.1. - С.382-412.
5. Давидова О.Г., Рачинський В.В. Сорбція білків на іонообмінних целюлоза / / Прикладна біохімія та мікробіологія. -1977 .- Т.3. - № 3. -С.341-345.
6. Дудкін М.С., Щелкунов Л.Ф. Харчові волокна і нові продукти харчування (огляд) / / Зап. харчування. - 1998. - № 2. - C. 35 - 41.
7. Ізмайлова В.М., Ребіндер П А. Структуроутворення в білкових системах. - М.: Наука, 1974. - С.68.
8. Іммергут Е.Х. Целюлоза. - M.: Лісова промисловість, 1967. -С.114-117.
9. Каравайко Г.І., Галицька Н.Б., Авакян З.А. Спосіб отримання твердих біосорбентів для вилучення металів / / RV 2045574.C12N11/08. - 1995.
10. Колотуша Т.Т., Полонська І.М., Белякова Л.А. та ін Спосіб отримання носіїв для іммобілізації органічних сполук / / AC № 1153975.B 01I 20/10. - 1985.
11. Кочетков Н.К., Бочков А.Ф., Дмитрієв Б.А. та ін Хімія вуглеводів. - М.: Хімія. - 1967. - 350С.
12. Кулічінскій Ю.Л., Малашенко Т.А., Фірсова В.І. Спосіб отримання білкового сорбенту / / SU 1680715, С08 Н1/00, В01J20/30, С08 I5/20/-1991.
13. Куніжев С.М., Денісова Є.В. Інформаційний листок «Біофільтри нового покоління». - Ставрополь: Вид-во СГУ, 2001. 2 с.
14. Куніжев С.М., Сєров О.В., Денисова Є.В., Аполохова С.Ф., Воробйова О.В., Анісенко О.В. / / Заявка 2002105544 (РФ) Спосіб отримання сорбентів. Позитивне рішення від 7 березня 2002 року. 7 с.
15. Лішевського М.О., Вірник А.Д., Роговін З.А. Введення нових функціональних груп у макромолекулу модифікованої целюлози, що містить ароматичні аміногрупи. - Москва, 1963. - 165с.
16. Макушин Є.М., Тур Л.Т. Спосіб отримання сорбенту / / АС 615089 З 08 В 15/00. - 1978.
17. Матюшин Ю.М., Корчатова Л.І., Сопін В.Ф. Дослідження впливу умов висушування целюлози на теплоту її згоряння. I Всесоюзна конференція з синтезу целюлози та його регуляції.: Тез. - Казан, 1980. - З 36.
18. Раскін М.Н., Єгоров А.Є., Васильєва Г.Г., Кательнікова Н.Є., Петропавлівський Г.А. Спосіб отримання МКЦ / / АС № (11) 751808 30.07.80. Бюл. № 28.
19. Роговін З.А., Шоригіна М.М. Хімія целюлози і її супутників. - М.: Госхіміздат, 1953 .- .678 с.
20. Степанова З.М., Грищенко С.І., Стручак С.В., та ін Спосіб отримання сорбенту для афінної хроматографії / / SV 1578137.C08B15/00, B01I20/24.20/30. - 1990.
21. Тарчевській І.А., Марченко Г.М. Біосинтез і структура целюлози. - М.: Наука, 1985. - 279 с.
22. Тетін А. Хімія і фізика молока. - М.: Харчова промисловість, 1979. - 624 с.
23. Черкасов О.М., Пасічник В.А. Мембрани і сорбенти в біотехнології. - Л.: Хімія, 1991. - 240с.
24. Marx-Figini M., Schulz GV Die Viskosimetrische Molekulargewichts bestimung von Cellulosen und Cellulosennitraten unter Standartbedigungen. - Makromol. Chem., 1962. - Bd.54. - S.102-118.
Технологія отримання казеїну представлена у вигляді схеми на рисунку 1.
Сухе молоко |
Вода |
Лимонна кислота |
Гомогенізація |
Центрифугування |
Білковий комплекс |
Полісахаридний комплекс |
Малюнок 1 - Схема отримання казеїну з сухого молока
Вибір мікрокристалічної целюлози (МКЦ) як носій обумовлений, перш за все, її доступністю і наявністю реакційно-здатних груп, легко вступають в хімічні реакції, а також тим, що вона природним чином покращує самоочищення кишечника. Володіючи тонізуючу дію на тканини кишечника, посилює перистальтику і допомагає позбавитися від контаменантов і слизу, тим самим, покращуючи засвоєння поживних речовин і води.
