На правах рукопису
НАЧАРОВ Петро Васильович
Прогностичне значення білків теплового шоку ПРИ ВІЛ-ІНФЕКЦІЇ
14.00.10-інфекційні хвороби
АВТОРЕФЕPAT дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
1997
Робота виконана у Військово-медичної академії.
Науковий керівник:
доктор медичних наук Є. І. Змушко.
Науковий консультант:
доктор медичних наук професор Ю. В. Лобзин.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук професор В. В. Іванова, доктор медичних наук професор А. Г. Рахманова.
Провідна установа-Російський науково-методичний центр та профілактиці і боротьбі зі СНІДом.
Захист дисертації відбудеться "" ............... 1997
в .... годині на засіданні спеціалізованої ради Д 106.03.05
при Військово-медичної академії (194044, м. Санкт-Петербург, вул. Лебедєва, 6).
З дисертацією можна ознайомитися у фундаментальній бібліотеці академії.
Автореферат розісланий
1997
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук професор Ю. І. Ляшенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність проблеми. У Росії питання стратегії і тактики боротьби з ВІЛ-інфекцією визначені роботами В. І. Покровського (1988: 1989; 1993). В. І. Покровський (1987) передбачив прийдешній розмах поширення ВІЛ-інфекції в країні і впровадив у практичну охорону здоров'я структуру, призначену для боротьби зі СНІДом. В даний час ВІЛ-інфекція охопила всі країни світу. На середину 1996 року загальна кількість інфікованих вірусом імунодефіциту у всьому світі досягло 27900 тисяч чоловік (Рахманова А.Г., 1996). Незважаючи на те, що виконаний безпрецедентно великий обсяг наукових досліджень з. проблемі ВІЛ-інфекції, запропоновані методи лікарської терапії, що дозволяють домагатися тимчасового поліпшення стану хворих на СНІД. до теперішнього часу не відомий жоден достовірний випадок одужання, тому СНІД вважають хворобою з летальністю 100%. Проблема ВІЛ-інфекції ускладнюється ще й тим фактом, що з початку дев'яностих років ВІЛ все більш і більш завойовує основну популяцію населення, в той час як протягом перших десяти років поширення йшло переважно серед певних груп населення, так званих "груп ризику" - наркомани , гомосексуалісти. повії, хворі на гемофілію (Лобзин Ю.В., Казанцев А.П.. 1996). Актуальність проблеми визначає некероване інтенсивне зростання випадків інфікованості, хворобливості та смертності в усіх країнах світу (Шувалова Е.П., 1995). Виявлення ВІЛ-інфікованих осіб не призводить до припинення передачі ВІЛ від них, незважаючи на повідомлення їх про кримінальну відповідальність за зараження (Покровський В.В. з співавт., 1996). Не вирішеними залишаються основні проблеми СНІДу (Бєлозьоров Є.С. з співавт., 1995): - відсутність методів ранньої діагностики: - повна некерованість патологічних процесів у хворого: - відсутність надійних клінічних та лабораторних показників переходу інфекційного процесу з латентної стадії в маніфестних. При СНІД та ВІЛ-інфекції досить добре вивчені основні лабораторні діагностичні показники, що свідчать про інфікування (Змушко Є.І. з співавт., 1996). Однак питання прогнозування клінічного перебігу ВІЛ-інфекції вимагають подальшого вивчення. Найбільше клінічне значення має прогноз переходу від безсимптомної фази до персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ), а також від ПГЛ до стадії вторинних захворювань, який важливий для своєчасного призначення етіотропних і патогенетичних засобів (Рахманова А.Г.. Чайка Н.А., 1989) . При пошуку нових тестів, які давали б уявлення про стан імунокомпетентних клітин крові при ВІЛ-інфекції, звернула на себе увагу група порівняно недавно відкритих внутрішньоклітинних білків, які отримали назву "білки теплового шоку" (БТШ) або "стресові білки". Ці білки недостатньо вивчені, але вже наявні дані говорять, що вони високо консервативні в процесі філогенезу (Lindqulst S., 1986), незвично поліфункціональні - відіграють важливу роль у багатьох внутрішньоклітинних імунобіохімічних процесах як в екстремальних, так і в нормальних умовах (Polla BS, 1988), що дозволяє припустити про участь білків теплового шоку у формуванні патобіохімічних внутрішньоклітинних зв'язків при ВІЛ-інфекції. У відповідь на вплив несприятливих факторів, в тому числі і вірусної інфекції, формується неспецифічна клітинна реакція, яка супроводжується посиленням процесів вільнорадикального окислення (Іванова В.В. з співавт., 1992: 1996), синтезом білків теплового шоку (Kaufman SHE. 1990) і є одним з механізмів дестабілізації геному клітин-мішеней. У цих умовах важливою є роль ферменту ксантиноксидази, яка служить генератором вільних радикалів при ряді патологічних станів клітини і є найбільш значущою серед прооксидантних систем, характерних для лімфоїдної клітини (Кожем'якін Л.А. із співавт .. 1992). Відсутність у літературі даних по комплексній оцінці процесів дестабілізації геному, пов'язаних з активністю вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази в імунокомпетентних клітинах крові в динаміці розвитку ВІЛ-інфекції не дозволяє визначити значимість названих показників для прогнозу клінічного перебігу хвороби. Мета дослідження: дати оцінку можливості використання показників білків теплового шоку сімейства БТШ-70 та комплексу біохімічних змін в мононуклеарах периферичної крові в прогнозуванні клінічного перебігу ВІЛ-інфекції. Для досягнення зазначеної мети необхідно було вирішити следуюіе завдання: 1. Вивчити динаміку традиційних показників імунного стату-а у ВІЛ-інфікованих і визначити їх прогностичну значущість при переході клінічного перебігу хвороби з однієї стадії в іншу. 2. Вивчити зміни активності ксантиноксидази, інтенсивності процесів вільнорадикального окислення і показників нестабільності геному мононуклеарів периферичної крові при ВІЛ-інфекції та оцінити їх прогностичну значимість. 3. Розробити методичні підходи до створення імунологічного методу для кількісного та якісного аналізу білків сімейства БТШ-70. 4. Вивчити показники білків сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові на різних фазах ВІЛ-інфекції. 5. Визначити взаємозв'язок змін білків сімейства БТШ-70 та комплексу біохімічних показників дестабілізації геному. вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази мононуклеарів периферичної крові у хворих у динаміці захворювання та оцінити їх значимість для прогнозу клініко-маніфестних форм ВІЛ-інфекції. Наукова новизна: 1. Вперше встановлено, що наростання накопичення конститутивний ізоформи білків сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові ВІЛ-інфікованих пропорційно ступеня вираженості клінічних проявів хвороби. 2. Показано зв'язок зміни показників білків сімейства БТШ-70 з рівнем нестабільності геному, активністю процесів вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази в мононуклеарах периферичної крові у хворих на ВІЛ-інфекцію в процесі розвитку клінічної картини захворювання. 3. Встановлено, що зміна стану білків сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові адекватно відображає вірогідність переходу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази у фазу персистуючої генералізованої лімфаденопатії і від персистуючої генералізованої лімфаденопатії до стадії вторинних захворювань. 4. Встановлено, що ВІЛ-інфекція викликає порушення реакції білків теплового шоку (БТШ-70) мононуклеарів периферичної крові у відповідь на ушкоджують впливу (гіпертермія. ультрафіолетове опромінення). Практична значимість роботи. Комплекс показників, що відображають стан системи білків теплового шоку, системи ксантиноксидази, процесів вільнорадикального і нестабільності геному мононуклеарів периферичної крові, в сукупності з традиційними імунологічними показниками може бути використаний для прогнозування переходу клінічного перебігу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази у фазу ПГЛ і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. Вивчення показників білків теплового шоку мононуклеарів периферичної крові людини як захисного механізму неспецифічної дії може може бути застосовано для оцінки ефективності лікарських засобів з імуномодулюючими властивостями, а також для розробки нових діагностичних підходів до прогнозування імунодефіцитних станів різної етіології. Основні положення, що виносяться на захист: 1. Перехід клінічного перебігу захворювання від безсимптомної фази до персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань характеризується збільшенням вмісту конститутивний ізоформи сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові. 2. Зміни вмісту білків сімейства БТШ-70 в процесі ВІЛ-інфекції відбуваються на тлі збільшення показників нестабільності геному, інтенсифікації процесів вільнорадикального окислення та підвищення активності ксантиноксидази в мононуклеарах периферичної крові. 