Аеробні енергетичні процеси
По відношенню до молекулярного кисню організми поділяються на аеробів і анаеробів. У свою чергу, аероби і анаероби поділяються на облігатні і факультативні. Деякі облігатні аероби можуть існувати при вмісті кисню, що дорівнює його вмісту в атмосфері або перевищує цю величину, але зустрічаються ті, які не переносять рівень кисню, що перевищує кілька відсотків. У свою чергу, деякі анаероби, хоча і не використовують кисень, але переносять його високі концентрації в навколишньому середовищі. Ряд мікроорганізмів може різко міняти чутливість до кисню в залежності від типу харчування, наприклад водневі бактерії при вирощуванні в гетеротрофних умовах аеротолерангни, а в автотрофних - мікроаерофільні.
Аеробне дихання. Дихальна ланцюг
При аеробному диханні в якості кінцевого акцептора електронів використовується молекулярний кисень. Аеробне дихання характерне для більшості тварин і рослин і широко поширене в світі прокаріотів. На першому його етапі основний субстрат дихання - відновлений NAD - утворюється в результаті катаболізму цукрів, органічних кислот, амінокислот і інших субстратів у процесі функціонування метаболічних шляхів, які прямо не залежать від присутності кисню і можуть здійснюватися в анаеробних умовах. До них відносяться гліколіз і інші шляхи метаболізму Сахаров, цикл три-карбонових кислот, системи окислення жирних кислот і ін Отриманий в результаті дегідрування субстратів NADH частково використовується в конструктивних процесах, а в основному окислюється через дихальний ланцюг.
Природу компонентів дихального ланцюга і порядок їх розташування визначали хімічними, фізико-хімічними та біохімічними методами, серед яких важливе місце займають диференціальна спектрофотометрія і інгібіторний аналіз. Їх поєднання дозволяє визначити, які саме компоненти беруть участь в окисленні даного субстрату і яка послідовність їх розташування в дихальному ланцюзі.
Специфічними інгібіторами дихання служать наступні речовини:
інгібітори NADH-дегідрогенази: барбітурати, ротеноном;
інгібітор цитохром-с-редуктази: антіміцін А;
інгібітори цитохромоксидази.
Проте існує і ціанід-резистентне дихання.
Блокування перенесення електронів інгібітором призводить до того, що переносники, що знаходяться на ділянці, що передує інгібіруемому, переходять в відновлене стан, тоді як переносники, що знаходяться після інгібіруемого ділянки, переходять в окислене стан.
На відміну від мітохондрій, склад дихального ланцюга у прокаріот часто залежить не тільки від виду мікроорганізму, але й від типу її харчування, а також від вмісту кисню в газовій фазі. Прикладом може служити дихальна ланцюг Escherichia coli.
Зворотний перенос електронів
У тих випадках, коли окислювані субстрати - донори електронів і протонів мають високий окисно-відновний потенціал, вони включаються в дихальний ланцюг на рівні цитохромної ланки. Це призводить до того, що, по-перше, в дихальному ланцюзі залишається тільки один пункт сполучення, і для забезпечення енергетичних потреб клітини вона повинна функціонувати з високою швидкістю. По-друге, для відновлення NADP використовується зворотний перенос електронів за рахунок ТЕП, створюваного на цітохромоксідазном ділянці.
Еволюція шляхів аеробного метаболізму
Системи дихання сучасних організмів є продуктом тривалої еволюції життя від анаеробних до аеробних умов. Прийнято вважати, що первинна атмосфера Землі носила відновлювальний характер і практично не містила кисню. У неї входили такі гази як С0 2, СН 4, N 2, NH 3, Н 2 і деякі інші - в менших кількостях. Тому перші живі організми, швидше за все, були анаеробами.
Основна маса кисню утворилася, мабуть, в результаті життєдіяльності фотосинтезуючих організмів. Перші аеробні мікроорганізми могли з'явитися на Землі близько 2 млрд років тому згідно з послідовністю, відображеної на схемі:
Анаероби -> фототрофи - ► аеротолеранти -> аероби -> аероби.
На початкових етапах еволюції організми змушені були захищатися від окислювального дії кисню і, ймовірно, не мали здатність запасати енергію, що виділяється при окисленні субстратів за участю кисню. Захист могла здійснюватися двома основними шляхами: пасивним, тобто переходом в екологічні ніші, де кисень відсутній, і активним - детоксикацією кисню. Системи детоксикації збереглися і у сучасних організмів.
Одним із найбільш токсичних продуктів відновлення кисню є супероксидний аніон-радикал, що утворюється при одно електронної реакції
Такі аніон-радикали можуть виникати в результаті багатьох метаболічних реакцій: при взаємодії з киснем компонентів дихального і фотосинтетичної ланцюгів, а також абиогенно в результаті фото-і електрохімічних процесів у водному середовищі. Час життя супероксидних аніонів відносно велике, вони можуть проникати в клітини і перетворюватися в інші токсичні продукти: гідроксильні радикали і синглетний кисень
Радикал ОН утворюється також при радіаційному розкладанні води і є найсильнішим з усіх відомих окислювачів. Щодо синглетного кисню потрібно відзначити, що в нормі електронні оболонки атома кисню знаходяться в стабільному стані, проте при порушенні атом кисню може переходити в синглетное стан з підвищеною реакційною здатністю, яке виникає і при дисмутації супероксидного аніона:
2'0 2 »+ 2Н + -> * 0 2 + Н 2 0 2.
Таким чином, клітці і в сучасних умовах необхідні захисні механізми для детоксикації як супероксид-аніону, так і інших форм «активного» кисню.
Основними захисними ферментами є супероксиддисмутазноі-мутаза, каталаза і пероксидаза. Супероксиддисмутаза каталізує реакцію з утворенням збудженому, триплетного кисню:
20 лютого - + 2Н + -> 0 2 + Н 2 0 2.
Деякі клітинні пігменти також відіграють захисну роль, «перехоплюючи» синглетний кисень.
Тільки після вироблення систем захисту еволюція могла приступити до створення систем, які дозволили б утилізувати енергію, отриману при окисленні субстратів за участю кисню. Результатом такої еволюції і є сучасні дихальні системи.
Найбільш поширеним способом отримання енергії в анаеробних умовах є різні види бродінь. У разі тварин і рослинних клітин це гліколіз, у прокаріот типи бродінь значно різноманітніші.
