Мембранна ензимологія
Введення
Біомембран - це не просто якась пасивна структура, яка обмежує водні компартменти. Вже коротке знайомство з типами ферментів, пов'язаних з мембранами, показує, наскільки різноманітні асоційовані з мембранами каталітичні активності.
Трансмембранні ферменти, що каталізують пов'язані реакції на протилежних сторонах мембрани. Типові ферменти цього класу мають кілька активних центрів. Характерними прикладами можуть служити окислювально-відновні ферменти, наприклад фотосинтетичні реакційні центри рослин і бактерій або цитохром с-оксидаза мітохондрій. Розташовані на протилежних сторонах мембрани активні центри цих ферментів пов'язані один з одним за допомогою потоку електронів, що генерує трансмембранний електричний потенціал. До цього класу ферментів можуть бути віднесені також багато рецептори. Зв'язування ліганда з доменом, локалізованим із зовнішнього боку клітинної мембрани, призводить до змін в цитоплазматичної домені ферменту, які в свою чергу ініціюють клітинну відповідь. У цьому випадку через мембрану переноситься інформація, а не заряди або які-небудь розчинені молекули. Показано, що деякі рецептори є тирозинових протеїнкінази і, отже, являють собою мембранні ферменти, які мають каталітичну активність. Більшість же мембранних рецепторів самі по собі не каталізують жодних хімічних реакцій і не є в цьому сенсі ферментами.
Трансмембранні ферменти, які беруть участь у транспорті речовин. Багато мембранні білки беруть участь у транспорті молекул через бішар. , как в случае Са** - АТРазы саркоплазматического ретикулума. Активний транспорт може бути пов'язаний з гідролізом ATP, як у випадку Са ** - АТРази саркоплазматичного ретикулуму. Рушійною силою активного транспорту можуть бути також іонні градієнти. с помощью лактозопермеазы сопряжен с поглощением протонов и зависит от трансмембранного градиента электрохимического потенциала. Наприклад, транспорт лактози через плазматичну мембрану Є. coli за допомогою лактозопермеази пов'язаний з поглинанням протонів і залежить від трансмембранного градієнта електрохімічного потенціалу.
Білки, які є компонентами електронтранспортних ланцюгів. ; элементы фотосинтетической электронтранспортной цепи в тилакоидах. Найбільш типові ферменти цього класу - компоненти дихального ланцюга мітохондрій, що закінчується, цитохром с-оксидазой; ферменти системи електронного транспорту мікросом, що включають цитохром Р450 і цитохром bs; елементи фотосинтетичної електронно-транспортного ланцюжка в тилакоїди. Локалізація компонентів електронтранспортних ланцюгів у мембрані приводить до збільшення їх локальної концентрації, що дозволяє значно прискорити перенесення електронів між молекулами. Основне питання полягає в тому, чи є компоненти відповідних електронтранспортних ланцюгів вільно дифундують в площині мембрани білками або вони знаходяться в мембрані у вигляді більш-менш довгоживучих суперкомплексов.
Ферменти, здатні використовувати мембранозв'язані субстрати. У цей клас можуть входити ферменти, які беруть участь у метаболізмі компонентів мембрани: фосфоліпідів, гліколіпідів, поліізопреноідних з'єднань і стероїдів, а також ферменти, які беруть участь у процессингу мембранних і секреторних білків. У більшості випадків ці ферменти є інтегральними мембранними білками, але іноді є розчинні білки, лише тимчасово пов'язані з мембраною. и фосфолипаза С, связанные с мембраной посредством гликозилфосфа-тидилинозитольиого якоря. Прикладами білків цього типу є лідерних пептідаза з Є. coli і фосфоліпаза С, пов'язані з мембраною допомогою глікозілфосфа-тіділінозітольіого якоря.
Ферменти, що використовують водорозчинні субстрати. Багато мембранозв'язані ферменти використовують розчинні субстрати. У деяких випадках фермент локалізується в такій області мембрани, де велика концентрація субстрату. Наприклад, ацетилхолінестерази, що каталізує гідроліз ацетилхоліну, мабуть, фіксується в постсинаптической мембрані за допомогою ковалентного зшивки з фосфатіділінозітольним гликолипидов. -концевой части полипептидов. Цілий ряд ферментів, які беруть участь у гідролізі крохмалю і білків, прикріплюється до мембран мікроворсинок кишечника за допомогою гідрофобних доменів, розташованих в N-кінцевій частині поліпептидів. Ймовірно, зв'язок цих травних ферментів з мембраною дозволяє створити локально високу концентрацію розчинних молекул, що сприяє їх ефективному поглинанню клітиною. Як приклад можна навести два ферменти з цієї групи: сахарази-ізомальтази і мальтаза-глюкоамілаза.
Ферменти, що утворюють мембранозв'язаних комплекс для полегшення каналізації субстрату. Мембрани можуть служити своєрідним організуючим каркасом, з яким пов'язуються периферичні ферменти з утворенням мультиферментного комплексу. Є непрямі дані про те, що беруть участь в реакціях циклу Кребса ферменти матриксу мітохондрій зв'язуються з мембраною таким чином, що продукт одного ферменту стає субстратом іншого, не виходячи за межі мультиферментного комплексу. Такий механізм міг би полегшити метаболічні перетворення. Оскільки ферменти в суперкомплексах пов'язані один з одним слабкими зв'язками, з певністю продемонструвати їх існування досить важко.
Ферменти, які здійснюють човникові переміщення між цитозолі та мембраною і активність яких модулюється зв'язуванням з мембраною. Ця група мембранних ферментів виявлена недавно. Вони здатні зв'язуватися або прямо з поверхнею фосфоліпідного бішару, або зі специфічними білковими рецепторами. Найчастіше ці ферменти активуються при зв'язуванні з мембраною, але іноді спостерігається і їх інактивація. , протеинкиназа С и некоторые ферменты, участвующие в каскаде свертывания крови. Типовими прикладами ферментів, що активується при зв'язуванні, є піруватоксідаза з Є. cod, протеїнкіназа С і деякі ферменти, що у каскаді згортання крові.
В першу чергу слід відзначити ключову роль ліпідного оточення мембранних ферментів у прояві їх активності. или по крайней мере создать для фермента подходящее окружение. Цей фактор може дуже сильно ускладнити інтерпретацію кінетичних даних і вимагати значних експериментальних зусиль у реконструкції очищених інтегральних мембранних ферментів з фосфоліпідами, з тим щоб наблизити умови роботи ферменту до умов in vivo або принаймні створити для ферменту підходяще оточення.
1. Деякі специфічні положення, що мають відношення до активності мембранних ферментів
Проблема вивчення функціонування мембранних ферментів зводиться по суті до проблеми гетерогенного каталізу. Ці ферменти знаходяться не в безперервній гомогенному середовищі, а локалізовані в біомембрані, міцели, везикул чи іншої мембранної системі. Мембранні ферменти вельми чутливі до локального оточення, яке, взагалі кажучи, може істотно відрізнятися від оточення в розчині. Більше того, для здійснення каталітичної реакції фермент і мембранозв'язаних субстрат повинні знаходитися в одній і тій же мембрані або. везикул, тому при аналізі кінетичних властивостей мембранних ферментів часто виникають проблеми, пов'язані з їх просторовим розділенням. , так и в модельных системах. Розглянемо деякі положення, що стосуються кінетичних аспектів роботи мембранних ферментів як in situ, так і в модельних системах.
1. Просторове розділення ферменту і субстрату. Фермент і субстрат повинні мати можливість взаємодіяти. Припустимо, що ми вивчаємо очищений інтегральний мембранний фермент в розчині детергенту з неполярних ліпофільним субстратом. І фермент, і субстрат солюбілізіровани в детергентних міцелах, але для того, щоб міг здійснюватися каталіз, вони повинні знаходитися в одних і тих же міцелах. При надлишку детергенту збільшується ймовірність того, що фермент і субстрат будуть знаходитися в різних міцелах, і лімітуючою стадією в цьому випадку стане дифузія субстрату в ферментно-детергентних міцели. При цьому швидкість роботи ферменту залежить від поверхневої концентрації субстрату в міцели, а не від об'ємної концентрації. При роботі з дуже гідрофобними субстратами часто виникає інша проблема. Такі субстрати можуть не до кінця солюбілізіроваться в міцелах або мембранних везикулах, частина їх коагулює з утворенням грудок або мікроскопічних кристалів, в які фермент не проникає. Невелика кількість ферментів може працювати в вивернутих міцелах, коли містять воду структури дисперговані в органічному розчиннику, але це швидше виняток, ніж правило.
Інші проблеми при вимірюванні активності мембранних ферментів виникають, коли або фермент, або субстрат знаходиться як в мембранозв'язаних, так і в розчиненої формах. Прикладами такого роду служать "поверхневі" ферменти - ліпази або фактори згортання крові. Для аналізу кінетики таких систем необхідно знати співвідношення між формами ферменту в даних експериментальних умовах і каталітичні активності кожної з форм. У всіх цих випадках зміст величин максимальної швидкості і константи Міхаеліса може бути зовсім іншим, ніж для ферментів, активність яких вимірюється в гомогенному середовищі, що сильно ускладнює інтерпретацію цих параметрів.
Гьстерезіс і гетерогенність. Мембранні ферменти мають і іншими особливостями, що утрудняють інтерпретацію кінетичних даних. Ці особливості пов'язані з солюбілізаціі. Каталітична активність мембранних ферментів часто дуже сильно залежить від використовуваного детергенту або фосфолипида. Зазвичай активність мембранних ферментів вимірюють у суміші, яка містить детергент і екзогенно доданий фосфолипид. Крім того, ферментний препарат нерідко містить соочіщаемие з ним ендогенні ліпіди. У таких умовах фізичний стан ферменту, зокрема ступінь його агрегації, виявляється досить невизначеним і швидше за все гетерогенним. Часто в одній і тому ж середовищі, компоненти якої змішувалися в різній послідовності, отримують зовсім різні ферментативні активності. Така залежність від передісторії препарату являє собою приклад гистерезиса і досить типова для мембранних ферментів. По суті фермент "застрягає" в метастабільних стані і не може придбати найбільш стабільну "робочу конформацію". Наприклад, просте змішування солюбілізірованного мембранного білка з фосфоліпідних велікуламі швидше за все не призведе до вбудовуванню білка в ліпосоми. Для досягнення успішної реконструкції розроблені спеціальні процедури, що дозволяють уникнути переходу системи в небажане метастабільного стан. . Як приклад ферменту, що утворює великі агрегати, можна навести бактопренолкіназу, дуже гідрофобний білок з Staphylococcus aureus. Його активність не залежить від ступеня агрегації, що зустрічається далеко не завжди.
Явище гістерезису сильно залежить від типу фосфолипида, тому дані по специфічності ліпідів у відношенні активності окремих мембранних ферментів часто виявляються досить ненадійними.
Фермети у везикулах. Часто в дослідженнях використовують мембранні ферменти, вбудовані в бішар замкнутих везикул. , содержащиеся в изолированных природных мембранах, либо очищенные ферменты, встроенные в липосомы. Це можуть бути або ферменти in situ, що містяться в ізольованих природних мембранах, або очищені ферменти, вбудовані в ліпосоми. У таких експериментах виникають свої проблеми. Найбільш очевидна з них пов'язана з тим, що активний центр ферменту може знаходитися всередині везикули і, отже, бути ізольованим від розчинної у воді субстрату. З цим пов'язана проблема так званої прихованої ферментативної активності, що виявляється тільки після того, як везикули з тих чи інших причин стануть проникними або зруйнуються. Це явище часто використовують для визначення орієнтації мембранного ферменту в везикули. Частка прихованої активності прямо відповідає частці ферменту, активний центр якого локалізована всередині везикули. При цьому можна використовувати лише такі субстрати, які не здатні проникати через мембрану.