3. Показники білків сімейства БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові в сукупності з традиційними імунологічними показниками можливо використовувати для прогнозування переходу клінічного перебігу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази у фазу персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. Апробація роботи. Результати досліджень були докладені на XI-й і XII-й наукових конференціях молодих вчених академії (ВМедА, Ленінград, 1990; ВМедА, Санкт-Петербург, 1992), на VI-му Всесоюзному біохімічному з'їзді (Санкт-Петербург, 1992), на Першій міжнародній регіональній конференції з ВІЛ-інфекції "Соціальні та медичні проблеми СНІДу" (Санкт-Петербург, 1994). на засіданні Санкт-Петербурзького відділення Російського наукового товариства інфекціоністів (Санкт-Петербург, 1996), на IV міжнародній конференції "СНІД, рак і споріднені проблеми" (Санкт-Петербург. 1996), на III Всеросійському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Санкт-Петербург. 1996). Матеріали дисертації використані у звітах по темі НДР N 50-93-В12 "Біохімічні механізми формування імунодефіцитів під впливом ВІЛ і імунодіагностика імунодефіцитних станів хворих на СНІД" і по темі НДР N 60-95-П4 "Дослідження ролі системи білків теплового шоку в патогенезі ВІЛ- інфекції ". Реалізація результатів роботи. За темою дисертації опубліковано 7 наукових робіт. Результати роботи використовуються в практиці навчального процесу та науково-дослідній роботі кафедри інфекційних хвороб, кафедри клінічної біохімії і лабораторної діагностики, у роботі НДЛ СНІДу та інфекційних захворювань у ЗС РФ Військово-медичної академії, кафедри інфекційних хвороб Семипалатинського державного медичного інституту, кафедри ЛОР-хвороб з курсом алергології та імунології Чімкентского державного медичного інституту, кафедри інфекційних хвороб Волгоградського державного медичного університету. Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 171 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, п'яти розділів власних досліджень. обговорення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку літератури, що включає 61 вітчизняний і 140 зарубіжних джерел. Дисертація ілюстрована 24 малюнками і 17 таблицями. ЗМІСТ РОБОТИ 1. Загальна характеристика хворих та методів дослідження У процесі роботи були обстежено 34 інфікованих та хворих на ВІЛ-інфекцією, серед яких переважали особи чоловічої статі у віковій категорії від 20 до 39 років. Клінічне спостереження та обстеження хворих проводили в лікарні N 30 імені С.П. Боткіна м. Санкт-Петербурга, Республіканської клінічної інфекційної лікарні м. Усть-Іжори Ленінградської області, в Центрі по боротьбі та профілактиці СНІДу м.Санкт-Петербурга. Хворі були розподілені по групах відповідно до клінічної класифікації В. І. Покровського (1989). ВІЛ-інфікованих в стадії інкубації і хворих у термінальній стадії не обстежили. Контрольну групу склали 25 практично здорових чоловіків (донорів крові) у віці від 20 до 39 років - військовослужбовці. Імунологічні та біохімічні дослідження проводили у Військово-медичної академії, визначення білків теплового шоку - на базі інституту цитології Академії наук. Діагноз ВІЛ-інфекції верифікували серологічно - за наявності в крові специфічних антитіл до ВІЛ за допомогою тест-систем для гетерогенного імуноферментного аналізу методом подвійних антитіл (виробництва фірм СП "діаплюс". Росія-Швейцарія, СП "Авіценна", Росія-Сирія). Результати імуноферментного аналізу підтверджували за допомогою імуноблотингу ("Du Pont", США). Для оцінки імунного статусу у обстежених пацієнтів вивчали такі показники: кількість лейкоцитів, лімфоцитів; субпопуляції Т-лімфоцитів за допомогою проточного цитофлюориметр "EPICS-C" (Coulter elektronics. США-Франція) з застосуванням моноклональних антитіл фірми "Ortho Diagnostic Systems" (США) : РГМЛ з Конан визначали за методом M. George. JHVaughan (1962); кількість В-лімфоцитів, які несуть Ig M, G, А, визначали методом імунофлюоресценції з використанням моноспецифічний сироваток до імуноглобулінів людини; концентрації Ig M. G, А, визначали методом радіальної иммунодиффузии в гелі (Mancini С. et al .. 1963); вміст циркулюючих імунних комплексів за методом Ю. А. Гриневича. А. Н. Алфьорова (1981). Для дослідження системи білків теплового шоку в мононуклеарах периферичної крові ВІЛ-інфікованих була отримана панель поліклональних антитіл. При імунізації тварин і афінної очистки антитіл застосовували препарат білків БТШ-70. Для отримання препарату БТШ-70 використовували білковий екстракт, отриманий з м'язової тканини великої рогатої худоби та клітин культури HeLa. Виділили препарат методами іонообмінної (з DEAE-сефароза; і афінної (з АТФ-агарози) хроматографії. Чистоту отриманих білків БТШ-70 перевіряли за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфату натрію. Препарат БТШ-70 мав чистоту близько 98% і містив суміш конститутивний (hsc-70) і індуцибельної (hsp-70) ізоформ сімейства БТШ-70. З імунної сироватки кроликів виділяли антитіла до БТШ-70 методами висолювання і афінної хроматографії на колонках з сумішшю білків hsc-70 і hsp-70. Кожна серія антитіл піддавалася перевірці на специфічність двома методами - імуноферментного аналізу та иммуноблоттинга. Для визначення епітопів БТШ-70, з якими реагували отримані антитіла, використовували "сендвіч"-метод імуноферментного аналізу і реакція иммунопреципитации з попередніми мічених білків [35S]-метіоніном. Іммунопреціпітати були піддані одно- і двовимірному електрофорез (Laemli UK, 1970; O'Farrel PH. 1978). Поліклональні антитіла використовували в конструкції іммуноблотінга з подальшою денситометрії проявлених зон білків, що дозволяло напівкількісне оцінювати зміст ізоформ сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові хворих. Для перевірки функціонального стану системи БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові служили навантажувальні тести In vitro - тепловий шок (прогрів клітин при 43 ± 0.3 ° С у водяному термостаті) і ультрафіолетове опромінення з використанням приладу МД-73 "Ізольда". Визначення активності ксантиноксидази та її форми в мононуклеарной фракції крові проводили за методом У. Прайор (1979). Рівень процесів вільнорадикального окислення тотально в мононуклеарах периферичної крові і окремо в їх ядрах оцінювали за вмістом продуктів, що пов'язують тіобарбітурової кислоту, які визначали за методом M. Uchlyama, M. Michara (1978). У Як інтегральних біохімічних показників нестабільності геному клітин були обрані відносна частка продуктів деградації хроматину - полидезоксинуклеопротеидов, які є фрагментами ДНК, (Parks DA, Granger DN, 1986) і інтенсивність утворення однониткових розривів ДНК (Birnboim HC. Jewcac JJ. 1981). Статистична обробка цифрових даних здійснювали методом варіаційної статистики з використанням параметричного критерію (t) Стьюдента. У випадку малих вибірок використовували непараметричні статистичні критерії. Розрахунки проводили з використанням програми STATGRAF (Statistical Graphics System), версія 2.1. 