І гліколіз, і деякі інші анаеробні процеси дисиміляції є лише підготовчими етапами для подальших аеробних процесів отримання енергії, і, як правило, тварини і рослинні клітини не можуть рости тільки за рахунок анаеробних процесів катаболізму. Серед прокаріотів, навпаки, існує безліч облігатно анаеробних форм, здатних рости тільки за рахунок анаеробних способів отримання енергії. Ми послідовно розглянемо головні типи анаеробних енергетичних процесів: анаеробне дихання, безкисневий фотосинтез і різні види бродінь.
Анаеробне дихання
Механізм цього процесу подібний з аеробним диханням і також використовує ланцюг перенесення електронів. Проте кінцевим акцептором електронів служить не кисень, а інші неорганічні або органічні речовини. У залежності від природи кінцевого акцептора розрізняють нітратне, сульфатне, карбонатна, фумаратное типи дихання та ін
Нітратне дихання. Від нітратного дихання слід відрізняти асиміляційну нітратредукція, яка може відбуватися як в аеробних, так і в анаеробних умовах і служить для отримання амонійній форми азоту, використовуваної в конструктивних процесах. Цей процес здійснюється «розчинними» ферментами: нітратредуктази і нітритредуктази і не пов'язаний з запасанием енергії. У процесі асиміляційну нітратредук-ції не утворюється летючих продуктів:
Нітратним диханням, або денітрифікацією, називається дис-сіміляціонная нітратредукція, що приводить до утворення молекулярного азоту за участю ланцюга перенесення електронів і супроводжується запасанием енергії. У цьому випадку ферменти локалізовані в мембрані:
Повністю цей процес протікає у бактерій-денітрифікатори, тоді як у Escherichia coli та деяких інших бактерій здійснюється тільки перша стадія дінітріфікаціі, що призводить до накопичення в середовищі нітритів. Денітрифікатори, як правило, є факультативними анаеробами, і кисень пригнічує Дисиміляційна нітратредукція. Денітрифікація призводить до великих втрат азотних добрив з грунту, тому для придушення денітрифікації грунт необхідно рихлити.
Отриманий аденозин-5'-фосфосульфат повторно активується АТР:
Сульфатне дихання. Як і у випадку нітратредукції існує асиміляційна сульфатредукции, при якій сульфат відновлюється до сульфіду з подальшим використанням у конструктивних процесах. Першою стадією є активація сульфату:
Двічі «активоване 3-фосфоаденозін-5-фосфосульфат піддається відновленню спочатку до сульфіту, а потім до сульфіду. Такий шлях відновлення сульфату притаманний широкому колу організмів.
При Діссіміляціонний сул'фатредукціі або сульфатної диханні на першому етапі також утворюється APS, який прямо відновлюється до сульфіту, а потім у різних організмів відбувається або одноступінчаста, або триступеневе відновлення сульфіту до сульфіду.
Виявлено три типи сульфітредуктаз, містять особливий гем - сірогем. Інші сульфітредуктази містять цитохроми. При використанні в якості донора електронів молекулярного водню, а для конструктивних процесів - органічних речовин Сульфат бактерії ростуть як хемолітогетеротрофи з утворенням на 1 моль сульфату 3 молей АТР, частина яких витрачається на активацію сульфату. Життєдіяльність таких бактерії в природних умовах призводить до накопичення значних кількостей сірководню, який може окислюватися, утворюючи відкладення сірки. Ці бактерії викликають також анаеробну корозію металів.
Карбонатна дихання. При карбонатному диханні в якості кінцевого акцептора електронів використовується С0 2:
4Н 2 + С0 2 -> СН 4 + 2Н 2 0.
SHAPE \ * MERGEFORMAT
Як показано дослідами з радіоізотопами, С0 2 акцептує від водню тільки електрони так як водень метану відбувається з води. Процес відновлення протікає східчасто з використанням ланцюга перенесення електронів, що включає дегідрогенази, редуктази і переносники електронів, що містять цитохроми
Карбонатна дихання характерне для метанових бактерій, що відносяться до архей. Багато з них можуть використовувати С0 3 в якості єдиного джерела вуглецю, тобто існувати хемолітоавтотрофно. Вони є облігатними строгими анаеробами. Показано утворення АТР у процесі відновлення С0 2 до метану, але стехіометрія процесу не відома. У природних умовах метанові бактерії утворюють метан у водоймищах і болотах, причому в деяких полярних морях є відкладення метану як кристаллогидрата. Метанові бактерії - один з головних компонентів систем очищення стічних вод. Вони мешкають також в рубці жуйних тварин.
Бродіння
Бродіння - це такий тип енергетичних процесів, при якому речовини, котрі піддаються хімічним перетворенням, самі служать донорами і акцепторами електронів. Молекулярний кисень в цих процесах не бере участь. Звідси перше визначення бродінь, дане відомим французьким мікробіологом Л. Пастером: «Бродіння - це життя без повітря".
Запасання енергії при бродіння відбувається або шляхом субстратного фосфорилювання з утворенням макроергічних сполук, або шляхом формування ТЕП за рахунок екскреції неорганічних іонів або кислих продуктів бродіння. Незважаючи на велику різноманітність типів бродінь, які зазвичай отримують назву по головному кінцевого продукту (спиртове, молочнокисле, маслянокислое, пропіоновокислі, муравьінокіслое, ацетон-бутилового і т.д.), субстратних фосфорилювання здійснюється в обмеженій кількості типових реакцій.
Поряд з субстратною фосфорилюванням запасання енергії в процесах бродіння може здійснюватися шляхом формування ТЕП. Так, деякі облігатно анаеробні бактерії, що здійснюють бродіння з утворенням метілмалоніл-СоА, здатні формувати градієнт іонів Na + у процесі декарбоксилювання цієї сполуки в пропіоніл-СоА.
Іншим прикладом служить формування градієнта Н + в процесі екскреції кислих продуктів бродіння. Разом з аніоном лактату через мембрану транслоціруются два протони. Процес може тривати до тих пір, поки концентрації лактату в середовищі й у клітці не зрівняються. У результаті створюється ТЕП, який надалі може використовуватися на енергетичні потреби клітини.
Фотосинтез
До цих пір ми розглядали організми, які для забезпечення конструктивних процесів використовують енергію хімічних зв'язків органічних або неорганічних речовин. Інша велика група організмів здатна забезпечувати конструктивний метаболізм за рахунок світлової енергії в процесі, який отримав назву фотосинтез. Отже, фотосинтез - це процес використання енергії світлового випромінювання для побудови живого речовини. Освіта АТР в процесі фотосинтезу називають фотофосфорілірованіем.
