МИНИСТЕРСТВО ОСВІТИ ТА НАУКИ УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
«ХАРКІВСКИЙ ПОЛІТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ»
Кафедра біотехнології, біофізики та аналітичної хімії
Реферат
На тему «Імуноферментні аналізатори»
Виконала студентка гр. ХТ-420б
Воскобоєнко В. П.
Перевірила
доцент Бєлих І. А.
Харків 2022
Зміст
Вступ 3
Порівняння двох систем для імуноферментного аналізу 4
Імуноферментний аналіз 8
Метод імуноферментного аналізу 11
Класифікація ІФА 15
Імуноферментний тест 17
Висновки 19
Список використаної літератури 20
Вступ
Моя тема доповіді імуноферментні аналізатори і іх вплив на життя людини та тварин. Також в цій доповіді я розповім в чому полягає сутність самого імуноферментного аналізу. Для чого використовують ІФА та де вони потрібні.
Почнемо з того, що ІФА аналізатори та ІФА рідери допомагають проводити ряд всебічних аналізів в автоматичному режимі, з високою точністю одержуваних результатів і мінімальним втручанням лаборантів. За допомогою, пропонованих Biovet сучасних приладів, здійснювати імунно-хімічну діагностику можна в ліцензованій ветеринарній клініці або спеціалізованому медичному центрі.
Що ж таке імуноферментний аналіз? Імуноферментний аналіз (ІФА, ELISA) або, точніше, ферментний імуносорбентний аналіз (нгіб. Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA) — імунологічний метод для визначення наявності певних антигенів, шляхом реакції антиген-антитіло.
Є дуже багато різних видів аналізаторів, але два основних види цих приладів, які є найпопулярнішими – це VIDAS та miniVIDAS.
Більша частина моєї доповіді буде саме про імуноферментний аналіз та де він використовується.
Порівняння двох систем для імуноферментного аналізу
Система miniVIDAS (Рис.1)
Рис.1 Система miniVIDAS
Система miniVIDAS® являє собою інструмент, призначений для здійснення імуно-аналізів за принципом імуноферментного флуоресцентного аналізу ІФФА (ELFA), який об’єднує ІФА (ELISA) з вимірюванням флуоресценції кінцевого продукту. Це технологія забезпечує відмінну чутливість і специфічність аналізу, що неодноразово підтверджено контролями якості на міжнародному рівні.
До складу системи mini-VIDAS® входять:
· Аналітичний модуль
- здійснює всі етапи аналізу, використовуючи при цьому зчитані показники флуоресценції;
- складається з двох окремих відсіків, кожен з яких може здійснювати 6 тестів одночасно.
· Внутрішній комп'ютер та принтер
- використовується для управління всіма результатами;
- можливість обробки 12 тестів за годину;
- можливість здійснення одноразових тестів;
- все необхідне входить до складу одного набору;
- всі реагенти готові до використання, та позначені штрих-кодами з метою спрощення відслідковування.
· Широкий діапазон реагентів
· більше 100 тестів в наявності;
· 5 окремих відсіків, кожен з яких може здійснювати 6 тестів одночасно;
· можливість здійснення 60 тестів за годину.
Причини вибору системи miniVIDAS для здійснення імунно-аналізів
Автоматична система, що використовується у всьому світі з метою надання операторові допомоги в оптимізації робочого процесу, та в підвищенні продуктивності лабораторії.
Не потрібні спеціальні навики роботи, не потрібні жодні додаткові реагенти, не потрібні щоденні калібрування, чищення та заправка приладу – просто вставте стрип-смужку в аналізатор, додайте зразок та натисність «Старт» і через вказаний час поверніться за результатом.
Надійність:
- середня тривалість безвідмовної роботи: більше 1000 днів;
- відсутність контамінації при перенесенні;
- зчитування показників флуоресценції;
- наявність внутрішньої програми контролю якості.
Система VIDAS (Рис 2)
Рис. 2 Система VIDAS
Система VIDAS® являє собою багатопараметровий інструмент, призначений для здійснення імуно-аналізів за принципом імуноферментного флуоресцентного аналізу ІФФА (ELFA), який об’єднує ІФА (ELISA) з вимірюванням флуоресценції кінцевого продукту. Це технологія забезпечує відмінну чутливість і специфічність аналізу, що неодноразово підтверджено контролями якості на міжнародному рівні.
До складу системи VIDAS® входять:
· окремий аналітичний модуль, комп'ютер, та принтер;
· 5 окремих відсіків, кожен з яких може здійснювати 6 тестів одночасно;
· можливість здійснення до 60 тестів за годину.
