Технологія ферментних препаратів
Ферменти як біокаталізатори мають ряд унікальних властивостей, наприклад, таких як висока каталітична активність і вибірковість дії. У ряді випадків ферменти мають абсолютною специфічністю, каталізує перетворення тільки однієї речовини. Для кожного ферменту існує свій оптимум рН, при якому його каталітичну дію максимально. При різкій зміні рН ферменти інактивуються через незворотною денатурації. Прискорення реакції при підвищенні температури також лімітований певними межами, оскільки вже при температурі 40-50оС багато ферментів денатурують. Ці властивості ферментів доводиться враховувати при розробці технології нового препарату.
Оскільки ферменти - речовини білкової природи, в суміші з іншими білками їх кількість визначити практично неможливо. Наявність ферменту в препараті може бути встановлено лише за перебігом тієї реакції, яку каталізує фермент. При цьому кількісну оцінку змісту ферменту можна дати, визначивши або кількість утворилися продуктів реакції, або кількість витраченого субстрату. За одиницю активності ферменту приймають то його кількість, яка каталізує перетворення одного мікромоля субстрату в 1 хвилину при заданих стандартних умовах - стандартна одиниця активності.
За рішенням Міжнародного біохімічного союзу активність вирішено визначати при t = 30оС по початковій швидкості реакції, коли концентрація насичення ферменту і тимчасова залежність близька до кінетиці реакції нульового порядку. Інші параметри реакції індивідуальні для кожного ферменту. Активність ферментного препарату виражається в мікромоля субстрату, прореагировавшего під дією 1 мл ферментного розчину або 1 грама препарату в оптимальних умовах за 1 хвилину. Якщо ферментний препарат не містить баласту, то його активність виявляється у тих же стандартних одиницях на 1 мг ферменту. Якщо ж є баласт, то активність вважається на 1 мг білка в ферментному препараті. Активність випускається препарату - найважливіший нормований показник якості.
Основну частину ферментів, одержуваних промисловим способом, становлять гідролази. До них відносяться, в першу чергу амилолитические ферменти: α-амілаза, β-амілаза, глюкоамілаза. Їх основна функція - гідроліз крохмалю і глікогену. Крохмаль при гідролізі розщеплюється на декстрини, а потім до глюкози. Ці ферменти застосовуються в спиртовій промисловості, хлібопеченні.
Протеолітичні ферменти утворюють клас пептідгідролаз. Їхня дія полягає у прискоренні гідролізу пептидних зв'язків у білках і пептидах. Важлива їхня особливість - селективний характер дії на пептидні зв'язки у білковій молекулі. Наприклад, пепсин діє тільки на зв'язок з ароматичними амінокислотами, трипсин - на зв'язок між аргініном і лізином. У промисловості протеолітичні ферменти класифікують за здатністю проявляти активність у певній області рН:
рН 1.5 - 3.7 - кислі протеази;
рН 6.5 - 7.5 - протеази;
pH> 8.0 - лужні протеази.
Протеази знаходять найширше застосування в різних галузях промисловості:
м'ясна - для пом'якшення м'яса;
шкіряна - пом'якшення шкур;
кіновиробництво - розчинення желатинового шару при регенерації плівок;
парфумерна - добавки в зубну пасту, креми, лосьйони;
виробництво миючих засобів - добавки для видалення забруднень білкової природи;
медицина - при лікуванні запальних процесів, тромбозів і т.д.
Пектолітіческіе ферменти зменшують молекулярну масу і знижують в'язкість пектинових речовин. Пектиназу діляться на дві групи - гідролази та транселімінази. Гидралаз отщепляют метильні залишки або розривають глікозидні зв'язку. Транселімінази прискорюють негідролітіческое розщеплення пектинових речовин з утворенням подвійних зв'язків. Застосовуються в текстильній промисловості (вимочування льону перед переробкою), у виноробстві - освітлення вин, а також при консервуванні фруктових соків.
Целлюлолитической ферменти дуже специфічні, їх дія виявляється в деполімеризації молекул целюлози. Зазвичай використовуються у вигляді комплексу, доводящего гідроліз целюлози до глюкози (у гідролізної промисловості). У медичній промисловості їх використовують для виділення стероїдів з рослин, у харчовій - для поліпшення якості рослинних олій, у сільському господарстві - як добавки до комбікормів для жуйних тварин.