Основні процеси фотосинтезу, донори електронів
Окислювально-відновний потенціал системи відновників фотосинтетичного ланцюга повинен бути нижче -400 мВ. Звичайні донори електронів, використовувані у фотосинтезі, не володіють таким низьким потенціалом, тому для відновлення X необхідний зворотний перенос електронів від молекули
пігменту за рахунок енергії світла. Донор електронів потім заповнює їх дефіцит в молекулі пігменту. Іншу ділянку, на якому затрачається енергія світла, - ресинтез АТР, що витрачається для «активування» продуктів фіксації С0 Г
У випадку вищих рослин і ціанобактерій донором електронів є вода, в результаті чого з неї звільняється кисень, тобто фотосинтез в цьому випадку є кисневим, або оксигену. Основними типами метаболізму тут є фотолітоавтотрофія або фотолітогетеротрофія:
С0 2 + 2Н 2 0 - у + Н 2 0 + 0 2.
Таким чином, фотосинтез рослинного і бактеріального типу розрізняється по: природі пігментів; використання донорів електронів; здібності до виділення кисню.
Шлях вуглецю у фотосинтезі. Цикл Кальвіна
Включення С0 2 в конструктивний метаболізм у фототрофів здійснюється в послідовності реакцій. Вона називається циклом автотрофної фіксації вуглекислоти, чи циклом Кальвіна, який схожий з пентозофосфатному циклом катаболізму цукрів у хемоорганогетеротрофов. Наведемо сумарне рівняння цих реакцій:
6С0 2 + 18 АТР + 12 NADPH + 12Н + -> С 6 Н 12 0 6 + 18ADP + 12NADP +.
Для синтезу однієї молекули глюкози тут потрібно 6 «обертів» циклу. У циклі Кальвіна, в порівнянні з пентози-фосфатним циклом, для регенерації акцептора С0 2 необхідні дві додаткові реакції:
Подальша послідовність реакцій є «звернення» гліколізу, де в якості відновника використовується NADPH, що призводить до утворення глюкози.
Аналогічний цикл фіксації С0 2 функціонує у хемолі-тоавтотрофних бактерій.
У рослин початкові ферменти циклу Кальвіна локалізовані в хлоропластах. У клітинах фототрофних бактерій рібулозоді-фосфаткарбоксілаза знайдена в карбоксісомах, хоча не виключено, що там вона перебуває в латентному стані.
У процесі функціонування цикл Кальвіна піддається суворої метаболічної регуляції. Особливо тонко регулюється активність фосфорібулокінази, зокрема, чутливої до енергетичного заряду клітини і до ступеня восстановленности NAD. Цикл працює ефективно тільки в умовах нормального постачання енергією і відновниками.
Бесхлорофільний фотосинтез
Особливий тип фотосинтезу - без участі хлорофільних пігментів - виявлений у екстремально галофільних архей. Це єдиний тип фотосинтезу, що не включає електрон-транспортний ланцюг. Клітини галобактерій містять особливий білок - бактеріородопсин, що включає каротиноід - ретиналь. Спільно з фосфоліпідами бактеріородопсин формує так звані фіолетові мембрани, які у вигляді бляшок покривають до 50% поверхні клітин. Під дією світла бактеріородопсин транслоцірует протони з цитоплазми в навколишнє середовище, створюючи протонний ТЕП, який за допомогою Н +-АТРсін-тетази перетвориться в АТР.
Система автотрофної фіксації С0 2 у галобактерій не виявлена, мабуть, вони існують як фотоорганогетеротрофи.
Фоторецепції
На відміну від фотосинтезу в процесі фоторецепції енергія світла запасається не у вигляді макроергічних сполук або ТЕП, а у вигляді інформації, що виражається в хімічних перетвореннях фоторецептора. Далі ці зміни перетворюються або в нервовий імпульс, або в той чи інший вид сигналу. Найчастіше фоторецепторами є каротиноїди або тетрапірроли. Іноді на цю роль претендують Флавін. Бактеріородопсин і деякі ферменти-фоторецептори використовуються в так званій «безсрібного» фотографії, де зображення проявляється за рахунок хімічних змін фоторецептора при дії світла.
Процеси конструктивного метаболізму
У попередніх розділах нами розглянуті способи та механізми акумуляції і трансформації енергії в клітині. Тепер коротко зупинимося на основних шляхах побудови речовини клітин, що включає як низькомолекулярні, так і високомолекулярні продукти. У фундаментальних курсах біохімії докладно викладаються схеми метаболічних шляхів, тому ми розглянемо лише деякі принципові закономірності організацію конструктивних процесів, звані також реакціями анаболізму.
Взаємозв'язок енергетичних і конструктивних процесів у клітині
Взаємозв'язок між реакціями, в результаті яких енергія виділяється і може бути запасена в клітці, і тими, в яких вона витрачається на побудову речовин клітини, зручніше за все розглянути на прикладі метаболізму глюкози, найчастіше виступають як «енергодающіх» субстратів. При цьому потрібно мати на увазі дві обставини. Перше: у клітці насправді не існує різкого розмежування енергетичних і конструктивних процесів. Як правило, в результаті реакцій катаболізму утворюються такі проміжні продукти, які можуть «підхоплюватися» ферментами анаболізму і використовуватися для побудови речовин клітини. Друге: в живій клітині широко застосовується принцип організації біохімічних процесів у вигляді метаболічних циклів, коли початковий і кінцевий компоненти в реакції ідентичні і цикли можуть функціонувати невизначено тривалий час за умови припливу субстратів і відтоку продуктів.
Розглянемо приклад, коли основним джерелом енергії і вуглецю служить глюкоза або містять глюкозу полісахариди. Послідовність протікають реакцій зображена на рис. 26.
Утилізація полісахаридів починається з їх гідролізу. Гідроліз за участю амілаз призводить до утворення олігосахаридів і вільних Сахаров, які за допомогою фосфорілази перетворюються на фосфорні ефіри Сахаров. У разі глюкози це найчастіше глюкозо-6-фосфат. Гідроліз за участю фосфорілази одразу призводить до утворення фосфосахаров. Зворотна реакція - синтез полісахаридів - типовий анаболічний процес, що протікає з витратою енергії, сенс якого або в освіті запасних речовин, або у синтезі структурних полісахаридів. У цих випадках проміжно утворюються похідні Сахаров і нуклеотидів. Фосфорилювання вільної глюкози каталізується гексокінази. Цей процес - перший етап гліколізу, де в результаті через проміжний синтез тріозофосфатов утворюється піруват. Він же виходить і при функціонуванні пентозофосфатного циклу, або пентозофосфатного шунта, біосинтетичні значення якого полягає, зокрема, в синтезі пентоз. Подальші перетворення пірувату призводять або до синтезу аланіну, або до утворення ацетил, «живить» цикл трикарбонових кислот, значення якого розглянемо докладніше трохи пізніше. При наявності готового аланіну з нього під дією відповідної дезамінази знову утворюється піруват, що вступає в катаболические процеси. Ацетил-СоА може вступати на шлях синтезу жирних кислот, що приводить, в кінцевому рахунку, до утворення ліпідів. У свою чергу, катаболізм ліпідів супроводжується їх гідролізом із звільненням жирних кислот, які далі деградують до ацетил-СоА. Таким чином, ацетил-СоА знаходиться в центрі як катаболічних, так і анаболічних перетворень багатьох субстратів, зокрема вуглеводів і ліпідів. Для завершення процесу окислення жирних кислот ацетільние залишки, які утворюються в результаті їх р-окислення, необхідно також окислити. Це здійснюється в ході ЦТК.