2. Результати власних досліджень Гуморальний і клітинний імунітет на різних стадіях хвороби Дослідження змін в імунній системі при розвитку ВІЛ-інфекції мало на меті виявити показники, достовірно змінюються при переході від однієї клінічної стадії (фази) до іншої. Аналіз змін імунологічних параметрів хворих дозволяє зробити висновок, що в динаміці ВІЛ-інфекції, в першу чергу, відбувається прогресуюче зниження функціональної спроможності імунної системи в міру розвитку клінічної картини захворювання. Виявлена дефектність імунного статусу стосується, перш за все. Т-системи імунітету. Однак далеко не усі досліджені традиційні імунодіагностичні параметри у своїй динаміці достовірно відображають початок переходу від безсимптомної фази захворювання до маніфестним стадіях. достовірне розходження між групами хворих на ВІЛ-інфекцією спостерігалося у наступних показників: - при переході від безсимптомної фази (ІІБ) до ПГЛ (IIB) - збільшення відносного вмісту лімфоцитів від 39,00 ± 2,13 до 45,92 ± 1.96% (p < 0,05), зменшення вмісту СD8 +-лімфоцитів (супресорів) ВІД 36,90 ± 2.90 до 27,83 ± 1,80% (p <0,01); - при переході від ПГЛ (IIB) до стадії вторинних захворювань (IIIA ) - збільшення вмісту В (IgA +)-лімфоцитів від 0,06 ± 0,01 до 0,10 ± 0,01 xlO9 / л (p <0,01), збільшення концентрації IgG від 11,74 ± 0.89 до 13.77 ± 0.66 г / л (р <0.05), збільшення вмісту циркулюючих імунних комплексів - зменшення пропускання світлового потоку від 92,1 ± 1,2 до 84.3 ± 1.6% (р <0,01). Як показав аналіз, процентні (відносні) показники у багатьох випадках не можна використовувати без оцінки абсолютних значень. абсолютний вміст В (IgA +)-лімфоцитів, залишається незмінним на стадії IIIA в порівнянні з безсимптомною фазою, зміна концентрації імуноглобулінів IgG відбуваються в діапазоні нормальних значень (9-15 г / л), що знижує прогностичну інформативність зазначених показників. Важливий і той факт, що немає єдиного імунологічного показника, який би достовірно характеризував обидва переходу ВІЛ-інфекції - від безсимптомної фази до генералізованої лімфаденопатії і від генералізованої лімфаденопатії до стадії вторинних захворювань. Зміст продуктів, що пов'язують тіобарбітурової кислоту, в мононуклеарах периферичної крові Вже у безсимптомній фазі у ВІЛ-інфікованих відзначено збільшення середніх значень вмісту ТБК-зв'язуючих сполук у мононуклеарах периферичної крові на 56%, а в їх ядрах - на 90%. У міру розвитку захворювання рівень названих продуктів вільно-радикального окислення зростає, досягаючи максимуму у хворих у стадії IIIB. При цьому середні значення в групі хворих в стадії IIIB перевищували контрольні в 3.2 рази в мононуклеарах і в 4,6 рази в ядрах мононуклеарів. Однак достовірне зростання показників вільнорадикального окислення між групами хворих на ВІЛ-інфекцією відзначається в мононуклеарах. але не в ядрах, і тільки в одному з нас цікавлять переходах клінічного перебігу - з бессимптомной фази (ПБ) до ПГЛ (IIB) від 2,82 ± 0,30 до 3,61 ± 0.37 нмоль/106 клітин (р <0,01) . Активність форм ксантиноксидази в мононуклеарах периферичної крові Відзначається прогресивне зростання загальної ксантіноксідазной активності в мононуклеарах периферичної крові пацієнтів з розвитком захворювання. Однак динаміка стану D-і 0-форм ферменту, виявилася різноспрямованою: у міру прогресування захворювання відбувається поступове зниження середніх значень активності D- форми ксантиноксидази (на 12,5% у стадії IIB і на 75,5% у стадії III В) і наростання активності 0-форми ферменту (на 13,4% у стадії ПБ і в 6,5 разів в стадії IIIB). При цьому достовірного зменшення активності D-форми ксантиноксидази в переходах клінічного перебігу ІІБ-IIB і IIB-IIIA не відзначається, а активність 0-форми достовірно зростає тільки при переході від безсимптомної фази (ПБ) до ПГЛ (IIB) (р <0,05) . Інтегральні метаболічні показники дестабілізації геному мононуклеарів периферичної крові У ВІЛ-інфікованих вже у безсимптомній фазі відзначається збільшення середніх значень вмісту полидезоксинуклеопротеидов (ПДН) в 1,3 рази, а вираженості однониткових розривів ДНК в 2.3 рази. Виявлені зміни прогресують по мірі розвитку ВІЛ-інфекції , однак достовірних відмінностей показників нестабільності ге-нома між групами хворих не відзначається, що не дозволяє розглядати їх в якості прогностичних критеріїв переходу клінічного перебігу хвороби з однієї стадії в іншу. Характеристика поліклональних антитіл до білків сімейства БТШ-70 Кожен з отриманих нами препаратів антитіл розпізнавав специфічний профіль ізоформ сімейства БТШ-70, денатурованих до-децілсульфатом натрію. Антитіла із сироватки кролика N5 (антитіла N5) розрізняють дві зони молекулярної маси 68-72 кДа, які являють собою дві ізоформи сімейства БТШ-70. Тепловий вплив (43 ° С - 30 хвилин) на клітини HeLa, білковий екстракт яких використовували для приготування імуноблоту. відбивалася на результаті імуноблоту посиленням інтенсивності зони, відповідної hsp70. Антитіла N7 розпізнавали і hsp70. і Р75, тоді як антитіла N10 головним чином пов'язувалися тільки з Р75. a Nil - з hsp70. Такі ж приклади розпізнавання білків сімейства БТШ-70 на імуноблоту спостерігалися, коли замість клітин HeLa для аналізу використовували мононуклеари периферичної крові людини. Для того, щоб визначити компоненти сімейства БТШ-70, які реагують у неденатурований стані з представленої панеллю антитіл, виконано дослідження иммунопреципитации. І одно-, і двовимірні електрофоретичні аналізи імунних комплексів не показували відмінностей між антигенами, преціпітірованнимі з тестованими антитілами: імунні комплекси містили тільки одну зону. відповідну індуцибельної формі hsp70. Іммобілізовані на твердій фазі антитіла N5 і N7 також вибірково реагували з антигеном hsp70 з білкового екстракту клітин HeLa. У підсумку, з причин особливих властивостей отриманих антитіл до БТШ-70. які, як зробило-сь, розпізнають тільки один або кілька суміжних сайтів на нативних молекулах БТШ-70. а також з причини властивостей білків сімейства БТШ-70 легко утворювати міцні з'єднання е іншими білками клітини в звичайних умовах, не видається можливим використати отримані поліклональні антитіла для створення імуноферментної тест-системи, призначеної для кількісного визначення БТШ-70 в білкових екстрактах мононуклеарів периферичної крові. Тому довелося використовувати зазначені антитіла в конструкції іншого методу для визначення БТШ-70 в білкових екстрактах - методу імуноблотингу с-подальшою денситометрії проявлених зон білків. Зміни стану сімейства БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові на різних стадіях ВІЛ-інфекції Сімейство БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові всіх груп обстежених представлено повністю трьома ізоформами: індуцибельної (hsp-70), конститутивний (hsc-70) і білком Р75. Не виявлено достовірних відмінностей у співвідношенні ізоформ БТШ-70 між донорами та пацієнтами у безсимптомній фазі ВІЛ-інфекції. Навпаки, у хворих у більш пізніх стадіях захворювання виявлено достовірне зміна аналізованих параметрів у порівнянні з контрольною групою. Спостерігається прогресивне зменшення середніх значень вмісту ізоформ hsp-70 і Р75, збільшення hsc-70 у міру розвитку клінічної картини захворювання. Однак достовірне розходження ізоформ сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові між групами хворих на ВІЛ-інфекцією спостерігали тільки по відношенню до конститутивний ізоформ (hsc-70). зміст якої збільшується при переході захворювання з бессимптомной фази (ПБ) до фази ПГЛ (IIB) від 59,3 ± 2,5 до 66.2 ± 2,7 у.г.о. (р <0,05) і від фази ПГЛ (IIB) до стадії вторинних захворювань (IIIA) від 66,2 ± 2.7 до 7l, l ± 3,0 у.г.о. (р <0,05). Дослідження впливу теплового впливу на мононуклеари периферичної крові обстежених осіб дозволило виявити прогресивне достовірне зменшення вмісту індуцибельної ізоформи hsp-70 при переходах ПБ до IIB від 38,9 ± 4,3 до 30.4 ± 3.1 у.г.о. 'і IIB до IIIA від 30 , 4 ± 3,1 до 22.1 ± 3.7 у.г.