Біосинтез мембранних білків та їх вбудовування в біомембрані

1. Існує ідентифікується частина поліпептидного послідовності, яка служить ділянкою впізнавання, або «сигналом», що направляють окремий поліпептид до мембрани, в яку він вбудовується. -конце новосинтезированного полипептида и отщепляются специфическими сигнальными пептидазами после встраивания его в нужную мембрану или переноса через нее. Ці сигнальні ділянки часто розташовані на N-кінці новосинтезованих поліпептиду і відщеплюються специфічними сигнальними пептідаза після вбудовування його в потрібну мембрану або перенесення через неї. -концевого сигнала различными авторами использовались следующие термины: сигнальный пептид, сигнальная последовательность, транзитный пептид, лидирующий пептид пре-последовательность. Для позначення N-кінцевого сигналу різними авторами використовувалися такі терміни: сигнальний пептид, сигнальна послідовність, транзитний пептид, лідируючий пептид пре-послідовність.

2. Процеси трансляції і вбудовування білків у мембрану можна розділити в експерименті. Для складання мембранних білків у більшості випадків необхідна енергія, яка відрізняється за розміром від тієї, яка потрібна для їх трансляції на рибосомі.

3. Зв'язавшись з мембраною-мішенню поліпептид повинен, крім того, перебувати в конформації, в якій може здійснюватися його перенесення через мембрану або вбудовування в неї. -конца к С-концу, при этом необходимо, чтобы белок был, по крайней мере, частично развернут или слабо свернут. У багатьох випадках перенесення білків через мембрани відбувається від N-кінця до С-кінця, при цьому необхідно, щоб білок був, принаймні, частково розгорнуто або слабо згорнутий. Поліпептид може транслоціроваться у витягнутій формі в ході енергозалежної процесу.

Особливий інтерес представляє процес складання мембранних білків. На рис.1 схематично показано три загальних механізму проникнення пептидного попередника в мембрану. Механізми А і Б, є варіантами схеми лінійного витіснення, згідно з якою сигнальна послідовність направляє поліпептид до переносящему пристрою, який включає в себе заповнений водою канал. Сигнальна послідовність може проходити прямо крізь канал (механізм А) або залишатися пов'язаної з мембраною, утворюючи, як показано на рис.1, петлю (механізм Б). У відсутності будь-якого сигналу зупинки процесу перенесення поліпептид буде транспортуватися через мембрану цілком. Однак якщо всередині поліпептиду є другий сигнальний пептид, званий стоп-сигналом перенесення, то процес зупиняється, і стоп-сигнал перенесення стає трансмембранним сегментом зрілого мембранного білка. Фіксуючи білок в мембрані, стоп-сигнал перенесення діє як сигнал сортування.

Схема В на рис.1 ілюструє можливу роль мимовільного включення в мембрану гідрофобних елементів поліпептидного попередника. Цей механізм може реалізовуватися тільки тоді, коли включення в мембрану відбувається після трансляції поліпептиду.

Рис.1. Три загальні моделі можливої ​​збірки білків в мембрані.

Дві перші (А і Б) припускають, що білок транспортується в лінійній формі через білковий канал. При наявності стоп-сигналу процес зупиняється, в іншому разі через мембрану проходить весь білок. Модель У припускає, що гідрофобні елементи поліпептиду мимовільно включаються в ліпідний бішар. Гідрофобний елемент може представляти собою одиночну спіраль або більш складну структуру. Процес може бути опосередкований білками.

Проблема збірки білків дуже важлива. Цей процес зазвичай не протікає мимовільно, лише в результаті взаємодії між утворюються поліпептидами і ліпідного бішару. Навпаки, він є енергозалежною і опосередковується білковими структурами, які поки не вивчені в достатній мірі. Експериментальні дані свідчать про те, що перенесення білків через мембрану (наприклад, в порожнину ендоплазматичного ретикулуму) і складання інтегральних мембранних білків - це тісно пов'язані сторони одного і того ж процесу. Логічно чекати, що проблеми транспортування білків через мембрани і їх укладання повинні вирішуватися однаковим чином.

1. Методи дослідження переносу білків через мембрани

Найбільш детально вивчені безклітинні системи, в яких набагато легше кількісно дослідити процеси переносу і протеолитического процесингу білків. У всіх цих системах використовуються мембранні везикули або препарати органел, у яких поверхня, обернена в цитоплазму, «дивиться» назовні, оскільки перенесення білків здійснюється з цитоплазми. Цій умові задовольняють мікросоми, отримані з ендоплазматичного ретикулуму секретирующих клітин, мітохондрій і хлоропластів. , они представляют собой удобный объект для изучения переноса белков в бесклеточной системе. Вивернуті везикули можна отримати з клітин Є. coli, вони представляють собою зручний об'єкт для вивчення перенесення білків в безклітинних системі.