Уявлення про цикл трикарбонових кислот сформульовані X. Кребсом в 1937 р. ЦТК виконує дві важливі задачі: 1) повне окислювання багатьох субстратів, що забезпечує клітину енергією, і 2) забезпечення проміжних продуктів для синтезу низки клітинних компонентів, зокрема амінокислот - аспарагінової та глутамінової кислот, одержуваних прямим амінування кетокислот: окса -лоацетата і 2-оксоглутарата. З них шляхом переамінування можуть бути отримані багато інші амінокислоти, і в кінцевому рахунку - білки.
Повертаючись до неможливості строгого поділу конструктивних і енергетичних процесів, відзначимо, що відносні вклади гліколізу і ЦТК в енергетику і біосинтезу залежать від швидкості росту організму. Ізотопні дослідження показали, що при високій швидкості росту Escherichia coli на середовищі з глюкозою ЦТК забезпечує біосинтезу, тоді як гліколіз виконує чисто енергетичну роль. При уповільненні швидкості зростання їх ролі міняються: основна енергетична функція належить ЦТК, а гліколіз використовується для глікогенеза, забезпечуючи синтез і запасання полісахаридів в клітці. Такі шляхи метаболізму, що грають як енергетичну, так і конструктивну роль, прийнято називати амфіболічні.
Завершуючи розгляд схеми на рис. 26, відзначимо, що ЦТК вносить внесок у синтез всіх найважливіших біополімерів клітини, в тому числі в синтез нуклеїнових кислот, через утворення пири-мідінов і пуринів. Синтез пуринів здійснюється за участю пентозофосфатного шунта, але частина атомів вуглецевого скелета пуринів відбувається з амінокислот: аспарагінової та глутамінової кислот, а також Форміат. Цукрова частина нуклеотидів відбувається з пентое, також утворюються в пентозофосфатному циклі. Піримідин можуть застосовуватися і в енергетичних процесах; їх катаболізм протікає через освіту метілмалоніл-СоА, в кінцевому рахунку включається до ЦТК.
Шляхи синтезу цих та інших компонентів клітини докладно викладені у фундаментальних курсах біохімії. На деяких закономірності синтезу біополімерів і механізмах регулювання цих процесів ми зупинимося в наступних розділах, а тут розглянемо має надзвичайно важливе для конструктивного метаболізму значення процес азотфіксації.
Фіксація азоту
Азот відноситься до чотирьох елементів складають основу живої речовини. Однак переважна маса азоту в біосфері представлена хімічно інертним молекулярним азотом атмосфери. Переклад його у форму, доступну для живих організмів, можливий трьома основними шляхами.
1. Освіта оксидів азоту під впливом електричних розрядів в атмосфері - важко піддається кількісному обліку, але навряд чи грає істотну роль в сучасних умовах.
2. Освіта аміаку та окислів азоту в хімічних реакціях в результаті техногенних процесів, здійснюваних людиною і що лежать в основі виробництва азотних добрив. За різними оцінками досягається зв'язування близько 4 • 10 7 т азоту в рік.
3. Фіксація азоту клітинами бактерій, яка, як не дивно, приблизно на порядок перевищує результати, досягнуті людиною у найдосконаліших хімічних виробництвах - 2 • 10 8 т азоту в рік. Таким чином, спільна діяльність мікроорганізмів призводить до зв'язування щорічно до 300 кг азоту на гектар грунту.
Фіксація азоту бактеріями відкрита С.М. Виноградским в 1883 р. на прикладі виділених з грунту бактерій, названих ним на честь Л. Пастера Clostridium pasteurianum.
Фіксувати азот, тобто перетворювати молекулярний азот у амонійний, здатні тільки прокаріоти, і серед них це властивість поширена досить широко. Процес надзвичайно енергоємний: для відновлення 1 молекули N 2 необхідно затратити 12 молекул АТР, інакше кажучи, для асиміляції 1 мг азоту Clostridium переробляє 500 мг глюкози.
Аеотфіксація здійснюється за допомогою ферменту нітрогенази, яка складається з двох компонентів: малого і великого. Деякі нітрогенази замість або разом з молібденом містять ванадій.
Для функціонування нітрогенази необхідні АТР, іони Mg 2 + та і відновлювач з низьким окислювально-відновним потенціалом.
Для відновлення молекули азоту необхідне перенесення шести електронів, але за один цикл не може бути перенесено більше двох електронів, тому процес протікає не менш ніж у трьох послідовних стадіях:
При швидкої зупинки реакції з інкубаційної суміші вдалося виділити гідразин. Мабуть, проміжні продукти залишаються міцно пов'язаними з нітрогеназой, яка здатна відновлювати і ряд інших сполук:
Здатність нітрогенази відновлювати ацетилен в етилен дозволила розробити простий метод визначення нітрогенази-ної активності, вельми чутливою до кисню, за рахунок чого азотфіксація відбувається або у облігатно і факультативно анаеробних бактерій, або в анаеробних ділянках клітини аеробних бактерій. У Rhizobium азотфіксація відбувається в бульбочках, що утворюються на коренях бобових рослин після «зараження» рослин цими бактеріями. При цьому клітини бактерій сильно видозмінюються, перетворюючись на так звані бактероїди, а рослини починають синтезувати особливий гемоглобін, якому приписується здатність захищати нітрогенази від надлишку кисню. Відомий також симбіоз покритонасінних рослин з азотфіксуючих-ські актиноміцетами, а голонасінних і папоротей - з ціанобактеріями. Врожайність злакових помітно підвищується в асоціації з бактеріями-азотфиксаторами роду Azospirillum. Азот-фіксуючі штами Klebsiella виявлені в кишечнику жителів Нової Гвінеї.
