МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ АВТОНОМНОЇ РЕСПУБЛІКИ КРИМ
ТАВРІЙСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. В. І. ВЕРНАДСЬКОГО
БІОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра біохімії
Молекулярний механізм Сплайсинг
Сімферополь, 2009
ЗМІСТ
Сплайсингу РНК
Введення
Сплайсосомних інтрони
Альтернативний сплайсинг
Збірка Сплайсосома
Сплайсинг БІЛКІВ
Введення
Структура інтеінов
Сучасні уявлення про механізм білкового сплайсингу
Ендонуклеазною активність інтеінов
Використання інтеінов в біотехнології
Висновок
Список літератури
Введення
Сплайсинг - дозрівання інформаційної РНК (мРНК) у еукаріотів, в процесі якого шляхом біохімічних реакцій з участю РНК і білків з іРНК видаляються ділянки, що не кодують білок (інтрони) і з'єднуються один з одним екзонів. Таким чином попередник іРНК перетворюється в зрілу мРНК, з якою зчитуються (транслюються) білки клітини.
Робота Шарпа і Робертса, опублікована в 1977 році, показала, що гени вищих організмів «розсіяні», тобто зберігаються в декількох різних ділянках ДНК. Кодуючі відрізки гена перемежаються з некодирующей ДНК, яка не використовується при експресії білків. «Розсіяна» структура гена була виявлена, коли аденовірусна мРНК була схрещена з фрагментами ланцюжка ДНК, що залишилися після впливу ендонуклеази. Після такого схрещування з'ясувалося, що мРНК-ділянки цих гібридних молекул мРНК-ДНК містять 5'-і 3'-кінці ділянок, що не володіють водневими зв'язками. Довші відрізки ДНК при гібридизації закільцьовують і утворювали відгалуження. Стало ясно, що ці закільцьовані ділянки, що містять непотрібні послідовності, витягуються з пре-мРНК в результаті процесу, який і був названий «сплайсингом». Згодом було також з'ясовано, що розсіяна структура украй широко поширена у еукаріотичних генів.
У природі виявлені кілька варіантів сплайсингу. Який з них буде проходити в кожному випадку залежить від структури інтрони і каталізатора, необхідного для реакції.
Сплайсосомних інтрони
Сплайсосомних інтрони часто перебувають у генах, що кодують білки. Для сплайсингу необхідна наявність спеціальних 3'-і 5 '- послідовностей. Сплайсинг каталізується Сплайсосома - великим комплексом між РНК і білками, що складається з п'яти малих ядерних рибонуклеопротеидов (мяРНП). РНК-складова мяРНП взаємодіє з інтронів і, можливо, бере участь в каталізі. Виявлено два типи сплайсосом (головна і додаткова), що відрізняються за входять до їх складу мяРНП.
Головна сплайсосома бере участь у сплайсинг інтронів, що містять гуанін і урацил (GU) в 5 сайті і аденін і гуанін (AU) в 3 сплайсинг-сайті. Вона складається з мяРНП: U1, U2, U4, U5 і U6.
Сплайсосома - структура, що складається з молекул РНК і білків і що здійснює видалення некодуючих послідовностей (інтронів) з попередників мРНК. Цей процес називається сплайсингом (від 'англ.' Splicing - зрощування). Сплайсосом складають п'ять малих ядерних рибонуклепротеіну (мяРНП) і деяка кількість додаткових білкових факторів.
Вміщені в Сплайсосома мяРНП називаються U1, U2, U4, U5 і U6. Вони беруть участь у багатьох взаємодіях між молекулами РНК, а також між РНК і білками.
РНК-частина мяРНП багата уридин.
У загальному випадку збірка Сплайсосома відбувається заново для кожної мРНК-попередника. Молекула пре-мРНК обов'язково містить специфічні фрагменти послідовності, що розпізнаються під час складання Сплайсосома. Це 5'-кінці, послідовність точки розгалуження, поліпірімідіновий ділянку і 3'-кінець.
Сплайсосома каталізує видалення проміжних послідовностей і з'єднання сусідніх екзонів. Інтрони зазвичай визначаються по наявності послідовності GU на 5'-кінці і послідовності AG на 3'-кінці. 3'-кінець може бути також визначений по ланцюжку поліпірімідінов різної довжини, званої поліпірімідіновим трактом (ППТ). ППТ виконують функцію скріплення факторів з 3'-кінцем, а також, можливо, зв'язування факторів з послідовністю точки розгалуження (ПТВ). ПТВ, у свою чергу, містить багато аденозину, необхідного для початку сплайсингу.