Поліпептид-попередник, що знаходиться у зовнішньому середовищі, при відповідних умовах буде переноситися всередину бульбашки або, принаймні, через мембрану бульбашки або органели. За цим процесом зазвичай стежать, додаючи протеази в зовнішнє середовище. Ступінь захисту від протеолізу є мірою кількості поліпептиду, транспортованого всередину везикули або органели. За ходом протеолитического процесу, здійснюваного сигнальної пептидаз, стежать за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності ДСН. Білка, убудований у мембрану, можна ідентифікувати за допомогою лужної екстракції, при цьому передбачається, що білки, які пов'язані з поверхнею мембран, при такій обробці видаляються. Однак так буває не завжди, тому результати, отримані за допомогою лужної екстракції, необхідно інтерпретувати з обережністю.

У таких безклітинних системах можна вивчати біохімічні умови переносу білків та ідентифікувати необхідні розчинні компоненти. Крім того, при цьому можна варіювати природу стерпного поліпептидного «субстрату».

При вивченні безклітинних систем були отримані вельми важливі дані про умови, необхідні для перенесення білків.

1. Посттрансляційної і котрансляціонний перенесення. Прийнято вважати, що у всіх досліджених системах перенесення в мембрани або через мембрани може здійснюватися незалежно від трансляції. Переконливі дані на цей рахунок були отримані для процесу перенесення білків в хлоропластах і мітохондріях, а також для переносу через бактеріальну мембрану. Довгий час вважалося, що перенесення білків в ендоплазматичний ретикулум або через мембрани ендоплазматичного ретикулуму завжди здійснюється паралельно трансляції, проте було чітко показано, що така паралельність не обов'язкова. Також важливим вважається те, що енергія, необхідна для перенесення, не походить від рибосомного биосинтетического апарату.

2. Енергетичні вимоги до перенесення. Як правило, перенесення білків у мембрани або через них енергозавісім. Необхідною умовою переносу як для прокаріотів, так і для еукаріотичних систем є гідроліз АТР (або іншого нуклеозидтрифосфат). . Це було показано для наступних процесів: а) перенесення білків в строму хлоропластів; б) транспорту білків у мітохондріальний матрикс, внутрішню і зовнішню мембрани; в) перенесення білків через ендоплазматичний ретикулум дріжджів і посттрансляційної вбудовування мембранних білків в ендоплазматичний ретикулум ссавців; г) перенесення білків через цитоплазматичну мембрану Є. coli.

Ще одним незалежним умовою перенесення білків в матрикс мітохондрій і у внутрішню мембрану мітохондрій є наявність на останній трансмембранного потенціалу. Цей потенціал, очевидно, необхідний на ранній стадії процесу, при зв'язуванні білка з мітохондрій.

3. Здатність попередника до перенесення. Є вагомі аргументи на користь того, що ключову роль в успішному перенесення білка грає його четвертинна структура. Швидше за все це пов'язано з тим, що сигнальна послідовність (ти), впізнавана апаратом перенесення, повинна бути доступна для нього. Отже, для здійснення переносу білок повинен бути нещільно згорнутий або частково розгорнуто. Крім того, якщо білки переносяться через мембрану у витягнутій конформації, то апарат перенесення повинен бути здатний до їх розгортання під час самого процесу переносу. Якби білки-попередники мали стабільної четвертинної структурою, то вони з працею розгорталися б і, отже, не були б здатні до переносу.

Транспорт білків здійснюється в розгорнутому вигляді. АТР необхідний для розгортання поліпептиду. Розгортання відбувається до переносу або паралельно йому. На те, що саме АТР необхідний для цього процесу, говорить той факт, що транспорт укорочених попередників на відміну від транспорту повнорозмірного білка може здійснюватися у відсутності АТР. Вперше ці дані були зроблені на основі вивчення мітохондріальної мембрани. Для запобігання згортання попередника в нативну конформацію необхідний який-небудь розчинна білковий кофактор. , который был не способен к эффективному переносу через плазматическую мембрану, если в цитозоле отсутствовал белок, называемый «триггер-фактором». Так, був виділений у водорозчинній формі, подібний поріном мітохондрій, попередник білка зовнішньої мембрани Є. coli OmpA, який був не здатний до ефективного переносу через плазматичну мембрану, якщо в цитозолі відсутній білок, званий «тригер-фактором». Відомо також, що для перенесення білків через мембрани ендоплазматичного ретикулуму ссавців або в ендоплазматічекій ретикулум необхідний розчинна кофактор, а саме - сигнал-розпізнає частка (СРЧ). Можливо, роль цього чинника полягає в запобіганні згортання попередника поліпептиду.