По відношенню до молекулярного кисню організми поділяються на аеробів і анаеробів. У свою чергу, аероби і анаероби поділяються на облігатні і факультативні. Деякі облігатні аероби можуть існувати при вмісті кисню, що дорівнює його вмісту в атмосфері або перевищує цю величину, але зустрічаються ті, які не переносять рівень кисню, що перевищує кілька відсотків. У свою чергу, деякі анаероби, хоча і не використовують кисень, але переносять його високі концентрації в навколишньому середовищі. Ряд мікроорганізмів може різко міняти чутливість до кисню в залежності від типу харчування, наприклад водневі бактерії при вирощуванні в гетеротрофних умовах аеротолерангни, а в автотрофних - мікроаерофільні.
Аеробне дихання. Дихальна ланцюг
При аеробному диханні в якості кінцевого акцептора електронів використовується молекулярний кисень. Аеробне дихання характерне для більшості тварин і рослин і широко поширене в світі прокаріотів. На першому його етапі основний субстрат дихання - відновлений NAD - утворюється в результаті катаболізму цукрів, органічних кислот, амінокислот і інших субстратів у процесі функціонування метаболічних шляхів, які прямо не залежать від присутності кисню і можуть здійснюватися в анаеробних умовах. До них відносяться гліколіз і інші шляхи метаболізму Сахаров, цикл три-карбонових кислот, системи окислення жирних кислот і ін Отриманий в результаті дегідрування субстратів NADH частково використовується в конструктивних процесах, а в основному окислюється через дихальний ланцюг.
Природу компонентів дихального ланцюга і порядок їх розташування визначали хімічними, фізико-хімічними та біохімічними методами, серед яких важливе місце займають диференціальна спектрофотометрія і інгібіторний аналіз. Їх поєднання дозволяє визначити, які саме компоненти беруть участь в окисленні даного субстрату і яка послідовність їх розташування в дихальному ланцюзі.
Специфічними інгібіторами дихання служать наступні речовини:
інгібітори NADH-дегідрогенази: барбітурати, ротеноном;
інгібітор цитохром-с-редуктази: антіміцін А;
інгібітори цитохромоксидази.
Проте існує і ціанід-резистентне дихання.
Блокування перенесення електронів інгібітором призводить до того, що переносники, що знаходяться на ділянці, що передує інгібіруемому, переходять в відновлене стан, тоді як переносники, що знаходяться після інгібіруемого ділянки, переходять в окислене стан.
На відміну від мітохондрій, склад дихального ланцюга у прокаріот часто залежить не тільки від виду мікроорганізму, але й від типу її харчування, а також від вмісту кисню в газовій фазі. Прикладом може служити дихальна ланцюг Escherichia coli.
Зворотний перенос електронів
У тих випадках, коли окислювані субстрати - донори електронів і протонів мають високий окисно-відновний потенціал, вони включаються в дихальний ланцюг на рівні цитохромної ланки. Це призводить до того, що, по-перше, в дихальному ланцюзі залишається тільки один пункт сполучення, і для забезпечення енергетичних потреб клітини вона повинна функціонувати з високою швидкістю. По-друге, для відновлення NADP використовується зворотний перенос електронів за рахунок ТЕП, створюваного на цітохромоксідазном ділянці.
Еволюція шляхів аеробного метаболізму
Системи дихання сучасних організмів є продуктом тривалої еволюції життя від анаеробних до аеробних умов. Прийнято вважати, що первинна атмосфера Землі носила відновлювальний характер і практично не містила кисню. У неї входили такі гази як С0 2, СН 4, N 2, NH 3, Н 2 і деякі інші - в менших кількостях. Тому перші живі організми, швидше за все, були анаеробами.
Основна маса кисню утворилася, мабуть, в результаті життєдіяльності фотосинтезуючих організмів. Перші аеробні мікроорганізми могли з'явитися на Землі близько 2 млрд років тому згідно з послідовністю, відображеної на схемі:
Анаероби -> фототрофи - ► аеротолеранти -> аероби -> аероби.
На початкових етапах еволюції організми змушені були захищатися від окислювального дії кисню і, ймовірно, не мали здатність запасати енергію, що виділяється при окисленні субстратів за участю кисню. Захист могла здійснюватися двома основними шляхами: пасивним, тобто переходом в екологічні ніші, де кисень відсутній, і активним - детоксикацією кисню. Системи детоксикації збереглися і у сучасних організмів.
Одним із найбільш токсичних продуктів відновлення кисню є супероксидний аніон-радикал, що утворюється при одно електронної реакції
Такі аніон-радикали можуть виникати в результаті багатьох метаболічних реакцій: при взаємодії з киснем компонентів дихального і фотосинтетичної ланцюгів, а також абиогенно в результаті фото-і електрохімічних процесів у водному середовищі. Час життя супероксидних аніонів відносно велике, вони можуть проникати в клітини і перетворюватися в інші токсичні продукти: гідроксильні радикали і синглетний кисень
Радикал ОН утворюється також при радіаційному розкладанні води і є найсильнішим з усіх відомих окислювачів. Щодо синглетного кисню потрібно відзначити, що в нормі електронні оболонки атома кисню знаходяться в стабільному стані, проте при порушенні атом кисню може переходити в синглетное стан з підвищеною реакційною здатністю, яке виникає і при дисмутації супероксидного аніона:
2'0 2 »+ 2Н + -> * 0 2 + Н 2 0 2.
Таким чином, клітці і в сучасних умовах необхідні захисні механізми для детоксикації як супероксид-аніону, так і інших форм «активного» кисню.
Основними захисними ферментами є супероксиддисмутазноі-мутаза, каталаза і пероксидаза. Супероксиддисмутаза каталізує реакцію з утворенням збудженому, триплетного кисню:
20 лютого - + 2Н + -> 0 2 + Н 2 0 2.
Деякі клітинні пігменти також відіграють захисну роль, «перехоплюючи» синглетний кисень.
Тільки після вироблення систем захисту еволюція могла приступити до створення систем, які дозволили б утилізувати енергію, отриману при окисленні субстратів за участю кисню. Результатом такої еволюції і є сучасні дихальні системи.
Найбільш поширеним способом отримання енергії в анаеробних умовах є різні види бродінь. У разі тварин і рослинних клітин це гліколіз, у прокаріот типи бродінь значно різноманітніші.
І гліколіз, і деякі інші анаеробні процеси дисиміляції є лише підготовчими етапами для подальших аеробних процесів отримання енергії, і, як правило, тварини і рослинні клітини не можуть рости тільки за рахунок анаеробних процесів катаболізму. Серед прокаріотів, навпаки, існує безліч облігатно анаеробних форм, здатних рости тільки за рахунок анаеробних способів отримання енергії. Ми послідовно розглянемо головні типи анаеробних енергетичних процесів: анаеробне дихання, безкисневий фотосинтез і різні види бродінь.