Група менш поширених мяРНП - U11, U12, U4atac і U6atac - входить разом з U5 до складу малої Сплайсосома, що виконує сплайсинг рідкісних інтронів пре-мРНК, званих интронами типу U12.
Рис. 1. Один з білків Сплайсосома, приєднаний до ділянки РНК.
Різні домени білка виділені різними кольорами, РНК - вертикальна молекула в правій частині малюнка.
Альтернативний сплайсинг
Альтернативний сплайсинг, під час якого відбувається рекомбінація екзонів - головне джерело генетичного різноманіття у еукаріотів. Змінному зрощуванню зазвичай приписувалася роль причини щодо малої кількості генів в геномі людини. Оцінка їх кількості впродовж багатьох років мінялася, максимальна ж кількість прогнозувалося на рівні 100 тисяч. Проте завдяки проекту Human Genome Project (англ. «Геном людини») стало відомо, що їх кількість близько до 30 000. При цьому, однак, вважається, що майже кожен людський ген має не менше двох ізоформ.
Сутність альтернативного сплайсингу полягає в тому, що в результаті Посттранскрипційна процесингу попередника мРНК, з якого в результаті сплайсингу вирізаються некодуючі послідовності нуклеотидів, відповідні інтрони транскрибованної гена, утворюються зрілі мРНК, що розрізняються за своєю первинній структурі. У результаті в різних клітинах з одного і того ж попередника виходять молекули зрілих мРНК, які об'єднують в різних комбінаціях послідовності екзонів транскрибованної гена.
Вперше неоднозначність сплайсингу була виявлена у аденовірусів - великих вірусів, що інфікують клітини тварин (Ziff EB, 1980). Геном аденовірусів направляє синтез кількох дуже довгих РНК-транскриптів, кожен з яких містить нуклеотидні послідовності, що кодують цілий ряд різних білків. Альтернативні шляхи сплайсингу призводять до того, що з абсолютно однакових первинних транскриптів утворюються молекули мРНК різних типів, що мають одну і ту ж 5'-кінцеву послідовність (5'-кеп), яка, таким чином, ініціює синтез декількох різних білків. Правило послідовного змикання донорних і акцепторних інтрони контактів не дотримується. Залишається неясним, як здійснюється контроль альтернативного сплайсингу РНК-транскриптів. Альтернативний процесинг РНК, можливо, має певні переваги, а саме економічність: підвищення інформаційної ємності геному в цьому випадку не супроводжується збільшенням його розмірів.
На рис. 2 представлена схема екзоном структури гена модулятора cAMP-респонсивних елемента людини (CREM). Під час сперматогенезу відбувається перемикання з синтезу репрессором транскрипції CREMальфа, CREMбета і CREMгамма на освіту CREMтау, який містить дві додаткові послідовності, збагачені Gln (Q1 і Q2), необхідні для транс-активації транскрипції. Більш короткий транскрипт, синтез якого ініціюється на промоторі P2, процесує з утворенням зрілих мРНК, які кодують групу невеликих молекул репрессором (ICER). Ініціація синтезу РНК на промоторі P2 активується під дією ритмічних гормональних сигналів епіфіза мозку.
У результаті використання такого механізму одна і та ж послідовність нуклеотидів гена може кодувати кілька різних білків. Комбінаторика об'єднання послідовностей нуклеотидів пре-мРНК в процесі альтернативного сплайсингу може бути дуже складною, оскільки до нього залучаються інтрони і екзон, а їх об'єднання відбувається з використанням різних точок сплайсингу, локалізованих в цих послідовностях. Розпізнавання ділянок ДНК, в яких знаходяться точки сплайсингу, які беруть участь у конкретному акті Посттранскрипційна процесингу пре-мРНК, відбувається за участю специфічних білків в результаті білково-нуклеїнового взаємодії.
Рис. 2. Схема формування активаторів і репрессором транскрипції, кодованих геном CREM і утворюються в результаті альтернативного сплайсингу.
У верхній частині малюнка зображена схема гена CREM, що включає альтернативні промотори Р1 і P2, кодони альтернативної ініціації і термінації трансляції, а також екзон, що кодують різні домени факторів. Внизу представлені комбінації послідовностей екзонів, які об'єднуються в зрілі мРНК, які кодують різних представників груп репрессором і активаторів транскрипції, а також ICER-білків.