Проблеми іншого роду виникають при вимірюванні активності трансмембранних ферментів, які каталізують реакції, що супроводжуються транспортом речовин або зарядів через бішар. Прикладами таких ферментів можуть служити цитохром с-оксидаза, що каталізує перенесення електронів через мембрану і транспорт протонів в протилежному напрямку, а також різноманітні АТР-залежні іонні насоси, наприклад Са 2 + - Атран-зи. При вбудовуванні в везикули переважно в одній орієнтації щодо внутрішньої і зовнішньої сторін везикули такі ферменти створюють трансмембранний градієнт концентрації речовин або електричний потенціал. Саме в цьому і полягає їх фізіологічна функція. У везикул з маленьким внутрішнім об'ємом, проте, цей градієнт буде створюватися дуже швидко, що призведе до фактичного зменшення числа обертів ферменту, якщо не будуть вжиті відповідні заходи. Це зменшення пов'язано з тим, що хімічна робота, що здійснюються при перенесенні молекули, іона або електрона проти існуючого градієнта, збільшується з збільшенням цього градієнта. При градієнті вище певного рівня фермент взагалі перестає працювати. Система, в якій відбувається таке зменшення активності, називається "сполученої", а сама ця активність є мірою того, наскільки цілісні везикули і якою мірою запобігти витік іонів або молекул у напрямку градієнта, створеного за допомогою ферменту. Ступінь пари можна оцінити, вимірюючи активність ферменту в умовах, коли градієнту не дають утворюватися. Наприклад, градієнт електричного потенціалу, що створюється на мембрані везикули цитохром с-оксидазой, можна зруйнувати, додавши в середу іонофор, що збільшує іонну проникність бішару. При цьому необхідно, щоб усередині везикули була висока концентрація буфера, оскільки в іншому випадку утилізація протонів усередині везикули з утворенням води приведе до швидкого і сильного защелачиванию внутрішнього середовища, що може вплинути на ферментативну активність.
Робота деяких іонних каналів і ферментів прямо регулюється трансмембранним потенціалом. За допомогою флуоресцентних і спінових міток показано також, що при наявності різниці потенціалів може істотно збільшуватися мікров'язкість бішару. Це теж позначається на активності ферментів. І нарешті, стверджується, що трансмембранний потенціал впливає на ступінь агрегації деяких мембранних білків, але фізіологічна роль цього явища невідома. Всі ці ефекти спостерігаються тільки на замкнутих везикулах.
Вплив поверхневого потенціалу. Більшість біомембран містять значну кількість негативно заряджених фосфоліпідів, а отже, несуть сумарний негативний заряд. З цим негативним зарядом, розподіленим по поверхні мембрани, пов'язаний поверхневий електричний потенціал. Він викликає зменшення концентрації негативно заряджених іонів в прилеглому до мембрани шарі в порівнянні з середньою об'ємною концентрацією і збільшення локальної концентрації позитивно заряджених іонів поблизу поверхні мембрани. Поверхневий потенціал, змінюючи локальну концентрацію заряджених субстратів і протонів, може досить істотно позначитися на поведінці ферментів, активний центр яких локалізований у поверхні мембрани. При фізіологічної іонної силі цей ефект буде проявлятися головним чином в області, що безпосередньо примикає до зарядженої поверхні мембрани, але тим не менш може виявитися досить істотним. Вплив поверхневого потенціалу проявляється у зміні вимірюваної величини Км для заряджених субстратів або в зсуві рН-залежності активності ферменту, оскільки локальна концентрація будь-якого зарядженого речовини буде або вище, або нижче, ніж концентрація в об'ємі. Тому кінетичні характеристики мембранного ферменту, вбудованого в везикули, які отримані з різних фосфоліпідів і мають різну поверхневу щільність заряду, можуть різнитися, і в свою чергу відрізнятися від властивостей ферменту, що знаходиться в нейтральних детергентних міцелах.
, так и встроенных в фосфолипидные везикулы, например для арилсульфатазы С, использующей отрицательно заряженный субстрат, или для моноаминооксидазы, катализирующей превращения катионного субстрата. Подібні ефекти спостерігалися для деяких мітохондріальних і мікросомних ферментів - як in situ, так і вбудованих у фосфоліпідний везикули, наприклад для арилсульфатази С, використовує негативно заряджений субстрат, або для моноамінооксидази, що каталізує перетворення катіонного субстрату. . Зміна ліпідного оточення / 3-гідроксібуті-ратдегідрогенази також впливає на величини Км для NADH. Вважають, що цей вплив обумовлено зміною щільності поверхневого заряду.
На закінчення відзначимо, що в літературі активно обговорювалася роль поверхневого заряду тилакоїдних мембран як фактора, що регулює латеральне розподіл мембранних білків і взаємодія між мембранами. У цьому випадку, однак, поверхневий заряд мембрани визначається головним чином білковими компонентами, а не ліпідами. , а также при реконструировании систем из очищенных компонентов, моделирующих природные структуры. Кожному б то не було, ясно, що облік поверхневого потенціалу абсолютно необхідний при аналізі роботи багатьох мембранних ферментів in vivo, а також при реконструюванні систем з очищених компонентів, що моделюють природні структури.
2. Реконструкція мембранних ферментів
Після того як мембранний фермент очищений, для вивчення його каталітичної активності бажано, а часто і необхідно реконструювати його з фосфоліпідами. и после очистки и реконструкции одинаковы. Кінетичні характеристики багатьох ферментів in situ і після очищення і реконструкції однакові. Незважаючи на те що властивості ферменту в штучних системах можуть змінюватися, вивчення очищених і реконструйованих ферментів дає великі переваги. Зокрема, а такій системі ие протікають різні конкуруючі реакції, притаманні біомембранами. Вдається усунути і інші ускладнюють дослідження проблеми. Використання реконструйованої системи дозволяє не тільки охарактеризувати ізольовану систему, а й визначити мінімальне число компонентів, необхідних для прояву тих чи інших біохімічних активностей. ответствен только один белок, лактозопермеаза. За допомогою реконструкції вфосфоліпідну везикули, наприклад, було показано, що за поглинання лактози клітинами Є. coli відповідальний тільки один білок, лактозопермеаза. и системы аденилатциклазного гормонального ответа. Аналогічним способом було однозначно визначено мінімальне число білкових компонентів, необхідних для реконструкції дихальної ланцюга Є. coli і системи аденілатціклазного гормонального відповіді.
Для вбудовування солюбілізірованних в детергенти очищених мембранних компонентів в модельні мембранні системи розроблено кілька методів. Найчастіше ферменти вбудовуються в одношарові фосфоліпідних везикули. Характеристики ж білків, активно чи пасивно збільшують іонну провідність мембрани, часто визначають після їх вбудовування в плоский бішар. Плоскі мембрани зручні для електричних вимірювань, що дозволяють визначити величину іонної провідності та інші похідні характеристики, наприклад залежність частки відкритих каналів від прикладеної електричної напруги. У таких системах, однак, важко або навіть неможливо визначити біохімічні характеристики білка, зокрема його каталітичні активності, відмінні від іонної проникності.
2.1 Вбудовування мембранних ферментів у ліпідні везикули
Для вбудовування мембранного білка в ліпідну везикулу насамперед необхідно позбутися від знаходиться у препараті білка детергенту, який, якщо він присутній у значних кількостях, дестабілізує фосфоліпідний бішар. Зазвичай детергент видаляють вже з суміші білка з фосфоліпідів, але в деяких випадках білок очищають від детергенту до початку реконструкції. Для видалення детергенту використовують гель-фільтрацію, діаліз або адсорбцію на поверхні кульок з полістиролу. Останній спосіб застосовують в першу чергу для видалення тритона Х-100. Всі перераховані методи досить ефективні, однак слід мати на увазі, що навіть після самих інтенсивних обробок у системі звичайно завжди залишається те або інше кількість зв'язаного детергенту.
Методи реконструкції можна розділити на дві групи.
I. Процедури, при яких білок попередньо очищають від детергенту, а потім проводять реконструкцію.
II. Процедури, в яких білки і фосфоліпіди змішують у присутності детергенту, а потім видаляють детергент до утворення протеоліпосом. Єдине обмеження тут полягає в наступному: обраний фосфолипид повинен бути здатний до формування стабільних бішару. Не можна, наприклад, використовувати ненасичені фосфатидилетаноламін. Дуже зручний сумарний фосфолипид з соєвих бобів, оскільки він відносно недорогий, легкодоступний і може застосовуватись у багатьох випадках.
I. Реконструкція без надлишку детергенту
Умови включення мембранних білків в попередньо сформовані фосфоліпідних везикули часто збігаються з умовами, які сприяють злиттю фосфоліпідних везикул. В основі обох процесів лежать певні порушення біслойную структури, або утворення "дефектів", які могли б полегшити як вбудовування білка, так і злиття везикул. Механізми цих процесів вивчені мало. Можливою труднощами в застосуванні цих методів є агрегація білка.
1. Інкубація білка із заздалегідь отриманими везикулами. и /З-гидроксибутиратдегидрогеназы. Цей спосіб застосовується далеко не завжди і використовується для реконструкції не пронизують бішар білків з обмеженою гідрофобною поверхнею, наприклад цитохрому bs і / З-гидроксибутиратдегидрогеназы. Конформація вбудованого таким чином білка, проте, відрізняється від нативної.
Реконструкція з участю амфіфільних каталізаторів. У ряді робіт було показано, що додавання в білково-вфосфоліпідну суміш амфіфільних речовин в низьких концентраціях полегшує вбудовування в везикули таких мембранних ферментів, як бактеріородопсин або цитохром с-оксидаза. Як амфіфільних речовин використовували холестерол, коротколанцюгові фосфатидилхоліну і жирні кислоти. Даний спосіб хороший тим, що в ньому не використовуються будь-які грубі процедури, в тому числі обробка надлишком детергентів, проте поки він мало поширений.
Замораживание-оттаивание/обработка ультразвуком. У деяких випадках з успіхом використовується метод заморожування-відтавання суміші з наступною обробкою ультразвуком. Ця методика, проте, застосовується нечасто через небезпеку денатурації білка. Іноді для полегшення реконструкції використовують просту обробку ультразвуком. Найімовірніше, білок спочатку включається в маленькі везикули, що володіють високою кривизною. Заморожування-відтавання, можливо, потрібно для злиття дрібних протеоліпосом в більш великі і більш однорідні за розмірами.
2. Реконструкція з використанням миючих засобiв
В даний час для реконструкції набагато частіше використовують методики, що складаються в солюбілізаціі суміші білка та фосфолипида детергентом і наступному видаленні детергенту. Після його видалення білок і фосфолипид спонтанно формують одношарові везикули, цілком придатні для ензимологічних досліджень. Зазвичай вибирають детергенти з високою критичною концентрацією міцелоутворення і малими розмірами міцел, з тим щоб їх можна було легко видалити діалізом або гельфільтраціей. Найчастіше використовують холато натрію і октілглюкозід. Розподіл отриманих везикул за розмірами визначається співвідношенням детергент: фосфолипид, а також способом і швидкістю видалення детергенту. Зазвичай використовують діаліз як більш повільний спосіб. + / K +- ATPa 3 bi . В якості прикладів можна навести вбудовування цитохром с-оксидази і Na + / K + - ATPa 3 bi.