2. Вбудовування білків у мембрану

2.1 Сигнальна гіпотеза

Білки вбудовуються в мембрану різними способами, але деталі цього процесу в багатьох випадках ще не встановлені. Для пояснення механізму вбудовування запропоновано дві моделі: сигнальна гіпотеза і мембранна триггерная гіпотеза. У сигнальної гіпотезі передбачається, що білок включається в мембрану паралельно його трансляції на мРНК в полірібосомах; це так зване котрансляціонное включення. Коли лідерних послідовність виходить з рибосоми, вона виявляється якоїсь сигнал-распознающей часткою (СРЧ), яка блокує подальшу трансляцію на рівні приблизно 70 амінокислот, 40 з яких залишаються у великому рибосомной комплексі, а 30 експоновані в середу. -РНК, близкородственная « Alu -семейству» последовательностей ДНК с большим числом повторов. СРЧ містить шість білків, з нею асоціюється 7 S-РНК, близькоспоріднена «Alu-сімейству» послідовностей ДНК з великим числом повторів. Блокування трансляції не знімається до тих пір, поки комплекс СРЧ-лідерних послідовність - рибосома не зв'яжеться з так званим «отстрігающім» білком (рецептором для СРЧ) ендоплазматичного ретикулуму. У цей момент починається котрансляціонное вбудовування в ендоплазматичний ретикулум. У процесі елонгації решти білка він переміщується через ліпідний бішар, оскільки рибосома залишається приєднаної до грубого ендоплазматичного ретикулума. Таким чином утворюється шорсткий (усіяний рибосомами) ендоплазматичний ретикулум. Рибосоми залишаються прикріпленими до грубого ендоплазматичного ретикулуму втечении всього часу синтезу мембранного білка і звільняються і дисоціюють на відповідні субодиниці тільки після його завершення. Коли раніше синтезована частину білка виходить у просвіт ендоплазматичного ретикулума, відщеплюється лідерних послідовність, і приєднуються вуглеводи.

Інтегральні мембранні білки не перетинають мембрану цілком; мабуть, цьому перешкоджає гідрофільна якірна послідовність на С-кінці. Секретуються ж білки проходять крізь мембранний бішар повністю і вивільняються у просвіт ендоплазматичного ретикулуму. До моменту їх надходження усередину везикули вуглеводні залишки вже виявляються пов'язаними з ними. Згодом секретуються білки виявляються в просвіті апарату Гольджі, де відбувається модифікація їх вуглеводних ланцюжків, а потім вони переміщуються до специфічних внутрішньоклітинним органел або клітинних мембран або секретуються. Деякі білки перетинають одну мембрану, а потім заякориваются в іншій, сусідній мембрані, наприклад внутрішній мембрані мітохондрій.

2.2 Мембранна триггерная гіпотеза

У цій гіпотезі особливе значення надається ролі лидерной послідовності в зміні третинної структури самого білка. Відповідно до цієї гіпотези, лідерних послідовність індукує таку упаковку зазвичай гідрофобного інтегрального білка, що останній може залишатися солюбілізірованним у водному середовищі цитоплазми, де він синтезований. Мембранний ліпідний бішар є як би тригером по відношенню до третинної структурі білка - останній переходить в таку конформацію, яка забезпечує його переважне включення в бішар. Таким чином, білок зазнає якийсь перехід і сам вбудовується в мембрану таким способом, щоб встановити необхідну поперечну асиметрію. Відразу після вбудовування білка або його інтеграції лідерних послідовність відщеплюється. Тригерна гіпотеза не передбачає специфічної взаємодії між рибосомою і мембраною, але це ще не означає, що синтез білка не може відбуватися на мембранах. Можливо, в одній і тій же клітині діють обидва механізми.