о. (р <0,05). Нами запропоновано індекс hsp-70 Tlll/hsp-70 N. представляє собою відношення змісту індуцибельної ізоформи сімейства БТШ-70 в клітці, підданої теплового шоку in vitro, до змісту цього білка в клітині, що знаходиться при t = 370С. Індекс hsp-70 TШ/hsp-70 N характеризує реакцію клітини на екстремальний вплив синтезом і накопиченням індуцибельної ізоформи. за яким побічно можна судити про адаптивної спроможності досліджених клітин. Достовірне зменшення індексу hsp-70 TlB/hsp-70 N спостерігається в обох переходах клінічних стадій: ПБ - IIB від 4,23 до 3.42 (р <0,05) і IIB - IIIA від 3,42 до 2.99 (р < 0.05). що свідчить про прогресивний ослабленні адаптивної функції мононуклеарів периферичної крові. Вплив ультрафіолетового опромінення на нононуклеари периферичної крові викликало аналогічні зрушення в системі білків теплового шоку у всіх групах хворих. Представлений аналіз отриманих результатів виявляє значущість динаміки показників сімейства білків теплового шоку БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові для прогнозу переходу клінічного розвитку ВІЛ-інфекції від безсимптомної фази до генералізованої лімфаденопатії і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. Патогенетична зв'язок досліджених біохімічних показників і білків теплового шоку БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові при ВІЛ-інфекції Виявлена динаміка показників нестабільності геному мононуклеарів периферичної крові у хворих на ВІЛ-інфекцією супроводжувалася істотним збільшенням концентрації сполук, що пов'язують тіобарбітурової кислоту, (продуктів вільнорадикального окислення) у клітинах і їх ядрах, що свідчить про пошкодження ДНК мононуклеарів вільними радикалами. Провідним генератором активних форм кисню при цьому. судячи з отриманих результатів, служить 0-форма ксантиноксидази, яка утворюється з D-форми ферменту в результаті її обмеженого протеолізу. У свою чергу, протеолітична трансформація D-форми ксантиноксидази в 0-форму може бути прооксидантно-індукованої. Таким чином можна припустити, що ушкодження ДНК мононуклеарів викликано вільними радикалами , що генеруються ксантінок-сідазой. У результаті атаки ДНК вільними радикалами спостерігається образованіе.апурінових / апірімідінових сайтів і однониткових розривів ДНК мононуклеарів периферичної крові. Причому ступінь зазначених процесів перебуває в залежності від клінічного перебігу ВІЛ-інфекції. У свою чергу, утворення однониткових розривів є стимулюючим чинником підвищення активності ксантиноксидази в мононуклеарах, а які утворюються олігонуклеотиди можуть служити факторами активації експресії провірусної геному ВІЛ. інтегрованого в ДНК мононуклеарів периферичної крові. У результаті формується патологічний круг. сприяє реплікації ВІЛ (рис.1, в кінці). Описані процеси, серед яких найбільш значущим є вільнорадикальне окислення, супроводжуються характерними змінами системи білків теплового шоку в мононуклеарах периферичної крові, що відбуваються в тісному зв'язку з клінічним перебігом ВІЛ-інфекції. Зазначені зміни БТШ-70 в неінфікованих клітинах можуть бути опосередковані впливом вірусного білка gplZO. взаємодія якого з рецептором CD4 НЕ тільки викликає стресову реакцію. виявляється поруч функціональних змін, у тому числі і посиленням транскрипції з генів БТШ-70 (G. Furlini at al .. 1994) .. а й призводить до програмованої клітинної загибелі - апоптозу зрілих СD4 +-лімфоцитів або СD34 +-гематопоетичних клітин-попередників (Hofman Во, 1991; Montagnier L. et al., 1992). У інфікованих клітинах експресія генів ВІЛ і генів, що кодують синтез БТШ-70. здійснюється за загальними механізмами з участю ядерного чинника NF-kB (Krumm A. et al .. 1993). Таким чином, і в неінфікованих, і в інфікованих ВІЛ імунокомпетентних клітинах крові хворих показники сімейства БТШ-70 можуть обгрунтовано розглядатися як індикатор активності реплікативного процесу вірусу, формування вторинного імунодефіциту (внаслідок дисфункції і загибелі СБ4 +-клітин) і розвитку клінічного перебігу хвороби. ВИСНОВКИ 1. Традиційні для оцінки імунного статусу лабораторні показники (кількість CD3 +. CD4 +. С08 +-лімфоцитів. В-лімфоцитів. несучих Ig М, G. А; РГМЛ з Конан; концентрація Ig M, G. А; зміст циркулюючих імунних комплексів) недостатньо повно відображають динаміку переходу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази до персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. 2. Підвищення активності 0-форми ксантиноксидази та інтенсивності процесів вільнорадикального окислення в мононуклеарах периферичної крові прогресують в динаміці захворювання, при цьому достовірні відмінності (р <0,05 і р <0.01 відповідно) спостерігаються тільки при переході від безсимптомної фази до персістірувщей генералізованої лімфаденопатії. 3. При розвитку ВІЛ-інфекції спостерігається збільшення відносної частки продуктів деградації хроматину (рівня полидезоксинуклеопротеидов) і інтенсивності освіти однониткових розривів ДНК в мононуклеарах периферичної крові без достовірних відмінностей в динаміці хвороби (р> 0,05). 4. Білки теплового шоку сімейства БТШ-70 індукують утворення поліклональних антитіл високої специфічності та афінності, які розпізнають один або кілька суміжних сайтів на нативних молекулах білків , що виключає можливість використання отриманих імуноглобулінів в конструкції імуноферментних тест-систем для кількісного визначення БТШ-70. але допускає їх застосування в методі іммуноблотінга. 5. При переході клінічного перебігу захворювання від безсимптомної фази до персистуючою генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань відбувається достовірне збільшення вмісту конститутивний ізоформи сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові, що характеризує перебування імунокомпетентних клітин у стані хронічного стресу (р <0.05). 6. Функціональне виснаження системи БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові ВІЛ-інфікованих проявляється зниженням інтенсивності відповіді ( синтез індуцибельної ізоформи БТШ-70) на стресові впливи у вигляді гіпертермії та ультрафіолетового опромінення. 7. Динаміка змін білків теплового шоку сімейства БТШ-70 в сукупності з показниками вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази мононуклеарів периферичної крові відповідає клінічному розвитку ВІЛ-інфекції, що дозволяє використовувати их для прогнозирования перехода клинического течения заболевания из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Предложенный способ оценки функционального состояния системы белков теплового шока мононуклеаров периферической крови с применением стрессорных воздействий - гипертермии и ультрафиолетового излучения - целесообразно использовать в экспериментальных исследованиях, направленных на изучение патогенеза вторичных иммунодефицитных состояниях при ВИЧ-инфекции и других инфекционных заболеваниях. Комплекс показателей, отражающих состояние семейства белков теплового шока БТШ-70 (повышение содержания конститутивной изофор-мы hsc-70 более 68,9 у. д.е.) и системы ксантиноксидазы (повышение активности 0-формы более 1,03 мкмоль/мг белка-мин) мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными показателями иммунного статуса может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии. Для перехода ПГЛ в стадию вторичных заболеваний характерно повышение содержания конститутивной изоформы hsc-70 более 74,1 у.д.е. Включение указанных методов в комплексное лабораторно-диагностическое обследование больных ВИЧ-инфекцией позволяет прогнозировать клиническое течение заболевания. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Приготовление специфических поликлональных антител к белкам теплового шока // Мат. XI науч. конф. молодых ученых и специалистов академии.- Л.:ВМедА, 1990.- С.18-19. 2. The characterization and use of different antibodies against the hsp70 major heat shock protein family for the development of an Immunoassay // Electrophoresls.- 1991.-N12.-P.670- 673 (coавт. Б.А.Маргулис и др.). 3. The state of HSP-70 in lymphocytes In transition of HIV Infection to the clinical manifestation stage // Social and medical problem of AIDS.- St.-Petersburg. 1994.- P. 14 (соавт. Л.А.Кожемякин и др. ). 4. HSP-70 state significance In the diagnosis and prognosis HIV-Infection // AIDS. cancer and related problems.- St.-Petersburg, 1996.- P. 130-131 (соавт. Е.И.Змушко). 5. Лабораторный контроль донорской крови в целях безопасности по ВИЧ-инфекции // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии.- СПб. 1996.- С. 67 (соавт. Е.И.Змушко и др.). 6. Диагностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Новые информационные технологии в медицине и экологии. -Гурзуф. Ялта, 1996.- С. 56 (соавт. Е.И.Змушко). 7. Прогностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Инфектология. Достижения и перспективы. -СПб: ВМедА, 1996.-С.99 (соавт. Е.И.Змушко и др.).
