Передача інформації в нервовій системі
Передача інформації в нервовій системі
Електричні сигнали, що забезпечують функціонування нервових клітин, опосередковані потоком іонів через водопроникні пори клітинної мембрани. Ці пори, утворені трансмембранних білків, називаються іонними каналами. До теперішнього часу розроблені високочутливі методи, що дозволяють зареєструвати і виміряти іонні струми, що протікають через поодинокі іонні канали.
Деякі іонні канали вибірково проникні тільки для катіонів, тоді як інші проводять тільки аніони. Катіонні канали можуть бути високо виборчими по відношенню до одного іону, наприклад натрію. Іонні канали здійснюють переходи між відкритим та закритим станом і мають, як правило, характерний час відкритого стану. Їхній внесок в іонний струм через клітинну мембрану визначається відносною кількістю часу, який вони знаходяться у відкритому стані.
Відкриття каналу регулюється різними механізмами. Деякі з цих механізмів фізичні, такі як розтягнення мембрани або зміни мембранного потенціалу. Інші механізми хімічні, включають зв'язування активних молекул (лігандів) з активним центром, який розташовується або з позаклітинної, або з внутрішньоклітинної боку каналу.
Важливою властивістю каналів, на додаток до кінетиці відкриття і закриття, є здатність відкритого каналу проводити іонний струм. Один із способів, яким іони можуть проникати через відкритий канал, є проста дифузія. Інший спосіб - взаємодія іонів з внутрішньоканальні центрами зв'язування і перескакування всередині водної пори від одного центру до іншого. У будь-якому випадку рух іона через канал є пасивним і визначається градієнтом концентрації і градієнтом електричного потенціалу на мембрані.
Кількість струму, що проходить через відкритий канал по електричному градієнту, залежить від проникності каналу для даного типу іонів. Величина струму також залежить від концентрації іонів в гирлах каналу. Ці два фактори, проникність і концентрація, визначають провідність каналу.
Передача імпульсу в нервовій системі опосередковується змінами мембранного потенціалу. У сенсорних нейронах адекватний стимул, такий як дотик, звук, світло, викликає локальну деполяризацію (роблячи мембранний потенціал менш негативним) або гіперполяризацію (мембранний потенціал стає більш негативним). Подібним же чином нейротрансмітери в синапсах викликають деполяризацію або гіперполяризацію постсинаптичні клітини. Потенціали дії, що являють собою короткі деполярізаціонние сигнали великої амплітуди, проводять по відростках нейрона інформацію з одного відділу нервової системи в іншій.
Всі ці зміни мембранного потенціалу викликані рухом іонів через клітинну мембрану. Наприклад, спрямоване всередину клітини рух позитивно заряджених іонів натрію знижує загальний негативний заряд мембрани або, іншими словами, викликає деполяризацію. Навпаки, результатом руху позитивно заряджених іонів калію з клітини є зростання загального негативного заряду, тобто гіперполяризація. Гиперполяризация може бути зумовлена також рухом всередину клітини негативно заряджених іонів хлору.
Як рухаються іони через клітинну мембрану і чим їх рух регулюється? Головним шляхом для швидкого переміщення іонів всередину клітки і з неї є іонні канали. Іонні канали являють собою вбудовані в мембрану молекули білка, які утворюють пори, проникні для іонів. Іонні струми регулюються через відкриття і закриття цих іонних каналів. Знання механізмів роботи іонних каналів дозволяє зрозуміти, як генеруються електричні сигнали.
Властивості іонних каналів. Клітинна мембрана нервової клітини
Клітинні мембрани складаються з рідкої фази ліпідів і вбудованих в ліпіди белковихмолекул. Молекули ліпідів організовані в двошаровий мембрану (бішар) товщиною близько 6 нм. Полярні гідрофільні головки ліпідів звернені до поверхонь мембрани, а гідрофобні хвости витягнуті до середини бішару. Ліпіди погано пропускають воду і практично непроникні для іонів. Білкові молекули частково занурені в шар ліпідів, або з позаклітинної, або з цитоплазматичної сторони. Деякі білки цілком пронизують мембрану. Саме пронизують мембрану (трансмембранні) білки утворюють іонні канали. Основні іони, що беруть участь в генерації електричних сигналів, такі як калій, натрій, кальцій або хлор, рухаються через іонні канали пасивно завдяки градієнту концентрацій і електричного потенціалу мембрани.
Інші трансмембранні білки служать як насосів і переносників, що забезпечують транспорт речовин через клітинну мембрану проти електрохімічних градієнтів. Транспортні механізми підтримують іонний склад цитоплазми, видаляючи або повертаючи ті іони, які пройшли клітинну мембрану по їх електрохімічним градієнтам. Вони також виконують важливу функцію переносу через клітинні мембрани субстратів метаболічних реакцій, таких як глюкоза і амінокислоти
Для іонних каналів функціонально важливими є переходи між відкритим та закритим станами. Ці переходи відбуваються практично моментально. З іншого боку, при системному вивченні поведінки будь-якого іонного каналу ми виявимо, що час відкритого стану варіює випадковим чином. Іноді канал відкритий тільки одну мілісекунду або навіть менше, хоча в наступний раз він може бути відкритий на набагато більш тривалий час. Тим не менш, кожен канал має характерне середній час відкритого стану (т), і всі варіації відбуваються навколо цього середнього показника.