За допомогою такої методики можна ввести в везикули відмінні від фосфоліпідів речовини, наприклад холестерол або убіхінон. У ряді випадків виникає необхідність у досить швидкому видаленні детергенту, особливо якщо білок нестабільний при його надлишку. Тоді застосовують гельфільтраціонную хроматографію, теж дозволяє ефективно відокремити білково-ліпідні везикули від детергенту. На рис.1 показаний профіль елюції з такою колонки.
Ще більш швидким є метод розведення, коли білково-ліпідно-детергентно суміш розводять до концентрації детергенту багато меншою, ніж критична концентрація міцелоутворення. При цьому спонтанно утворюються білково-фосфоліпідних везикули, які можна відокремити від детергенту центрифугуванням.
Зазвичай використовується для очищення мембранних ферментів тритон Х-100 дуже незручний при реконструкції, оскільки його важко Видалити з системи. Для видалення тритона застосовують кульки з полістиролу, і одна з проблем - втрата білка з-за його сорбції на поверхні кульок. Як приклад білка, реконструюється цим методом, можна навести натрієвий канал.
І нарешті, для реконструкції застосовували метод, заснований на диспергування суміші холестерол-фосфолипид-білок в діетиловому ефірі і наступному випаровуванні зверненої фази.
Однак малоймовірно, що багато білків витримають таку процедуру.
3. Деякі характеристики реконструйованих білково-фосфоліпідних везикул
У результаті застосування всіх методів, розроблених для реконструкції мембранних білків, утворюються одношарові везикули. Характеристики деяких з них детально вивчені. Це, зокрема, протеоліпосоми, що містять цитохром с-оксидазу, Иа + / К +-АТРази, цитохром Ь 5 і глікофорину. Особливий інтерес представляють:
1) середній розмір везикул і розподіл їх за розмірами;
2) розподіл білка в популяції везикул;
3) орієнтація білка по відношенню до площини бішару;
4) проникність везикул. Ці характеристики особливо важливі, якщо фермент каталізує трансмембранний перенос речовин або іонів. Для кількісного аналізу кінетики таких ферментів необхідно знати внутрішній обсяг везикул, їх проникність і розподіл білка. Для ферментів, що каталізують векторні реакції, молекули, які мають протилежну орієнтацію і знаходяться в одній везикул, будуть працювати "вхолосту", компенсуючи один одного при створенні результуючого іонного градієнта.
Розмір везикул. Розмір везикул сильно залежить від процедури реконструкції. Для його визначення краще всього використовувати методи електронної мікроскопії або гельфільтраціі. При видаленні детергенту діалізом утворюються протеоліпосоми діаметром від 500 до 2500 А в залежності від білка і використовуваного методу. При будь-якому способі реконструкції розміри одержуваних везикул варіюють у досить широких межах; протеоліпосоми потрібного діаметра можна потім відокремити за допомогою гельфільтраціонной хроматографії.
Розподіл білка. Коли при реконструкції використовується діаліз для видалення детергенту з суміші, що містить надлишок чи-Підаєв, розподіл білка між отриманими везикулами має підкорятися розподілу Пуассона. Однак насправді воно може залежати від вбудованого білка і методичних деталей. Слід зазначити, що при спонтанному вбудовуванні в попередньо отримані ліпосоми деякі білки включаються переважно у везикули малих розмірів. , например, в 200 раз эффективнее встраивается в везикулы диаметром 200 А, чем 1000 А. Цитохром bs, наприклад, в 200 разів ефективніше вбудовується в везикули діаметром 200 А, ніж 1000 А.
Орієнтація білка. Це питання важливе з точки зору ензимології, оскільки білок, активний центр якого локалізована всередині везикули, може бути недоступний для субстрату. Як не дивно, багато ферментів, наприклад цитохром с-оксидаза, Иа + / К +-АТРази, гліцерин-3-фосфатації-трансфераза, бактеріородопсин, здатні вбудовуватися в мембрану таким чином, що їх активний центр з імовірністю 75-95Чо виявляється зовні везикули . Везикули, що містять цитохром с-оксидазу, за допомогою ДЕАЕ-хроматографії вдається розділити на дві популяції: з активним центром, орієнтованим всередину, і з активним центром, орієнтованим назовні. У принципі такий спосіб поділу придатний і для інших білків.
Причина такої асиметрії вбудовування невідома. У деяких випадках орієнтована назовні частина ферменту має більший розмір, а вбудовування білка більш масивною частиною всередину везикули невигідно. Оскільки переважна орієнтація спостерігається і при вбудовуванні білків у великі ліпосоми, мабуть, асиметрія вбудовування не пов'язана з кривизною везикули, як у випадку розподілу ліпідів у везикулах малих розмірів. Ймовірно, важливу роль грають якісь кінетичні чинники, проте їх важко оцінити, оскільки неясна природа перехідних станів.
Не можна не відзначити також, що деякі білки вбудовуються в везикули неправильним чином, тобто в конформації, відмінною від нативної. , который в зависимости от метода реконструкции может находиться в одной из двух конформации. Найбільш типовий приклад - цитохром bs, який залежно від методу реконструкції може перебувати в одній з двох конформації. 3. Така поведінка характерна також для компонента Н-2К головного комплексу гістосумісності у мишей і, можливо, для білка оболонки бактеріофага Ml 3. -образной конфигурации, когда N - и С-концевые аминогруппы экспонированы наружу. Всі ці білки мають один трансмембранний гідрофобний домен, і при деяких умовах він включається в бішар в U-подібної конфігурації, коли N - і С-кінцеві аміногрупи експоновані назовні.
Проникність. Важливість цієї характеристики для ферментів, що каталізують перенесення речовин або іонів через бішар, безсумнівна. Багато систем транспорту та іонні насоси вивчали після вбудовування їх у протеоліпосоми, і очевидно, що протеоліпосоми, придатні для таких досліджень, повинні мати досить низькою проникністю. Присутність білка зазвичай призводить до збільшення проникності везикул, але ступінь цього збільшення дуже сильно залежить від вибору ліпіду і від кількості молекул білка на везикул. Висловлювалося припущення, що молекули деяких ліпідів завдяки їх формі краще упаковуються навколо вбудованих в бішар білків; тим самим згладжуються дефекти структури на кордоні білок-ліпід і зменшується їх проникність для розчинених речовин. Однак прямі докази з цього приводу відсутні.
3.1 Вплив ліпідів на активності мембранозв'язаних ферментів
Каталітична активність багатьох мембранних ферментів залежить від ліпідів. Ліпіди при цьому можуть виконувати дві функції:
1) створювати необхідне середовище;
2) діяти як аллостеріческій регулятор, модулирующий активність ферменту. У першому випадку ліпіди не тільки запобігають денатурацію ферментів, але і полегшують взаємодію ферментів один з одним і з іншими мембранозв'язаних компонентами, зокрема з ли-пофільнимі субстратами. Як аллостеріческій ефекторів ліпіди зазвичай активують фермент переважно шляхом стабілізації його в певній конформації. У принципі ці дві функції ліпідів зовсім різні, проте розмежувати їх експериментально буває вкрай важко. В ідеальній експериментальній системі аллостеріческій ефекторів повинен бути специфічний ліпід, а необхідна для роботи оточення ферменту має створюватися всій основною масою ліпідів у бішарі. На жаль, поки виявлений тільки один приклад абсолютної специфічності ферменту до визначення ліпідів. / З-Гідроксібутіратде-гидрогеназой для здійснення каталітичної активності необхідний саме фосфатидилхолін, в більшості ж випадків ферменти досить ефективно активуються різними ліпідами. А оскільки будь-ліпід може в тій чи іншій мірі виконувати як функцію оточення, так і функцію специфічного аллостеріческого ефектора, розрізнити ці два ефекти стає практично неможливо. На ферментативну активність може впливати також фізичний стан бішару, зокрема поверхнева щільність заряду і в'язкість. Систематично підбираючи ліпіди різної структури і змінюючи фізичний стан мембрани, можна встановити кореляції між активністю ферменту і цим "параметрами, але саме по собі таке дослідження ще не дозволяє розмежувати дві функції ліпідів. Зміна фізичного стану бішару може впливати на взаємодію з ферментом будь-яких ліпідів, в тому числі і тих, які функціонують як аллостеріческій ефектори. При вивченні ферментів, субстратом яких служать ліпофільні сполуки, виникають особливі проблеми, оскільки такі субстрати повинні бути включені в бішару до або після отримання везикул, а великі концентрації розчиненого в бішарі субстрату не можуть не позначитися на фізичному стані модельної мембрани.
Для дослідження впливу ліпідів на мембранні ферменти застосовується ще одна стратегія - так званий метод змішаних міцел. Фермент розчиняють в детергенти, не активує його, і до суміші додають ліпіди. Багато мембранні ферменти зберігають певну активність і в детергенти, причому така активність сильно залежить не тільки від природи ферменту, але і від вибраного детергенту, а також, можливо, від наявності ендогенних ліпідів у препараті очищеного ферменту. Взагалі кажучи, для методу змішаних міцел бажано повністю звільнити фермент від ліпіду, проте для цього іноді доводиться використовувати дуже грубі процедури, які можуть призвести до денатурації білка. Методи повного знежирення звичайно засновані на пропущенні препарату ферменту через середовище з великим надлишком детергенту. Для цього використовують гель-фільтрацію, центрифугування в градієнті щільності сахарози або зв'язування ферменту з яким-небудь твердим носієм з подальшим промиванням надлишком детергенту.
Метод змішаних міцел має ще й ту перевагу, що ліпофільний субстрат можна додати в міцелах того ж детергенту, хоча в цьому випадку можуть виникнути труднощі, пов'язані з просторовим поділом ферменту і субстрату. Спостережувані в такого роду системах ефекти ліпідів є переважно аллостеріческій, оскільки тут немає бішару, а зв'язування ліпідів з білком відбувається в глобулярної міцел у присутності великої кількості детергенту. На жаль, фізичний стан комплексу фермент-детергент-фосфолипид визначити практично неможливо, і це серйозний недолік описуваного підходу.
Будь-які ефекти, що спостерігаються в такій системі для будь-якого ліпіду, повинні бути отримані з використанням декількох не активують фермент детергентів. Тільки в цьому випадку можна бути впевненим, що детергент нейтральний. На жаль, такі роботи зустрічаються не часто.
Результати дослідження багатьох систем дозволяють зробити кілька загальних висновків.
Для активації ферменту дуже рідко буває необхідний ліпід з якоюсь суворо певною структурою. Безумовно, одні ліпіди активують цей фермент з більшою ефективністю, ніж інші, однак така перевага може залежати від умов вимірювання, а вже говорити про його фізіологічному значенні як мінімум передчасно. Цілком може виявитися, що ліпід, з високою ефективністю активує фермент, взагалі не є присутнім у мембрані, з якої цей фермент виділено. Тому до тверджень про специфічність ліпіду слід ставитися з. обережністю.
Вимірюється в системі зі змішаними мицеллами залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації ліпіду зазвичай свідчить про високу кооперативності процесу. Таку поведінку можна пояснити, зокрема, тим, що ліпіди зв'язуються некооператівіо з кількома еквівалентними центрами на ферменті, але активними є лише ті молекули ферменту, у яких зайнята велика частина ліпідсвязивающіх центрів. Нерідко при активації ферменту ліпідом спостерігається оптимум в концентраційної залежності, ймовірно пов'язаний з досягненням певного співвідношення між ліпідом і детергентом і освітою в такій суміші конкретних структур.
Сама по собі біслойную структура не є необхідною для активації ферментів, оскільки багато ферментів виявляють активність у присутності детергенту або у складі ліпідів-детергентних міцел. Відомі випадки, коли мембранні ферменти ефективно активуються ліпідами, взагалі не формують стабільні бішару.