Анаеробне дихання
Механізм цього процесу подібний з аеробним диханням і також використовує ланцюг перенесення електронів. Проте кінцевим акцептором електронів служить не кисень, а інші неорганічні або органічні речовини. У залежності від природи кінцевого акцептора розрізняють нітратне, сульфатне, карбонатна, фумаратное типи дихання та ін
Нітратне дихання. Від нітратного дихання слід відрізняти асиміляційну нітратредукція, яка може відбуватися як в аеробних, так і в анаеробних умовах і служить для отримання амонійній форми азоту, використовуваної в конструктивних процесах. Цей процес здійснюється «розчинними» ферментами: нітратредуктази і нітритредуктази і не пов'язаний з запасанием енергії. У процесі асиміляційну нітратредук-ції не утворюється летючих продуктів:
Нітратним диханням, або денітрифікацією, називається дис-сіміляціонная нітратредукція, що приводить до утворення молекулярного азоту за участю ланцюга перенесення електронів і супроводжується запасанием енергії. У цьому випадку ферменти локалізовані в мембрані:
Повністю цей процес протікає у бактерій-денітрифікатори, тоді як у Escherichia coli та деяких інших бактерій здійснюється тільки перша стадія дінітріфікаціі, що призводить до накопичення в середовищі нітритів. Денітрифікатори, як правило, є факультативними анаеробами, і кисень пригнічує Дисиміляційна нітратредукція. Денітрифікація призводить до великих втрат азотних добрив з грунту, тому для придушення денітрифікації грунт необхідно рихлити.
Отриманий аденозин-5'-фосфосульфат повторно активується АТР:
Сульфатне дихання. Як і у випадку нітратредукції існує асиміляційна сульфатредукции, при якій сульфат відновлюється до сульфіду з подальшим використанням у конструктивних процесах. Першою стадією є активація сульфату:
Двічі «активоване 3-фосфоаденозін-5-фосфосульфат піддається відновленню спочатку до сульфіту, а потім до сульфіду. Такий шлях відновлення сульфату притаманний широкому колу організмів.
При Діссіміляціонний сул'фатредукціі або сульфатної диханні на першому етапі також утворюється APS, який прямо відновлюється до сульфіту, а потім у різних організмів відбувається або одноступінчаста, або триступеневе відновлення сульфіту до сульфіду.
Виявлено три типи сульфітредуктаз, містять особливий гем - сірогем. Інші сульфітредуктази містять цитохроми. При використанні в якості донора електронів молекулярного водню, а для конструктивних процесів - органічних речовин Сульфат бактерії ростуть як хемолітогетеротрофи з утворенням на 1 моль сульфату 3 молей АТР, частина яких витрачається на активацію сульфату. Життєдіяльність таких бактерії в природних умовах призводить до накопичення значних кількостей сірководню, який може окислюватися, утворюючи відкладення сірки. Ці бактерії викликають також анаеробну корозію металів.
Карбонатна дихання. При карбонатному диханні в якості кінцевого акцептора електронів використовується С0 2:
4Н 2 + С0 2 -> СН 4 + 2Н 2 0.
SHAPE \ * MERGEFORMAT
де сом-кофермент М (HS-CH 2-CH 2-S0 3 H, 2-меркаптоетаНсульфо-ки слота). |
Як показано дослідами з радіоізотопами, С0 2 акцептує від водню тільки електрони так як водень метану відбувається з води. Процес відновлення протікає східчасто з використанням ланцюга перенесення електронів, що включає дегідрогенази, редуктази і переносники електронів, що містять цитохроми
Карбонатна дихання характерне для метанових бактерій, що відносяться до архей. Багато з них можуть використовувати С0 3 в якості єдиного джерела вуглецю, тобто існувати хемолітоавтотрофно. Вони є облігатними строгими анаеробами. Показано утворення АТР у процесі відновлення С0 2 до метану, але стехіометрія процесу не відома. У природних умовах метанові бактерії утворюють метан у водоймищах і болотах, причому в деяких полярних морях є відкладення метану як кристаллогидрата. Метанові бактерії - один з головних компонентів систем очищення стічних вод. Вони мешкають також в рубці жуйних тварин.
Бродіння
Бродіння - це такий тип енергетичних процесів, при якому речовини, котрі піддаються хімічним перетворенням, самі служать донорами і акцепторами електронів. Молекулярний кисень в цих процесах не бере участь. Звідси перше визначення бродінь, дане відомим французьким мікробіологом Л. Пастером: «Бродіння - це життя без повітря".
Запасання енергії при бродіння відбувається або шляхом субстратного фосфорилювання з утворенням макроергічних сполук, або шляхом формування ТЕП за рахунок екскреції неорганічних іонів або кислих продуктів бродіння. Незважаючи на велику різноманітність типів бродінь, які зазвичай отримують назву по головному кінцевого продукту (спиртове, молочнокисле, маслянокислое, пропіоновокислі, муравьінокіслое, ацетон-бутилового і т.д.), субстратних фосфорилювання здійснюється в обмеженій кількості типових реакцій.
Поряд з субстратною фосфорилюванням запасання енергії в процесах бродіння може здійснюватися шляхом формування ТЕП. Так, деякі облігатно анаеробні бактерії, що здійснюють бродіння з утворенням метілмалоніл-СоА, здатні формувати градієнт іонів Na + у процесі декарбоксилювання цієї сполуки в пропіоніл-СоА.
Іншим прикладом служить формування градієнта Н + в процесі екскреції кислих продуктів бродіння. Разом з аніоном лактату через мембрану транслоціруются два протони. Процес може тривати до тих пір, поки концентрації лактату в середовищі й у клітці не зрівняються. У результаті створюється ТЕП, який надалі може використовуватися на енергетичні потреби клітини.
Фотосинтез
До цих пір ми розглядали організми, які для забезпечення конструктивних процесів використовують енергію хімічних зв'язків органічних або неорганічних речовин. Інша велика група організмів здатна забезпечувати конструктивний метаболізм за рахунок світлової енергії в процесі, який отримав назву фотосинтез. Отже, фотосинтез - це процес використання енергії світлового випромінювання для побудови живого речовини. Освіта АТР в процесі фотосинтезу називають фотофосфорілірованіем.