Деякі іонні канали відкриваються досить часто навіть у спокої. Іншими словами, вірогідність знаходження таких каналів у відкритому стані в неактивованої клітці відносно висока. Більшість таких іонних каналів проникності для калію або хлору. Вони важливі для генерації мембранного потенціалу спокою. Решта іонні канали при цьому закриті, то є ймовірність знаходження їх у відкритому стані дуже низька. Активація цих каналів адекватним стимулом різко збільшує ймовірність відкриття. Цей же стимул може деактивувати іонні канали, колишні активними у спокої. Важливо пам'ятати, що активація або деактивація каналу означає зростання або зниження ймовірності відкриття каналу, але не збільшення або зменшення часу відкритого стану (т) каналу.
Крім активації та деактивації, іонний струм через канали регулюється двома іншими факторами. Перший чинник полягає в тому, що іонний канал переходить у нове конформационное стан, в якому звичайний активуючий стимул не здатний викликати відкриття каналу. Для іонних каналів, які активуються деполяризацією, такий стан називається інактивацією. Для каналів, що відповідають на хімічні стимули, це стан відомо як десенсітнзація. Другий механізм - блок відкритого каналу. Таке трапляється, коли, наприклад, велика молекула (така як токсин) зв'язується з іонним каналом і фізично закупорює пори. Іншим прикладом може служити блокування деяких катіонних каналів іонами магнію. У цьому випадку іони магнію самі не проникають через іонний канал, але зв'язуються з каналом в області його гирла і тим самим заважають проникненню інших катіонів.
Деякі канали специфічно відповідають на фізичні зміни в клітинній мембрані нейрона. Найбільш яскравими представниками цієї групи є потенціал-активуються канали. Прикладом може служити чутливий до потенціалу натрієвий канал, який відповідає за регенеративну деполяризацію, що лежить в основі генерації потенціалу дії. До цієї групи належать також механочувствітельние іонні канали, які відповідають на механічну дію на клітинну мембрану. Рецептори розтягнення, що містять іонні канали такого роду, знайдені в механорецептори шкіри.
Інші іонні канали відкриваються тоді, коли хімічні агенти активують зв'язують центри на молекулі каналу. Такі ліганд-актівіруемие іонні канали поділяються на дві підгрупи, в залежності від того, чи є активні центри внутрішньоклітинними або позаклітинними. Каналом, який відповідає на позаклітинне активацію, є катіонний канал постсинаптичної мембрани в скелетному м'язі. Цей канал активується нейротрансмітером ацетилхоліном, вивільнюваним з рухового нервового закінчення. Відкриття ацетилхолін-активованого іонного каналу дозволяє іонам натрію увійти в клітку, викликаючи деполяризацію м'язового волокна.
Ліганд-активуються канали, що відповідають на внутрішньоклітинні стимули, вносять канали, чутливі до місцевих змін концентрації специфічних іонів. Наприклад, кальцій-актівіруемие калієві канали активуються локальним підвищенням концентрації внутрішньоклітинного кальцію. Такі канали відіграють важливу роль у реполяризації клітинної мембрани під час завершення потенціалу дії. Крім іонів кальцію, типовими представниками лігандів, що активують іонні канали з цитоплазматичною боку мембрани, є циклічні нуклеотиди. Циклічний ГМФ, наприклад, відповідає за активацію натрієвих каналів в паличках сітківки. Такий тип каналу грає принципову роль у роботі зорового аналізатора.
Ця класифікація не є досить суворою. Наприклад, кальцій-актівіруемие калієві канали чутливі також до зміни потенціалу, а деякі потенціал-актівіруемие іонні канали чутливі до внутрішньоклітинним лигандам.
Для вимірювання іонних струмів через поодинокі канали спочатку був запропонований непрямий метод аналізу мембранного шуму. Потім був розроблений спосіб прямої реєстрації одиночних іонних каналів за допомогою методу, який називається Петч-кламп (patch-clamp). У сукупності ці підходи дали прямі відповіді на питання, що стосуються функції іонних каналів, як то: який заряд проходить через одиночний канал? як довго канал залишається відкритим? як час перебування іонного каналу у відкритому чи закритому стані залежить від мембранного потенціалу?
Петч-кламп метод, запропонований Е. Неєра, Б. Сакманном та їх колегами, значно поглибив наші знання про функціонування іонних каналів. Для Петч-кламп реєстрації необхідно, щоб кінчик скляної піпетки з внутрішнім діаметром близько 1 мкм щільно контактував з мембраною досліджуваної клітини. При вдалому підведенні, завдяки легкому присмоктуванню, між клітинною мембраною і склом піпетки створюється опір більше 10 9 Ом (звідси виник термін «гігаомний контакт», gigaohm seal). Коли піпетка з'єднана з відповідним підсилювачем, можна зареєструвати невеликі струми, що проходять через ділянку мембрани, що знаходиться всередині кінчика піпетки. Така конфігурація Петч-кламп методу називається cell attached (контакт з клітиною). Високоомний контакт гарантує, що іонні струми, що проводяться цією ділянкою клітинної мембрани, проходять переважно через підсилювальну апаратуру, а не губляться в місці контакту Петч-піпетки з клітиною. При використанні Петч-кламп методу реєструються події складаються з прямокутних струмових сигналів, що відображають процеси відкриття і закриття одиночних іонних каналів. Таким чином, ми в реальному часі можемо спостерігати активність одиночних білкових молекул мембрани.