3. Поліпептидні сигнали, що відповідають за сортування білків і

вбудова їх в мембрани

Про апарат і механізм перенесення майже нічого невідомо, трохи більше відомо про сигнальні послідовностях, присутніх у поліпептидів і напрямних кожен білок в потрібне місце. Успіхів у цій галузі вдалося досягти завдяки використанню техніки рекомбінантних ДНК. З її допомогою були сконструйовані гібридні поліпептиди, в які була включена тестуєма амінокислотна послідовність, що належить іншого білка. Таким чином можна було вивчати вплив передбачуваної сигнальної послідовності на локалізацію «білка-пасажира». Переваги такого підходу вдається використовувати тільки в тому випадку, якщо вся інформація, яка визначає локалізацію кінцевого продукту, укладена в первинній послідовності сигналу і якщо «білок-пасажир» є нейтральним учасником процесу і, що суттєво, підпорядковується сигналу. Ця умова виконується в багатьох випадках, але відомі і такі приклади, коли ефективність переносу або навіть кінцева локалізація залежать від «білка-пасажира». Якщо «білок-пасажир» знаходиться в конформації, не здатної до перенесення, то може відбуватися блокування переносу химерного білка. Крім того, функція деяких сигнальних послідовностей залежить від їх локалізації в поліпептидами від взаємодії з іншими ділянками поліпептидного ланцюга.

3.1 Сигнальна послідовність, що визначає вбудовування в

ендоплазматичний ретикулум

-конце имеется «короткоживущий» сигнальный пептид. У більшості білків, вбудованих в мембрану ендоплазматичного ретикулума або перетинають її, на N-кінці є «короткоживучий» сигнальний пептид. Це сигнальна послідовність безпосередньо взаємодіє принаймні з двома рецепторами, один з яких розчинний (сигнал-розпізнає частка), а інший знаходиться в мембрані. Можна було б очікувати, що амінокислотна послідовність цього сигнального пептиду буде дуже консервативною і приблизно однаковою у всіх переносимих білків, але очікування ці не виправдалися. Ці сигнальні ділянки не відрізняються сталістю ні щодо довжини, ні щодо амінокислотної послідовності, а численні досліди по мутагенезу показали, що вони можуть зазнавати значні структурні зміни. Дані про те, що сигнальні пептиди містять всю інформацію, необхідну для транспорту білків через мембрани ендоплазматичного ретикулуму чи всередині їх, ​​були отримані у дослідах з химерними поліпептидами. -концевой сигнальной последовательности к обычным цитоплазматическим белкам, например к глобину, приводило к тому, что они транспортировались в полость эндоплазматического ретикулума. Приєднання N-кінцевий сигнальної послідовності до звичайних цитоплазматическим білкам, наприклад до глобіну, призводило до того, що вони транспортувалися в порожнину ендоплазматичного ретикулуму.

-концевых сигнальных последовательностей три разных в структурном отношении участка: 1) положительно заряженный N -концевой участок ( n -участок); 2) центральное гидрофобное ядро из 7-15 остатков ( h -участок); 3) С-концевой участок (с-участок), который является полярным и содержит сайт, узнаваемый сигнальной пептидазой, которая находится на стороне эндоплазматического рутикулума, обращенной в полость. З точки зору «порівняльної анатомії» N-кінцевих сигнальних послідовностей три різні в структурному відношенні ділянки: 1) позитивно заряджений N-кінцевий ділянку (n-ділянка), 2) центральне гідрофобна ядро з 7-15 залишків (h-ділянка), 3 ) С-кінцевий ділянка (з-ділянка), який є полярним і містить сайт, впізнаваний сигнальної пептидаз, яка знаходиться на стороні ендоплазматичного рутікулума, оберненою в порожнину.

-конца мембранного белка. Від невеликих змін в сигнальних послідовностях залежить, чи буде «білок-пасажир» секретуватися в порожнину ендоплазматичного ретикулуму чи він залишиться прикріпленим до мембрани, і якою буде орієнтація N-кінця мембранного білка.