Збірка Сплайсосома
Канонічна модель формування активної області Сплайсосома є впорядкованим покроковий процес коннекту одиниць мяРНП на підкладці пре-мРНК. Під час первинного розпізнавання пре-мРНК відбувається зв'язування мяРНП U1 з 5'-стиком пре-мРНК, а також формування з інших білкових факторів фиксационной комплексу або раннього комплексу (Е-комплексу) для ссавців. Фіксаційний комплекс - АТФ-незалежна освіту, що утримує пре-мРНК для здійснення сплайсингу.
Малий ядерний рибонуклепротеіну U2 зв'язується з областю розгалуження за рахунок взаємодії з компонентом Е-комплексу U2АF (допоміжним фактором мяРНП U2) і, можливо, з U1. У результаті АТФ-залежної реакції U2 утворює міцний зв'язок з послідовністю точки розгалуження (ПТВ), тим самим формуючи комплекс А. Подвійний зв'язок між U2 і областю розгалуження пре-мРНК витягує аденозин з відгалужуються ланцюжка. Присутність же в U2 псевдоурідінових залишків практично напроти області розгалуження призводить до зміни конфігурації зв'язків РНК-РНК під час зв'язування з U2. Ці зміни структури, викликані псевдоуридин, поміщає 2'-OH-групу витягнутого аденозину в положення, що дозволяє зробити перший крок сплайсингу.
U4, U5 і U6, що з'єднуються з утворенням більшого потрійного мяРНП, зв'язуються з збирається Сплайсосома і формують комплекс В, який після некотороие проміжних перегрупувань субодиниць перетворюється на комплекс С - власне сплайсосом, яка приступає до каталізу сплайсингу.
Неясно, яким чином потрійний мяРНП U4-U5-U6 зв'язується з комплексом А. Цей процес може опосередковано взаємодією між білками, так само як і взаємодіями між нуклеотидами малі ядерні РНК, що входять до складу U2 і U6.
U5 взаємодіє з послідовностями на 5'-і 3'-кінцях сплайсінгового ділянки за рахунок інваріантної петлі малі ядерні РНК, що входить до його складу. Білкові компоненти U5 взаємодіють з 3'-регіоном сплайсінгового ділянки.
Після зв'язування з потрійним мяРНП і перед початком сплайсингу в Сплайсосома відбувається безліч змін конфігурації зв'язків РНК-РНК. Ці зміни продовжуються і у вже почала роботу Сплайсосома. Багато взаємодії між РНК є взаємовиключними, проте до цих пір неясно, що викликає ці взаємодії і завдяки чому дотримується їх порядок.
Перше перетворення - це, можливо, зсув U1 з 5'-кінця сплайсінгового ділянки і виникнення там зв'язку з U6. Відомо, що U1 слабо пов'язаний з діючою Сплайсосома, а також є інгібітором для утворення зв'язку між U6 і 5-кінцем (показано на прикладі короткого ланцюжка РНК, яка містить 5'-екзон і 5'-кінець сплайсінгового ділянки).
Зв'язування U2 з ПТВ - ще один приклад взаємодії між РНК, що виникає на місці взаємодії між РНК і білками. При зв'язуванні U2 зі Сплайсосома, білок Е-комплексу SF1, що зв'язується з ділянкою розгалуження, витісняється, оскільки наявність U2 виключає його зв'язування з цією ділянкою. Усередині самого U2 також відбуваються деякі взаємовиключні переконфігурації. Наприклад, в його активній формі, виникає шпилька IIа, а неактивній же формі домінує взаємодія між шпилькою і подальшим ділянкою ланцюга.
Неясно, за рахунок чого U4 відділяється від U6. Вважається, що в збірці Сплайсосома бере участь кілька гелікази, які можуть розкручувати РНК в зв'язці U4-U6 і таким чином спрощувати формування зв'язку U2-U6.
Зв'язки між шпильками I і II в мяРНП U4 і U6 розриваються, і ділянка, що звільнилася шпильки II U6 згортається сам на себе з утворенням внутрішньомолекулярної шпильки. Після цього потреба в U4 відпадає. Ділянка, що звільнилася шпильки I U6 зв'язується з малі ядерні РНК U2 з утворенням U2-U6-спіралі I. Структура спіралі I, проте, взаімоісключающа з 3'-половиною ділянки внутрішньої 5'-шпильки малі ядерні РНК U2.