НАЧАРОВ Петро Васильович
Прогностичне значення білків теплового шоку ПРИ ВІЛ-ІНФЕКЦІЇ
14.00.10-інфекційні хвороби
АВТОРЕФЕPAT дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
1997
Робота виконана у Військово-медичної академії.
Науковий керівник:
доктор медичних наук Є. І. Змушко.
Науковий консультант:
доктор медичних наук професор Ю. В. Лобзин.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук професор В. В. Іванова, доктор медичних наук професор А. Г. Рахманова.
Провідна установа-Російський науково-методичний центр та профілактиці і боротьбі зі СНІДом.
Захист дисертації відбудеться "" ............... 1997
в .... годині на засіданні спеціалізованої ради Д 106.03.05
при Військово-медичної академії (194044, м. Санкт-Петербург, вул. Лебедєва, 6).
З дисертацією можна ознайомитися у фундаментальній бібліотеці академії.
Автореферат розісланий
1997
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук професор Ю. І. Ляшенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність проблеми. У Росії питання стратегії і тактики боротьби з ВІЛ-інфекцією визначені роботами В. І. Покровського (1988: 1989; 1993). В. І. Покровський (1987) передбачив прийдешній розмах поширення ВІЛ-інфекції в країні і впровадив у практичну охорону здоров'я структуру, призначену для боротьби зі СНІДом. В даний час ВІЛ-інфекція охопила всі країни світу. На середину 1996 року загальна кількість інфікованих вірусом імунодефіциту у всьому світі досягло 27900 тисяч чоловік (Рахманова А.Г., 1996). Незважаючи на те, що виконаний безпрецедентно великий обсяг наукових досліджень з. проблемі ВІЛ-інфекції, запропоновані методи лікарської терапії, що дозволяють домагатися тимчасового поліпшення стану хворих на СНІД. до теперішнього часу не відомий жоден достовірний випадок одужання, тому СНІД вважають хворобою з летальністю 100%. Проблема ВІЛ-інфекції ускладнюється ще й тим фактом, що з початку дев'яностих років ВІЛ все більш і більш завойовує основну популяцію населення, в той час як протягом перших десяти років поширення йшло переважно серед певних груп населення, так званих "груп ризику" - наркомани , гомосексуалісти. повії, хворі на гемофілію (Лобзин Ю.В., Казанцев А.П.. 1996). Актуальність проблеми визначає некероване інтенсивне зростання випадків інфікованості, хворобливості та смертності в усіх країнах світу (Шувалова Е.П., 1995). Виявлення ВІЛ-інфікованих осіб не призводить до припинення передачі ВІЛ від них, незважаючи на повідомлення їх про кримінальну відповідальність за зараження (Покровський В.В. з співавт., 1996). Не вирішеними залишаються основні проблеми СНІДу (Бєлозьоров Є.С. з співавт., 1995): - відсутність методів ранньої діагностики: - повна некерованість патологічних процесів у хворого: - відсутність надійних клінічних та лабораторних показників переходу інфекційного процесу з латентної стадії в маніфестних. При СНІД та ВІЛ-інфекції досить добре вивчені основні лабораторні діагностичні показники, що свідчать про інфікування (Змушко Є.І. з співавт., 1996). Однак питання прогнозування клінічного перебігу ВІЛ-інфекції вимагають подальшого вивчення. Найбільше клінічне значення має прогноз переходу від безсимптомної фази до персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ), а також від ПГЛ до стадії вторинних захворювань, який важливий для своєчасного призначення етіотропних і патогенетичних засобів (Рахманова А.Г.. Чайка Н.А., 1989) . При пошуку нових тестів, які давали б уявлення про стан імунокомпетентних клітин крові при ВІЛ-інфекції, звернула на себе увагу група порівняно недавно відкритих внутрішньоклітинних білків, які отримали назву "білки теплового шоку" (БТШ) або "стресові білки". Ці білки недостатньо вивчені, але вже наявні дані говорять, що вони високо консервативні в процесі філогенезу (Lindqulst S., 1986), незвично поліфункціональні - відіграють важливу роль у багатьох внутрішньоклітинних імунобіохімічних процесах як в екстремальних, так і в нормальних умовах (Polla BS, 1988), що дозволяє припустити про участь білків теплового шоку у формуванні патобіохімічних внутрішньоклітинних зв'язків при ВІЛ-інфекції. У відповідь на вплив несприятливих факторів, в тому числі і вірусної інфекції, формується неспецифічна клітинна реакція, яка супроводжується посиленням процесів вільнорадикального окислення (Іванова В.В. з співавт., 1992: 1996), синтезом білків теплового шоку (Kaufman SHE. 1990) і є одним з механізмів дестабілізації геному клітин-мішеней. У цих умовах важливою є роль ферменту ксантиноксидази, яка служить генератором вільних радикалів при ряді патологічних станів клітини і є найбільш значущою серед прооксидантних систем, характерних для лімфоїдної клітини (Кожем'якін Л.А. із співавт .. 1992). Відсутність у літературі даних по комплексній оцінці процесів дестабілізації геному, пов'язаних з активністю вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази в імунокомпетентних клітинах крові в динаміці розвитку ВІЛ-інфекції не дозволяє визначити значимість названих показників для прогнозу клінічного перебігу хвороби. Мета дослідження: дати оцінку можливості використання показників білків теплового шоку сімейства БТШ-70 та комплексу біохімічних змін в мононуклеарах периферичної крові в прогнозуванні клінічного перебігу ВІЛ-інфекції. Для досягнення зазначеної мети необхідно було вирішити следуюіе завдання: 1. Вивчити динаміку традиційних показників імунного стату-а у ВІЛ-інфікованих і визначити їх прогностичну значущість при переході клінічного перебігу хвороби з однієї стадії в іншу. 2. Вивчити зміни активності ксантиноксидази, інтенсивності процесів вільнорадикального окислення і показників нестабільності геному мононуклеарів периферичної крові при ВІЛ-інфекції та оцінити їх прогностичну значимість. 3. Розробити методичні підходи до створення імунологічного методу для кількісного та якісного аналізу білків сімейства БТШ-70. 4. Вивчити показники білків сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові на різних фазах ВІЛ-інфекції. 5. Визначити взаємозв'язок змін білків сімейства БТШ-70 та комплексу біохімічних показників дестабілізації геному. вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази мононуклеарів периферичної крові у хворих у динаміці захворювання та оцінити їх значимість для прогнозу клініко-маніфестних форм ВІЛ-інфекції. Наукова новизна: 1. Вперше встановлено, що наростання накопичення конститутивний ізоформи білків сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові ВІЛ-інфікованих пропорційно ступеня вираженості клінічних проявів хвороби. 2. Показано зв'язок зміни показників білків сімейства БТШ-70 з рівнем нестабільності геному, активністю процесів вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази в мононуклеарах периферичної крові у хворих на ВІЛ-інфекцію в процесі розвитку клінічної картини захворювання. 3. Встановлено, що зміна стану білків сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові адекватно відображає вірогідність переходу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази у фазу персистуючої генералізованої лімфаденопатії і від персистуючої генералізованої лімфаденопатії до стадії вторинних захворювань. 4. Встановлено, що ВІЛ-інфекція викликає порушення реакції білків теплового шоку (БТШ-70) мононуклеарів периферичної крові у відповідь на ушкоджують впливу (гіпертермія. ультрафіолетове опромінення). Практична значимість роботи. Комплекс показників, що відображають стан системи білків теплового шоку, системи ксантиноксидази, процесів вільнорадикального і нестабільності геному мононуклеарів периферичної крові, в сукупності з традиційними імунологічними показниками може бути використаний для прогнозування переходу клінічного перебігу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази у фазу ПГЛ і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. Вивчення показників білків теплового шоку мононуклеарів периферичної крові людини як захисного механізму неспецифічної дії може може бути застосовано для оцінки ефективності лікарських засобів з імуномодулюючими властивостями, а також для розробки нових діагностичних підходів до прогнозування імунодефіцитних станів різної етіології. Основні положення, що виносяться на захист: 1. Перехід клінічного перебігу захворювання від безсимптомної фази до персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань характеризується збільшенням вмісту конститутивний ізоформи сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові. 2. Зміни вмісту білків сімейства БТШ-70 в процесі ВІЛ-інфекції відбуваються на тлі збільшення показників нестабільності геному, інтенсифікації процесів вільнорадикального окислення та підвищення активності ксантиноксидази в мононуклеарах периферичної крові. 