3.2 Стоп-сигнали перенесення

-концевых якорей в образовавшемся мембранном белке, характерно наличие относительно длинных гидрофобных участков. Для неотщепляемих сигнальних послідовностей, які грають роль N-кінцевих якорів в утворився мембранному білку, характерно наявність відносно довгих гідрофобних ділянок. Звідси випливає, що перенесення може зупинятися просто при наявності протяжного гідрофобного ділянки, який здатний утворити трансмембранну α-спіраль. На користь тассского припущення свідчать деякі експериментальні дані. , в норме секретирующегося через плазматическую мембрану, встраивали гидрофобные сегменты. Наприклад, за допомогою рекомбінантної ДНК в середню частину білка Є. coli, в нормі секретується через плазматичну мембрану, вбудовували гідрофобні сегменти. Якщо їх довжина була не менше 16 амінокислотних залишків, то транспорт білка блокувався, і він залишався приєднаним до плазматичної мембрани. Можна заперечити, що в даному випадку мова йде про бактеріальну системі, але все-таки механізми переносу в про-та еукаріотичних системах подібні. -белка вируса везикулярного стоматита с измененными мембранными доменами. Далі були сконструйовані варіанти G-білка вірусу везикулярного стоматиту зі зміненими мембранними доменами. Довжина гідрофобного сегмента могла становити не 20, а 8 залишків, при цьому поліпептид залишався трансмембранним, хоча транспорт в плазматичну мембрану блокувався. Таким чином, природа стоп-сигналу переносу точно не відома. Необхідно з'ясувати два питання: 1) чи беруть участь у зупинці перенесення специфічні білки апарату перенесення, 2) чи визначається зупинка перенесення гідрофобністю стоп-сигнал, або якимось більш тонкими чинниками? Було показано, що ділянки стоп-сигнальної послідовності, відповідальні за блокування переносу через ендоплазматичний ретикулум, можуть ніяк не впливати на транспорт через мембрану хлоропласта. Це означає, що згадані два процеси можуть істотно різнитися.

-конца; об этом свидетельствует поведение простых систем. Визначення старт-і стоп-сигналів на увазі лінійну схему переносу, що починається з N-кінця; про це свідчить поведінка простих систем. Однак виявилося, що послідовності, які блокують перенесення в одному випадку, можуть ініціювати його в іншому. Отже, важлива не тільки природа самих стоп-або старт-послідовностей, але і їхнє оточення в поліпептиди.

3.3 Використання синтетичних сигнальних пептидів

наружной мембраны и исследовано их взаимодействие с модельными фосфолипидными мембранами и везикулами Е. coli . Синтезовано пептиди, що відповідають сигнальної послідовності дикого типу, а також мутантні сигнальні пептиди білка LamB зовнішньої мембрани і досліджено їх взаємодію з модельними фосфоліпідних мембранами і везикулами Є. coli. перенос предшественников как периплазматичекого белка, так и белка наружной мембраны, а пептид, соответствующий мутантной сигнальной последовательности, дефектной по экспорту, не ингибирует перенос в бесклеточной системе. Показано, що пептид, відповідний сигнальної послідовності дикого типу, ефективно інгібує in vitro перенесення попередників як періплазматічекого білка, так і білка зовнішньої мембрани, а пептид, відповідний мутантної сигнальної послідовності, дефектної з експорту, не інгібує перенесення в безклітинних системі. Це означає, що сигнальні пептиди дізнаються якийсь загальний рецептор у цитозольної або мембранної фракції. Крім того, ефективність зв'язування цих пептидів з модельними мембранами (монослоем і бішару) корелює з їхньою здатністю служити сигналом переносу. Кореляція між гідрофобністю сигнальної послідовності і здатністю ініціювати транслокацію виявляється і при використанні попередника мальтозосвязивающего білка.

Ці дані узгоджуються з моделлю, згідно з якою первинна сигнальна послідовність визначає локалізацію поліпептидного попередника в мембрані шляхом неспецифічних взаємодій з ліпідного бішару, після чого здійснюється більш специфічне зв'язування з білковим рецептором. Подібна модель була запропонована для амфіфільних пептидних гормонів. Але сигнальний пептид в тваринних клітинах до його зв'язування з мембраною взаємодіє з якимось розчинною рецептором. Яке значення для сигнального пептиду має його здатність зв'язуватися з ліпідами - залишається неясним.

3.4 Сигнальні пептидази

-концевых сигнальных пептидов необходимы специфические белки. Для видалення тимчасових N-кінцевих сигнальних пептидів необхідні специфічні білки. . Найбільш повно охарактеризовано сигнальні протеази з Є. coli. содержат сигнальный пептид, который отщепляется на периплазматической поверхности внутренней мембраны с помощью лидер-пептидазы; ее структура представлена на рис.2. Більшість експортованих білків Є. coli містять сигнальний пептид, який відщеплюється на періплазматіческой поверхні внутрішньої мембрани за допомогою лідер-пептидази; її структура представлена ​​на рис.2.

Рис.2. . Передбачувана топологія лідер-пептидази з Є. coli.

Амінокислотні залишки пронумеровані. Прямокутниками позначені гідрофобні сегменти. Перший гідрофобну ділянку не був виявлений експериментально, висновок про його існування був зроблений виходячи з його гідрофобності. Наявність і орієнтація другий гідрофобного ділянки встановлено експериментально і, мабуть, він функціонує як внутрішня сигнальна послідовність. Третій гідрофобний сегмент має слабо виражений гідрофобний характер і є частиною періплазматіческого домену.