Причини вибору системи VIDAS для здійснення імунно-аналізів
Автоматична система, що використовується у всьому світі з метою надання оперативної допомоги в оптимізації робочого процесу, та в підвищенні продуктивності лабораторії.
Не потрібні спеціальні навики роботи, не потрібні жодні додаткові реагенти, не потрібні щоденні калібрування, чищення та заправка приладу – просто вставте стрип-смужку в аналізатор, додайте заразок та натисність «Старт» і через вказаний час поверніться за результатом.
Простота у використанні:
- інструмент VIDAS® являє собою систему, що функціонує за принципом “завантажив і працюй”;
- даний інструмент завжди готовий до використання, і потребує мінімум технічного обслуговування;
- є можливість зберігати параметри калібрації в пам’яті інструменту.
Надійність:
- середня тривалість безвідмовної роботи: більше 1000 днів;
- відсутність контамінації при перенесенні;
- зчитування показників флуоресценції;
- наявність внутрішньої програми контролю якості.
Лабораторіям, що бажають здійснювати більшу кількість тестів протягом меншого проміжку часу ми рекомендуємо використовувати основну систему VIDAS®, що являє собою більшу версію пристрою miniVIDAS®.
Імуноферментний аналіз
Імуноферментний аналіз — вид імунохімічного аналізу, що базується на імунологічній реакції антигену з відповідним антитілом з утворенням комплексу антиген — антитіло, для виявлення якого використовують кон’югати антигену, антитіла або обидва компоненти цієї реакції з ферментами. Індикатором реакції є здатність ензимів викликати руйнування субстрату з утворенням забарвленого продукту.
Для кількісного аналізу найчастіше застосовують два варіанти виконання ІФА. Першим етапом є зв’язування нгібітор нийих антитіл (або антигену) на поверхні твердої фази. Далі стає можливим проведення реакції конкурентного або непрямого (сендвіч) типу. В першому варіанті антиген, який мітиться ферментом, конкурує з досліджуваним неміченим антигеном за антитіла, які утримуються на твердій фазі: ферментна активність виявляється обернено пропорційною кількості антигену в досліджуваному зразку. В другому варіанті конкуренція відсутня: антигени досліджуваної біологічної рідини реагують з іммобілізованими на твердій фазі антитілами, після чого надлишок суміші видаляється і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв’язуються з уже іммобілізованим антигеном. У цьому разі ферментативна активність знаходиться в прямо пропорційній залежності від кількості антигену в досліджуваному біологічному матеріалі. Як ферментні мітки використовують пероксидазу (з хріну), лужну фосфатазу, глюкозооксидазу і β-галактозидазу. Під дією ферменту на хромоген утворюється забарвлений продукт, вміст якого визначають за оптичною густиною розчину. Найбільш досконалий і поширений на сьогодні є метод ІФА, пов’язаний з використанням подвійних моноклональних антитіл, — метод плашкового твердофазного ІФА — ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Його принцип полягає у формуванні комплексу «листовий пиріг», в якому сполука визначається одним із внутрішніх шарів, а індикаторний фермент — зовнішнім.
ІФА широко застосовують в різних напрямках медицини: клінічній експериментальній вірусології (в т.ч. діагностика СНІДу, гепатиту, грипу); мікробіології (діагностика інфекційних захворювань); біохімії; імунології; токсикології; фармакології; а також для контролю технології виробництва у медичній, харчовій, фармацевтичній та мікробіологічній промисловостях.
Існує цілий ряд підходів, що дозволяють визначити, чи відбулося зв’язування антитіла з антигеном-мішенню. Один з них — це ферментний іммуносорбентний аналіз (ELISA), що часто використовується для діагностики різноманітних антигенів.(Схема 1)
Схема 1 Проведення аналізу
Підготовка підкладки для фіксації досліджуваного зразка;
Зразок, у якому хочуть виявити специфічну молекулу або мікроорганізм, фіксують на твердій підкладці, наприклад на пластиковій мікротитрувальній плашці, що зазвичай має 96 лунок;
До фіксованого зразка додають антитіло, специфічне до маркерної молекули (первинне антитіло), потім промивають лунку, щоб видалити молекули первинного антитіла, які не зв'язалися;
Додають вторинне антитіло, що специфічно зв’язується з первинним і не взаємодіє з маркерною молекулою. До цього антитіла приєднаний фермент (наприклад, лужна фосфатаза, пероксидаза або уреаза), що може каталізувати перетворення незабарвленого субстрату в забарвлений продукт. Промивають лунку, щоб видалити молекули, які не зв'язалися;
Додають незабарвлений субстрат, що впізнається та утилізується ферментом;
Проводять якісне або кількісне визначення пофарбованого продукту, за допомогою оцінки оптичної щільності
Метод імуноферментного аналізу
У всіх галузях медицини в сучасних умовах для діагностики та наукових цілей використовується імунний аналіз, в основу якого покладена реакція взаємодії антигену і антитіла з використанням різних варіантів мічення одного з компонентів (фермент, радіонуклід, флуоресцентний барвник та інші). Методи імунного аналізу, такі як імуноферментний аналіз (ІФА), хемілюмінесцентний аналіз і імунофлуоресцентний відрізняються між собою за типом використовуваної мітки, умовами і варіантами методик.