3. Показники білків сімейства БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові в сукупності з традиційними імунологічними показниками можливо використовувати для прогнозування переходу клінічного перебігу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази у фазу персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. Апробація роботи. Результати досліджень були докладені на XI-й і XII-й наукових конференціях молодих вчених академії (ВМедА, Ленінград, 1990; ВМедА, Санкт-Петербург, 1992), на VI-му Всесоюзному біохімічному з'їзді (Санкт-Петербург, 1992), на Першій міжнародній регіональній конференції з ВІЛ-інфекції "Соціальні та медичні проблеми СНІДу" (Санкт-Петербург, 1994). на засіданні Санкт-Петербурзького відділення Російського наукового товариства інфекціоністів (Санкт-Петербург, 1996), на IV міжнародній конференції "СНІД, рак і споріднені проблеми" (Санкт-Петербург. 1996), на III Всеросійському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Санкт-Петербург. 1996). Матеріали дисертації використані у звітах по темі НДР N 50-93-В12 "Біохімічні механізми формування імунодефіцитів під впливом ВІЛ і імунодіагностика імунодефіцитних станів хворих на СНІД" і по темі НДР N 60-95-П4 "Дослідження ролі системи білків теплового шоку в патогенезі ВІЛ- інфекції ". Реалізація результатів роботи. За темою дисертації опубліковано 7 наукових робіт. Результати роботи використовуються в практиці навчального процесу та науково-дослідній роботі кафедри інфекційних хвороб, кафедри клінічної біохімії і лабораторної діагностики, у роботі НДЛ СНІДу та інфекційних захворювань у ЗС РФ Військово-медичної академії, кафедри інфекційних хвороб Семипалатинського державного медичного інституту, кафедри ЛОР-хвороб з курсом алергології та імунології Чімкентского державного медичного інституту, кафедри інфекційних хвороб Волгоградського державного медичного університету. Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 171 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, п'яти розділів власних досліджень. обговорення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку літератури, що включає 61 вітчизняний і 140 зарубіжних джерел. Дисертація ілюстрована 24 малюнками і 17 таблицями. ЗМІСТ РОБОТИ 1. Загальна характеристика хворих та методів дослідження У процесі роботи були обстежено 34 інфікованих та хворих на ВІЛ-інфекцією, серед яких переважали особи чоловічої статі у віковій категорії від 20 до 39 років. Клінічне спостереження та обстеження хворих проводили в лікарні N 30 імені С.П. Боткіна м. Санкт-Петербурга, Республіканської клінічної інфекційної лікарні м. Усть-Іжори Ленінградської області, в Центрі по боротьбі та профілактиці СНІДу м.Санкт-Петербурга. Хворі були розподілені по групах відповідно до клінічної класифікації В. І. Покровського (1989). ВІЛ-інфікованих в стадії інкубації і хворих у термінальній стадії не обстежили. Контрольну групу склали 25 практично здорових чоловіків (донорів крові) у віці від 20 до 39 років - військовослужбовці. Імунологічні та біохімічні дослідження проводили у Військово-медичної академії, визначення білків теплового шоку - на базі інституту цитології Академії наук. Діагноз ВІЛ-інфекції верифікували серологічно - за наявності в крові специфічних антитіл до ВІЛ за допомогою тест-систем для гетерогенного імуноферментного аналізу методом подвійних антитіл (виробництва фірм СП "діаплюс". Росія-Швейцарія, СП "Авіценна", Росія-Сирія). Результати імуноферментного аналізу підтверджували за допомогою імуноблотингу ("Du Pont", США). Для оцінки імунного статусу у обстежених пацієнтів вивчали такі показники: кількість лейкоцитів, лімфоцитів; субпопуляції Т-лімфоцитів за допомогою проточного цитофлюориметр "EPICS-C" (Coulter elektronics. США-Франція) з застосуванням моноклональних антитіл фірми "Ortho Diagnostic Systems" (США) : РГМЛ з Конан визначали за методом M. George. JHVaughan (1962); кількість В-лімфоцитів, які несуть Ig M, G, А, визначали методом імунофлюоресценції з використанням моноспецифічний сироваток до імуноглобулінів людини; концентрації Ig M. G, А, визначали методом радіальної иммунодиффузии в гелі (Mancini С. et al .. 1963); вміст циркулюючих імунних комплексів за методом Ю. А. Гриневича. А. Н. Алфьорова (1981). Для дослідження системи білків теплового шоку в мононуклеарах периферичної крові ВІЛ-інфікованих була отримана панель поліклональних антитіл. При імунізації тварин і афінної очистки антитіл застосовували препарат білків БТШ-70. Для отримання препарату БТШ-70 використовували білковий екстракт, отриманий з м'язової тканини великої рогатої худоби та клітин культури HeLa. Виділили препарат методами іонообмінної (з DEAE-сефароза; і афінної (з АТФ-агарози) хроматографії. Чистоту отриманих білків БТШ-70 перевіряли за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфату натрію. Препарат БТШ-70 мав чистоту близько 98% і містив суміш конститутивний (hsc-70) і індуцибельної (hsp-70) ізоформ сімейства БТШ-70. З імунної сироватки кроликів виділяли антитіла до БТШ-70 методами висолювання і афінної хроматографії на колонках з сумішшю білків hsc-70 і hsp-70. Кожна серія антитіл піддавалася перевірці на специфічність двома методами - імуноферментного аналізу та иммуноблоттинга. Для визначення епітопів БТШ-70, з якими реагували отримані антитіла, використовували "сендвіч"-метод імуноферментного аналізу і реакція иммунопреципитации з попередніми мічених білків [35S]-метіоніном. Іммунопреціпітати були піддані одно- і двовимірному електрофорез (Laemli UK, 1970; O'Farrel PH. 1978). Поліклональні антитіла використовували в конструкції іммуноблотінга з подальшою денситометрії проявлених зон білків, що дозволяло напівкількісне оцінювати зміст ізоформ сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові хворих. Для перевірки функціонального стану системи БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові служили навантажувальні тести In vitro - тепловий шок (прогрів клітин при 43 ± 0.3 ° С у водяному термостаті) і ультрафіолетове опромінення з використанням приладу МД-73 "Ізольда". Визначення активності ксантиноксидази та її форми в мононуклеарной фракції крові проводили за методом У. Прайор (1979). Рівень процесів вільнорадикального окислення тотально в мононуклеарах периферичної крові і окремо в їх ядрах оцінювали за вмістом продуктів, що пов'язують тіобарбітурової кислоту, які визначали за методом M. Uchlyama, M. Michara (1978). У Як інтегральних біохімічних показників нестабільності геному клітин були обрані відносна частка продуктів деградації хроматину - полидезоксинуклеопротеидов, які є фрагментами ДНК, (Parks DA, Granger DN, 1986) і інтенсивність утворення однониткових розривів ДНК (Birnboim HC. Jewcac JJ. 1981). Статистична обробка цифрових даних здійснювали методом варіаційної статистики з використанням параметричного критерію (t) Стьюдента. У випадку малих вибірок використовували непараметричні статистичні критерії. Розрахунки проводили з використанням програми STATGRAF (Statistical Graphics System), версія 2.1. 