Рис. 3. Схема розташування кодують білок (екзон, синій колір) і некодуючих білок (інтрони (сірий) колір 3 'і 5' нетрансльовані області (зелений) в гені людини CDK4
Сплайсинг БІЛКІВ
Введення
В даний час кардинально змінюються багато погляди на основи життя. Молекулярна біологія - не виняток. Наприклад, ще років 10-15 тому термін «каталіз» пов'язували виключно з білками, а «сплайсинг» - з нуклеїновими кислотами (в основному РНК). Однак поступово стало зрозуміло, що кожен клас макромолекул володіє набагато більшою функціональністю. Наприклад, у 1982-1983 рр.. було показано, що деякі різновиди РНК, подібно білкам, володіють каталітичною активністю (вони отримали назву рибозимів). В останні роки було відкрито, що деякі малі РНК здатні регулювати і навіть блокувати експресію генів. А в 1990 р. було виявлено явище білкового автосплайсінга - процесу, аналогічного сплайсингу РНК. З цього моменту стало зрозуміло, що канонічні закони молекулярної біології, нещодавно ще здавалися абсолютними та непорушними, відображають тільки найбільш загальні принципи живого, і повинні доповнюватися, виправлятися, а іноді й заново листуватися.
Splice (англ. «зшивати, з'єднувати») - з'єднання двох відрізків мотузки або каната шляхом сплетення їх кінців (морський термін).
Сплайсинг - це процес дозрівання молекул, в результаті якого з попередника віддаляється внутрішня частина з наступним лігування (тобто утворенням ковалентного зв'язку) фланкують послідовностей (тобто тих частин молекули, що примикали до кінців віддаленої внутрішньої частини).
Сплайсинг білків, або білковий сплайсинг - це внутрішньомолекулярний автокаталітіческій процес, що відбувається в деяких білках, при якому внутрішня частина білка (під назвою інтеін) вищепляются з білка-попередника з подальшим лігування частин, що залишилися. На місці сплайсингу в білку-попереднику знаходиться цистеїн або серин, тобто амінокислота з нуклеофільної бічний групою. Відомі в даний час реакції сплайсингу не вимагають екзогенних кофакторів і джерел енергії (наприклад, АТФ або ГТФ). Словом «сплайсинг» позначають зазвичай сплайсинг пре-мРНК.
Сплайсинг білків був відкритий двома групами дослідників (Анраку і Стівенса) в 1990 р. Обидві групи відкрили білок VMA1 дріжджів Saccharomyces cerevisiae, попередник вакуолярної H +-АТФази. Амінокислотна послідовність N-і С-решт VMA1 на 70% відповідає послідовності вакуолярної H +-АТФази інших організмів, тоді як центральна послідовність на 30% збігається з дріжджовий нуклеаз АЛЕ.
Білковий сплайсинг був відкритий при дослідженні дріжджового гена VMA1, що кодує субодиницю Vma1 вакуолярної ATФази. Виявилося, що в результаті дозрівання центральна частина білка видаляється, а фланкуючі її послідовності лігуються («зшиваються» між собою). При цьому для кінцевих послідовностей дріжджового гена VMA1 характерна висока ступінь гомології з аналогічними послідовностями інших мікроорганізмів, тоді як в центральній частині вона порушувалася. Так стало ясно, що і у білків в деяких випадках може відбуватися процес, аналогічний сплайсингу пре-мРНК. Також як і в автосплайсінге РНК, для сплайсингу білків не потрібні ні ферменти, ні кофактори. За аналогією центральну частину білка (яка самовирезается) назвали інтеіном (від internal protein), фланкирующие послідовності - N-і С-екстеінамі-і С-екстеінамі (external protein), а весь процес - білковим сплайсингом (рис. 1).
Рис. 1. Схематичне будова основних типів інтеінов.
А. Класичний інтеін, що містить ендонуклеазною домен, Б. Міні-інтеін. Консервативні амінокислотні залишки, необхідні для сплайсингу, позначені однобуквеним абревіатурами (один залишок з N-кінця інтеіна і тріада залишків - на стику з C-кінця і C-екстеіна).
Структура інтеінов
Умовно інтеіни можна поділити на дві великі групи - класичні інтеіни і міні-інтеіни. Класичний інтеін складається з двох доменів - сплайсінгового домену, який якраз і каталізує вирізання інтеіна з білка-господаря і подальше його зшивання (так би мовити, «замітає сліди»), і центрального ендонуклеазною домену (який може розрізати ДНК за певних сайтів), що забезпечує так званий «хоумінг» інтеіна. Хоумінг - настільки цікавий процес, що докладніше ми його розглянемо нижче. У двох словах скажемо тільки, що він (хоумінг) відповідає за поширення гена інтеіна (що навіть більше схоже на розмноження, якщо б цей термін можна було застосувати до окремого білку). Міні-інтеіни не мають центрального ендонуклеазною домену та хоумінгом не займаються.