Імуноферментний аналіз широко використовується для діагностики в біології та медицині як практичній, так і у фундаментальній. Окремі варіанти твердофазного ІФА дозволяють виявляти у зразку поодинокі молекули.
Метод ІФА – лабораторний метод, який використовується для якісного або кількісного визначення речовин в низьких і дуже низьких концентраціях. Даний метод дозволяє ідентифікувати такі біологічно активні речовини організму людини як: гормони, ферменти, нейропептиди, продукти імунної системи та інші, а також призначений для виявлення чужорідних антигенів та антитіл. Біогенні аміни: melatonin, adrenaline, noradrenaline, dopamine, metanephrine, normetanephrine, serotonin, tryptophan – визначають у сироватці крові, плазмі, сечі, а histamine можливо визначити і в калі.
Метод ІФА має ряд переваг: метод високочутливий, специфічний, точний, експрес-метод, стандартизований (оцінка реакції проводиться автоматично), не вимагає спеціальних умов у лабораторії, для роботи необхідні мікрообсяги матеріалу, виконують методику на доступному вітчизняному або імпортному обладнанні.
Імуноферментний аналіз заснований на специфічному зв'язуванні антитіла з антигеном, при цьому один з компонентів кон'югованих з ферментом, в результаті реакції з відповідним хромогенним субстратом утворюється забарвлений продукт. За допомогою рідера або імуноферментного аналізатора спектрофотометрично визначається шукане в матеріалі з'єднання або речовина.
Постійне технічне вдосконалення методики призвело до появи можливості іммобілізації антигену і антитіла на різних носіях із збереженням їх зв'язуючої активності. У сучасних імуноферментних наборах широко використовують моноклональні антитіла. Надзвичайно широке коло завдань, що стоять перед дослідниками з розробки нових тест-систем для визначення біологічно активних речовин (БАР) послужило подальшому розвитку методу, підвищенню його чутливості і специфічності.
Теоретична основа імуноферментного аналізу сформована на даних сучасної імунохімії та хімічної ензимології, знаннях фізико-хімічних закономірностей реакції антиген-антитіло, а також на головних принципах аналітичної хімії.
Чутливість методу ІФА і час проведення методики визначається кінетичними і термодинамічними характеристиками реакції антиген-антитіло, співвідношенням реагентів, активністю ферменту і роздільною здатністю методу його детекції.
Об'єктами дослідження ІФА є як низькомолекулярні, так і високомолекулярні сполуки, віруси і бактерії.
При проведенні ІФА для попередження нелабораторних помилок необхідно:
-дотримання умов збору та підготовки проб;
-дотримання умов зберігання проб;
-дотримання умов транспортування та зберігання тест-систем;
-проведення вхідного контролю тест-систем: визначення якості тест-систем (чутливість,
специфічність, відтворюваність за допомогою контрольних матеріалів),
-попередження перехресних реакцій.
При проведенні ІФА для попередження внутрішньолабораторних помилок необхідно виконання наступних заходів:
- дотримуватися правил безпеки в діагностичній лабораторії;
- оформляти відповідну документацію;
- здійснювати контроль за дотриманням або виконанням інструкції із застосування тест-системи,
вкладеної безпосередньо в комплект до використовуваного набору реагентів;
- виключити помилки при підготовці тест-систем і проб до аналізу, а саме: не змішувати реагенти різних серій, контролювати якість і чистоту лабораторного посуду, наконечників до мікропіпеток і дозаторів, контролювати температуру реагентів, виключити помилки на етапі обліку результатів.
- контроль роботи обладнання;
- оцінка якості роботи лаборантів.
Основні рекомендації при підготовці проб крові до виконання ІФА.