У простому випадку струми поодиноких каналів з'являються нерегулярно і з різною тривалістю, але з постійною амплітудою. У деяких випадках, проте, картина струмів може бути більш складною. Деякі іонні канали, наприклад, у відкритому стані можуть мати більш ніж один рівень провідності. Крім того, іонні канали можуть проявляти комплексну кінетику. Наприклад, струм через одиночний іонний канал може виглядати не як простий прямокутник, а як «спалах» відкриттів каналу.
Таким чином, Петч-кламп метод надає нові унікальні можливості для вивчення поведінки іонних каналів. По-перше, ізоляція маленької ділянки мембрани дозволяє спостерігати активність всього декількох іонних каналів, а не тисяч, які активуються в цілій клітині. По-друге, високий опір контакту дає можливість реєструвати навіть вкрай поодиноких іонних каналів і можемо провести аналіз кінетики каналів.
Петч-кламп метод дозволяє здійснювати також реєстрацію іонних каналів і в інших конфігураціях. Досягнувши контакту в конфігурації cell attached, можна, відводячи електрод, відтягнути ділянку мембрани для формування inside-out (внутрішня сторона назовні) конфігурації. В останньому випадку цитоплазматична сторона мембрани буде звернена до перфузійні розчини. З іншого боку, за допомогою невеликого додаткового присмоктування можна прорвати ділянку мембрани, розташований усередині реєструючого електрода, забезпечивши контакт останнього з цитоплазмою клітини. У цих умовах будуть реєструватися струми в конфігурації whole-cell (ціла клітина). Нарешті, після отримання конфігурації «ціла клітина», можна відтягнути електрод від клітини, сформувавши з мембрани спочатку тонку перемичку, а потім, після відділення цієї ділянки, отримати конфігурацію outside-out (зовнішня сторона назовні). Кожна з цих конфігурацій має свої переваги, їх використання залежить від типу досліджуваного іонного каналу і тієї інформації, яку ми хочемо отримати в даному експерименті. Наприклад, для аплікації речовин на зовнішню сторону мембрани кращою є конфігурація outside-out.
Петч-кламп конфігурація «ціла клітина» передбачає обмін між цитоплазмою клітини і розчином, що заповнює реєструючу піпетку. Цей обмін, званий іноді «діаліз», може бути використаний для навмисної заміни внутрішньоклітинного складу іонів на ті, які знаходяться в піпетці. З іншого боку (особливо в тих випадках, коли клітина мала), необхідно враховувати, що важливі цитоплазматичні компоненти можуть бути втрачені через їх швидкого переходу під внутріпіпеточний розчин. Такий втрати можна уникнути, використовуючи так званий перфорований Петч-кламп метод. У цьому випадку для формування початкової cell attached конфігурації використовується піпетка, заповнена речовиною, здатним формувати мембранні пори (наприклад антибіотик ністатин). Після деякого часу в ізольованому за допомогою електрода ділянці мембрани утворюються проникні для електролітів пори, що дозволяють реєструвати іонні струми в конфігурації «ціла клітина».
До розробки Петч-кламп методу властивості іонних каналів в клітинних мембранах досліджувалися в експериментах, в яких для вимірювання мембранного потенціалу або мембранного струму використовувалися скляні мікроелектроди. Використання Лінгом і Джерардом в 1949 році скляних мікроелектродів для внутрішньоклітинної реєстрації іонних струмів в живих клітинах було не менш важливою подією, ніж введення Петч-кламп методу три десятиліття по тому. Цей метод забезпечував точне вимірювання мембранного потенціалу спокою клітини, потенціалу дії, а також відповідей на синаптичну активацію м'язових волокон і нейронів.
Метод внутрішньоклітинної реєстрації. Гостра скляна микропипетка, діаметр кінчика якої не перевищує 0,5 мкм, заповнена концентрованим сольовим розчином (наприклад, 3 M KC1), служить електродом і приєднується до вольтметра для запису потенціалу. Момент проколювання піпеткою клітинної мембрани, що призводить до проникнення її в клітинну цитоплазму, виявляється миттєвою появою потенціалу, що відповідає мембранному потенціалу спокою. При вдалому проникненні у клітину мембрана обхоплює зовнішню поверхню піпетки, завдяки чому цитоплазма залишається ізольованою від позаклітинної рідини.
На початку 1970-х років, використовуючи нервово-м'язовий синапс жаби, Катц і Міледі зробили оригінальні експерименти, в яких метод внутрішньоклітинної мікроелектродної реєстрації використовувався для вивчення характеристик «шумів», продукованих медіатором ацетилхоліном (АХ). У такому синапсі АХ, освобождаюшійся з моторного нервового закінчення, відкриває хемовозбудімие іонні канали постсинаптичної мембрани. Вхід катіонів у волокно через відкриті іонні канали викликає деполяризацію мембрани. Коли Катц і Міледі локально аппліціровалі екзогенний АХ на область синапсу, вони виявили, що викликана деполяризація супроводжувалася електричним «шумом». Під час стабільної деполяризації швидкі коливання потенціалу були набагато більше коливань ізолінії в спокої. Вони припустили, що зростання електричного шуму в присутності АХ було пов'язано з хаотичним відкриттям і закриттям АХ-активуються іонних каналів. Іншими словами, аплікація АХ призводила до відкриття великої кількості іонних каналів, і число це випадково коливалося в залежності від кількості взаємодій АХ з рецепторами.
Використовуючи відому з фізики техніку аналізу шуму, Катц і Міледі змогли отримати інформацію про середньостатистичний поведінці окремого іонного каналу, який активується АХ. Пізніше подібні експерименти були проведені на тому ж об'єкті Anderson і Stevens. На відміну від попередників, ці дослідники вимірювали мембранний струм, викликаний АХ, що дозволило встановити величину і тривалість іонних струмів через одиночний канал.