Важливим параметром, що визначає активність більшості мембранних ферментів, безумовно є фізичний стан бішару. нет. Однак чітких даних про фізіологічної регуляції ферментативної активності за допомогою цього параметра in vivo немає. При переході ліпідів у фазу гелю багато ферментів стають неактивними або їх активність різко зменшується. У літературі є маса прикладів, коли зміни швидкості роботи ферменту з температурою корелювали зі зміною фізичного стану ліпідів. У цих роботах основна увага зверталася на кореляцію між точками перегину в температурних залежностях ферментативної активності і який-небудь характеристикою, що відбиває фізичний стан ліпіду. Виявити зв'язок ферментативної активності з в'язкістю мембрани, виходячи з температурної залежності, дуже непросто, оскільки температура впливає одночасно на дуже багато параметрів. Слід мати на увазі, що в'язкість мембрани в значній мірі корелює з щільністю упаковки молекул ліпіду в бішарі і індуковані температурою зміни в'язкості можна пояснити в основному змінами в щільності упаковки. Існує дуже мало прикладів чіткої лінійної кореляції між активністю ферменту і в'язкістю мембрани. Неясно, правда, як інтерпретувати цю кореляцію з точки зору механізму ферментативної реакції. І лише в кількох роботах містяться вказівки на те, яка або які з стадій ферментативної реакції є лімітуючими і модулюються зв'язуванням ліпіду. У зв'язку з цим необхідно згадати, що ліпіди можуть сильно впливати не тільки на максимальну швидкість, але і на зв'язування ферменту із субстратами і кофакторами.
Взагалі кажучи, при дослідженні взаємодії з певним ферментом великого числа різних ліпідів кореляції між активністю ферменту і яким-небудь одним параметром не спостерігається. Поки ліпід знаходиться в рідкокристалічному стані, для ферментативної активності часто більш важлива структура полярної головки ліпіду, ніж в'язкість бішару. Іншими словами, важлива хімічна структура індивідуальних ліпідів, а чому - це вже окреме питання.
4. Деякі приклади ліпідзавісімих ферментів
Розглянуті нижче п'ять ферментів обрані в якості прикладів тому, що, по-перше, вони найкраще вивчені і охарактеризовані, по-друге, вони охоплюють кілька типів мембранних ферментів, по-третє, вони можуть служити ілюстрацією кількох основних проблем, що виникають при дослідженні ліпідзавісімой активації.
4.1 0-гидроксибутиратдегидрогеназа
Це один з найбільш добре вивчених активуються ліпідом ферментів і єдиний фермент, що володіє абсолютною специфічністю до визначення ліпідів: активувати БДГ здатний тільки фосфатидилхолін. + . БДГ локалізується на внутрішній поверхні внутрішньої мітохондріальної мембрани і каталізує окислення / 3-гидроксибутирата за допомогою NAD +. Обидва субстрату водорозчинні. Молекулярна маса субодиниці ферменту дорівнює 31 кДа, але її амінокислотна послідовність до кінця не встановлена. БДГ швидше за все не є трансмембранним білком. Одержуваний після очищення фермент вільний від фосфолипида і детергенту і здатний спонтанно вбудовуватися в фосфоліпідних везикули. Хоча БДГ пов'язується і з везикулами, не містять фосфатидилхоліну, каталітичну активність фермент починає проявляти тільки у присутності фосфатидилхоліну. При вбудовуванні ферменту в везикул, мабуть, відбувається не тільки взаємодія з поверхнею мембрани, а й значне занурення білка в бішар, а також зміни конформації білка. Кінетичні властивості ферменту і його тетрамерной форми однакові в мітохондральной мембрані і після реконструкції з мітохондріальними ліпідами.
На рис.6.2 наведена крива активації БДГ фосфоліпідних везикулами, що містять різну кількість фосфатидилхоліну. У всіх випадках фермент вбудований в ліпосоми. Залежність швидкості ферментативної реакції від змісту фосфатидилхоліну в бішарі вказує на високу кооперативность процесу, в якому беруть участь два необхідних для активації ліпідсвязивающіх центру.
Крім того, за даними про гасіння флуоресценції триптофану похідними фосфатидилхоліну окремо була визначена доступність молекул фосфатидилхоліну для БДГ. Ступінь гасіння флуоресценції фактично є мірою зв'язування ліпіду. Виявилося, що фосфатидилхолін зв'язується некооперативна з приблизно 12 центрами в молекулі ферменту. Таке некооперативна зв'язування з досить великим числом центрів дуже типово для мембранних білків у бішарі. Крім того, основна частина флуоресценції гаситься при більш низьких концентраціях фосфатидилхоліну, ніж необхідно для активації. Така розбіжність між зв'язуванням ліпіду і активацією ферменту можна пояснити, якщо припустити, що в активації бере участь тільки дуже невелика частина центрів, які не вдається виявити в експериментах з гасіння флуоресценції. Наведені результати цікаві ще й тим, що дозволяють зіставити фізична взаємодія певного ліпіду і ферменту з біохімічним відповіддю.
Інтерпретація результатів таких експериментів ускладнюється тим, що активність ферменту може сильно залежати від ступеня його агрегації, тобто активність ферменту в різних ліпідах, мабуть, буде відповідати ступеню його дезінтеграції. БДГ чудовий ще й тим, що це один з небагатьох ферментів, що активуються коротколанцюгові гомологами фосфатидилхоліну, які зв'язуються з ферментом і активують його в концентраціях нижче критичної концентрації міцелоутворення. Ці дані також підтверджують, що в активацію ліпідом залучено лише невелика кількість центрів зв'язування на білку.
4.2 Піруватоксідаза
, катализирующая окисление пирувата до уксусной кислоты и СОг и восстановление убихинона в цитоплазматической мембране, обеспечивает поступление электронов в аэробную дыхательную цепь. Ця флавіносодержащая дегідрогеназа з Є. coli, що каталізує окислення пірувату до оцтової кислоти і СОГ та відновлення убихинона на цитоплазматичній мембрані, забезпечує надходження електронів в аеробну дихальний ланцюг. Фермент володіє рядом чудових особливостей. Він розчинний у воді і не проявляє жодних характерних для мембранного білка властивостей. Однак у присутності субстрату і кофактора відбувається зміна конформації білка, в результаті чого формується центр зв'язування з мембраною. У цих умовах різко зростає спорідненість ферменту до детергентів та фосфоліпідний везикула, і білок за своїми властивостями стає схожий на справжній мембранний фермент. Піруватоксідаза може служити прикладом ферменту, який є цитоплазматическим, поки субстрату мало, але перетворюється в мембранний, як тільки концентрація субстрату стає досить високою.
Найбільший інтерес при дослідженні цього ферменту представляла його ефективна активація ліпідами. Активність ферменту можна виміряти, використовуючи замість природного мембранозв'язаних акцептора - убихинона будь-якої розчинний у воді штучний акцептор електронів, наприклад феррицианида. У присутності ліпідів каталітична активність піруватоксідази зростає до 50 разів. На відміну від / 3-гидроксибутиратдегидрогеназы цей фермент активується найрізноманітнішими фосфоліпідами і детергентами. У концентраціях нижче критичних концентрацій міцелоутворення фермент повністю активується як аніонними, так і катіонними детергентами, а дослідження зв'язування детергентів показує, що в активації бере участь дуже невелика кількість центрів зв'язування. Зв'язування ферменту з фосфатіділхоліновимі везикулами або детергентами не відбувається до тих пір, поки не додано субстрат і кофактор. У присутності субстрату і кофактора піруватоксідаза здатна зв'язуватися і активуватися різноманітними везикулами, отриманими з цілого ряду фосфоліпідів. Зв'язування відбувається в першу чергу за рахунок гідрофобних, а не електростатичних взаємодій. Зв'язування ліпіду і активація в разі піруватоксідази, мабуть, нероздільні, хоча і не всі везикули пов'язується фосфолипида або амфіфільних сполук відповідальні за активацію ферменту. Активація ліпідами викликає зміни у спектрі поглинання пов'язаного Флавіна, ймовірно, внаслідок полегшення реакції перенесення електронів.
Конформаційні зміни в молекулі піруватоксідази призводять не тільки до утворення ліпідсвязивающего домену, але і до появи чутливого до протеазам ділянки кола поблизу С-кінця. Протеоліз пригнічує зв'язування ліпідів, але, як це не дивно, викликає активацію ферменту відносно реакції відновлення водорозчинних штучних акцепторів електронів. Активоване протеазами фермент, проте, вже не може відновлювати мембранозв'язаних убіхінон, оскільки втрачає здатність зв'язуватися з мембраною.
Як показують результати клонування і секвенування гена, що кодує піруватоксідазу, амінокислотна послідовність білка не має протяжних гідрофобних ділянок. Генетичні дослідження, а також дані по протеолізу показали, що за зв'язування ліпіду відповідальний ділянку поліпептиду, локалізований поблизу С-кінця. У цій ділянці є коротка потенційно амфіфільних а-спіраль, яка і може брати участь у зв'язуванні з поверхнею бішару. , у которого пируватоксидаза лишена последних 24 аминокислотных остатков. Отримано мутантний штам Е. coli, у якого піруватоксідаза позбавлена останніх 24 амінокислотних залишків. , но in vitro успешно катализирует реакцию с водорастворимым акцептором электронов. Такий фермент повністю неактивний in vivo, але in vitro успішно каталізує реакцію з водорозчинним акцептором електронів. Імовірно такий мутантний варіант піруватоксідази не здатний зв'язуватися з мембраною навіть при високих концентраціях субстратів, а значить, не може здійснювати каталіз, оскільки для цього фермент повинен окислюватися убіхінон. , могут с успехом применяться для объяснения механизма функционирования фермента в клетке. Наведене дослідження є хорошим прикладом того, як дані щодо зв'язування ліпіду та активації, отримані in vitro, можуть з успіхом застосовуватися для пояснення механізму функціонування ферменту в клітині.
І піруватоксідаза, і / 3-гидроксибутиратдегидрогеназа можуть активуватися або 1) при зв'язуванні з невеликим числом молекул амфіфільних сполук, або 2) при зв'язуванні з поверхнею бішару. В останньому випадку деяка частина білка проникає в глиб мембрани. Обидва розглянутих прикладу чітко ілюструють роль фосфоліпідів як аллостеріческій регуляторів.
4.3 Са 2 + - АТРази
Якщо попередні два приклади ілюструють роль ліпідів як аллостеріческій ефекторів мембранних білків, то Са 2 + - АТРази і ще два ферменти, розглянуті нижче, є прикладами ферментів, на активність яких впливають структура ліпіду і фізичний стан бішару. Виділена з саркоплазматичного ретикуло скелетних м'язів Са 2 + - АТРази складається з єдиної поліпептидного ланцюга з мовляв. масою 115 кДа. Фермент здійснює активний транспорт Са 2 + всередину саркоплазматичного ретикулуму, зменшуючи тим самим концентрацію Са 2 + в цитоплазмі під час релаксації м'язи. На кожну гидролизованную молекулу АТР через мембрану переносяться два іони Са 2 +, і реакція є електрогенной, тобто перенесення зарядів через бішар створює трансмембранний електричний потенціал. За результатами секвенування відповідного гена встановлена амінокислотна послідовність білка. Передбачається, що поліпептид має 10 трансмембранних спіральних ділянок.
У мембрані саркоплазматичного ретикулума фермент, мабуть, утворює димери, але мономерна форма в міцелах детергенту зберігає основні кінетичні властивості. За допомогою процедури дезоксіхолатного діалізу очищена Са 2 + - АТРази може бути успішно вбудована в везикули. У деяких препаратах реконструйований фермент утворює більш великі агрегати, ніж димери, хоча фізіологічне значення цього процесу неясно.