Інструменти і лабораторний посуд використовувані для аналізу повинні бути чистими і сухими. Для дослідження частіше використовується кров отримана з ліктьової вени у пацієнта (натщесердце). Забір крові у пацієнтів повинен бути здійснений голками з великим діаметром, щоб уникнути пошкодження еритроцитів, так як гемоліз еритроцитів веде до хибнопозитивного результату. Кров повинна зберігатися не більше 24 годин з моменту забору і при температурі +2?...+8?С. Сироватку крові слід відбирати після відстоювання крові в термостаті при 37 ° С протягом не менше ніж години. Сироватка крові може бути відокремлена від еритроцитів центрифугуванням (10 хв. При 3000 об / хв або 20 хв. При 1500 об / хв). Зберігати сироватки слід при температурі +2 ? ... +8 ? С від 5 до 7 днів, так як більш тривале зберігання веде до бактеріального проросту і хибнопозитивного результату. Для тривалішого зберігання сироватки, допускається її заморожування при – 20 ? С і зберігання терміном до 20 днів, тому що при більш тривалому зберіганні процес заморожування впливає на структуру і стабільність деяких компонентів проби. Не слід заморожувати і розморожувати сироватки кілька разів, так як багаторазове розморожування призводить до руйнування антигенів і антитіл, зміни складу проб. Сироватки крові не рекомендується зберігати у саморозморожуваному холодильнику.
У методі імуноферментного аналізу виділяють три стадії:
1. «упізнавання» тестованого з'єднання специфічним до нього антитілом, що веде до утворення імунного комплексу;
2. формування зв'язку кон'югату з імунним комплексом або з вільними місцями зв'язування;
3. перетворення ферментної мітки в реєстрований сигнал.
Класифікація ІФА
В основу класифікації ІФА покладено кілька підходів:
I. За типом реагентів, присутніх на першій стадії ІФА, розрізняють конкурентний і неконкурентний методи.
- конкурентний метод ІФА – на першій стадії в системі присутні одночасно аналізоване з'єднання і його аналог, мічений ферментному, який конкурує з аналізованим з'єднанням за центри специфічного зв'язування з ним.
- неконкурентний метод ІФА – в системі на першій стадії присутнє тільки аналізоване з'єднання і специфічні до нього центри зв'язування.
II. Методи ІФА поділяються на гомогенні і гетерогенні.
Гомогенний метод.
Передбачає проведення трьох стадій ІФА у розчині, де між основними стадіями немає додаткових етапів поділу утворених імунних комплексів від компонентів, що не прореагували. Гомогенний метод призначений для визначення низькомолекулярних субстанцій і в його основі лежить інгібування активності ферменту при його з'єднанні з антигеном або антитілом. Активність ферменту відновлюється в результаті реакції антиген-антитіло. Зв'язування антитіла з антигеном (що містить ферментну мітку) призводить до інгібування активності ферменту на 95% по відношенню до високомолекулярного субстрату. Це обумовлено винятком субстрату з активного центру ферменту. У міру збільшення концентрації антигену зв'язується все більше антитіл і зберігається все більше вільних кон'югатів антиген-фермент, здатних гідролізувати високомолекулярний субстрат.
Експрес-метод.
Чутливість методу досить висока. З його допомогою можна визначити речовину на рівні пікомоль.
Гетерогенний метод.
Здійснюється проведення аналізу у двофазній системі за участю твердої фази – носія, і обов’язкова стадія поділу імунних комплексів від компонентів, що не прореагували (відмивання нгібіто), і знаходяться вони у різних фазах (утворені імунні комплекси знаходяться на твердій фазі, а не нгібітор ний комплекси – у розчині). Гетерогенні методи, в яких формування імунних комплексів на першій стадії протікає на твердій фазі, називають твердофазними методами. Методи відносяться до гомогенно – гетерогенним, якщо перша стадія ІФА – утворення специфічних комплексів відбувається у розчині, а потім для розділення компонентів використовують тверду фазу з іммобілізованим реагентом.
У методі ІФА за принципом визначення тестованої речовини виділяють:
1) Пряме визначення концентрації речовини (антигену або антитіл) за кількістю прореагувавших (провзаємодіяних) з ним центрів зв'язування. У цьому випадку ферментна мітка буде знаходитися в утвореному специфічному комплексі антиген-антитіло. Концентрація визначеної речовини буде прямо пропорційна реєстрованим сигналам.
2) Визначення концентрації речовини по різниці загального числа місць зв'язування і залишених вільних центрів зв'язування. Концентрація визначеної речовини при цьому буде зростати, а реєстрований сигнал знижуватися. Спостерігається зворотна залежність від величини реєстрованого сигналу.