Основні процеси фотосинтезу, донори електронів
Окислювально-відновний потенціал системи відновників фотосинтетичного ланцюга повинен бути нижче -400 мВ. Звичайні донори електронів, використовувані у фотосинтезі, не володіють таким низьким потенціалом, тому для відновлення X необхідний зворотний перенос електронів від молекули
пігменту за рахунок енергії світла. Донор електронів потім заповнює їх дефіцит в молекулі пігменту. Іншу ділянку, на якому затрачається енергія світла, - ресинтез АТР, що витрачається для «активування» продуктів фіксації С0 Г
У випадку вищих рослин і ціанобактерій донором електронів є вода, в результаті чого з неї звільняється кисень, тобто фотосинтез в цьому випадку є кисневим, або оксигену. Основними типами метаболізму тут є фотолітоавтотрофія або фотолітогетеротрофія:
С0 2 + 2Н 2 0 - у + Н 2 0 + 0 2.
Таким чином, фотосинтез рослинного і бактеріального типу розрізняється по: природі пігментів; використання донорів електронів; здібності до виділення кисню.
Шлях вуглецю у фотосинтезі. Цикл Кальвіна
Включення С0 2 в конструктивний метаболізм у фототрофів здійснюється в послідовності реакцій. Вона називається циклом автотрофної фіксації вуглекислоти, чи циклом Кальвіна, який схожий з пентозофосфатному циклом катаболізму цукрів у хемоорганогетеротрофов. Наведемо сумарне рівняння цих реакцій:
6С0 2 + 18 АТР + 12 NADPH + 12Н + -> С 6 Н 12 0 6 + 18ADP + 12NADP +.
Для синтезу однієї молекули глюкози тут потрібно 6 «обертів» циклу. У циклі Кальвіна, в порівнянні з пентози-фосфатним циклом, для регенерації акцептора С0 2 необхідні дві додаткові реакції:
Подальша послідовність реакцій є «звернення» гліколізу, де в якості відновника використовується NADPH, що призводить до утворення глюкози.
Аналогічний цикл фіксації С0 2 функціонує у хемолі-тоавтотрофних бактерій.
У рослин початкові ферменти циклу Кальвіна локалізовані в хлоропластах. У клітинах фототрофних бактерій рібулозоді-фосфаткарбоксілаза знайдена в карбоксісомах, хоча не виключено, що там вона перебуває в латентному стані.
У процесі функціонування цикл Кальвіна піддається суворої метаболічної регуляції. Особливо тонко регулюється активність фосфорібулокінази, зокрема, чутливої до енергетичного заряду клітини і до ступеня восстановленности NAD. Цикл працює ефективно тільки в умовах нормального постачання енергією і відновниками.
Бесхлорофільний фотосинтез
Особливий тип фотосинтезу - без участі хлорофільних пігментів - виявлений у екстремально галофільних архей. Це єдиний тип фотосинтезу, що не включає електрон-транспортний ланцюг. Клітини галобактерій містять особливий білок - бактеріородопсин, що включає каротиноід - ретиналь. Спільно з фосфоліпідами бактеріородопсин формує так звані фіолетові мембрани, які у вигляді бляшок покривають до 50% поверхні клітин. Під дією світла бактеріородопсин транслоцірует протони з цитоплазми в навколишнє середовище, створюючи протонний ТЕП, який за допомогою Н +-АТРсін-тетази перетвориться в АТР.
Система автотрофної фіксації С0 2 у галобактерій не виявлена, мабуть, вони існують як фотоорганогетеротрофи.
Фоторецепції
На відміну від фотосинтезу в процесі фоторецепції енергія світла запасається не у вигляді макроергічних сполук або ТЕП, а у вигляді інформації, що виражається в хімічних перетвореннях фоторецептора. Далі ці зміни перетворюються або в нервовий імпульс, або в той чи інший вид сигналу. Найчастіше фоторецепторами є каротиноїди або тетрапірроли. Іноді на цю роль претендують Флавін. Бактеріородопсин і деякі ферменти-фоторецептори використовуються в так званій «безсрібного» фотографії, де зображення проявляється за рахунок хімічних змін фоторецептора при дії світла.
Процеси конструктивного метаболізму
У попередніх розділах нами розглянуті способи та механізми акумуляції і трансформації енергії в клітині. Тепер коротко зупинимося на основних шляхах побудови речовини клітин, що включає як низькомолекулярні, так і високомолекулярні продукти. У фундаментальних курсах біохімії докладно викладаються схеми метаболічних шляхів, тому ми розглянемо лише деякі принципові закономірності організацію конструктивних процесів, звані також реакціями анаболізму.
Взаємозв'язок енергетичних і конструктивних процесів у клітині
Взаємозв'язок між реакціями, в результаті яких енергія виділяється і може бути запасена в клітці, і тими, в яких вона витрачається на побудову речовин клітини, зручніше за все розглянути на прикладі метаболізму глюкози, найчастіше виступають як «енергодающіх» субстратів. При цьому потрібно мати на увазі дві обставини. Перше: у клітці насправді не існує різкого розмежування енергетичних і конструктивних процесів. Як правило, в результаті реакцій катаболізму утворюються такі проміжні продукти, які можуть «підхоплюватися» ферментами анаболізму і використовуватися для побудови речовин клітини. Друге: в живій клітині широко застосовується принцип організації біохімічних процесів у вигляді метаболічних циклів, коли початковий і кінцевий компоненти в реакції ідентичні і цикли можуть функціонувати невизначено тривалий час за умови припливу субстратів і відтоку продуктів.
Розглянемо приклад, коли основним джерелом енергії і вуглецю служить глюкоза або містять глюкозу полісахариди. Послідовність протікають реакцій зображена на рис. 26.
Утилізація полісахаридів починається з їх гідролізу. Гідроліз за участю амілаз призводить до утворення олігосахаридів і вільних Сахаров, які за допомогою фосфорілази перетворюються на фосфорні ефіри Сахаров. У разі глюкози це найчастіше глюкозо-6-фосфат. Гідроліз за участю фосфорілази одразу призводить до утворення фосфосахаров. Зворотна реакція - синтез полісахаридів - типовий анаболічний процес, що протікає з витратою енергії, сенс якого або в освіті запасних речовин, або у синтезі структурних полісахаридів. У цих випадках проміжно утворюються похідні Сахаров і нуклеотидів. Фосфорилювання вільної глюкози каталізується гексокінази. Цей процес - перший етап гліколізу, де в результаті через проміжний синтез тріозофосфатов утворюється піруват. Він же виходить і при функціонуванні пентозофосфатного циклу, або пентозофосфатного шунта, біосинтетичні значення якого полягає, зокрема, в синтезі пентоз. Подальші перетворення пірувату призводять або до синтезу аланіну, або до утворення ацетил, «живить» цикл трикарбонових кислот, значення якого розглянемо докладніше трохи пізніше. При наявності готового аланіну з нього під дією відповідної дезамінази знову утворюється піруват, що вступає в катаболические процеси. Ацетил-СоА може вступати на шлях синтезу жирних кислот, що приводить, в кінцевому рахунку, до утворення ліпідів. У свою чергу, катаболізм ліпідів супроводжується їх гідролізом із звільненням жирних кислот, які далі деградують до ацетил-СоА. Таким чином, ацетил-СоА знаходиться в центрі як катаболічних, так і анаболічних перетворень багатьох субстратів, зокрема вуглеводів і ліпідів. Для завершення процесу окислення жирних кислот ацетільние залишки, які утворюються в результаті їх р-окислення, необхідно також окислити. Це здійснюється в ході ЦТК.