Ендонуклеазною і сплайсінговий регіони утворюють в молекулі інтеіна два просторово розділених домену. Сплайсінговий домен утворюється N-і С-кінцевими частинами інтеіна. Він має характерну подковообразную форму. Кінці інтеіна жорстко зафіксовані один навпроти одного в просторі, і по суті формують активний центр (АЦ), дуже схожий на АЦ трипсину або будь-який інший серинових протеази. Обидва кінці інтеіна, за якими відбувається розрізання, знаходяться близько АЦ (рис. 2).
Рис. 2. Просторова структура інтеіна (міні-інтеін Mxe GyrA).
Зближені кінці інтеіна позначені квадратом. Зображення отримано з PDB-структури 1AM2.
Сучасні уявлення про механізм білкового сплайсингу
Багатьма дослідниками було показано, що білковий сплайсинг є аутокаталітіческім процесом і для свого здійснення не вимагає присутності ферментів або кофакторів. Проте визначити точний механізм сплайсингу білків довгий час не вдавалося - процес відбувається дуже швидко, і звичайними методами виявити проміжні з'єднання не представлялося можливим. Головна проблема полягала в тому, що інтеін у складі білка не можна було навіть виділити - сплайсинг проходив відразу після синтезу білка, і поки клітини збиралися і ціалізуватися - слідів вже не залишалося. Вирішити це завдання вдалося групі Ф. Перлер (Francine Perler) досить очевидним (як це тепер здається) способом. Вони змінювали ряд консервативних амінокислотних залишків у інтеінах методом спрямованого мутагенезу. Як тільки мутації стосувалися активного центру інтеіна - білковий сплайсинг блокувався на різних етапах, і в середовищі накопичувалися проміжні продукти реакції. Наприклад, зміна С-кінця інтеіна викликало накопичення «розгалужених» білків, у яких було ... два N-кінця. Дослідження цих незвичайних білків і дозволило запропонувати механізм білкового сплайсингу (див. рис. 3).
Рис. 3. Механізм білкового сплайсингу.
Подією, що запускає білковий сплайсинг, є автокаталітіческій N-O або N-S-зсув (перший амінокислотний залишок на N-кінці інтеіна Ser або Cys, відповідно) на N-кінцевому сайті сплайсингу (крок 1). У результаті утворюється високореакційні ефірна або тіоефірні зв'язок.
З точки зору хімії, N-O/N-S-сдвіг не є енергетично вигідним процесом, оскільки в результаті реакції відбувається розрив амідній (пептидного) зв'язку і утворюється високоенергетична ефірна / тіоефірні зв'язок. Тому цей процес повинен каталізувати. Дійсно, протікання реакції розриву пептидного зв'язку на N-кінці полегшується як мінімум двома чинниками. По-перше, процес каталізується самим сплайсінговим доменом інтеіна. По-друге, на ефективність N-кінцевого розщеплення певний вплив мають екстеіни. Показано, що у деяких інтеінов пептидний зв'язок, що зв'язує N-екстеін і першу амінокислоту інтеіна, знаходиться в рідкісній і не характерною для білків цис-конформації. Оскільки такий зв'язок енергетично невигідна, її наявність провокує протікання N-О або N-S зсуву, тобто ініціює сплайсинг.
На другому етапі білкового сплайсингу відбувається нуклеофільних атака утворилася ефірного зв'язку OH-або SH-групою першого залишку С-екстеіна. У результаті відбувається реакція трансетеріфікаціі, тобто перенесення Н-кінцевого екстеіна на бічну групу перший залишку С-екстеіна (крок 2). У результаті утворюється розгалужене проміжне з'єднання (ті самі білки з двома N-кінцями, за допомогою вивчення яких був і запропонований даний механізм сплайсингу). Така перестановка призводить до зміщення зарядів, що в свою чергу, індукує циклізації бічного ланцюга Asn на С-кінці інтеіна (крок 3).
Циклизация бічної групи Asn призводить до розриву пептидного зв'язку між інтеіном і С-екстеіном - розгалужена структура розпадається на вільний інтеін і лігувати екстеіни, пов'язані один з одним ефірним зв'язком (крок 3). Останній крок сплайсингу білка відбувається спонтанно (кроки 4а та 4б).