очищенный фермент мог функционировать, будучи включенным в липосомы. Для перенесення білків через внутрішню мембрану ця пептідаза не потрібна, але вона необхідна для вивільнення експортованого білка з цитоплазматичної мембрани. In vitro очищений фермент міг функціонувати, будучи включеним в ліпосоми. Специфічність розщеплення вельми висока, але не визначається виключно амінокислотною послідовністю поблизу сайту розщеплення. , что неудивительно, если учесть сходство сигнальных последовательностей. Сигнальна пептідаза, яка функціонує в ЕПР, має ту ж специфічність, що й відповідний фермент Є. coli, що не дивно, якщо врахувати схожість сигнальних послідовностей. Була очищена сигнальна пептідаза з мікросом еукаріот. Показано, що вона асоційована з іншими поліпептидами, можливо мають відношення до механізму переносу.

имеется вторая сигнальная пептидаза, участвующая в процессинге пролипопротеинов. У Е. coli є друга сигнальна пептідаза, що бере участь у процессингу проліпопротеінов. замечательны тем, что при созревании их N -конец модифицируется с помощью глицерида. Ці поліпептидні компоненти оболонки Є. coli чудові тим, що при дозріванні їх N-кінець модифікується за допомогою глицерида. Проліпопротеіновая сигнальна пептідаза також знаходиться на цитоплазматичній мембрані. Після відщеплення сигнальний пептид залишається в цитоплазматичній мембрані і руйнується за допомогою мембранозв'язаних ферментів протеази ΙV.

У мітохондріях і хлоропластах повинно бути присутні кілька сигнальних пептидаз, оскільки процесинг відбувається більш ніж в одному компартменте. Розчинну пептидаз з мітохондріального матриксу вдалося частково очистити, але охарактеризована вона не повністю.

4. Розчинні і мембранозв'язані білки, необхідні для

переносу

Ідентифіковано декілька цитозольних і мембранозв'язаних білкових компонентів, необхідних для перенесення. Найбільш детально охарактеризовано білкові фактори, які беруть участь у вбудовуванні білків в ендоплазматичний ретикулум ссавців (рис.3).

1. Сигнал-розпізнає частка (СРЧ). -РНК. Це розчинний рібонуклеопротеіновий комплекс, що складається з шести різних білків і молекули 7 S-РНК. СРЧ необхідна для ініціації переносу. Вона пов'язується з сигнальною послідовністю утворюється поліпептиду під час його синтезу на рибосомі. Для препролактіна, наприклад, константа дисоціації становить 1нм. За допомогою методу фотохімічного зшивання був ідентифікований один з поліпептидів (54 кДа), безпосередньо взаємодіє із сигнальною послідовністю попередника. За деякими даними, отриманими для безклітинних систем, зв'язування СРЧ інгібує трансляцію або викликає її затримку. Втім, не виключено, що цей феномен є артефактом, в усякому разі, як було показано на модельних дослідах, його не обов'язково залучати до пояснення кінетики переносу білків in . vivo. Одна з вірогідних функції СРЧ полягає в запобіганні неправильного згортання утворюється поліпептиду, яке може блокувати перенесення (наприклад, через екранування сигнальних послідовностей). Затримка трансляції повинна зменшувати ймовірність такого помилкового згортання і, отже, збільшувати ефективність переносу білків.

Рис.3. Схематичне зображення ранніх стадій котрансляціонного перенесення поліпептиду через ендоплазматичний ретикулум ссавців.

Сигнал-розпізнає частка і СРЧ-рецептор (стикового білок) добре охарактеризовані. Мембраносвязивающій сигнальний рецептор зображений як компонент каналу через мембрану, але існування таких каналів і роль сигнального рецептора не безперечні. Після утворення комплексу між сигнальним пептидом і мембранозв'язаних рецептором на стадії 3 СРЧ і стикувальний білок можуть диссоциировать і брати участь в новому циклі, залишаючи мембранозв'язаних рибосому і утворилася ланцюг приєднаними до апарату переносу.

Деякі невеликі білки (<8,5 кДа) транспортуються в ендоплазматичний ретикулум незалежно від СРЧ. лягушки, препромеллитин (оба они являются предшественниками секретируемых белков) и пробелок оболочки фага М13. У їх число входять препропептід GLa жаби, препромеллітін (обидва вони є попередниками секретується білків) і пробелок оболонки фага М13. У всіх цих прикладах конформація попередника така, що білки повинні залишатися здатними до перенесення навіть у відсутності СРЧ і рибосом.