Існує ряд факторів, що впливають на біосинтез ферментів. У першу чергу, до них відноситься генетичний. Склад і кількість синтезованих ферментів спадково детерміновані. Застосовуючи мутагени можна змінити генетичні властивості мікроорганізмів і отримати штами з цінними для промисловості властивостями. До мутагенним факторів належать іонізуюче та неіонізуюче випромінювання, ізотопи, антибіотики, інші хімічні сполуки, що перетворюють спадкові елементи клітини. Незважаючи на визначальну роль генетичного фактора у біосинтезі ферментів, продуктивність біотехнологічних процесів залежить і від складу живильного середовища. При цьому важливо не тільки наявність джерел основних поживних речовин, але і речовин, що грають роль індукторів або репрессором біосинтезу даного конкретного ферменту або їх груп. Механізм цього явища ще не цілком вивчений, але сам факт має враховуватися при виборі технології.
Розглянемо кілька прикладів. Фермент ліпаза майже не синтезується грибом Aspergillus awamori на середовищі без індуктора, додавання жиру кашалота підсилює біосинтез ферменту в сотні разів. При додаванні ж у середу крохмалю і при повному виключенні мінерального фосфору інтенсивно синтезується фосфатаза. Не тільки наявність індуктора здатне збільшувати вихід ферменту. Важливу роль відіграє склад живильного середовища та умови культивування. При розробці процесу біосинтезу a-амілази культурою Aspergillus oryzae заміна сахарози (як джерело вуглецю) на крохмаль збільшила активність ферменту в 3 рази, додавання солодових екстрактів (з пророслих насіння злакових) ще в 10 разів, а підвищення концентрації основних елементів живильного середовища на 50% - ще в 2 рази.
Для інтенсифікації процесу зростання і синтезу ферментів додають різні чинники зростання, наприклад, амінокислоти, пуринові основи, а їх похідні, РНК і продукти її гідролізу. Як джерело вуглецю використовують крохмаль, кукурудзяний екстракт, соєве борошно, гідролізати біомаси дріжджів. Мікроорганізми можуть утилізувати і мінеральні джерела азоту. До складу поживних середовищ входять і іони MG, Mn, Zn, Fe, Cu та ін металів. Механізм дії більшості з них невідомий. Деякі входять до складу ферменту. Іони Ca підвищують стійкість a-амілази, іони Fe і Mg активізують і стабілізують протеолітичні ферменти.
Оптимальний склад живильного середовища для кожного продуцента може бути визначений двома способами: емпіричний і побудова математичної моделі з використанням комп'ютера. Останній, природно, переважно. За характером культивування всі технологічні процеси виробництва ферментних препаратів діляться на дві великі групи: глибинний і поверхневий методи.
Глибинний метод виробництва ферментів
У цьому випадку мікроорганізми вирощуються в рідкому поживному середовищі. Технічно більш досконалий, ніж поверхневий, так як легко піддається автоматизації і механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні зазвичай значно нижче, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.
При глибинному культивуванні продуцентів ферментів виділяють, як і в будь-якому біотехнологічному процесі, 5 етапів.
1. Приготування поживних середовищ залежить від складу компонентів.
Деякі попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для приготування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня обсіменіння об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації та апарати. Повітря очищається до і після аерірованія. До - тому що містить частинки пилу органічної та неорганічної природи, після - тому що несе клітини продуцента.
2. Отримання засевной матеріалу.
Для засіву живильного середовища матеріал готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів це міцеліальних вегетативна маса, для бактерій - молода зростаюча культура на початковій стадії спороутворення. Отримання посівного матеріалу полягає у збільшенні маси продуцента в 3-4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується лише вегетативно, він різко зростає (до 5-20%). Якщо ж відбувається рясне спороношення - скорочується до 1%.
3. Виробниче культивування.
Біосинтез ферментів в глибинній культурі протікає протягом 2-4 діб при безперервній подачі повітря і перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах можуть гальмувати ріст біомаси продуцента, тому часто свіжа середовище або деякі її компоненти вводяться в ферментер на стадії активного зростання. Температурний оптимум знаходиться в інтервалі 22-32оС. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості утворилися метаболітів і концентрації клітин. Дані надходять у комп'ютер, який визначає стратегію корекції процесу і автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкращу якість продуктів.
4. Виділення.
У міцелії тридобової культури зазвичай залишається не більше 15% ферментів. Решта виділяються в навколишнє клітини рідке середовище. У цьому випадку препарати ферментів виділяють з фільтратів після відділення біомаси.
5. Отримання товарної форми.
Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів
При поверхневому методі культура росте на поверхні твердої зволоженою живильного середовища. Міцелій повністю огортає і досить міцно скріплює тверді частинки субстрату, з якого отримують поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середовище повинна бути пухкою, а шар культури-продуцента невеликим.