Відповідно до прийнятої на сьогодні теорії, білковий сплайсинг складається з серії послідовних перестановок. Детальними дослідженнями цих перестановок займається російський вчений Старокадомского. Але найдивніше, що крім цис-сплайсингу (тобто автокаталітіческого видалення інтеіна з білка-попередника), у багатьох організмів виявлено явище транс-сплайсингу. На пальцях це можна пояснити так: у двох білків на відповідних кінцях є по половинці інтеіна (назвемо їх інтеін-подібні домени, ВПС), які, з'єднуючись за типом «ключ-замок», утворюють цілком функціональний інтеін. А ця освічена інтеін вирізає сам себе, зшиваючи два білки в єдине ціле. Тобто, в результаті транс-сплайсингу відбувається зшивання двох білків, що кодуються двома різними генами (рис. 4). І це не лабораторна екзотика: за таким механізмом, наприклад, відбувається утворення білка DnaE (одна з субодиниць ДНК-полімерази) у Synechocystis sp.
Рис. 4. Механізм транс-сплайсингу.
Рис. 5. Передбачуваний механізм сплайсингу білків
а, б - альтернативні механізми ініціації сплайсингу, N, C - N-і C-кінцеві екстеіни білків-попередників
Ендонуклеазною активність інтеінов
Наступною дивовижною особливістю інтеінов (правда, не всіх) є їх ендонуклеазною активність. Інтеін забезпечує (з певними обмеженнями) розповсюдження свого гена в геномі клітини. Такий процес, як ми вже говорили, і називається хоумінгом інтеінов. Іншими словами, інтеін-білок може ампліфікувати (множити) кількість своїх генів у клітині. Також за рахунок цієї властивості він може забезпечувати передачу інтеінового гена іншим особам даного виду або передавати іншим видам (т. зв. Горизонтальний і вертикальний перенесення відповідно). Причому еволюційний аналіз поширення різних інтеінов (а їх відкрито більше 1000, причому і у прокаріотів, і у нижчих еукаріот) свідчить, що інтеіни поширюються досить активно, і до того ж, опинившись у різних видах, можуть мутувати і змінювати свою послідовність. Загалом, інтеіни в даному випадку ведуть себе подібно транспозона або навіть примітивним вірусам (якщо таке в принципі можна сказати про білки). Хоча ... ряд вірусів також несе в собі інтеіни. Наприклад відкритий недавно гігантський Мімі-вірус має інтеін (APMV Pol) в гені ДНК-полімерази.
Механізм хоумінга схематично зображений на рис. 6. Насправді, хоумінг - це не така вже екзотика. Хоумінг-ендонуклеази були відомі ще до відкриття інтеінов. Це великий клас сайт-специфічних ДНКаз, які часто кодуються мобільними генетичними елементами.
Хоумінг цікавий в першу чергу тим, що забезпечує так званий «горизонтальний» перенесення гена - тобто перенесення послідовності в гомологічні області інших видів. Здійснюється це, найімовірніше, вірусами. Дійсно, інтеіни найчастіше зустрічаються в білках, залучених у метаболізм нуклеїнових кислот (полімерази, лігази, гірази, гелікази, білки репарації ДНК і т. п.). Але ж це ті білки, які присутні у вірусів і фагів! У загальних рисах механізм горизонтального перенесення можна описати так: додаткові копії ДНК, які з'являються під час формування нових вірусів, можуть дізнаватися як мішень для хоумінга. Інтеін каталізує перенесення своєї послідовності у вірусну ДНК. Таким чином ген потрапить у вірус, а вірус під час наступної інфекції може внести його в геном іншого, близького виду. Так гени інтеінов можуть подорожувати за видами. Проте тут варто відзначити, що розповсюджуються вони лише між одноклітинними організмами - у багатоклітинних вони поки не знайдені. Зате виявлено кілька сімейств ферментів і молекул, що активується за механізмами, схожим на білковий сплайсинг. Чи відбулися вони від предків інтеінов або виникли самостійно - поки що невідомо.
Рис. 6. Принциповий механізм хоумінга інтеінов.
Інтеін каталізує двохланцюжкової розрив у алелів (-) у точці інтеіновой вставки. При цьому утворюється 3'-виступаючий кінець довжиною 4 нуклеотиду («липкий» кінець). Далі клітинними ферментами проводиться репарація дволанцюжкової розриву з використанням в якості матриці алельному ДНК, що містить послідовність інтеіна. Це забезпечує його перенесення в аллель (-). Оскільки вихідної аллель може бути і плазмідна, і вірусна ДНК, таким способом може забезпечуватися і горизонтальний перенос, що дозволяє інтеінам поширюватися і зберігатися (або навіть «виживати», якщо б такий термін можна було застосувати до поліпептидів). Проте насправді процес хоумінга відбувається досить рідко в силу ряду обставин.