Високорозвинена поверхню МКЦ, активні кінцеві групи, які утворюються при гидролитическом розщепленні глюкозидним зв'язків високополімерний целюлози, наявність силанольних груп ≡ Si-OH на поверхні аеросилу, є визначальним чинником у процесі модифікації поверхні носія білковими лігандами.
Використання казеїну для активації поверхні носія обумовлено рядом позитивних властивостей білкового комплексу: присутність фосфору у вигляді фосфосерінових груп, які визначають аніонний характер казеїну в нейтральному середовищі, високий вміст деяких амінокислот (глутамінова кислота, лейцин, пролін) і неполярних залишків відповідає за нерозчинність казеїну у воді на рівні ізоелектричної точки (рН 4,6) [1]. Крім того, первинна структура пептидного ланцюга відрізняється присутністю двох контрастних зон: кінцева послідовність-NH 2 має в цілому основний і гідрофобний характер; кінцева послідовність-СООН є кислої і гідрофільної; і обумовлює ряд важливих фізико-хімічних властивостей казеїном [7], одне з яких полягає у високій адсорбційної здатності.
Згідно з фізико-хімічними властивостями, казеїн є кислотним білком, тому добре розчиняється в розчинах лугів з утворенням казеїнатів. При концентрації гідроксиду натрію нижче 5% неможливо досягти повного розчинення казеїну, вище 15% - може настати необоротна денатурація білка.
Концентрація казеїну для модифікації поверхні аеросилу вибирається з урахуванням стеричного фактора. Менше 1 мас.% Казеїну використовувати недоцільно, тому що залишаються не задіяні в процесі модифікації всі функціональні групи аеросилу. Використання понад 15 мас.% Казеїну неприпустимо у зв'язку з конкуренцією молекул казеїну за право володінням центрами зв'язування, які знаходяться на поверхні кремнезему.
Технологія отримання ентеросорбенту включає в себе 6 стадій і представлена на малюнку 2.
Жорсткої матриці для іммобілізації казеїну служила МКЦ - неіоногенні гідрофільний полісахарид. Модифікацію поверхні МКЦ казеїном проводили згідно з методикою викладеної в роботі [14].
Стадія 1 характеризує процес отримання казеїну з сухого молока.
Стадія 2 включає розчинення наважки казеїну в розчиннику. На цій стадії в розчин казеїну вводиться неорганічний газоутворювач гідрокарбонат амонію в кількості не більше 1-3% за масою. Введення гідрокарбонату амонію дозволить виключити забруднення сорбенту контаменантамі.
Фракціонування білків молока |
Приготування розчину казеїну і введення газообразователя NH 4 HCO 3 |
Іммобілізація казеїну на МКЦ Зміст казеїну 5 мас.%, 10 мас.%. |
Випаровування розчинника t ≤ 30-35 0 C (вакуум) |
Висушування твердофазного сорбенту, t ≤ 50ч60 0 C (вакуум) |
Стабілізація сорбенту підкисленим розчином ацетону (pH ~ 4,6) |
Рисунок 2 - Схема отримання сорбенту на основі мікрокристалічної целюлози
Стадія 3 включає суспензірованіе навішування МКЦ і розчину казеїну з неорганічним газоутворювачем.
Стадії 4,5 відображають сушку сорбенту під вакуумом при t = 50 0 С до випаровування розчинника.
Стадія 6 включає стабілізацію сорбенту підкисленим розчином ацетону.
3.2. Дослідження сорбційної ємності розроблених сорбентів щодо іонів кобальту (II)
Для синтезованих сорбентів були проведені аналізи сорбційної ємності щодо іонів кобальту.
Кобальт в якості мікроелемента вельми активно впливає на надходження в організм азотистих речовин, збільшення змісту хлорофілу і аскорбінової кислоти, активує ряд ферментів, підсилює біосинтез білків і нуклеїнових кислот. Він є сполучною ланкою між сорбентом і сорбованих препаратом. Саме тому, нами були проведені дослідження щодо отримання кобальтвмісних ентеросорбентів. На малюнку 3 представлені дані за питомою адсорбції вище представлених сорбентів щодо іонів кобальту.
Малюнок 3 - Питома адсорбція щодо іонів Со 2 + компонентів, що складають структуру сорбенту і самого сорбенту на основі мікрокристалічної целюлози (МКЦ) і казеїну
Для даних кривих було отримано критеріальне рівняння і розрахована ймовірність ступеня апроксимації.