У ряді лабораторій ізольований фермент був повністю знежирений і реконструйовано з цілим рядом ліпідів і ліпідних сумішей. На рис.6.3 представлена залежність активності АТРази від кількості пов'язаного з ферментом ліпіду за відсутності детергентів. З наведених даних видно, що для повної активації на одну молекулу АТРази повинно припадати 30 молекул фосфоліпідів; цієї кількості, за оцінками, досить, щоб утворити навколо кожної молекули білка фосфоліпідний моношар. Настільки прямолінійна інтерпретація цих даних, очевидно, неправомочна, оскільки нам невідомо фізичний стан такої суміші.
На підставі результатів цієї роботи була запропонована концепція прикордонних, або аннулярная, ліпідів, тобто ліпідів, що безпосередньо межують з білком. Критичним фактором, що визначає ферментативну активність, згідно з цією концепцією, повинен бути ліпідний склад цього аннулярная шару. Відсутність впливу холестеролу, включеного до фосфоліпідно-білкові комплекси, припускає, що холестерол не включається до аннулярная шар, однак відповідні дані щодо зв'язування холестеролу показали, що це не так. Взагалі кажучи, на підставі одних лише кінетичних даних зрозуміти механізм скріплення ліпіду досить важко.
У декількох роботах було достовірно доведено, що вище температури фазового переходу ліпіду відсутня кореляція між в'язкістю або параметром впорядкованості бішару та ферментативною активністю. У регуляції ферментативної активності більш важливу роль, безумовно, відіграє структура самого ліпіду, ніж будь-який окремо взятий параметр, що відображає фізичний стан бішару. Але чому одні ліпіди активують вбудовані в везикули ферменти краще, ніж інші, поки невідомо.
4.4 Na + / K + ATPA3a
+ и К + через плазматическую мембрану животных клеток. Цей фермент каталізує АТР-залежний транспорт іонів Na + і К + через плазматичну мембрану клітин тварин. + и поступают два иона К + . На кожну молекулу гідролізованого АТР з клітки виводяться три іона Na + і надходять два іона К +. + /К + -АТРаза выделена в чистом виде из нескольких источников. Фермент є електрогенним іонним насосом, що генерує трансмембранний потенціал. Na + / К +-АТРази виділена в чистому вигляді з декількох джерел. Вона завжди складається з двох су'едініц: великий каталітичної субодиниці та малої, що представляє собою глікопротеїн. Функція / 3-суб'єктів незалежно від одиниці неясна. + /К + -АТРазы из почек овцы и из электрического органа ската Torpedo californica . Повні амінокислотні послідовності обох субодиниць відомі для Na + / К +-АТРази з нирок вівці і з електричного органу ската Torpedo californica. Каталітична субодиниця гомологічна Са + - АТРази і також утворює значну кількість трансмембранних спіральних ділянок. / З-Субодиниця, мабуть, також перетинає мембрану; ймовірно, трансмембранним є і єдиний спіральний сегмент.
Функціонуючої формою ферменту, мабуть, є або гетеродімер а / 3, або тетрамер г; дослідники поки не прийшли до єдиної думки щодо мінімальної одиниці, необхідної для іонного транспорту. Очищений фермент вдається реконструювати з цілим рядом фосфоліпідів, але для відновлення активності найбільш ефективні фосфатидилсерин і фосфатіділгліцерол. Причина цього неясна, але показано також, що фермент у бішарі дещо краще зв'язується з кислими фосфоліпідами. Ліпідне оточення впливає не тільки на каталітичну активність, але і на чутливість ферменту до специфічного інгібітору уабаіну.
+ /К + - АТРазы в первую очередь важна структура полярных головок фосфолипидов, но определенную роль, по-видимому, играет и вязкость бислоя. Для реконструкції Na + / К + - АТРази в першу чергу важлива структура полярних головок фосфоліпідів, але певну роль, мабуть, грає і в'язкість бішару. Про це свідчать результати експериментів зі зміни зі збільшенням гідростатичного тиску в'язкості ліпідів у містять фермент препаратах плазматичної мембрани. Високий тиск стабілізує систему в конфігурації з мінімальним об'ємом. Тому зі збільшенням гідростатичного тиску вільний обсяг і в'язкість бішару зменшуються. Як видно з рис, 6.4, між ферментативною активністю і в'язкістю мембрани, вимірюваної за ступенем анізотропії флуоресценції мембранних зондів, спостерігається чітка кореляція. Автори вважають, що зміна властивостей бішару при підвищенні тиску призводить до стабілізації певних конформаційних станів ферменту в ході каталітичного циклу, що впливає на лімітуючої стадії сумарної реакції.
Не можна, однак, виключати й інше пояснення: тиск впливає на фермент прямо, а не опосередковано через ліпід. Втім, ці експерименти важливі вже тим, що показують можливість зміни фізичного стану мембрани під дією гідростатичного тиску.
4.5 Переносник глюкози
Разючий, однак, той факт, що на максимальну швидкість роботи цього переносника взагалі не впливає температурний фазовий перехід ліпіду з рідкокристалічного стану в гель.
5. Мембранозв'язані електротранспортних ланцюга
У більшості робіт, присвячених мембранним ферментам, досліджувалися компоненти різних мембранних систем електронного транспорту. Ці системи виконують дуже важливі біохімічні функції, а їх компоненти містять забарвлені простетичні групи, що дозволяє стежити за допомогою спектрофотометричного методу за кінетикою їх редокс-або конформаційних перетворень як в нативної мембрані, так і після виділення і очищення окремих ферментів. Тут ми розглянемо чотири основні злектронтранспортние системи, схематично зображені на рис. 5. Це:
1) бере участь у біосинтезі стероїдів, що містить цитохром Р450 система мітохондрій кори надниркових залоз;
\ 3) дыхательная цепь митохондрий; 2) система мікросомного окислення, що включає безліч цитохромів Р450, а також цитохром bs \ 3) дихальна ланцюг мітохондрій;
4) фотосинтетична система тілакоїдов зелених рослин. Всі чотири системи є основними білковими компонентами мембран, в яких вони локалізовані, і можуть служити ілюстрацією різних рівнів організації мультиферментного комплексів в мембранної ензимології. Перші дві системи каталізують анаболічні та катаболические реакції, які у присутності молекулярного кисню і зазвичай ліпофільних мембранозв'язаних субстратів. Термінальні ферменти цих електронтранспортних ланцюгів, цитохром Р450 і десатураза жирних кислот, характеризуються дуже низьким числом обертів. Системи і є основними електронтранспортних ансамблями енергетичного обміну, первинна функція яких полягає в перенесенні протонів через мембрану. Генерований при цьому градієнт електрохімічного потенціалу протонів використовується для синтезу АТР. На відміну від мікросомной і мітохондріальної системи цитохрому Р450, дихальна і фотосинтетична ланцюга каталізують трансмембранні реакції і характеризуються досить високим числом обертів, 200-300 з "1. У наведеному нижче короткому огляді основна увага звертається на приватні питання, цікаві з точки зору ензимології, відзначаються деякі загальні риси, а також представляють особливий інтерес дискусійні моменти.
При розгляді будь-якої з цих систем, природно, виникає питання: до якої міри можуть взаємодіяти один з одним різні мембранозв'язані компоненти цих електронтранспортних ланцюгів, з тим щоб утворилися довгоживучі комплекси? Теоретичний розгляд ймовірності асоціації мембранних білків показує, що найбільш важливі такі фактори:
1) висока концентрація реакційноздатних білків через обмеженість мембранного простору;
2) заздалегідь задана орієнтація білків, оскільки вони можуть обертатися лише в площині, паралельній площині мембрани; обертання перпендикулярно поверхні бішару заборонено;
3) виключений об'єм, пов'язаний з наявністю в мембрані інших білків, що призводить до ще більшого концентрування компонентів цих систем.
5.1. Система синтезу стероїдів у мітохондріях
Кошти, виділені надпочечниками стероїдні гормони, такі, як кортизон, синтезуються з холестеролу в ході реакцій, що каталізуються ферментами, які локалізовані в мітохондріях і ЕПР. При цьому проміжні продукти метаболічного шляху повинні "курсуватиме" між даними органелами. Реакції катализируются мембранозв'язаних гемвмісного білками - цитохромами Р450. Назва цієї великої групи ферментів пов'язане з тим, що максимум їх поглинання припадає на довжину хвилі 450 нм. Ці ферменти є оксидаза зі змішаною функцією; в катализируемой ними реакції відбувається розщеплення молекули кисню, при цьому один атом кисню включається до складу молекули води, другий - в субстрат. У біосинтезі стероїдів беруть участь чотири цитохрому Р450. Два знаходяться в мітохондріях, два - в ЕПР тканини. Необхідні для реакції електрони надходять в систему через відносно просту електронтранспортной ланцюг.
, который восстанавливает флавопротеин и ферредоксин. У мітохондріях кори надниркових залоз джерелом електронів для синтезу гормонів є NADPH, який відновлює флавопротеїни і ферредоксін. Ці білки локалізовані на матриксних стороні внутрішньої мітохондріальної мембрани. 450 scc и Р450п#, являются интегральными мембранными ферментами, способными взаимодействовать с мембраносвязанными субстратами. Два цитохрому Р450, P 450 scc і Р450п #, є інтегральними мембранними ферментами, здатними взаємодіяти з мембранозв'язаних субстратами. Адренодоксін-редуктаза, можливо, частково занурена в бішар, але легко відділяється від мембрани. Адренодоксін - це низькомолекулярний РАО "творений білок, він переносить електрони від флавопротеі" на до цитохрому Р450. Взаємодія адренодоксіна з редуктазою і цитохромами Р450 здійснюється головним чином за допомогою іонних взаємодій. Ймовірно, з обома реакційними партнерами адренодоксін зв'язується за допомогою одного і того ж домена. Такий же спосіб передачі електронів між двома мембранними ферментами за участю невеликого розчинного білка можна виявити і в дихальній, і в фотосинтетичної електронтранспортних системах. Зв'язування стероїдних субстратів з цитохромами Р450 можна зареєструвати щодо змін у спектрі поглинання гема. Холе-стеролсвязивающій центр, мабуть, експонований в гідрофобну область ліпідного бішару. Показано також, що зв'язування холестеролу більш ніж в 10 разів збільшує спорідненість адренодоксіна до цитохрому Р450.
Число оборотів адренодоксіна набагато вище, ніж двох зазначених ферментів, тому одна молекула відновленого адренодоксіна може забезпечити електронами кілька молекул цитохрому Р450. Зазначена на ріс.6.5 стехіометрія компонентів за умови, що лімітуючим є функціонування цитохромів Р450, створює своєрідний ефект електронного каскаду. Очевидно, що за таких обставин три компоненти цієї простої системи не зможуть утворити єдиний суперкомплекс, та й навряд чи можливе формування такого комплексу сприяло б ефективному перенесенню електронів по ланцюгу.