Принципи аналізу шуму досить прості: по-перше, якщо струми одиночного каналу є великими, сумарний шум також буде більшим. По-друге, іонні канали, що відкриваються на відносно тривалий час, будуть продукувати низькочастотний шум; навпаки, канали, що відкриваються на короткий час, будуть продукувати високочастотний шум. Дослідження амплітудно-часових характеристик шумів, активованих АХ в нервово-м'язовому синапсі, показало, що через одиночний відкритий іонний канал проходить близько 10 мільйонів іонів за секунду. Крім того, з'ясувалося, що значення середнього відкритого часу іонного каналу складає від 1 до 2 мс.
Незважаючи на широке витіснення Петч-кламп методом, аналіз шуму до цих пір використовується для вивчення іонних каналів в клітинах, які не піддаються дослідженню за допомогою Петч-клампи, наприклад, в деяких областях центральної нервової системи. Крім того, аналіз шуму є порівняно швидким методом для отримання інформації про властивості велику популяцію каналів і використовується в комбінації з Петч-кламп реєстрацією від цілої клітини для ідентифікації типів каналів. Тим не менш, треба розуміти, що за допомогою аналізу шуму неможливо отримати детальну інформацію про поведінку одиночного каналу, особливо в каналах зі складною кінетикою або за наявності декількох рівнів провідності каналу.
Кінетичне поведінку каналу, то є час його перебування в закритому і відкритому станах, може надати інформацію про механізми відкриття та закриття каналу, а також про константи швидкостей цих процесів. З іншого боку, величина струму, що проходить через іонний канал, є прямим відображенням того, як швидко проникають іони рухаються через канал. Струм іонів залежить не тільки від властивостей каналу, але також від трансмембранного потенціалу. На цьому малюнку зображено фрагмент мембрани, який містить один спонтанно активний іонний канал, проникний для калію. Розчини, як в піпетці, так і у ванні для об'єкта, містять однакову (150 ммоль) концентрацію іонів калію. Іони калію через відкритий канал можуть рухатися в обох напрямах. Однак оскільки концентрації іонів по обидві сторони мембрани ідентичні, а трансмембранний потенціал відсутній, то немає ніякого руху іонів в жодному Петч-кламп метод має гідність, яке ще не було згадано: ми можемо міняти потенціал на реєструючої піпетці і варіювати, таким чином, трансмембранну різниця потенціалів. Наприклад, при мембранному потенціалі +20 Мв кожне відкриття калієвого іонного каналу супроводжується струмом, спрямованим назовні. Це пов'язано з тим, що позитивно заряджені іони калію рухаються через канал по електричному градієнту між розчином в піпетці і у ванні. З іншого боку, коли всередині піпетки створений негативний потенціал величиною в -20 мВток спрямований у зворотному напрямку (через відкритий канал в піпетку).
Залежність струму є лінійною: струм (I), що проходить через канал, пропорційний потенціалу (V):
Це формула являє собою перетворений закон Ома. Константа 7 називається провідністю каналу. При одному і тому ж потенціалі на мембрані канал з високою провідністю переносить багато струму, канал з низькою провідністю проводить малий струм.
Провідність вимірюється У Сіменс (См). У нейронах трансмембранний потенціал зазвичай виражається в мілівольтах (1 мВ = 10 -3 В), струми одиночних іонних каналів в пікоампер (1 пА = 10 -12 А), провідність у пікосіменсах (1 ПСМ = 10 -12 См). потенціал +20 мВ продукував струм близько 2,2 пА, відповідно провідність каналу (I / V) склала 2,2 пА/20 мВ = 110 ПСМ
Канали різняться за своєю вибірковості: деякі катіонні канали пропускають тільки натрій, калій або кальцій, інші є менш виборчими. Аніонні канали порівняно не вибагливі для малих аніонів, але вони пропускають в основному іони хлору, тому що хлор є найпоширенішим аніоном позаклітинної і внутрішньоклітинної рідин.
Література
Крутько В.М., Славін М.Б., Смирнова Т.М. Математичні підстави геронтології.
Реутов В.П. та ін Проблема оксиду азоту в біології та медицині і принцип циклічності.
Методологія біології: нові ідеї (синергетика, семіотика, коеволюція). Ред. Баксанский О.Е.
Новіков Г.Г. Ріст і енергетика розвитку костистих риб у ранньому онтогенезі
Передача інформації в нервовій системі
Електричні сигнали, що забезпечують функціонування нервових клітин, опосередковані потоком іонів через водопроникні пори клітинної мембрани. Ці пори, утворені трансмембранних білків, називаються іонними каналами. До теперішнього часу розроблені високочутливі методи, що дозволяють зареєструвати і виміряти іонні струми, що протікають через поодинокі іонні канали.
Деякі іонні канали вибірково проникні тільки для катіонів, тоді як інші проводять тільки аніони. Катіонні канали можуть бути високо виборчими по відношенню до одного іону, наприклад натрію. Іонні канали здійснюють переходи між відкритим та закритим станом і мають, як правило, характерний час відкритого стану. Їхній внесок в іонний струм через клітинну мембрану визначається відносною кількістю часу, який вони знаходяться у відкритому стані.