Уявлення про цикл трикарбонових кислот сформульовані X. Кребсом в 1937 р. ЦТК виконує дві важливі задачі: 1) повне окислювання багатьох субстратів, що забезпечує клітину енергією, і 2) забезпечення проміжних продуктів для синтезу низки клітинних компонентів, зокрема амінокислот - аспарагінової та глутамінової кислот, одержуваних прямим амінування кетокислот: окса -лоацетата і 2-оксоглутарата. З них шляхом переамінування можуть бути отримані багато інші амінокислоти, і в кінцевому рахунку - білки.
Повертаючись до неможливості строгого поділу конструктивних і енергетичних процесів, відзначимо, що відносні вклади гліколізу і ЦТК в енергетику і біосинтезу залежать від швидкості росту організму. Ізотопні дослідження показали, що при високій швидкості росту Escherichia coli на середовищі з глюкозою ЦТК забезпечує біосинтезу, тоді як гліколіз виконує чисто енергетичну роль. При уповільненні швидкості зростання їх ролі міняються: основна енергетична функція належить ЦТК, а гліколіз використовується для глікогенеза, забезпечуючи синтез і запасання полісахаридів в клітці. Такі шляхи метаболізму, що грають як енергетичну, так і конструктивну роль, прийнято називати амфіболічні.
Завершуючи розгляд схеми на рис. 26, відзначимо, що ЦТК вносить внесок у синтез всіх найважливіших біополімерів клітини, в тому числі в синтез нуклеїнових кислот, через утворення пири-мідінов і пуринів. Синтез пуринів здійснюється за участю пентозофосфатного шунта, але частина атомів вуглецевого скелета пуринів відбувається з амінокислот: аспарагінової та глутамінової кислот, а також Форміат. Цукрова частина нуклеотидів відбувається з пентое, також утворюються в пентозофосфатному циклі. Піримідин можуть застосовуватися і в енергетичних процесах; їх катаболізм протікає через освіту метілмалоніл-СоА, в кінцевому рахунку включається до ЦТК.
Шляхи синтезу цих та інших компонентів клітини докладно викладені у фундаментальних курсах біохімії. На деяких закономірності синтезу біополімерів і механізмах регулювання цих процесів ми зупинимося в наступних розділах, а тут розглянемо має надзвичайно важливе для конструктивного метаболізму значення процес азотфіксації.
Фіксація азоту
Азот відноситься до чотирьох елементів складають основу живої речовини. Однак переважна маса азоту в біосфері представлена хімічно інертним молекулярним азотом атмосфери. Переклад його у форму, доступну для живих організмів, можливий трьома основними шляхами.
1. Освіта оксидів азоту під впливом електричних розрядів в атмосфері - важко піддається кількісному обліку, але навряд чи грає істотну роль в сучасних умовах.
2. Освіта аміаку та окислів азоту в хімічних реакціях в результаті техногенних процесів, здійснюваних людиною і що лежать в основі виробництва азотних добрив. За різними оцінками досягається зв'язування близько 4 • 10 7 т азоту в рік.
3. Фіксація азоту клітинами бактерій, яка, як не дивно, приблизно на порядок перевищує результати, досягнуті людиною у найдосконаліших хімічних виробництвах - 2 • 10 8 т азоту в рік. Таким чином, спільна діяльність мікроорганізмів призводить до зв'язування щорічно до 300 кг азоту на гектар грунту.
Фіксація азоту бактеріями відкрита С.М. Виноградским в 1883 р. на прикладі виділених з грунту бактерій, названих ним на честь Л. Пастера Clostridium pasteurianum.
Фіксувати азот, тобто перетворювати молекулярний азот у амонійний, здатні тільки прокаріоти, і серед них це властивість поширена досить широко. Процес надзвичайно енергоємний: для відновлення 1 молекули N 2 необхідно затратити 12 молекул АТР, інакше кажучи, для асиміляції 1 мг азоту Clostridium переробляє 500 мг глюкози.
Аеотфіксація здійснюється за допомогою ферменту нітрогенази, яка складається з двох компонентів: малого і великого. Деякі нітрогенази замість або разом з молібденом містять ванадій.
Для функціонування нітрогенази необхідні АТР, іони Mg 2 + та і відновлювач з низьким окислювально-відновним потенціалом.
Для відновлення молекули азоту необхідне перенесення шести електронів, але за один цикл не може бути перенесено більше двох електронів, тому процес протікає не менш ніж у трьох послідовних стадіях:
При швидкої зупинки реакції з інкубаційної суміші вдалося виділити гідразин. Мабуть, проміжні продукти залишаються міцно пов'язаними з нітрогеназой, яка здатна відновлювати і ряд інших сполук:
Здатність нітрогенази відновлювати ацетилен в етилен дозволила розробити простий метод визначення нітрогенази-ної активності, вельми чутливою до кисню, за рахунок чого азотфіксація відбувається або у облігатно і факультативно анаеробних бактерій, або в анаеробних ділянках клітини аеробних бактерій. У Rhizobium азотфіксація відбувається в бульбочках, що утворюються на коренях бобових рослин після «зараження» рослин цими бактеріями. При цьому клітини бактерій сильно видозмінюються, перетворюючись на так звані бактероїди, а рослини починають синтезувати особливий гемоглобін, якому приписується здатність захищати нітрогенази від надлишку кисню. Відомий також симбіоз покритонасінних рослин з азотфіксуючих-ські актиноміцетами, а голонасінних і папоротей - з ціанобактеріями. Врожайність злакових помітно підвищується в асоціації з бактеріями-азотфиксаторами роду Azospirillum. Азот-фіксуючі штами Klebsiella виявлені в кишечнику жителів Нової Гвінеї.