Вирощування виробничої культури відбувається зазвичай в асептичних умовах, але середу та кювети необхідно простерилізувати. Перед кожним новим завантаженням також необхідна стерилізація устаткування.
Переваги поверхневої культури: значно більш висока кінцева концентрація ферменту на одиницю масу середовища (при осахаривании крохмалю 5 кг поверхневої культури замінюють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.
Посівний матеріал може бути трьох видів:
- Культура, що виросла на твердому живильному середовищі;
- Споровий матеріал;
- Міцеліальних культур, вирощена глибинним способом.
У три етапи отримують і посівну культуру. Спочатку музейну культуру продуцента пересівають на 1 - 1.5 г зволожених стерильних пшеничних висівок у пробірку і вирощують в термостаті до рясного спороутворення. Другий етап - аналогічно, але в колбах, третій - у посудинах з 500 г середовища.
Основу живильного середовища становлять пшеничні висівки, як джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до висівкам можна додавати буряковий жом, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середу гострим паром при помішуванні (температура - 105-140 С, час 60-90 хвилин). Після цього середу засівають і розкладають рівним шаром в стерильних кюветах. Кювети поміщають в растільние камери. Культивують протягом 36-48 годин.
Зростання ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набухання конідій та їх проростання (температура не нижче 28о С), потім ріст міцелію у вигляді гармата сірувато-білого кольору (необхідно виводити тепло, що виділяється) і утворення конідій. Для створення сприятливих умов росту і розвитку продуцента необхідна аерація і підтримка оптимальної вологості (55-70%).
Виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні культура являє корж з набряклих частинок середовища, щільно пов'язаних зрощеним міцелієм. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм. Культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40 ° С, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній і спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.
Схема очищення зводиться до наступного:
- Звільнення від нерозчинних речовин;
- Звільнення від супутніх розчинних речовин;
- Фракціонування (як правило, хроматографічними методами).
Для виділення ферменту з поверхневої культури необхідна екстракція. Як правило, екстраген - вода. При цьому в розчин переходять цукру, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення і очищення завершує сушіння. Після сушіння препарат повинен містити не більше 6-8% вологи, тоді він може в герметичній упаковці зберігатися до року без втрати активності.
Стандартизація ферментного препарату - доведення активності ферменту до стандартної, що відповідає вимогам ГОСТ. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі - крохмаль, лактоза та ін
Враховуючи величезні перспективи застосування ферментних препаратів у різних галузях промисловості і сільського господарства, медицини, можна зробити висновок про необхідність розширення досліджень в цій області для оптимізації технології та гарантійного отримання високоактивних і стабільних препаратів мікробних ферментів.
Іммобілізація ферментів
У сучасній біотехнології одне з чільних місць належить ферментам. Ферменти та ферментні системи широко використовуються в різних галузях промисловості, медицині, сільському господарстві, хімічному аналізі і т.д.
Ферменти - речовини білкової природи і тому нестійкі при зберіганні, а також чутливі до теплових впливів. Крім того, ферменти не можуть бути використані багаторазово через труднощі у відділенні їх від реагентів та продуктів реакції. Вирішити ці проблеми допомагає створення іммобілізованих ферментів. Початок цьому методу було покладено в 1916 році, коли Дж. Нельсон і Є. Гріффін адсорбувати на вугіллі інвертазу і показали, що вона зберігає в такому вигляді каталітичну активність. Сам термін "іммобілізовані ферменти узаконений в 1971 році, і означає будь-яке обмеження свободи пересування білкових молекул у просторі.
. Сутність іммобілізації ферментів - прикріплення їх в активній формі до нерозчинної основі або ув'язнення в напівпроникну мембранну систему. Прикріплення ферменту до носія здійснюється адсорбційно, хімічним зв'язком або шляхом механічного включення ферменту в органічний або неорганічний гель (в капсулу і т. п.). При цьому допускається прикріплення ферменту тільки за рахунок функціональних груп, що не входять в активний центр ферменту і не беруть участь в утворенні фермент-субстратного комплексу. Носій ферменту або матриця може име ^ ь вид зернистого матеріалу, волокнистої структури, пластинчастої поверхні, плівок або тканин, порожнистих волокон, трубочок, капсул і т. д. Має значення розмір частинок носія. Важливо мати велику поверхню, тому рекомендуються невеликі частинки діаметром 0,1-0,2 мм. Носій ферменту може бути як природна речовина, так і синтетичний полімер.
Переваги іммобілізованих ферментів перед нативними попередниками:
1. Гетерогенний каталізатор легко відділимо від реакційного середовища, що дає можливість зупинити реакцію в будь-який момент, використовувати фермент повторно, а також одержувати чистий від ферменту продукт.