Y =-75397x 5 + 64191x 4 - 20021x 3 + 2761,9 x 2 - 157,67 x + 3,2388
R 2 = 0,8572
Аналізуючи криві адсорбції щодо іонів З 2 + (рис.3) на поверхню сорбенту з розчину можна зробити висновок, що відсоток зв'язування іонів кобальту з сорбентом на основі МКЦ та казеїну вище, ніж окремих компонентів сорбенту. Дана обставина можна пояснити не тільки процесами, пов'язаними з наявністю активних груп, що входять до складу казеїнового комплексу, а й самою структурою сорбційної матриці. Крім того, іони кобальту мають незначний вплив на міцел казеїну, тим самим, не порушуючи мають місце міжмолекулярних взаємодій. При цьому адсорбційні процеси протікають за класичною схемою локалізованої адсорбції (крива адсорбції казеїну щодо іонів Со 2 + рис. 3).
Зіставляючи отримані результати адсорбційних процесів, що протікають на поверхні компонентів, що входять до складу сорбенту МКЦ + казеїн, і самого сорбенту можна зробити висновки, що казеїн, гетерогенізованих на поверхні носія, значно збільшує відсоток адсорбції. Цей результат наочно демонструє рис.3.
3.3 Дослідження сорбційної ємності сорбентів
щодо іонів заліза (II).
Для дослідження брали 2г сорбенту МКЦ +5 мас.% Казеїн, заливали 5мл хлориду заліза (III) відомої концентрації (0,1 М, 0,5 М; 1М). Після закінчення 24г розчин відфільтрували.
Нами була розрахована питома адсорбція, дані якої представлені на малюнку.
Малюнок 4 - Питома адсорбція сорбентів на основі МКЦ з різним вмістом казеїну щодо іонів Fe (III)
Для даних кривих було отримано критеріальне рівняння і розрахована ймовірність ступеня апроксимації.
Y =-34701x 4 + 7206,5 x 3 - 494,08 x 2 + 13,629 x - 0,1088
R 2 = 1
Аналізуючи криві адсорбції щодо іонів Fe (рис.4) на поверхню сорбенту з розчину можна зробити висновок, що відсоток зв'язування іонів заліза з сорбентом на основі МКЦ та казеїну вище, ніж окремих компонентів сорбенту. Ця обставина пояснюється структурою сорбційної матриці. Крім того, іони заліза мають незначний вплив на міцел казеїну, не порушуючи міжмолекулярних взаємодій.
Нами була розрахована сорбційна ємність розроблених сорбентів щодо різних концентрацій іонів заліза. Дані сорбційної ємності представлені в таблиці 1.
Таблиця 1 - Сорбційна ємність ентеросорбентів, щодо різних концентрацій іонів заліза
щодо іонів магнію (II).
Для дослідження брали 2г сорбенту з 5%-вим змістом казеїну залили 5мл сульфату магнію відомої концентрації (0,1 М, 0,5 М; 1М). Після закінчення 24г досліджуваний розчин відфільтрували і проводили титрування. Нами була розрахована питома адсорбція. На малюнку 5 представлені дані за питомою адсорбції представлених сорбентів щодо іонів магнію (II).
ВИСНОВОК
У відповідності з метою та поставленими завданнями проведених досліджень по одному з основних напрямів біотехнології - розробці нових сорбційних матеріалів із заданими властивостями-вдалося розробити матриці, які мають низку переваг: розвинутій питомою поверхнею, термостабильностью, механічної стійкістю, малим зміною обсягу гранул при зміні рН або іонної сили, наявністю функціональних груп, придатних для селективної іммобілізації.
Розроблено технологію отримання ентеросорбентів на основі мікрокристалічної целюлози (МКЦ) шляхом гетерогенізації поверхні природних високомолекулярних сполук білкової природи - казеїном.
Досліджено сорбційна ємність розроблених сорбентів щодо іонів кобальту. Отримані дані показали, що сорбційна ємність більше у самого сорбенту, на відміну від компонентів сорбенту. Дана обставина можна пояснити не тільки процесами, пов'язаними з наявністю активних груп, що входять до складу казеїнового комплексу, а й самою структурою сорбційної матриці.