Відкриття каналу регулюється різними механізмами. Деякі з цих механізмів фізичні, такі як розтягнення мембрани або зміни мембранного потенціалу. Інші механізми хімічні, включають зв'язування активних молекул (лігандів) з активним центром, який розташовується або з позаклітинної, або з внутрішньоклітинної боку каналу.
Важливою властивістю каналів, на додаток до кінетиці відкриття і закриття, є здатність відкритого каналу проводити іонний струм. Один із способів, яким іони можуть проникати через відкритий канал, є проста дифузія. Інший спосіб - взаємодія іонів з внутрішньоканальні центрами зв'язування і перескакування всередині водної пори від одного центру до іншого. У будь-якому випадку рух іона через канал є пасивним і визначається градієнтом концентрації і градієнтом електричного потенціалу на мембрані.
Кількість струму, що проходить через відкритий канал по електричному градієнту, залежить від проникності каналу для даного типу іонів. Величина струму також залежить від концентрації іонів в гирлах каналу. Ці два фактори, проникність і концентрація, визначають провідність каналу.
Передача імпульсу в нервовій системі опосередковується змінами мембранного потенціалу. У сенсорних нейронах адекватний стимул, такий як дотик, звук, світло, викликає локальну деполяризацію (роблячи мембранний потенціал менш негативним) або гіперполяризацію (мембранний потенціал стає більш негативним). Подібним же чином нейротрансмітери в синапсах викликають деполяризацію або гіперполяризацію постсинаптичні клітини. Потенціали дії, що являють собою короткі деполярізаціонние сигнали великої амплітуди, проводять по відростках нейрона інформацію з одного відділу нервової системи в іншій.
Всі ці зміни мембранного потенціалу викликані рухом іонів через клітинну мембрану. Наприклад, спрямоване всередину клітини рух позитивно заряджених іонів натрію знижує загальний негативний заряд мембрани або, іншими словами, викликає деполяризацію. Навпаки, результатом руху позитивно заряджених іонів калію з клітини є зростання загального негативного заряду, тобто гіперполяризація. Гиперполяризация може бути зумовлена також рухом всередину клітини негативно заряджених іонів хлору.
Як рухаються іони через клітинну мембрану і чим їх рух регулюється? Головним шляхом для швидкого переміщення іонів всередину клітки і з неї є іонні канали. Іонні канали являють собою вбудовані в мембрану молекули білка, які утворюють пори, проникні для іонів. Іонні струми регулюються через відкриття і закриття цих іонних каналів. Знання механізмів роботи іонних каналів дозволяє зрозуміти, як генеруються електричні сигнали.
Властивості іонних каналів. Клітинна мембрана нервової клітини
Клітинні мембрани складаються з рідкої фази ліпідів і вбудованих в ліпіди белковихмолекул. Молекули ліпідів організовані в двошаровий мембрану (бішар) товщиною близько 6 нм. Полярні гідрофільні головки ліпідів звернені до поверхонь мембрани, а гідрофобні хвости витягнуті до середини бішару. Ліпіди погано пропускають воду і практично непроникні для іонів. Білкові молекули частково занурені в шар ліпідів, або з позаклітинної, або з цитоплазматичної сторони. Деякі білки цілком пронизують мембрану. Саме пронизують мембрану (трансмембранні) білки утворюють іонні канали. Основні іони, що беруть участь в генерації електричних сигналів, такі як калій, натрій, кальцій або хлор, рухаються через іонні канали пасивно завдяки градієнту концентрацій і електричного потенціалу мембрани.
Інші трансмембранні білки служать як насосів і переносників, що забезпечують транспорт речовин через клітинну мембрану проти електрохімічних градієнтів. Транспортні механізми підтримують іонний склад цитоплазми, видаляючи або повертаючи ті іони, які пройшли клітинну мембрану по їх електрохімічним градієнтам. Вони також виконують важливу функцію переносу через клітинні мембрани субстратів метаболічних реакцій, таких як глюкоза і амінокислоти
Мембранні канали відрізняються за своєю вибірковості: деякі проникні для катіонів, інші для аніонів. Деякі катіонні канали є селективними по відношенню тільки до одного виду іона. Наприклад, деякі канали проникні виключно для іонів натрію, інші для іонів калію, інші для іонів кальцію. Однак існують щодо неселективні катіонні канали, що дозволяють проходити навіть невеликим органічним катіонів. Аніонні канали, пов'язані з передачею електричного імпульсу, мають низьку специфічністю. Проте вони, як правило, називаються «хлорних каналів», тому що іон хлору є найбільш поширеним рухомим аніоном в біологічних рідинах. До того ж, деякі канали (звані коннексонамі) з'єднують сусідні клітини і проникні як для багатьох неорганічних іонів, так і для деяких дрібних органічних молекул
Хоча для простоти ми часто представляємо білкові молекули як статичні структури, вони такими зовсім не є. Через свою теплової енергії всі великі молекули внутрішньо нестабільні. При кімнатній температурі хімічні зв'язки розтягуються і послаблюються, тобто постійно коливаються стосовно до стійкого стану. Незважаючи на те, що ці індивідуальні руху становлять величину тільки близько 10 -12 м (з частотою, що досягає 10 13 Гц), такі атомні коливання можуть приводити в підсумку до набагато більш значним і більш повільних змін у структурі молекул. Це відбувається тому, що численні швидкі рухи атомів періодично створюють умови для взаємодії функціональних груп білка, незважаючи на наявність взаємних відштовхують сил. Взаємодії функціональних груп призводять до кінетичним переходах білка, які, раз виникнувши, можуть тривати багато мілісекунди або навіть секунди. Відомим прикладом може служити молекула гемоглобіну. Центри зв'язування кисню укладені усередині макромолекули цього білка і до них немає постійного вільного доступу. Зв'язування кисню може бути досягнуто тільки за рахунок транзиторного доступу молекул газу до центрів зв'язування на молекулі тема. Таким чином, молекула гемоглобіну «дихає», періодично стаючи доступною для зв'язування кисню, інакше цей білок був би не здатний виконувати призначену функцію з перенесення газів.Для іонних каналів функціонально важливими є переходи між відкритим та закритим станами. Ці переходи відбуваються практично моментально. З іншого боку, при системному вивченні поведінки будь-якого іонного каналу ми виявимо, що час відкритого стану варіює випадковим чином. Іноді канал відкритий тільки одну мілісекунду або навіть менше, хоча в наступний раз він може бути відкритий на набагато більш тривалий час. Тим не менш, кожен канал має характерне середній час відкритого стану (т), і всі варіації відбуваються навколо цього середнього показника.