5.2 Мікросомние електронтранспортних ланцюга
Електронтранспортних ланцюга, локалізовані на цитоплазматичній поверхні ендоплазматичного ретикулуму, беруть участь також в метаболічних перетвореннях ліпофільних субстратів. Як видно з ріс.6.5, існують дві такі системи, але, як нещодавно з'ясувалося, вони не є незалежними. окисляется флавопротеином цитохром fts -редуктазой, которая в свою очередь через цитохромы восстанавливает стеарил-СоА-десатуразу. В одній системі NADH окислюється флавопротеїнів цитохром fts-редуктазою, яка в свою чергу через цитохроми відновлює стеарил-СоА-десатуразу. У мікросомах печінки десатураза є індуцибельних ферментом. другим флавопротеином, цитохром Р450-редуктаз<цй, которая затем передает электроны на целое семейство цитохромов Р450. Друга система включає в себе окислення NADPH іншим флавопротеїнів, цитохром Р450-редуктаз <цй, яка потім передає електрони на ціле сімейство цитохромів Р450. Одні з цих цитохромів також є індуцибельних, інші - конститутивними. Відзначимо, що в обох системах число термінальних ферментів значно перевищує число редуктаз на початку кожного кола. Як і в Р450-яка містить системі мітохондрій, число оборотів термінальних ферментів настільки мало, що невелика кількість редуктаз цілком встигає забезпечити відновними еквівалентами всі молекули термінальних ферментів. Мікросомная система не містить будь-яких розчинних білкових компонентів, аналогічних адренодоксіну; всі ферменти є інтегральні мембранні білки, їх можна виділити з мембрани, очистити і досліджувати в реконструйованому вигляді.
распределены в мембране случайным образом и взаимодействуют благодаря диффузии: эти два фермента диффундируют латерально по поверхности мембраны, а перенос электронов происходит только во время их случайных столкновений. У серії грунтовних робіт Штрітматтер з колегами чітко показав, що цитохром /> 5-редуктаза і цитохром bs розподілені в мембрані випадковим чином і взаємодіють завдяки дифузії: ці два ферменти дифундують латерально по поверхні мембрани, а перенесення електронів відбувається тільки під час їх випадкових зіткнень. Такий механізм реалізується як у реконструйованих протеоліпосомах, так і в мікросомной мембрані. Дифузія, однак, не є лімітуючим процесом. над редуктазой. У нормі в системі є десятикратний надлишок цитохрому bs над редуктазою. кинетически эквивалентен эндогенному пулу цитохромов bs . Такий надлишок пов'язаного з мік-Росомной мембраною екзогенного цитохрому bs кінетично еквівалентний ендогенному пулу цитохромів bs. , и цитохром 65-редуктаза являются двухдоменными белками, в которых глобулярный растворимый домен связывает простетическую группу, а единственный гидрофобный хвост заякоривает белок в мембране. І цитохром bs, і цитохром 65-редуктаза є двухдоменнимі білками, в яких глобулярний розчинна домен пов'язує простетичної групу, а єдиний гідрофобний хвіст заякориваются білок в мембрані. Гемсвязивающій і флавінсвязивающій домени сконструйовані таким чином, щоб полегшити перенесення електрона від Флавіна до гему при взаємодії цих білків.
в микросомах не диффундирует свободно, а по крайней мере временно образует стехиометрические комплексы с цитохромами Р450 и, возможно, с NADPH -цитохром Р450-редуктазой. У більш пізніх дослідженнях, однак, були отримані серйозні вказівки на те, що частина цитохрому bs в мікросомах не дифундують вільно, а принаймні тимчасово утворює стехіометричні комплекси з цитохромами Р450 і, можливо, з NADPH-цитохром Р450-редуктазою. играет важную роль в работе электронтранспортной цепи, включающей по крайней мере некоторые изоформы цитохрома Р450 из микросом печени. Таким чином, цитохром bs грає важливу роль в роботі електронно-транспортного ланцюга, що включає принаймні деякі ізоформи цитохрому Р450 з мікросом печінки.
Різні цитохроми Р450 в мікросомах печінки окислюються цілою низкою ендогенних ліпофільних субстратів, а також чужорідних молекул. -концу полипептида. NADPH -цитохром Р450-редуктаза имеет близкую структуру с большим гидрофильным доменом, прикрепленным к мембране коротким гидрофобным хвостом. Якщо виходити з первинної структури ізоформ цитохромів Р450, то ці білки повинні мати безліч трансмембранних сегментів, однак експериментальні дослідження показують, що, мабуть, ферменти заякорилися у мікросомной мембрані за допомогою єдиного трансмембранного спірального домену, розташованого ближче до N-кінця поліпептиду. NADPH -цитохром Р450-редуктаза має близьку структуру з великим гідрофільним доменом, прикріпленим до мембрани коротким гідрофобним хвостом. Щоб пояснити, яким чином одна молекула редуктази може "обслужити" настільки великий надлишок молекул Р450, запропоновано два механізми. В одному постулюється існування стабільної кластера, що представляє собою молекулу редуктази в оточенні молекул цитохромів Р450. Відповідно до другої моделі, для переносу електронів необхідні вільна дифузія і зіткнення ферментів. Отримані деякі дані про формування у реконструйованих фосфоліпідних протеоліпосомах еквімолярних комплексів цитохрому Р450 і його редуктази. Якщо такі комплекси дійсно існують в мікросомной мембрані, то вони, мабуть, є тимчасові освіти, швидко розпадаються й знову утворюються за участю інших молекул Р450. Лише в такому варіанті єдина молекула редуктази може відновити багато молекул цитохромів. Остаточну картину ще належить з'ясувати, але вже ясно, що компоненти мікросомной ланцюга не можна вважати ізольованими. Для успішного функціонування системи, ймовірно, суттєвими можуть виявитися якісь складні варіанти білок-білкових взаємодій.
5.3 Дихальна система мітохондрій
Внутрішня мембрана мітохондрій є місцем, де здійснюється окислювальне фосфорилювання. Суть процесу полягає в сполученні потоку електронів, спрямованого від органічних субстратів до кисню, з переміщенням протонів з матриксу мітохондрій через мембрану в межмембранное простір. Як і попередні дві електронно-транспортного ланцюжка, компоненти цієї системи теж представлені не в еквімолярних кількостях, тобто дихальна ланцюг не може функціонувати як довгоживучий мультиферментного комплекс. Проте в даному випадку число оборотів термінального ферменту, цитохром с-оксидази, дуже велике, а оцінити, яка стадія є лімітуючою, в такій ситуації дуже непросто. Ланцюг складається з чотирьох трансмембранних мультісуб'едінічних комплексів, розчинної цитохрому с і убихинона-10. Перенесення електронів через комплекс II не супроводжується перенесенням протонів. Однак реакції, каталізуються комплексом I, комплексом III і IV комплексом, супроводжуються векторним перенесенням протонів через мембрану. Ці реакції є електрогеннимі і призводять до генерації трансмембранного електричного потенціалу. Такі ферменти в складі ланцюга називаються "місцями з'єднання". Щодо механізмів переміщення протонів поки немає єдиної думки, хоча в літературі обговорюються конкретні моделі, зокрема для комплексів III і IV. Настає трансмембранний різниця електрохімічних потенціалів протонів зменшується за рахунок роботи протонного каналу АТР-синтази. Енергія потоку використовується цим ферментом для синтезу АТР.
Концентрація компонентів дихальних ланцюгів у мітохондріальній мембрані досить висока, проте існування еквімолярних комплексів між утворюють ці ланцюги мультісуб'едінічнимі ферментами не можна вважати доведеним.
У літературі обговорюються моделі електронного транспорту за участю таких перехідних довгоживучих білкових агрегатів, проте наявні кінетичні дані можна пояснити, не припускаючи утворення таких суперкомплексов. Цитохром з виконує функцію човника, швидко переносить електрони між комплексами III і IV, аналогічно адренодоксіну в містить цитохром Р450 системі мітохондрій. При фізіологічної іонній силі цитохром с може дифундувати не тільки уздовж поверхні бішару, але і в об'ємі розчину, що збільшує його здатність до швидкого переносу електронів. Дана система має ряд особливостей, не характерних для описаних вище прикладів електронтранспортних ланцюгів.
Основні компоненти дихального ланцюга організовані в не-диссоциирующие комплекси. Наприклад, комплекс III складається з декількох субодиниць і містить три гема і один железосерний центр. Перенесення електронів між простетичними групами всередині кожного з компонентів відбувається швидко і не вимагає їх випадкових зіткнень.
Жиророзчинні переносники водню служать для перенесення відновлювальних еквівалентів не тільки між ферментами, але і з одного боку бішару на іншу. Показано, що убіхінон має здатність до швидкої латеральної дифузії в площині мембрани, хоча питання про величину коефіцієнта дифузії не вирішене. У модельних системах убіхінон також може переносити відновлювальні еквіваленти через бішар. Убихинон при переміщеннях не виходить з мембрани, проте в ході редокспревращеній він може захоплювати або вивільняти протони на межі розділу фаз ліпід-вода з будь-якої сторони мембрани. Кінетичні властивості ізольованих ферментів, що використовують убіхінон в якості субстрату, можна з успіхом аналізувати, використовуючи рівняння Міхаеліса-Ментен з відповідними значеннями Км і І тах, якщо відома реальна концентрація хінону в бішарі. Інша річ, якщо ми розглядаємо стаціонарну кінетику систем, в яких одна популяція ферментів пов'язана з іншого допомогою вільно диффундирующего пулу хінонів як інтермедіатів. Для опису подібних систем доводиться застосовувати спеціальні рівняння. Той факт, що компоненти дихального ланцюга пов'язані через вільно дифундує пул хінонів, не викликає сумнівів, але в питанні, чи є дифузія хінону лімітуючою стадією в роботі електронно-транспортного ланцюга, єдиної думки серед дослідників немає.
Протони, перенесені через мембрану при роботі дихальних ної ланцюга, повертаються назад з допомогою АТР-синтази, замикаючи тим самим протонний цикл. Механізм, за яким протони переносяться від компонентів електронтранспонтной ланцюга до АТР-синтази, теж до кінця не встановлений, і це питання навряд чи буде вирішений у найближчому майбутньому. Більшість дослідників вважають, що протони, що переносяться через бішар, швидко приходять в рівновагу з усієї водної фазою. Відповідно до іншої точки зору, існує локалізований протонний потік і протони переносяться або вздовж поверхні бішару, або всередині бішару, або прямо на АТР-синтази. Більшість даних на користь цього механізму носять непрямий характер, але в літературі є свідчення швидкого переміщення протонів уздовж поверхні фосфоліпідного моношару У не-фізіологічному умовах. Можливо, за деяких обставин такий локалізований протонний потік має якесь значення.
Таким чином, дана електронтранспортний система являє собою сукупність невеликого числа високоорганізованих комплексів, пов'язаних між собою низькомолекулярними рухомими переносниками, як ліпофільними, так і водорозчинними. Кінетику перенесення електронів можна пояснити в рамках моделі вільно дифундують форм, які можуть переміщатися уздовж мембрани на відстань понад 100 А.
5.4. Фотосинтетичний електронтранспортний система тілакоїдов
До фотосинтетичної електронтранспортной системі можна також віднести Світлозбиральні комплекси, що поглинають світло і передають енергію електронного збудження на два реакційних центру. Захват енергії збудження реакційними центрами призводить до поділу зарядів і утворення на протилежних сторонах мембрани сильного окислювача і сильного відновника. Це в свою чергу Веде до окислення води до молекулярного кисню фотосистемою II і створює рушійну силу для транспорту електронів по ланцюгу, сполученого з трансмембранним переносом протонів. Утворений на бішарі градієнт електрохімічних потенціалів протонів використовується для синтезу АТР за допомогою АТР-синтази, званої сполучають чинником. Структура фотосистеми II, мабуть, дуже схожа на структуру бактеріального фотореакціонного центру, яка була детально вивчена методом рентгеноструктурного аналізу. дыхательной цепи митохондрий, а сопрягающий фактор - митохондриальной АТР-синтазе. & Б /-Комплекс аналогічний комплексу III дихального ланцюга мітохондрій, а що сполучається фактор - мітохондріальної АТР-синтази. Роль пластоціанін дуже нагадує роль цитохрому с у дихальному ланцюзі, що є розчинною переносником електронів, а пластохинон представляє собою повний аналог убихинона в електронно-транспортного системі мітохондрій.