Використання інтеінов в біотехнології
На мій погляд, інтеіни є одним з найбільш вдалих і перспективних інструментів у біотехнології білків та протеомні дослідженнях. Ми коротко розглянемо основні з методів, а також самі екзотичні з них - наприклад, створення білків-«кілець» або спосіб контролю розмноження генно-модифікованих рослин.
Очищення рекомбінантних білків
Після відкриття феномену білкового сплайсингу увагу дослідників відразу привернув факт самодостатності інтеіна і точності його самовирезанія. Тобто, якщо пришити інтеін на рівні гена до цікавого для нас білку (білок-Х), то теоретично ми зможемо експресувати злитий білок (інтеін-білок-Х), який за певних умов розріже (інтеін + білок-Х). Якщо ж вставити інтеін між двома білками (білок-Х-інтеін-білок-Y), то в результаті можна отримати зшитий подвійний білок (білок-Х-білок-Y). Логічним є запитання: а чи можна використовувати для цих цілей штучний інтеін з афінної міткою (*- інтеін)? Це б дозволило очистити отриманий продукт (*- інтеін-білок-Х), а потім відокремити від білка-Х його мітку (*- інтеін). У результаті ми отримали б цільової білок без будь-яких додаткових модифікацій. У цілому інтеін-опосередкована очищення пропонує всі переваги афінної хроматографії (швидка і ефективна очистка міченого білка), дозволяючи обійти головний недолік цього методу - необхідність точного і стовідсоткового відщеплення афінної мітки від вже чистого препарату.
Ретельне дослідження показало, що це дійсно можливо. Зараз створені кілька систем на основі різних інтеінов, які несуть His-tag, хітин-зв'язуючий домен бактерій (CBD) та інші класичні аффінниє мітки. Ряд із них вже комерційно доступний (наприклад системи IMPACT, IMPACT-СН, TWIN-IMPACT фірми NEB). Аналогічні системи створюються і в Росії. Потенціал таких технологій величезний - в першу чергу тому, що дозволяє спростити очищення рекомбінантного білка до одного етапу (проти 4-5 етапів на іонно-обмінних носіях, які використовуються в багатьох фармацевтичних виробництвах) і не вимагає змін самого цільового білка (обов'язкових при використанні традиційних афінних міток, які впроваджуються в сам білок).
Використання білкового сплайсингу для створення біосенсорів
Після відкриття того, що за допомогою інтеіна можна біологічно прийнятно зшити два різних білки, почалися роботи зі створення нового типу біосенсорів. Головною проблемою в цій галузі є складність іммобілізації сенсорного білка на поверхні (тобто покриття ним поверхні сенсора так, щоб білок не втратив працездатності). За допомогою інтеінов можна «зшивати» між собою два різних білки, один з яких може служити молекулярним якорем, зв'язуючись з потрібною поверхнею, а другий - самим сенсором. Так, наприклад, за допомогою такої технології вдалося зшити мальтоза-зв'язуючий білок (МВР) і Т4 ДНК-лігази. У результаті активність Т4-лігази збереглася, а пришитий МВР дозволяє її закріпити або очистити на поверхні біосенсора. Інша технологія - протеомні мікроаналіз (protein microarray) - вимагає створення матриць, на яких були б ковалентно пришиті певні білки-маркери. Проблема полягає в тому, що, з точки зору технологічності (тобто простоти зберігання, транспортування та використання), білки повинні бути пришиті ковалентно. При цьому вони, природно, не повинні втрачати активності (що проблематично, оскільки на твердих поверхнях білки часто злипаються і інактивуються) і не містити домішок (які можуть спотворювати результати). Тому інтеіни як посередники, які можуть нативної зшивати цільової білок з будь-якою поверхнею, модифіковану якимось чином (наприклад, покриту недорогим сірковмісним полімером), є дуже цінним інструментом. Перші роботи в цій галузі вже дали досить хороші результати. Ці роботи дозволяють сподіватися, що в найближчому майбутньому ми будемо мати потужний інструмент для аналізу білок-білкових взаємодій і картування протеома організму - адже це, як відомо, наступна глобальне завдання після картування геному.