Список використаної літератури
1. Алексєєва Н.Ю., Арістова В.П., Патратій А.П. Склад і властивості молока як сировини для молочної промисловості: Довідник. - М.: Агропромиздат, 1986. - С.238.
2. Білявська Т.А., Большова Т.А., Брикіна Г.Д. Хроматографія неорганічних речовин. М.: Вища школа, 1986 р. - 296 с.
3. Горбатова К.К. Біохімія молока. - М.: Харчова пром-ть, 1980. - 354 с.
4. Глегг Р.Е., Танг Л.Дж., Бруер Р.Дж.Д. Фракціонування .- Целюлоза та її похідні. Під ред. Н. Байклза, Л. Сегала. - М.: Світ, 1974. - Т.1. - С.382-412.
5. Давидова О.Г., Рачинський В.В. Сорбція білків на іонообмінних целюлоза / / Прикладна біохімія та мікробіологія. -1977 .- Т.3. - № 3. -С.341-345.
6. Дудкін М.С., Щелкунов Л.Ф. Харчові волокна і нові продукти харчування (огляд) / / Зап. харчування. - 1998. - № 2. - C. 35 - 41.
7. Ізмайлова В.М., Ребіндер П А. Структуроутворення в білкових системах. - М.: Наука, 1974. - С.68.
8. Іммергут Е.Х. Целюлоза. - M.: Лісова промисловість, 1967. -С.114-117.
9. Каравайко Г.І., Галицька Н.Б., Авакян З.А. Спосіб отримання твердих біосорбентів для вилучення металів / / RV 2045574.C12N11/08. - 1995.
10. Колотуша Т.Т., Полонська І.М., Белякова Л.А. та ін Спосіб отримання носіїв для іммобілізації органічних сполук / / AC № 1153975.B 01I 20/10. - 1985.
11. Кочетков Н.К., Бочков А.Ф., Дмитрієв Б.А. та ін Хімія вуглеводів. - М.: Хімія. - 1967. - 350С.
12. Кулічінскій Ю.Л., Малашенко Т.А., Фірсова В.І. Спосіб отримання білкового сорбенту / / SU 1680715, С08 Н1/00, В01J20/30, С08 I5/20/-1991.
13. Куніжев С.М., Денісова Є.В. Інформаційний листок «Біофільтри нового покоління». - Ставрополь: Вид-во СГУ, 2001. 2 с.
14. Куніжев С.М., Сєров О.В., Денисова Є.В., Аполохова С.Ф., Воробйова О.В., Анісенко О.В. / / Заявка 2002105544 (РФ) Спосіб отримання сорбентів. Позитивне рішення від 7 березня 2002 року. 7 с.
15. Лішевського М.О., Вірник А.Д., Роговін З.А. Введення нових функціональних груп у макромолекулу модифікованої целюлози, що містить ароматичні аміногрупи. - Москва, 1963. - 165с.
16. Макушин Є.М., Тур Л.Т. Спосіб отримання сорбенту / / АС 615089 З 08 В 15/00. - 1978.
17. Матюшин Ю.М., Корчатова Л.І., Сопін В.Ф. Дослідження впливу умов висушування целюлози на теплоту її згоряння. I Всесоюзна конференція з синтезу целюлози та його регуляції.: Тез. - Казан, 1980. - З 36.
18. Раскін М.Н., Єгоров А.Є., Васильєва Г.Г., Кательнікова Н.Є., Петропавлівський Г.А. Спосіб отримання МКЦ / / АС № (11) 751808 30.07.80. Бюл. № 28.
19. Роговін З.А., Шоригіна М.М. Хімія целюлози і її супутників. - М.: Госхіміздат, 1953 .- .678 с.
20. Степанова З.М., Грищенко С.І., Стручак С.В., та ін Спосіб отримання сорбенту для афінної хроматографії / / SV 1578137.C08B15/00, B01I20/24.20/30. - 1990.
21. Тарчевській І.А., Марченко Г.М. Біосинтез і структура целюлози. - М.: Наука, 1985. - 279 с.
22. Тетін А. Хімія і фізика молока. - М.: Харчова промисловість, 1979. - 624 с.
23. Черкасов О.М., Пасічник В.А. Мембрани і сорбенти в біотехнології. - Л.: Хімія, 1991. - 240с.
24. Marx-Figini M., Schulz GV Die Viskosimetrische Molekulargewichts bestimung von Cellulosen und Cellulosennitraten unter Standartbedigungen. - Makromol. Chem., 1962. - Bd.54. - S.102-118.