На відміну від дихальної ланцюга основні мембранні комплекси представлені в фотосинтетичної системі приблизно в еквімо-лярной співвідношенні. Однак будь-які серйозні вказівки в літературі на формування суперкомплексов відсутні. Навпаки, для даної системи характерна вражаюча латеральна гетерогенність, в результаті якої фотосистема II виявляється локалізованої в гранальних, щільно упакованих ділянках, а фотосистема I і що сполучається чинник - у стромальних ділянках тилакоїди. Пластохинон і комплекс, мабуть, розподілені між цими ділянками рівномірно. Внаслідок такого латерального поділу для сполучення двох фотосистем необхідна дифузія на відстань принаймні 1000 А. Швидше за все основним переносником відновлювальних еквівалентів на такі відстані є пластохинон, хоча швидкість його латеріальной дифузії точно не відома. В оптимальних умовах лімітуючою стадією, ймовірно, є окислення пластохинона £ б /-комплексом, однак чи пов'язано це зі швидкістю його латеральної дифузії або з роботою самого ферменту - неясно.
Латеральное поділ компонентів ланцюга в тилакоїди явно не сприяє прискоренню перенесення електронів між ферментами. Можливо, воно необхідне для ефективного перерозподілу світлової енергії між двома фотосистеми. Фосфорилювання білка Світлозбиральні комплексу II призводить до його перерозподілу між гранальнимі і стромальних ділянками мембрани, полегшуючи його взаємодія з фотосистемою I в стромальних ділянках, що в свою чергу збільшує частку енергії збудження, що надходить на реакційні центри фотосистеми I.
5.5 Взаємодії між мембранними та розчинними ферментами
Біомембрани грають важливу роль у функціонуванні цілого ряду розчинних ферментів. Після руйнування клітини багато ферментів можна виявити і в розчинної, і в мембранної фракціях. Віднесення якогось ферменту до класу периферичних мембранних білків залежить від сили його взаємодії з мембраною і способу виділення. Крім того, деякі розчинні ферменти в специфічних умовах зв'язуються з мембраною, і, отже, в залежності від фізіологічного стану клітини локалізуються або на мембрані, або в цитозолі. Крім того, існує група розчинних ферментів, що каталізують реакції з участю мембранозв'язаних субстратів. Для функціонування такі білки повинні бути здатні хоча б тимчасово зв'язуватися з мембраною.
У всіх цих випадках мембрана виконує наступні функції:
1) визначає локалізацію або компартментацію ферменту або групи ферментів;
2) здійснює аллостеріческій активацію або інактивацію ферментів в певних умовах або в певній галузі в клітці;
3) створює середовище, в якому ліпофільні субстрати можуть бути перетворені у відповідні продукти.
6. Розчинні ферменти, які при необхідності можуть зв'язуватися з мембраною
Поки ця важлива група налічує невелике число ферментів, але, мабуть, у недалекому майбутньому їх список збільшиться. Найбільш характерний приклад - протеїнкіназа С, хоча і інші представники цієї групи непогано охарактеризовані.
6.1 протеїнкінази С
Це ключовий фермент системи передачі сигналу, що запускається швидким розщепленням фосфатидилінозитолу в плазматичній мембрані. Такі позаклітинні речовини, як нейромедіатори, гормони або фактори зростання, зв'язуються зі специфічними рецепторами на поверхні клітини. Це призводить до активації фосфоліпази С, яка починає гідролізувати фосфатидилінозитолу з утворенням другий посередників. Один з продуктів гідролізу, інозитол-1 ,4,5-трифосфат, викликає збільшення концентрації вільного кальцію всередині клітини. Другий продукт, 5я-1 ,2-диацилглицерол, активує протеїн С, що в свою чергу призводить до фосфорилювання цілого ряду білків-мішеней, багато з яких, наприклад рецептор фактора росту епідермісу, є мембранозв'язаних. Згідно сучасним уявленням, дана система бере участь у здійсненні цілого ряду клітинних функцій, зокрема в поділі, диференціювання і екзоцитоз.
До активації клітини будь-якими екзогенними агентами протеїнкіназа З залишається неактивній і виявляється лише в цитозолі. Однак після стимуляції клітини фермент швидко активується і виявляється в мембранних фракціях. показали, что для связывания с мембраной и активации необходимы кислые фосфолипиды, а также Са 2 + и диацилглицерол. Дослідження in vitro показали, що для зв'язування з мембраною та активації необхідні кислі фосфоліпіди, а також Са 2 + і диацилглицерол. Специфічність до фосфоліпідів, необхідного для активації, до деякої міри залежить від природи субстрату. Для активації фосфотрансферазной активності ферменту можна додати прямо до клітин проникають через мембрану коротко цепочечниє диацилглицерол, наприклад діоктаноілгліцерол. Природні другий посередники, довголанцюгові диацилглицерол, нерозчинні у воді і залишаються в мембрані. Аналогічну дію надають, мабуть, промотори пухлинного росту форболових ефіри: як показано, вони здатні зв'язуватися з ферментом і викликати ті ж зміни, що й ендогенний сигнал. Після зв'язування форболових ефірів або диацилглицерол зростає спорідненість ферменту до Са 2 + та фосфатидилсерину. Показано, що ефективним конкурентним інгібітором ферменту є сфингозин.
Насправді протеїнкіназа З представлена кількома різними, але близькими за структурою поліпептидами з мовляв. масою - 80000. Наприклад, з мозку кролика виділено три форми. Протеїнкіназа С має двухдоменную структуру. Один домен містить каталітичні центри, що зв'язують АТР і білок-субстрат, і функціонує як серинових і треонінових фосфотрансфераз. Другий домен, мабуть, бере участь у зв'язуванні фосфатидилсерин, диацилглицерол і Са 2 +. За допомогою м'якого протеолізу можна розділити два цих домену, отримавши повністю активний каталітичний фрагмент з мовляв. масою - 50000. Таким чином, активувати фермент можна двома взаємовиключними способами: протеолізу і зв'язуванням з мембраною. Таким же чином ведуть себе і деякі інші ліпідзавісімие ферменти, наприклад піруватоксідаза. Фізіологічне значення протеолітичної активації неясно.
Очищений фермент був вбудований в фосфоліпідних везикули і в змішані везикули, що містять тритон Х-100 і фосфоліпіди. В обох випадках було показано, що саме по собі зв'язування ліпіду ферментом необхідно, але не достатньо для прояву ферментативної активності. Наприклад, для зв'язування ферменту з фосфоліпідних везикулами досить 2 "Уо фосфатидилсерин, в той час як для оптимального фосфорилювання його необхідно вже 50. У нормі вміст фосфату-ділсеріна в плазматичній мембрані становить 8-10%. Оскільки фермент активується в змішаних міцелах, які містять приблизно 20 мовляв.% фосфатидилсерин в тритоні Х-100, наявність біслойную структури не є необхідним, що, взагалі кажучи, дуже типово для ліпідзавісімих ферментів. Залежність спостережуваної активації від концентрації фосфатидилсерин свідчить про кооперативний характер взаємодій ферменту і ліпіду, що також досить звичайно. За оцінками функціонально активний фермент являє собою комплекс, що містить мономер ферменту, одну молекулу диацилглицерол, один або більше іонів Са 2 + і принаймні чотири молекули фосфатидилсерин. Зв'язування завжди відбувається з поверхнею мембрани, але роль Са 2 + невідома. Він може, наприклад, хелатований карбоксильні групи фосфатидилсерин і якісь групи в білку і / або відігравати роль аллостеріческого регулятора при зв'язуванні білка. Той факт, що фермент може бути помічений іодонафталін-1-азидом, служить вказівкою на деякий проникнення білка в гідрофобну зону бішару, але не більше того.
6.2 Ефект поверхневого розведення в змішаних міцелах
Рис. ілюструє цікаву особливість протеїнкінази С та інших мембранних ферментів, що виявляється при вимірюванні їх активності в системах зі змішаними мицеллами. У цьому експерименті вимірювали залежність здатності ферменту пов'язувати форболових ефір від концентрації тритона Х-100. Якщо підтримувати постійним зміст фосфатидилсерин в мольних відсотках, а концентрацію тритона Х-100 збільшувати, то фермент буде пов'язувати форболових ефір навіть при високій концентрації детергенту. Однак якщо підтримувати постійної об'ємну концентрацію фосфолипида і збільшувати кількість детергенту, то фермент перестане пов'язувати форболових ефір при високих концентраціях тритона Х-100. Для активації ферменту важлива не об'ємна, а поверхнева концентрація ліпіду, іншими словами, число молекул ліпіду на міцели. Якщо ця величина падає, то зменшуються також здатність ферменту зв'язуватися з такими змішаними мицеллами і здатність активізуватися. Це явище називається явищем поверхневого розведення.
6.3 Інші приклади
-холина. Лімітуючою стадією біосинтезу фосфатидилхоліну є синтез інтермедіату CDP-холіну. Фермент, що каталізує цю реакцію, називається СОР: фосфохолін цітіділтрансферазой. Він міститься в цитозолі, але, як було нещодавно показано, може зв'язуватися з ендоплазматичним ретикулумом, де відбувається його активація. Саме в місці зв'язування здійснюється біосинтез фосфатидилхоліну. Відзначимо, що обидва субстрату розчиняються у воді і не пов'язані з мембраною. Що змушує фермент зв'язуватися з мембраною, поки неясно. Можливо, сигналом є поява в мембрані диацилглицерол. Розглядаються також такі механізми:
1) збільшення вмісту довголанцюгових жирних кислот або ацильних похідних СоА;
2) виснаження мікросомной мембрани по фосфатидилхолін;
3) дефосфорілірованіе самого ферменту, в результаті чого він переходить у мембранозв'язаних активну конформацію. Для встановлення справжнього механізму необхідні подальші дослідження.
Показано, що залежно від змісту мембранозв'язаних диацилглицерол фермент діацілгліцеролкіназа може переміщатися з цитозолю в мембрану. Він каталізує перетворення диацилглицерол в фосфатидний кислоту і принаймні частково відповідальний за утилізацію диацилглицерол в мембрані. Диацилглицерол і жирні кислоти беруть участь також у зв'язуванні а-актініна з мембранами. Вважають, що певну роль у прикріпленні пучків мікрофіламентів до плазматичної мембрани відіграє і діацілгліцеролкіназа. Можливо, індуковані диацилглицерол і жирними кислотами утворення комплексів а-актініна і актину є важливим елементом фізіологічної активності тромбоцитів.
. Зупинимося коротко ще на двох ферментах, які в певних умовах зв'язуються з біомембранами: піруватоксідазе і фосфатіділсерінсінтетазе з Є. coli. У присутності субстрату обидва ферменту переміщуються з цитозолю в цитоплазматичну мембрану. Піруватоксідаза вже згадувалася як приклад ліпідзавісімого ферменту. У присутності пірувату, відновлюючого пов'язаний з білком флавінових кофактор, фермент за своїми властивостями стає класичним мембранним білком. Він відновлює розчинений у мембрані убіхінон і тому для свого функціонування повинен бути пов'язаний з мембраною. У нормі при очищенні фосфатіділсерінсінтази вона виділяється у зв'язаному з рибосомами вигляді, але в присутності або субстрату, або продукту виявляється пов'язаної з мембраною.