2. Результати власних досліджень Гуморальний і клітинний імунітет на різних стадіях хвороби Дослідження змін в імунній системі при розвитку ВІЛ-інфекції мало на меті виявити показники, достовірно змінюються при переході від однієї клінічної стадії (фази) до іншої. Аналіз змін імунологічних параметрів хворих дозволяє зробити висновок, що в динаміці ВІЛ-інфекції, в першу чергу, відбувається прогресуюче зниження функціональної спроможності імунної системи в міру розвитку клінічної картини захворювання. Виявлена дефектність імунного статусу стосується, перш за все. Т-системи імунітету. Однак далеко не усі досліджені традиційні імунодіагностичні параметри у своїй динаміці достовірно відображають початок переходу від безсимптомної фази захворювання до маніфестним стадіях. достовірне розходження між групами хворих на ВІЛ-інфекцією спостерігалося у наступних показників: - при переході від безсимптомної фази (ІІБ) до ПГЛ (IIB) - збільшення відносного вмісту лімфоцитів від 39,00 ± 2,13 до 45,92 ± 1.96% (p < 0,05), зменшення вмісту СD8 +-лімфоцитів (супресорів) ВІД 36,90 ± 2.90 до 27,83 ± 1,80% (p <0,01); - при переході від ПГЛ (IIB) до стадії вторинних захворювань (IIIA ) - збільшення вмісту В (IgA +)-лімфоцитів від 0,06 ± 0,01 до 0,10 ± 0,01 xlO9 / л (p <0,01), збільшення концентрації IgG від 11,74 ± 0.89 до 13.77 ± 0.66 г / л (р <0.05), збільшення вмісту циркулюючих імунних комплексів - зменшення пропускання світлового потоку від 92,1 ± 1,2 до 84.3 ± 1.6% (р <0,01). Як показав аналіз, процентні (відносні) показники у багатьох випадках не можна використовувати без оцінки абсолютних значень. абсолютний вміст В (IgA +)-лімфоцитів, залишається незмінним на стадії IIIA в порівнянні з безсимптомною фазою, зміна концентрації імуноглобулінів IgG відбуваються в діапазоні нормальних значень (9-15 г / л), що знижує прогностичну інформативність зазначених показників. Важливий і той факт, що немає єдиного імунологічного показника, який би достовірно характеризував обидва переходу ВІЛ-інфекції - від безсимптомної фази до генералізованої лімфаденопатії і від генералізованої лімфаденопатії до стадії вторинних захворювань. Зміст продуктів, що пов'язують тіобарбітурової кислоту, в мононуклеарах периферичної крові Вже у безсимптомній фазі у ВІЛ-інфікованих відзначено збільшення середніх значень вмісту ТБК-зв'язуючих сполук у мононуклеарах периферичної крові на 56%, а в їх ядрах - на 90%. У міру розвитку захворювання рівень названих продуктів вільно-радикального окислення зростає, досягаючи максимуму у хворих у стадії IIIB. При цьому середні значення в групі хворих в стадії IIIB перевищували контрольні в 3.2 рази в мононуклеарах і в 4,6 рази в ядрах мононуклеарів. Однак достовірне зростання показників вільнорадикального окислення між групами хворих на ВІЛ-інфекцією відзначається в мононуклеарах. але не в ядрах, і тільки в одному з нас цікавлять переходах клінічного перебігу - з бессимптомной фази (ПБ) до ПГЛ (IIB) від 2,82 ± 0,30 до 3,61 ± 0.37 нмоль/106 клітин (р <0,01) . Активність форм ксантиноксидази в мононуклеарах периферичної крові Відзначається прогресивне зростання загальної ксантіноксідазной активності в мононуклеарах периферичної крові пацієнтів з розвитком захворювання. Однак динаміка стану D-і 0-форм ферменту, виявилася різноспрямованою: у міру прогресування захворювання відбувається поступове зниження середніх значень активності D- форми ксантиноксидази (на 12,5% у стадії IIB і на 75,5% у стадії III В) і наростання активності 0-форми ферменту (на 13,4% у стадії ПБ і в 6,5 разів в стадії IIIB). При цьому достовірного зменшення активності D-форми ксантиноксидази в переходах клінічного перебігу ІІБ-IIB і IIB-IIIA не відзначається, а активність 0-форми достовірно зростає тільки при переході від безсимптомної фази (ПБ) до ПГЛ (IIB) (р <0,05) . Інтегральні метаболічні показники дестабілізації геному мононуклеарів периферичної крові У ВІЛ-інфікованих вже у безсимптомній фазі відзначається збільшення середніх значень вмісту полидезоксинуклеопротеидов (ПДН) в 1,3 рази, а вираженості однониткових розривів ДНК в 2.3 рази. Виявлені зміни прогресують по мірі розвитку ВІЛ-інфекції , однак достовірних відмінностей показників нестабільності ге-нома між групами хворих не відзначається, що не дозволяє розглядати їх в якості прогностичних критеріїв переходу клінічного перебігу хвороби з однієї стадії в іншу. Характеристика поліклональних антитіл до білків сімейства БТШ-70 Кожен з отриманих нами препаратів антитіл розпізнавав специфічний профіль ізоформ сімейства БТШ-70, денатурованих до-децілсульфатом натрію. Антитіла із сироватки кролика N5 (антитіла N5) розрізняють дві зони молекулярної маси 68-72 кДа, які являють собою дві ізоформи сімейства БТШ-70. Тепловий вплив (43 ° С - 30 хвилин) на клітини HeLa, білковий екстракт яких використовували для приготування імуноблоту. відбивалася на результаті імуноблоту посиленням інтенсивності зони, відповідної hsp70. Антитіла N7 розпізнавали і hsp70. і Р75, тоді як антитіла N10 головним чином пов'язувалися тільки з Р75. a Nil - з hsp70. Такі ж приклади розпізнавання білків сімейства БТШ-70 на імуноблоту спостерігалися, коли замість клітин HeLa для аналізу використовували мононуклеари периферичної крові людини. Для того, щоб визначити компоненти сімейства БТШ-70, які реагують у неденатурований стані з представленої панеллю антитіл, виконано дослідження иммунопреципитации. І одно-, і двовимірні електрофоретичні аналізи імунних комплексів не показували відмінностей між антигенами, преціпітірованнимі з тестованими антитілами: імунні комплекси містили тільки одну зону. відповідну індуцибельної формі hsp70. Іммобілізовані на твердій фазі антитіла N5 і N7 також вибірково реагували з антигеном hsp70 з білкового екстракту клітин HeLa. У підсумку, з причин особливих властивостей отриманих антитіл до БТШ-70. які, як зробило-сь, розпізнають тільки один або кілька суміжних сайтів на нативних молекулах БТШ-70. а також з причини властивостей білків сімейства БТШ-70 легко утворювати міцні з'єднання е іншими білками клітини в звичайних умовах, не видається можливим використати отримані поліклональні антитіла для створення імуноферментної тест-системи, призначеної для кількісного визначення БТШ-70 в білкових екстрактах мононуклеарів периферичної крові. Тому довелося використовувати зазначені антитіла в конструкції іншого методу для визначення БТШ-70 в білкових екстрактах - методу імуноблотингу с-подальшою денситометрії проявлених зон білків. Зміни стану сімейства БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові на різних стадіях ВІЛ-інфекції Сімейство БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові всіх груп обстежених представлено повністю трьома ізоформами: індуцибельної (hsp-70), конститутивний (hsc-70) і білком Р75. Не виявлено достовірних відмінностей у співвідношенні ізоформ БТШ-70 між донорами та пацієнтами у безсимптомній фазі ВІЛ-інфекції. Навпаки, у хворих у більш пізніх стадіях захворювання виявлено достовірне зміна аналізованих параметрів у порівнянні з контрольною групою. Спостерігається прогресивне зменшення середніх значень вмісту ізоформ hsp-70 і Р75, збільшення hsc-70 у міру розвитку клінічної картини захворювання. Однак достовірне розходження ізоформ сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові між групами хворих на ВІЛ-інфекцією спостерігали тільки по відношенню до конститутивний ізоформ (hsc-70). зміст якої збільшується при переході захворювання з бессимптомной фази (ПБ) до фази ПГЛ (IIB) від 59,3 ± 2,5 до 66.2 ± 2,7 у.г.о. (р <0,05) і від фази ПГЛ (IIB) до стадії вторинних захворювань (IIIA) від 66,2 ± 2.7 до 7l, l ± 3,0 у.г.о. (р <0,05). Дослідження впливу теплового впливу на мононуклеари периферичної крові обстежених осіб дозволило виявити прогресивне достовірне зменшення вмісту індуцибельної ізоформи hsp-70 при переходах ПБ до IIB від 38,9 ± 4,3 до 30.4 ± 3.1 у.г.о. 'і IIB до IIIA від 30 , 4 ± 3,1 до 22.1 ± 3.7 у.г.