2. Рецептор СРЧ, або стикувальний білок. Комплекс СРЧ / рибосома / утворюється поліпептидний ланцюг транспортується в шорсткий ендоплазматичний ретикулум, долаючи енергію сильної взаємодії між СРЧ, званим також стикувальним білком. -концом к мембране. Рецептор СРЧ містить субодиницю з молекулярною масою 73 кДа, приєднану N-кінцем до мембрани. Ймовірно, рибосома також зв'язується зі специфічними рецепторами, присутніми в мембрані.

3. Рецептор сигнальної послідовності. Сигнальна послідовність на утворюється поліпептидного ланцюга переміщується від СРЧ до другого рецептору, що знаходиться в мембрані і званому рецептором сигнальної послідовності. Про це свідчать результати дослідів по фотохимическому зшивання, в яких використовується мітка, пов'язана з сигнальною послідовністю препролактіна. Передбачуваний мембранозв'язаних рецептор є глікопротеїн з молекулярною масою 35 кДа. Можливо, він становить частину каналу, через який здійснюється перенесення. За допомогою такого ж підходу з використанням поперечної зшивки і синтетичного сигнального пептиду був виявлений ще один кандидат на роль рецептора сигнальної послідовності (45 кДа). Зв'язок між цими двома білками невідома і функції їх до кінця не встановлені. Як тільки утворилася поліпептидний ланцюг зв'язується з мембранозв'язаних рецепторм, СРЧ і її рецептор можуть звільнитися від рибосоми і взяти участь в новому циклі. Про передбачуваний каналі, що бере участь в перенесенні, нічого невідомо, очищення його є досить складним завданням.

5. Збірка мультісуб'едінічних комплексів та оновлення

мембранних білків

Після вбудовування мембранного поліпептиду в мембрану він ще повинен придбати правильну конформацію, що забезпечує його біологічну активність, а якщо мова йде про мультісуб'едінічних комплексах, то зв'язатися з іншими білками. Зокрема, у еукаріотів при цьому повинні відбутися різні ковалентні модифікації, наприклад глікозилювання, ацилювання, сульфування або утворення дисульфідних зв'язків. Навіть коли такі модифікації не є необхідними, процес конформаційного дозрівання може бути повільним і відстояти за часом від вбудовування в мембрану.

четко наблюдается сборка стабильных тримеров обоих белков, LamB и OmpF , после включения соответствующих мономеров в наружную мембрану, при этом созревание LamB занимает около 5 мин. Наприклад, у Є. coli чітко спостерігається збірка стабільних тримерів обох білків, LamB і OmpF, після включення відповідних мономерів в зовнішню мембрану, при цьому дозрівання LamB займає близько 5 хв. В еукаріотичних клітинах глікопротеїн гемаглютиніну вірусу грипу, перш ніж потрапити з ендоплазматичного ретикулума в комплекс Гольджі, повинен сформувати правильну четвертинну структуру, відповідну зрілої формі. Несвернутие молекули гемаглютиніну залишаються в ЕПР. Освіта тримерів займає приблизно 7-10 хв. -белка вируса везикулярного стоматита. Схожа олігомеризація спостерігається також для G-білка вірусу везикулярного стоматиту.

Збірка багатьох субодиничні комплексів, що містять різні субодиниці, теж, мабуть, відбувається в ЕПР. Прикладом служить нікотинових ацетилхолінових рецепторів, який містить дві α-субодиниці і по одній β-, γ-і δ-субодиниці (рис.4).

Рис.4. Модель каналу нікотинового ацетилхолінового рецептора.

Показані загальний вид каналу та його розташування в мембрані, відмічені ділянки глікозилювання із зовнішньої сторони і місця зв'язування ацетилхоліну на α-субодиниць.

За допомогою антитіл можна розрізнити окремі форми α-субодиниці: 1) початковий продукт, вбудовується в ендоплазматичний ретикулум; ця форма не може пов'язувати антагоніст α-бунгаротоксін; 2) форма, здатна зв'язуватися з α-бунгаротоксіном і що настає через кілька хвилин після завершення трансляції в ЕПР; 3) зріла рецептор, що містить всі субодиниці (α ₂ βγδ), який виявляється через 15хв після завершення трансляції в ЕПР; 4) готовий рецептор на клітинній поверхні, що з'являється через приблизно 2ч після трансляції. Дозрівання включає утворення дисульфідних зв'язків, олігосахаридних процесинг і ацилювання за участю жирних кислот. Ймовірно, певну роль в збірці, яка відбувається у комплексі Гольджі, грає фосфорилювання субодиниць.