Циклизация ферментів
Таке важко навіть уявити. Однак це здійснено - білок «скрутили в бублик» без початку, без кінця. Для цього був використаний феномен транс-сплайсингу, тільки інтеін-подібні N-і С-домени перебували не в різних білках, а на різних кінцях одного білка. Методика, за допомогою якої можливо ціклізіровать білки, отримала назву SICLOPPS (Split Intein-mediated Circular Ligation Of Peptide and ProteinS). До речі, закільцований таким способом фермент (зі складною назвою дегідрофолатредуктаза), після цього не тільки не втратив своєї активності, але навіть навпаки - став менш чутливим до зміни температури середовища. А в промисловості, де з-за великих обсягів температуру реакції контролювати набагато складніше, такі каталізатори будуть дуже затребувані.
Експресія токсичних для клітини продуктів
Часто еукаріотичні білки, які експресуються в клітинах прокаріот, вбивають організм-продуцент. Це явище називається токсичністю. Через неї ряд практично важливих білків (наприклад, протеази) в достатніх кількостях напрацювати в бактеріях не вдається. Використання систем експресії на основі інтеінов може вирішити цю проблему. Токсичні для клітини білки можна напрацьовувати у вигляді неактивних химерних попередників, злитих з інтеінамі. Останні порушують структуру продукту і не дають йому активуватися. Після напрацювання такі химерні білки очищаються і активуються шляхом індукції самоудаленія інтеіна з їх структури.
Висновок
До сьогоднішнього дня вважається, що сплайсинг в живих клітинах протікає безпосередньо після трансляції. Це відноситься і до цис-і до транс-варіантами. Ймовірно останнім потрібно якийсь час для зустрічі та об'єднання ІПДоменов. Але в літературі відсутні дані про те, що в будь-якій клітці спостерігався пул білків з і без інтеіна - інтеіни виявляються тільки після секвенування генома.
У біотехнології ситуація інша - в більшості випадків саме потрібні інтеіни, активністю яких можна було б керувати. Це досягається заміною або першого цистеїну, або останнього аспарагіну на аланін. Крім того, часто заміна природних екстеінов на біотехнологічні продукти вже гальмує активність інтеіна. Відповідно в обох випадках ми можемо виділити інтеін-який містить конструкт та потім активувати сплайсинг - найчастіше додаванням тіольних агентів, які виконують роль цистеїну або серину.
Сплайсинг нуклеїнових кислот є одним з найпотужніших способів швидкої перетасовки спадкової інформації, що в деяких випадках допомагає живим організмам швидко пристосуватися до нових умов. Тому його виявлення у білків ще раз підтвердило універсальний для всього живого принцип «розумної ощадливості» - вдалі процеси, характерні для одних типів молекул, часто виявляються і в інших (у даному випадку - і в нуклеїнових кислот, і у білків).
Механізми білкового сплайсингу до цих пір до кінця не вивчені. І особливо це відноситься до можливих функцій інтеінов в клітці. Про те, що дають інтеіни клітинам, що з ними відбувається після сплайсингу, як часто відбувається явище сплайсингу або хоумінга - до цих пір не відомо. Це дає широке поле для досліджень. Однак безперечно одне - явище білкового сплайсингу дає ще більшу гнучкість і пристосовність організмам, оскільки дозволяє вже пост-трансляційної змінювати продукт гена (або генів). Ми бачимо, що до відомих, і без того витонченим і багатогранним, механізмам живої клітини додається ще один. І цілком ймовірно - далеко не останній.
Список літератури
1.http: / / ru.wikipedia.org / wiki / Сплайсинг
2.http: / / ru.wikipedia.org / wiki / Сплайсосома #. D0.A1.D0.BF.D0.BB.D0.B0.D0.B9.D1.81.D0.B8.D0.BD.D0 . B3_.D0.A0.D0.9D.D0.9A
3.http: / / ru.wikipedia.org / wiki / Сплайсінг_белков
4.Старокадомскій П.Л. Теорія і механізм сплайсингу / / Молекулярна біологія, Москва, 2007
5. Сплайсинг білків на сервері «Біологія людини» (в інтернеті);
6. Старокадомского П. Л. Білковий сплайсинг / / Молекулярна біологія (Москва), 2007, том 41, № 2, c. 314-330. (В інтернеті);
7. Старокадомского П. Л. Білковий сплайсинг / / Укр. биохим. журн., 2005, № 4, с. 14-29;
8. Сайт «біомолекули»: «Геном людини: як це було і як це буде»;
9. Сайт «біомолекули»: «Білки проти РНК: хто першим вигадав сплайсинг?»