2. Ферментативний процес з використанням іммобілізованих ферментів можна проводити безперервно, регулюючи швидкість каталізуються реакції і вихід продукту.
3. Модифікація ферменту цілеспрямовано змінює його властивості, такі як специфічність (особливо щодо макромолекулярного субстрату), залежність каталітичної активності від рН, іонного складу та інших параметрів середовища, стабільність до денатуруючих впливів.
4. Можна регулювати каталітичну активність іммобілізованих ферментів шляхом зміни властивостей носія дією фізичних факторів, таких як світло та звук. Іммобілізувати ферменти можна як шляхом зв'язування на нерозчинних носіях, так і шляхом внутрішньомолекулярної або міжмолекулярної зшивки білкових молекул низькомолекулярними біфункціональних з'єднань, а також шляхом приєднання до розчинного полімеру.
Широке застосування в нашій країні і за кордоном знаходять ферментні препарати і продукти, що володіють амілолітичною активністю. У нашій країні випускають такі амилолитические ферментні препарати: з активної &-амилазой - Амілорізін П10х, амилосубтилина Г10х; глюкоамилазой - Глюкоамилаза очищена. Крім того, виробляються білий солод і солодові екстракти з активною &-амилазой, які виробляються з пророслого зерна жита чи ячменю.
Під дією амілолітичних ферментів підвищується вміст зброджують цукор у тесті, що призводить до інтенсифікації процесу дозрівання напівфабрикатів, збільшення кількості декстринів, що сприяє збереженню свіжості хліба.
При додаванні ферментних препаратів в оптимальних дозах збільшується обсяг хлібобулочних виробів, поліпшується структура їх пористості, м'якуш стає більш ніжним, поліпшуються смак і аромат хліба, кірка набуває більш інтенсивне забарвлення і глянець.
У складі Амілорізіна П10х міститься комплекс ферментів амилолитического і протеолитического дії, найбільше значення з яких має &-амілаза. Продуцентом Амілорізіна П10х є пліснявий гриб Aspergillus oryzae. Оптимальні умови дії Амілорізіна Шох-рН 4,7-5,4 і температура 40-45 ° С.
Амилосубтилина Г10х представляє собою очищений ферментний препарат, утворений Bacillus subtilis. Препарат містить &-амілазу, (3-глюканазу і протеазу. Оптимальними умовами дії препарату є рН 6,0-6,3 і температура 50-55 ° С. Бактеріальна?-Амілаза в порівнянні з грибною має високу термостабильностью, температура інактивації становить 63 -71 ° С.
Амілорізін П10х і амилосубтилина Г10х надають найбільш ефективну дію при додаванні до борошна з пружною, недостатньо еластичною клейковиною, із зниженою і нормальною сахарообразующую здатністю (180-250 мг мальтози на 10 г борошна) і автолітіческой активністю до 30%.
Глюкоамилаза очищена (оптимальні умови дії: рН 3,0-5,0; температура 55-60 ° С) - препарат, продуцентом якого є гриб Aspergollus awamory або штам дріжджів Endomycopsiz sp. 20-9, знаходить застосування при виробництві високоосахаренних ферментативних напівфабрикатів і рідких дріжджів.
Значним недоліком застосування амилолитических препаратів є наявність в їх складі протеази, що ускладнює їх використання при переробці борошна з пониженим вмістом клейковини, а також слабкою по силі. Хлібні вироби кращої якості виходять при сумісному внесенні амілолітичних ферментів і покращувачів окисного дії.
Вітчизняний цитолітичним ферментний препарат, продуцентом якого є культура гриба Trichothecium rozeum, володіє геміцеллюлазной, целлобіазной, пентозаназной активністю. У результаті досліджень з пошуку можливостей використання в хлібопекарській промисловості Цітороземіна П10х, який відрізняється високою цитолітичної і незначною аміполітіческой і протеолітичної активністю, було зроблено такий висновок: додавання його в тісто в діапазоні концентрацій від 0,01 до 0,1% до маси борошна сприяє додатковому збагаченню тесту редукуючими цукрами, призводить до значного накопичення в ньому водорозчинних пентозанів, зміни пружно-пластичних властивостей клейковини, сприяє поліпшенню реологічних властивостей геста, що призводить до збільшення об'ємного виходу хліба.