У діагностиці використовують і застосовують такі варіанти методики ІФА: з загальним принципом ІФА, прямий імуноферментний аналіз, непрямий імуноферментний аналіз, за принципом «Сендвіч» - як варіант для виявлення антигенів, конкурентний ІФА, нгібітор ний ІФА, метод імуноферментних плям (ELISPOT) та інші.
Метод імуноферментного аналізу багато в чому унікальний, що дозволило йому отримати широке застосування, як в діагностиці, так і в дослідженнях, проведених в рамках наукових проектів.
Імкуноферментний тест
ІФА використовується для виявлення та ідентифікації вірусу і антитіл до нього (у тварин-реконвалесцентів) або дослідження рівня поствакцинальних антитіл.
Для ідентифікації вірусспецифічного антигену імуноферментний тест застосовують в двох варіантах: гістохімічному і твердофазном.
Гістохімічний варіант ІФА, або імунопероксидазному реакція. Імунопероксидазному реакція аналогічна методу імунофлуоресценції, але відрізняється тим, що для постановки реакції використовують антитіла, мічені НЕ флуорохромом, а ферментом, і облік результатів реакції проводять не під люмінесцентним мікроскопом, а під звичайним світловим.
Прямий пероксидазний тест. При виявленні антигену за допомогою прямого імунопероксидазному методу використовують противірусні кон'югати, т. Е. Кон'югати, отримані з антитіл, виділені з специфічної сироватки, і фермент. Кон'югати готують в спеціалізованих установах біологічної промисловості.
В позитивних випадках, т. Е. За наявності антигену в досліджуваному препараті, після нанесення імунопероксидазному кон'югату утворюється комплекс антиген - антитіло, мічений ферментом. Після нанесення на препарат розчину субстрату останній під дією ферменту розкладається, утворюючи кольоровий продукт ферментативної реакції, добре видний в світловому мікроскопі.
Непрямий імунопероксидазний тест застосовують для виявлення вірусспсціфіческого антигену. При цьому використовують антивидові імунопероксидазний кон'югати, приготовані в спеціалізованих установах. Перевагою непрямого методу є універсальність мічених антивидових глобулінів, а також велика чутливість його в порівнянні з прямим.
Методи твердофазного імуноферментного аналізу. Методи твердофазного ІФА засновані на застосуванні антитіл (антигенів), фіксованих на нерозчинних носіях. В якості носіїв використовують скляні або нейлонові кульки, полістиролові або керамічні пробірки і мікропанелі. Останнім часом широкого використання в ІФА отримали полістиролові мікропанелі. Застосування їх і автоматизація процесу постановки і обліку реакції дозволяють за короткий час досліджувати велике число зразків сироваток на наявність антитіл та іншого матеріалу на наявність вірусспсціфіческого антигену.
При відсутності спеціального обладнання облік результатів ІФА може ефективно проводитися на струменевих спектрофотометрах, флуориметр, фотоелектрокалориметри. Достовірність результатів аналізу при цьому дещо знижується і зменшується число проб, яке могло б бути проаналізовано за робочий день.
Часто цінною є якісна інформація про наявність або відсутність даного з'єднання в досліджуваній пробі. У цих випадках облік результатів ІФА можна проводити візуально, по появі пофарбованого продукту ферментативної реакції. Ця особливість методу вкрай важлива при необхідності масових досліджень далеко від стаціонарних лабораторних центрів.
Висновки
В цій роботі я порівняла два імуноферментні аналізатори VIDAS та miniVIDAS. Скорочено описала їх характеристики та вивела для себе висновок, що вони майже нічим не відрізняються. За окрема, VIDAS набагато функціональніший за miniVIDAS та його рекомендують брати якщо треба здійснювати більшу кількість тестів протягом меншого проміжку часу.
Ще я описала дію імуноферментного аналізу, привела схему проведення цієї роботи та приклади.
Розібрала метод ІФА - розписала сам метод, написала про попередження двох видів помилок: нелабораторних та внутрішньо-лабораторних.
Розписала класифікацію ІФА вона буває двох типів: конкурентний та неконкурентний, та види: гомогенні та гетерогенні.
Написла про поняття імуноферментного тесту та вивела два види: гістохімічний та твердофазний.
Список використаної літератури
Б. Глік, Дж. Пастернак, Молекулярна біотехнологія, Москва, Мир, 2002.(С.?)
Метод імуноферментного аналізу
Камышников В.С. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. В 2 т. — Мінськ, 2000; Клиническая оценка лабораторных тестов / Под ред. Н.У. Тица. — М., 1986.
Порівняльна характеристика аналізаторів
Імуноферментний тест