Деякі іонні канали відкриваються досить часто навіть у спокої. Іншими словами, вірогідність знаходження таких каналів у відкритому стані в неактивованої клітці відносно висока. Більшість таких іонних каналів проникності для калію або хлору. Вони важливі для генерації мембранного потенціалу спокою. Решта іонні канали при цьому закриті, то є ймовірність знаходження їх у відкритому стані дуже низька. Активація цих каналів адекватним стимулом різко збільшує ймовірність відкриття. Цей же стимул може деактивувати іонні канали, колишні активними у спокої. Важливо пам'ятати, що активація або деактивація каналу означає зростання або зниження ймовірності відкриття каналу, але не збільшення або зменшення часу відкритого стану (т) каналу.
Крім активації та деактивації, іонний струм через канали регулюється двома іншими факторами. Перший чинник полягає в тому, що іонний канал переходить у нове конформационное стан, в якому звичайний активуючий стимул не здатний викликати відкриття каналу. Для іонних каналів, які активуються деполяризацією, такий стан називається інактивацією. Для каналів, що відповідають на хімічні стимули, це стан відомо як десенсітнзація. Другий механізм - блок відкритого каналу. Таке трапляється, коли, наприклад, велика молекула (така як токсин) зв'язується з іонним каналом і фізично закупорює пори. Іншим прикладом може служити блокування деяких катіонних каналів іонами магнію. У цьому випадку іони магнію самі не проникають через іонний канал, але зв'язуються з каналом в області його гирла і тим самим заважають проникненню інших катіонів.
Деякі канали специфічно відповідають на фізичні зміни в клітинній мембрані нейрона. Найбільш яскравими представниками цієї групи є потенціал-активуються канали. Прикладом може служити чутливий до потенціалу натрієвий канал, який відповідає за регенеративну деполяризацію, що лежить в основі генерації потенціалу дії. До цієї групи належать також механочувствітельние іонні канали, які відповідають на механічну дію на клітинну мембрану. Рецептори розтягнення, що містять іонні канали такого роду, знайдені в механорецептори шкіри.
Інші іонні канали відкриваються тоді, коли хімічні агенти активують зв'язують центри на молекулі каналу. Такі ліганд-актівіруемие іонні канали поділяються на дві підгрупи, в залежності від того, чи є активні центри внутрішньоклітинними або позаклітинними. Каналом, який відповідає на позаклітинне активацію, є катіонний канал постсинаптичної мембрани в скелетному м'язі. Цей канал активується нейротрансмітером ацетилхоліном, вивільнюваним з рухового нервового закінчення. Відкриття ацетилхолін-активованого іонного каналу дозволяє іонам натрію увійти в клітку, викликаючи деполяризацію м'язового волокна.
Ліганд-активуються канали, що відповідають на внутрішньоклітинні стимули, вносять канали, чутливі до місцевих змін концентрації специфічних іонів. Наприклад, кальцій-актівіруемие калієві канали активуються локальним підвищенням концентрації внутрішньоклітинного кальцію. Такі канали відіграють важливу роль у реполяризації клітинної мембрани під час завершення потенціалу дії. Крім іонів кальцію, типовими представниками лігандів, що активують іонні канали з цитоплазматичною боку мембрани, є циклічні нуклеотиди. Циклічний ГМФ, наприклад, відповідає за активацію натрієвих каналів в паличках сітківки. Такий тип каналу грає принципову роль у роботі зорового аналізатора.
Ця класифікація не є досить суворою. Наприклад, кальцій-актівіруемие калієві канали чутливі також до зміни потенціалу, а деякі потенціал-актівіруемие іонні канали чутливі до внутрішньоклітинним лигандам.
Для вимірювання іонних струмів через поодинокі канали спочатку був запропонований непрямий метод аналізу мембранного шуму. Потім був розроблений спосіб прямої реєстрації одиночних іонних каналів за допомогою методу, який називається Петч-кламп (patch-clamp). У сукупності ці підходи дали прямі відповіді на питання, що стосуються функції іонних каналів, як то: який заряд проходить через одиночний канал? як довго канал залишається відкритим? як час перебування іонного каналу у відкритому чи закритому стані залежить від мембранного потенціалу?