Вирішальним чинником процесу складання є, ймовірно, стабільність таких стехіометричних комплексів, як ацетилхолінових рецепторів. Мабуть, у деяких системах окремі субодиниці синтезуються в значному надлишку і не утворюють стабільних комплексів, а піддаються протеолитическому розщеплення.

-канал. Вивчався також процес дозрівання і збирання структури, що утворює Na-канал. Необхідною умовою дозрівання є утворення дисульфідній зв'язку між α-і β _{2-субодиницями,} однак, ця подія відбувається через приблизно 1ч після трансляції і транспорту субодиниць в апарат Гольджі, а рецептор з'являється на клітинній поверхні через 4ч після трансляції. У цьому випадку вільні α-субодиниці не піддаються швидкої деградації, а зберігаються в міжклітинному пулі і, можливо, використовуються надалі як попередників для формування каналу в зростаючих нейронах.

Дозрілі мембранні білки піддаються безперервного оновлення. -канала составляет около 30ч, что типично для поверхностных белков. Період полуобновленія Na-каналу складає близько 30ч, що типово для поверхневих білків. /К-АТРазы в растущих клетках в культуре происходит за время 20-40ч. Оновлення великої субодиниці Na / К-АТРази у зростаючих клітинах в культурі відбувається за час 20-40ч. Мабуть, деградація принаймні деяких білків відбувається в лізосомах.

Приклади поновлення мембранних білків

Стабільність білків у клітині визначається безліччю різних факторів. Особливо цікавим прикладом деградації мембранних білків є гідроксиметилглутарил-СоА-редуктаза. Цей фермент знаходиться в гладкому ЕПР і регулює ендогенний синтез холестеролу. Деградація його відбувається досить швидко (~ 2-4ч) і прискорюється при взаємодії з холестеролом. Для прискорення процесу необхідна наявність мембранозв'язаних домену ферменту. За певних умов у культурі ооцитів китайського хом'ячка спостерігається сверхпродукція (більше 500раз) цього ферменту. У результаті утворюються мембранні трубочки, що займають 15% клітинного об'єму і містять інші мембранні білки, а також ліпіди. Додавання холестеролу призводить до швидкої деградації надлишку мембран, що говорить про координацію синтезу і деградації мембранних компонентів.

или Q _В ) с молекулярной массой 32 кДа из тилакоидов хлоропластов. Іншим цікавим прикладом селективного метаболізму мембранних білків є гербіцідсвязивающій білок (званий також білком Dl або Q _В) з молекулярної масою 32 кДа з тилакоїдів хлоропластів. Цей білок синтезується як попередник, дозріваючи всередині окремих ламелл тилакоїди, не зібраних в грани, і є частиною фотосистеми ΙΙ в ламелами, що входять до грани. На світлі швидкість деградації цього поліпептиду в мембрані набагато вище, ніж інших білків. Причина цього явища невідома, можливо, воно пов'язане з тим, що у фотосистемі ΙΙ на світлі відбуваються якісь пошкодження.

Висновки

Клітини еукаріот містять багато мембранних органел і безліч різних внутрішньоклітинних мембран, кожна з яких володіє унікальним білковим складом. Будь-який мембранний білок, інформація про синтез якого укладена в ядрі, повинен безпомилково доставлятися від місця синтезу на рибосомі, що знаходиться в цитоплазмі, до місця призначення. Для цього використовується складна система сигнальних послідовностей, що містяться в будь-якій зрілій формі поліпептиду або попередника, а також рецептори всередині клітини, здатні ці сигнали розпізнати. Деякі мембранні білки включаються в ліпідний бішар мимоволі, але в більшості випадків правильна збірка білку всередині клітинної мембрани є енергозалежною процесом, який здійснюється за допомогою спеціалізованого апарату. Мабуть, білки не можуть включитися в клітинну мембрану до тих пір, поки вони не набудуть частково розгорнуту конформацію. Розгортання білків або підтримання їх в розгорнутій конформації, необхідної для перенесення, можливо, здійснюються за участю АТР і специфічних білків у цитоплазмі.

Література

1. Генніс Р. біомембрани: Молекулярна структура та функції: Пер. з англ. - М.: Світ, 1997.

2. Марі Р., Греннер Д., Мейес П., Родуелл В. Біохімія людини: У 2-х томах. Т.2. Пер. з англ. - М.: Світ, 1993.

3. Мецлер Д. Біохімія. Хімічні реакції в живій клітині: Пер. з англ. - М.: Світ, 1980.

4. Страйер Л. Біохімія: Пер. з англ. - М.: Світ, 1984. - Т.1.