Зарубіжні аналоги ферментних препаратів
Зарубіжними фірмами, також випускаються ферментні препарати, що володіють амілолітичною активністю. До них відносяться: Fungamyl BG (Фунгаміл BG), виготовлений на основі очищеної грибний амілази (оптимум рН 4,5-5,0 температури 53-55 ° С), Bioferm P, Biobake P conc, Grindamyl A 1000, характеризуються низьким рівнем амілоглюкозідазной і протеїназно активності, що дозволяє застосовувати їх при переробці борошна з різними хлібопекарськими властивостями.
Gungamyl Super AX, Biobake 721 і Grindarmyl100 розроблені для корекції низькою амілолітичною активності борошна, а також для поліпшення структури м'якушки, підвищення обсягу хлібобулочних виробів і продовження терміну зберігання свіжості.
Препарати Novamyl, Biobake 2000, Grindamyl MAX-LIFE U4 і Grindamyl MAX-LIFE Е5 призначені для подовження терміну зберігання хліба у свіжому стані. Ферментний препарат Novamyl проявляє максимальну активність при випічці тестових заготівель (оптимуми рН 5,8-6,0, температури 54-76 ° С) і сприяє більш повному протіканню процесу клейстеризації крохмалю, що призводить до значного збільшення терміну свіжості хліба.
Grindamyl MAX-LIFE U4 - ферментний комплекс, що складається з грибний і бактеріальної амілаз, розроблений для уповільнення черствіння хлібних виробів, вироблюваних опарним способом, Крім того, додавання ферментного препарату Grindamyl MAX-LIFE U4 призводить до поліпшення показника стабільності тесту. Препарат Grindamyl MAX-LIFE E5 грибного походження доцільно застосовувати при прискорених технологіях.
Ферментні препарати з геміцеллюлазной активністю діють на нерозчинні високомолекулярні пентозани, що містяться в пшеничному тісті, збільшують частку низькомолекулярних пентозанів, що сприяє утворенню більш міцного каркаса клейковини. Внесення препаратів з геміцеллюлазной активністю сприяє збільшенню частки зв'язаної вологи в тісті. Це призводить до збільшення водопотлотітельной здібності напівфабрикатів і, отже, до поліпшення структурно-механічних властивостей тіста.
Із зарубіжних ферментних препаратів з геміцеллюлазной активністю застосовують препарат Pentopan 500 BG (Пентопан 500 BG), що представляє очищений препарат ферменту, отриманого при культивуванні Humicola insolens і виявляє пентозаназную активність (оптимальні умови рН 5-6 і 4 ° С). Застосування цього препарату сприяє стабілізації властивостей тіста, збільшення обсягу хліба, поліпшенню структури м'якушки, продовженню терміну зберігання свіжості готових виробів.
Протеолітичні ферментні препарати, що каталізують гидролитическое розщеплення білкових речовин, доцільно використовувати при переробці борошна з надмірно сильної клейковиною, оскільки ферменти цієї групи, проявляючи відновну активність, надають деструктуруючих дію на клейковину борошна і покращують реологічні властивості тіста. Крови того, ферментні препарати цієї групи застосовують при виробництві затяжного печива, крекерів, листкових виробів з бездріжджового теста.К протеолітичних ферментних препаратів відносяться Прото-субтілін Г10х або Г20х, продуцентом якого є Bacillus subtilis, а також Протозім, Neutease (Novo Noelisk).
Ферментні препарати, які мають липолитической активністю, в якості основного ферменту містять активну ліпазу. Фермент ліпаза здійснює гідроліз триацилгліцеридів з утворенням жирних кислот і гліцерину. Як препарат з ліполітичною активністю застосовують Новозім 677 BG (Novo Noelisk). Застосування цього препарату дозволяє збільшувати стабільність тіста і об'єм хліба, поліпшувати структуру пористості і колір м'якушки.
Список використаної літератури
1. Бірюков, В.В. Основи промислової біотехнології / В.В. Бірюков. - М. Колос, 2004.
2. Варфоломєєв С.Д., Гуревич К.Г. Біокінетики: практичний курс. - М.: Файр-ПРЕС, 1999. - 720 с.
3. Грачова І.М., Кривова А.Ю. Технологія ферментних препаратів. - 3-е изд., Перераб. і доп. М.: Изд-во "Елевар" 2000. 512с. мул.
4. Грачова, І.М. Технологія ферментних препаратів / І.М. Грачова. - М.: Агропромиздат, 1985.
5. Кіслухіна, О.В. Ферменти у виробництві їжі та кормів / О. В. Кіслухіна. - М.: Колос, 2002.
6. Манаков, М.М. Теоретичні основи промислової біотехнології / М.Н. Манаков, Д.Г. Победимський. - М.: Вища школа, 1989. - 310 с.