Петч-кламп метод, запропонований Е. Неєра, Б. Сакманном та їх колегами, значно поглибив наші знання про функціонування іонних каналів. Для Петч-кламп реєстрації необхідно, щоб кінчик скляної піпетки з внутрішнім діаметром близько 1 мкм щільно контактував з мембраною досліджуваної клітини. При вдалому підведенні, завдяки легкому присмоктуванню, між клітинною мембраною і склом піпетки створюється опір більше 10 9 Ом (звідси виник термін «гігаомний контакт», gigaohm seal). Коли піпетка з'єднана з відповідним підсилювачем, можна зареєструвати невеликі струми, що проходять через ділянку мембрани, що знаходиться всередині кінчика піпетки. Така конфігурація Петч-кламп методу називається cell attached (контакт з клітиною). Високоомний контакт гарантує, що іонні струми, що проводяться цією ділянкою клітинної мембрани, проходять переважно через підсилювальну апаратуру, а не губляться в місці контакту Петч-піпетки з клітиною. При використанні Петч-кламп методу реєструються події складаються з прямокутних струмових сигналів, що відображають процеси відкриття і закриття одиночних іонних каналів. Таким чином, ми в реальному часі можемо спостерігати активність одиночних білкових молекул мембрани.
У простому випадку струми поодиноких каналів з'являються нерегулярно і з різною тривалістю, але з постійною амплітудою. У деяких випадках, проте, картина струмів може бути більш складною. Деякі іонні канали, наприклад, у відкритому стані можуть мати більш ніж один рівень провідності. Крім того, іонні канали можуть проявляти комплексну кінетику. Наприклад, струм через одиночний іонний канал може виглядати не як простий прямокутник, а як «спалах» відкриттів каналу.
Таким чином, Петч-кламп метод надає нові унікальні можливості для вивчення поведінки іонних каналів. По-перше, ізоляція маленької ділянки мембрани дозволяє спостерігати активність всього декількох іонних каналів, а не тисяч, які активуються в цілій клітині. По-друге, високий опір контакту дає можливість реєструвати навіть вкрай поодиноких іонних каналів і можемо провести аналіз кінетики каналів.
Петч-кламп метод дозволяє здійснювати також реєстрацію іонних каналів і в інших конфігураціях. Досягнувши контакту в конфігурації cell attached, можна, відводячи електрод, відтягнути ділянку мембрани для формування inside-out (внутрішня сторона назовні) конфігурації. В останньому випадку цитоплазматична сторона мембрани буде звернена до перфузійні розчини. З іншого боку, за допомогою невеликого додаткового присмоктування можна прорвати ділянку мембрани, розташований усередині реєструючого електрода, забезпечивши контакт останнього з цитоплазмою клітини. У цих умовах будуть реєструватися струми в конфігурації whole-cell (ціла клітина). Нарешті, після отримання конфігурації «ціла клітина», можна відтягнути електрод від клітини, сформувавши з мембрани спочатку тонку перемичку, а потім, після відділення цієї ділянки, отримати конфігурацію outside-out (зовнішня сторона назовні). Кожна з цих конфігурацій має свої переваги, їх використання залежить від типу досліджуваного іонного каналу і тієї інформації, яку ми хочемо отримати в даному експерименті. Наприклад, для аплікації речовин на зовнішню сторону мембрани кращою є конфігурація outside-out.
Петч-кламп конфігурація «ціла клітина» передбачає обмін між цитоплазмою клітини і розчином, що заповнює реєструючу піпетку. Цей обмін, званий іноді «діаліз», може бути використаний для навмисної заміни внутрішньоклітинного складу іонів на ті, які знаходяться в піпетці. З іншого боку (особливо в тих випадках, коли клітина мала), необхідно враховувати, що важливі цитоплазматичні компоненти можуть бути втрачені через їх швидкого переходу під внутріпіпеточний розчин. Такий втрати можна уникнути, використовуючи так званий перфорований Петч-кламп метод. У цьому випадку для формування початкової cell attached конфігурації використовується піпетка, заповнена речовиною, здатним формувати мембранні пори (наприклад антибіотик ністатин). Після деякого часу в ізольованому за допомогою електрода ділянці мембрани утворюються проникні для електролітів пори, що дозволяють реєструвати іонні струми в конфігурації «ціла клітина».
До розробки Петч-кламп методу властивості іонних каналів в клітинних мембранах досліджувалися в експериментах, в яких для вимірювання мембранного потенціалу або мембранного струму використовувалися скляні мікроелектроди. Використання Лінгом і Джерардом в 1949 році скляних мікроелектродів для внутрішньоклітинної реєстрації іонних струмів в живих клітинах було не менш важливою подією, ніж введення Петч-кламп методу три десятиліття по тому. Цей метод забезпечував точне вимірювання мембранного потенціалу спокою клітини, потенціалу дії, а також відповідей на синаптичну активацію м'язових волокон і нейронів.
Метод внутрішньоклітинної реєстрації. Гостра скляна микропипетка, діаметр кінчика якої не перевищує 0,5 мкм, заповнена концентрованим сольовим розчином (наприклад,
На початку 1970-х років, використовуючи нервово-м'язовий синапс жаби, Катц і Міледі зробили оригінальні експерименти, в яких метод внутрішньоклітинної мікроелектродної реєстрації використовувався для вивчення характеристик «шумів», продукованих медіатором ацетилхоліном (АХ). У такому синапсі АХ, освобождаюшійся з моторного нервового закінчення, відкриває хемовозбудімие іонні канали постсинаптичної мембрани. Вхід катіонів у волокно через відкриті іонні канали викликає деполяризацію мембрани. Коли Катц і Міледі локально аппліціровалі екзогенний АХ на область синапсу, вони виявили, що викликана деполяризація супроводжувалася електричним «шумом». Під час стабільної деполяризації швидкі коливання потенціалу були набагато більше коливань ізолінії в спокої. Вони припустили, що зростання електричного шуму в присутності АХ було пов'язано з хаотичним відкриттям і закриттям АХ-активуються іонних каналів. Іншими словами, аплікація АХ призводила до відкриття великої кількості іонних каналів, і число це випадково коливалося в залежності від кількості взаємодій АХ з рецепторами.