о. (р <0,05). Нами запропоновано індекс hsp-70 Tlll/hsp-70 N. представляє собою відношення змісту індуцибельної ізоформи сімейства БТШ-70 в клітці, підданої теплового шоку in vitro, до змісту цього білка в клітині, що знаходиться при t = 370С. Індекс hsp-70 TШ/hsp-70 N характеризує реакцію клітини на екстремальний вплив синтезом і накопиченням індуцибельної ізоформи. за яким побічно можна судити про адаптивної спроможності досліджених клітин. Достовірне зменшення індексу hsp-70 TlB/hsp-70 N спостерігається в обох переходах клінічних стадій: ПБ - IIB від 4,23 до 3.42 (р <0,05) і IIB - IIIA від 3,42 до 2.99 (р < 0.05). що свідчить про прогресивний ослабленні адаптивної функції мононуклеарів периферичної крові. Вплив ультрафіолетового опромінення на нононуклеари периферичної крові викликало аналогічні зрушення в системі білків теплового шоку у всіх групах хворих. Представлений аналіз отриманих результатів виявляє значущість динаміки показників сімейства білків теплового шоку БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові для прогнозу переходу клінічного розвитку ВІЛ-інфекції від безсимптомної фази до генералізованої лімфаденопатії і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. Патогенетична зв'язок досліджених біохімічних показників і білків теплового шоку БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові при ВІЛ-інфекції Виявлена динаміка показників нестабільності геному мононуклеарів периферичної крові у хворих на ВІЛ-інфекцією супроводжувалася істотним збільшенням концентрації сполук, що пов'язують тіобарбітурової кислоту, (продуктів вільнорадикального окислення) у клітинах і їх ядрах, що свідчить про пошкодження ДНК мононуклеарів вільними радикалами. Провідним генератором активних форм кисню при цьому. судячи з отриманих результатів, служить 0-форма ксантиноксидази, яка утворюється з D-форми ферменту в результаті її обмеженого протеолізу. У свою чергу, протеолітична трансформація D-форми ксантиноксидази в 0-форму може бути прооксидантно-індукованої. Таким чином можна припустити, що ушкодження ДНК мононуклеарів викликано вільними радикалами , що генеруються ксантінок-сідазой. У результаті атаки ДНК вільними радикалами спостерігається образованіе.апурінових / апірімідінових сайтів і однониткових розривів ДНК мононуклеарів периферичної крові. Причому ступінь зазначених процесів перебуває в залежності від клінічного перебігу ВІЛ-інфекції. У свою чергу, утворення однониткових розривів є стимулюючим чинником підвищення активності ксантиноксидази в мононуклеарах, а які утворюються олігонуклеотиди можуть служити факторами активації експресії провірусної геному ВІЛ. інтегрованого в ДНК мононуклеарів периферичної крові. У результаті формується патологічний круг. сприяє реплікації ВІЛ (рис.1, в кінці). Описані процеси, серед яких найбільш значущим є вільнорадикальне окислення, супроводжуються характерними змінами системи білків теплового шоку в мононуклеарах периферичної крові, що відбуваються в тісному зв'язку з клінічним перебігом ВІЛ-інфекції. Зазначені зміни БТШ-70 в неінфікованих клітинах можуть бути опосередковані впливом вірусного білка gplZO. взаємодія якого з рецептором CD4 НЕ тільки викликає стресову реакцію. виявляється поруч функціональних змін, у тому числі і посиленням транскрипції з генів БТШ-70 (G. Furlini at al .. 1994) .. а й призводить до програмованої клітинної загибелі - апоптозу зрілих СD4 +-лімфоцитів або СD34 +-гематопоетичних клітин-попередників (Hofman Во, 1991; Montagnier L. et al., 1992). У інфікованих клітинах експресія генів ВІЛ і генів, що кодують синтез БТШ-70. здійснюється за загальними механізмами з участю ядерного чинника NF-kB (Krumm A. et al .. 1993). Таким чином, і в неінфікованих, і в інфікованих ВІЛ імунокомпетентних клітинах крові хворих показники сімейства БТШ-70 можуть обгрунтовано розглядатися як індикатор активності реплікативного процесу вірусу, формування вторинного імунодефіциту (внаслідок дисфункції і загибелі СБ4 +-клітин) і розвитку клінічного перебігу хвороби. ВИСНОВКИ 1. Традиційні для оцінки імунного статусу лабораторні показники (кількість CD3 +. CD4 +. С08 +-лімфоцитів. В-лімфоцитів. несучих Ig М, G. А; РГМЛ з Конан; концентрація Ig M, G. А; зміст циркулюючих імунних комплексів) недостатньо повно відображають динаміку переходу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази до персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. 2. Підвищення активності 0-форми ксантиноксидази та інтенсивності процесів вільнорадикального окислення в мононуклеарах периферичної крові прогресують в динаміці захворювання, при цьому достовірні відмінності (р <0,05 і р <0.01 відповідно) спостерігаються тільки при переході від безсимптомної фази до персістірувщей генералізованої лімфаденопатії. 3. При розвитку ВІЛ-інфекції спостерігається збільшення відносної частки продуктів деградації хроматину (рівня полидезоксинуклеопротеидов) і інтенсивності освіти однониткових розривів ДНК в мононуклеарах периферичної крові без достовірних відмінностей в динаміці хвороби (р> 0,05). 4. Білки теплового шоку сімейства БТШ-70 індукують утворення поліклональних антитіл високої специфічності та афінності, які розпізнають один або кілька суміжних сайтів на нативних молекулах білків , що виключає можливість використання отриманих імуноглобулінів в конструкції імуноферментних тест-систем для кількісного визначення БТШ-70. але допускає їх застосування в методі іммуноблотінга. 5. При переході клінічного перебігу захворювання від безсимптомної фази до персистуючою генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань відбувається достовірне збільшення вмісту конститутивний ізоформи сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові, що характеризує перебування імунокомпетентних клітин у стані хронічного стресу (р <0.05). 6. Функціональне виснаження системи БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові ВІЛ-інфікованих проявляється зниженням інтенсивності відповіді ( синтез індуцибельної ізоформи БТШ-70) на стресові впливи у вигляді гіпертермії та ультрафіолетового опромінення. 7. Динаміка змін білків теплового шоку сімейства БТШ-70 в сукупності з показниками вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази мононуклеарів периферичної крові відповідає клінічному розвитку ВІЛ-інфекції, що дозволяє використовувати их для прогнозирования перехода клинического течения заболевания из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Предложенный способ оценки функционального состояния системы белков теплового шока мононуклеаров периферической крови с применением стрессорных воздействий - гипертермии и ультрафиолетового излучения - целесообразно использовать в экспериментальных исследованиях, направленных на изучение патогенеза вторичных иммунодефицитных состояниях при ВИЧ-инфекции и других инфекционных заболеваниях. Комплекс показателей, отражающих состояние семейства белков теплового шока БТШ-70 (повышение содержания конститутивной изофор-мы hsc-70 более 68,9 у. д.е.) и системы ксантиноксидазы (повышение активности 0-формы более 1,03 мкмоль/мг белка-мин) мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными показателями иммунного статуса может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии. Для перехода ПГЛ в стадию вторичных заболеваний характерно повышение содержания конститутивной изоформы hsc-70 более 74,1 у.д.е. Включение указанных методов в комплексное лабораторно-диагностическое обследование больных ВИЧ-инфекцией позволяет прогнозировать клиническое течение заболевания. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Приготовление специфических поликлональных антител к белкам теплового шока // Мат. XI науч. конф. молодых ученых и специалистов академии.- Л.:ВМедА, 1990.- С.18-19. 2. The characterization and use of different antibodies against the hsp70 major heat shock protein family for the development of an Immunoassay // Electrophoresls.- 1991.-N12.-P.670- 673 (coавт. Б.А.Маргулис и др.). 3. The state of HSP-70 in lymphocytes In transition of HIV Infection to the clinical manifestation stage // Social and medical problem of AIDS.- St.-Petersburg. 1994.- P. 14 (соавт. Л.А.Кожемякин и др. ). 4. HSP-70 state significance In the diagnosis and prognosis HIV-Infection // AIDS. cancer and related problems.- St.-Petersburg, 1996.- P. 130-131 (соавт. Е.И.Змушко). 5. Лабораторный контроль донорской крови в целях безопасности по ВИЧ-инфекции // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии.- СПб. 1996.- С. 67 (соавт. Е.И.Змушко и др.). 6. Диагностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Новые информационные технологии в медицине и экологии. -Гурзуф. Ялта, 1996.- С. 56 (соавт. Е.И.Змушко). 7. Прогностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Инфектология. Достижения и перспективы. -СПб: ВМедА, 1996.-С.99 (соавт. Е.И.Змушко и др.).