Використовуючи відому з фізики техніку аналізу шуму, Катц і Міледі змогли отримати інформацію про середньостатистичний поведінці окремого іонного каналу, який активується АХ. Пізніше подібні експерименти були проведені на тому ж об'єкті Anderson і Stevens. На відміну від попередників, ці дослідники вимірювали мембранний струм, викликаний АХ, що дозволило встановити величину і тривалість іонних струмів через одиночний канал.
Принципи аналізу шуму досить прості: по-перше, якщо струми одиночного каналу є великими, сумарний шум також буде більшим. По-друге, іонні канали, що відкриваються на відносно тривалий час, будуть продукувати низькочастотний шум; навпаки, канали, що відкриваються на короткий час, будуть продукувати високочастотний шум. Дослідження амплітудно-часових характеристик шумів, активованих АХ в нервово-м'язовому синапсі, показало, що через одиночний відкритий іонний канал проходить близько 10 мільйонів іонів за секунду. Крім того, з'ясувалося, що значення середнього відкритого часу іонного каналу складає від 1 до 2 мс.
Незважаючи на широке витіснення Петч-кламп методом, аналіз шуму до цих пір використовується для вивчення іонних каналів в клітинах, які не піддаються дослідженню за допомогою Петч-клампи, наприклад, в деяких областях центральної нервової системи. Крім того, аналіз шуму є порівняно швидким методом для отримання інформації про властивості велику популяцію каналів і використовується в комбінації з Петч-кламп реєстрацією від цілої клітини для ідентифікації типів каналів. Тим не менш, треба розуміти, що за допомогою аналізу шуму неможливо отримати детальну інформацію про поведінку одиночного каналу, особливо в каналах зі складною кінетикою або за наявності декількох рівнів провідності каналу.
Кінетичне поведінку каналу, то є час його перебування в закритому і відкритому станах, може надати інформацію про механізми відкриття та закриття каналу, а також про константи швидкостей цих процесів. З іншого боку, величина струму, що проходить через іонний канал, є прямим відображенням того, як швидко проникають іони рухаються через канал. Струм іонів залежить не тільки від властивостей каналу, але також від трансмембранного потенціалу. На цьому малюнку зображено фрагмент мембрани, який містить один спонтанно активний іонний канал, проникний для калію. Розчини, як в піпетці, так і у ванні для об'єкта, містять однакову (150 ммоль) концентрацію іонів калію. Іони калію через відкритий канал можуть рухатися в обох напрямах. Однак оскільки концентрації іонів по обидві сторони мембрани ідентичні, а трансмембранний потенціал відсутній, то немає ніякого руху іонів в жодному Петч-кламп метод має гідність, яке ще не було згадано: ми можемо міняти потенціал на реєструючої піпетці і варіювати, таким чином, трансмембранну різниця потенціалів. Наприклад, при мембранному потенціалі +20 Мв кожне відкриття калієвого іонного каналу супроводжується струмом, спрямованим назовні. Це пов'язано з тим, що позитивно заряджені іони калію рухаються через канал по електричному градієнту між розчином в піпетці і у ванні. З іншого боку, коли всередині піпетки створений негативний потенціал величиною в -20 мВток спрямований у зворотному напрямку (через відкритий канал в піпетку).
Залежність струму є лінійною: струм (I), що проходить через канал, пропорційний потенціалу (V):
Це формула являє собою перетворений закон Ома. Константа 7 називається провідністю каналу. При одному і тому ж потенціалі на мембрані канал з високою провідністю переносить багато струму, канал з низькою провідністю проводить малий струм.
Провідність вимірюється У Сіменс (См). У нейронах трансмембранний потенціал зазвичай виражається в мілівольтах (1 мВ = 10 -3 В), струми одиночних іонних каналів в пікоампер (1 пА = 10 -12 А), провідність у пікосіменсах (1 ПСМ = 10 -12 См). потенціал +20 мВ продукував струм близько 2,2 пА, відповідно провідність каналу (I / V) склала 2,2 пА/20 мВ = 110 ПСМ
Висновки
Електричні сигнали в нервовій системі генеруються рухом іонів через мембрану нервової клітини. Ці іонні струми протікають через водні пори трансмембранних білків, відомих як іонні канали.Канали різняться за своєю вибірковості: деякі катіонні канали пропускають тільки натрій, калій або кальцій, інші є менш виборчими. Аніонні канали порівняно не вибагливі для малих аніонів, але вони пропускають в основному іони хлору, тому що хлор є найпоширенішим аніоном позаклітинної і внутрішньоклітинної рідин.
Література
Крутько В.М., Славін М.Б., Смирнова Т.М. Математичні підстави геронтології.
Реутов В.П. та ін Проблема оксиду азоту в біології та медицині і принцип циклічності.
Методологія біології: нові ідеї (синергетика, семіотика, коеволюція). Ред. Баксанский О.Е.
Новіков Г.Г. Ріст і енергетика розвитку костистих риб у ранньому онтогенезі