6.4 Розчинні ферменти або ферментні ансамблі, які in vivo можуть бути асоційовані з мембраною
У літературі все частіше з'являються дані про можливу асоціації цілого ряду розчинних ферментів з мембраною. Більшість робіт присвячені зв'язування ферментів циклу трикарбонових кислот і / 3-окислення жирних кислот з внутрішньої мітохондріальної мембраною і ферментів гліколізу з плазматичною мембраною еритроцитів. Наводяться докази, хоча і не цілком переконливі, що ферменти мітохондріального матриксу організовані в пов'язані з поверхнею мембрани мультиферментного комплекси. У деяких випадках вдалося виявити специфічні центри зв'язування. + - зависимые дегидрогеназы образуют комплексы с NADH : убихинон оксидоредуктазой. Наприклад, NAD + - залежні дегідрогенази утворюють комплекси з NADH: убіхінон оксидоредуктаз. Креатинфосфокиназа специфічно зв'язується з кардіоліпіну у внутрішній мітохондріальній мембрані; гексокіназа також зв'язується з мітохондріями - можливо, з їх зовнішньою мембраною. Розподіл гексокінази між розчиненої і пов'язаної з мітохондріями формами, мабуть, модулюється гормонами або метаболітами. У всіх цих випадках сенс асоціації перерахованих ферментів, а можливо, і інших розчинних ферментів з мембраною, полягає у "каналізації" субстрату. Наприклад, стерпний через внутрішню мітохондріальну мембрану АТР повинен більш ефективно утилізуватися гексокінази, локалізованої біля мембрани. Однак це припущення поки не можна вважати остаточно доведеним.
У ряді робіт показано, що гліколітичні ферменти зв'язуються з експонованих в цитоплазму кислим доменом білка смуги 3 мембрани еритроцитів. У число цих ферментів входять альдолаза, фосфофруктокінази, гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогеназа. Передбачається, що в деяких випадках пов'язаний з мембраною фермент може залишатися в неактивній формі і швидко переходити в активну цитоплазматичну форму в присутності відповідних метаболітів. или это артефакт, связанный с работой in vitro . Поки неясно, правда, чи відбувається така асоціація in vivo або це артефакт, пов'язаний з роботою in vitro. Взаємодії між білками в таких асоціату відносно слабкі і залежать від іонної сили. Така ж картина характерна для деяких передбачуваних асоціатів ферментів з мітохондріальної мембраною. Однак сполучення гликолитических функцій з мембранними активностями і компартменталізація цих ферментів, взагалі кажучи, занадто приваблива концепція, щоб її відкидати, тим більше що для інших систем існування таких асоціатів доведено.
Отримати переконливі докази фізіологічної значимості взаємодії цих ферментів і ферментних ансамблів з мембраною досить важко, але є підстави вважати, що в недалекому майбутньому в цій галузі досліджень буде досягнутий певний прогрес.
Ще один клас взаємодіючих з мембраною розчинних білків представляють цитотоксини.
6.5 Фактори згортання крові - позаклітинні ферменти, що активуються зв'язуванням з мембраною
Згортання крові відбувається в результаті складного каскаду реакцій за участю цілого ряду факторів сироватки. У ході цих реакцій здійснюється послідовна протеолітична активація серії зімогеном, кожен з яких, активувалися, у свою чергу викликає активацію одного або декількох інших зімогеном. Кінцевим результатом усіх цих реакцій є перетворення фібриногену у фібрин. Для здійснення багатьох етапів цього каскаду необхідно, щоб активована протеаза та / або субстрат-зимоген зв'язалася з мембраною тромбоцитів, ендотеліальних чи інших клітин. Особливий інтерес представляють наступні питання:
1) як білки зв'язуються з мембранами? 2) яку роль грає мембрана в активації беруть участь у згортанні крові ферментів? Остаточних відповідей на ці запитання поки немає.
Всім зв'язується з мембранами факторів згортання крові необхідні кислі фосфоліпіди. Деякі з них, зокрема фактори VII, IX, X і протромбін, вимагають також Са 2 +. -концевых участках каждого из полипептидов. За участю вітаміну К відбувається модифікація цих чотирьох білків - карбоксилювання в ^-положенні залишків глутамату, локалізованих в гомологічних N-кінцевих ділянках кожного з поліпептидів. У результаті такої модифікації в молекулі білка формується значна кількість високоаффінних центрів зв'язування Са 2 +, який у свою чергу необхідний для відповідної взаємодії білків з кислими фосфоліпідами на мембрані. Яким чином Са 2 + полегшує білково-мембранні взаємодії, не зовсім ясно. Це може бути, зокрема, "зшивання" за допомогою Са 2 + білка з гідрофільними негативно зарядженими головками фосфолипида. Кальцій необхідний не для всіх факторів згортання крові. Так, фактор V може безпосередньо взаємодіяти з негативно зарядженими фосфоліпідами, а інший компонент, так званий "тканинний фактор", взагалі є інтегральним мембранним білком. Здебільшого, однак, фактори взаємодіють з поверхнею бішару за рахунок електростатичних сил, хоча іноді спостерігається і деякий проникнення білка в гідрофобну область мембрани.
Присутність фосфоліпідів сильно міняє стаціонарну кінетику реакцій протеолітичної активації. Різко зменшується значення Км для білкового субстрату; наприклад, для реакції активації фактора X чинником 1Ха Км змінюється від 181 до 0,058 мкМ. , увеличивает K ma * более чем в 200 000 раз. Додавання іншого білка, фактора Villa, збільшує K ma * більш ніж в 200 000 разів. Оскільки реакція каталізується обома ферментами, а субстрат в даних умовах вимірювання представлений як мембранозв'язаних, так і вільною формами, істинний механізм впливу ліпіду в таких реакціях визначити надзвичайно складно. Наприклад, показано, що протеолітична активність фактора X збільшується при зв'язуванні його з мембраною, в той час як фактор IX однаково активний у вільному і в мембранозв'язаних станах. и тканевого фактора. Фактор X можна також активувати комплексом фактора Vila і тканинного фактора. У цьому випадку протеолітична активація фактора X відбувається, тільки коли він знаходиться у вільній формі у розчині і не пов'язаний з мембраною. Інший приклад - активація протромбіну чинником Ха. Що спостерігається в цьому випадку низьке значення Км корелює з концентрацією субстрату і протромбіну на поверхні фосфоліпідної везикули. , образующий с фактором Ха комплекс, - то всякая зависимость Км от поверхностной концентрации протромбина на везикуле исчезнет. Якщо ж додати кофактор - фактор Va, утворює з фактором Ха комплекс, - то всяка залежність Км від поверхневої концентрації протромбіну на везикул зникне. На закінчення відзначимо, що дана система дуже складна, і роль ліпідів тут аж ніяк не зводиться лише до створення відповідної поверхні, на якій відбувається просте концентрування компонентів системи.
Фактори згортання крові входять до групи Са 2 +-залежних ліпідсвязивающіх білків. Функції цих білків не завжди бувають явні, деякі з них пов'язані з цитоскелетом. Фосфоліпази, до розгляду яких ми зараз перейдемо, також є Са 2 +-залежними ферментами.
6.6 фосфоліпази - розчинні ферменти, що каталізують розщеплення мембранозв'язаних субстратів
Фосфоліпіди служать субстратами багатьох розчинних ферментів, у тому числі фосфоліпаз. -2 с образованием жирной кислоты и лизофосфолипида. Серед них найкраще вивчена фосфоліпаза Аг, яка каталізує гідроліз фосфоліпідів по положенню sn -2 с освітою жирної кислоти і лізофосфоліпіда. Фосфоліпаза Аг була виділена спочатку з отрут кобри і гримучої змії, а потім з підшлункової залози бика та свині. Це дуже близькі по первинній структурі невеликі білки з мовляв. масою близько 14 000. Для деяких ферментів вдалося отримати з високою роздільною здатністю тривимірні структури, також володіють високим ступенем гомології. Ферменти з підшлункової залози синтезуються як неактивні зимоген, які потім активуються протеолізу: від зимогена відщеплюється сім залишків з С-кінця.
Фосфоліпаза Аг представляє особливий інтерес з точки зору мембранної ензимології, оскільки вона має здатність активуватися при взаємодії з інтегрованими формами субстрату, наприклад з мицеллами або бішару. На Ріс.6.8 представлена залежність від концентрації субстрату швидкості гідролізу коротколанцюгового фосфатидилхоліну фосфоліпазою Аг і його попередником з підшлункової залози свині.
Даний субстрат в концентраціях до 1,5 мМ є мономером, але при подальшому збільшенні концентрації формує міцели. І зимоген, і активоване фермент дуже повільно гідролізують субстрат в мономерний формі, але як тільки фосфолипид починає утворювати міцели, активність фосфоліпази А 2 різко зростає.
Активації фосфоліпази агрегованими субстратами було присвячено безліч робіт, а яких досліджувалася кінетика катализируемого ферментом гідролізу субстратів в мономерний формі, в чистих ліпідних міцелах, у змішаних міцелах з тритоном Х-100, в монослоях на поверхні розділу повітря-вода і в фосфоліпідних везикулах. Для здійснення каталітичної активності ферменту у всіх випадках потрібен Са 2 +, причому центр зв'язування єдиного іона Са 2 + можна виявити за допомогою рентгеноструктурного аналізу. На відміну від факторів згортання крові фосфоліпаза Аг не містить залишку - у-карбоксіглутаміновой кислоти і для її активації не потрібні кислі фосфоліпіди.
Для пояснення механізму активації фосфоліпаз запропоновано декілька гіпотез
У ряді робіт було показано, що зв'язування ферменту з мицеллами або бішару передує стадії активації, при якій різко зростає число оборотів ферменту, і експериментально ці дві стадії можна розділити. Така поведінка нічим не відрізняється від поведінки інших розглянутих ліпідзавісімих ферментів. Незважаючи на велику кількість даних по кінетиці, зв'язування і структурі фосфоліпази, дослідники не прийшли до єдиної думки про те, що відбувається з ферментом при його активації у присутності ліпідного бішару або міцел. У літературі розглядається кілька можливих механізмів.
Фермент зв'язується з бішару за допомогою спеціального "ділянки впізнавання поверхні розділу", відмінного від активного центру, і для його формування необхідний Са 2 +. Передбачається, що ця ділянка проникає в глиб мембрани. -концевого участка полипептида на взаимодействие с агрегированными субстратами. Ця модель грунтується, зокрема, на даних по специфічному впливу хімічної модифікації N-кінцевого ділянки поліпептиду на взаємодію з агрегованими субстратами. Боротьба, що при взаємодії ділянки впізнавання з мембраною активація ферменту, мабуть, обумовлена конформаційними змінами білка. Слід зазначити, що в кристалічному вигляді ферменти з підшлункової залози бика і свині представляють собою мономери, в той час як фосфоліпаза Аг з отрути гримучої змії є димером. Виявляється у мономерних фосфоліпаза ділянку, яка, як припускають, є "ділянкою впізнавання поверхні", в димерной ферменті недоступний з водної фази і знаходиться на поверхні межсуб'едінічного контакту.
Двухфосфоліпідная модель передбачає існування в ферменті двох або більше центрів зв'язування фосфоліпідів і заснована насамперед на кінетичних даних по активації ферменту фосфоліпідами у змішаних міцелах. Ця модель дозволяє врахувати роль агрегації двох або більше молекул ферменту як найважливішої частини схеми активації, а також роль можливих конформаційних змін у збільшенні каталітичної активності.
Постулюється, що конформація фосфоліпідного субстрату в агрегованому стані відрізняється від конформації мономерної форми, і саме з цим пов'язана більш висока швидкість гідролізу агрегованих форм ліпідів ферментом.
4. Збільшення активності пов'язано з тим, що з міцел або бішару продукти гідролізу видаляються легше. Крім того, саме по собі накопичення продуктів вже призводить до збільшення активності фосфоліпази Аг, хоча механізм цього явища неясний.
Одна з проблем, що виникають при аналізі процесу активації, полягає в тому, як розділити процеси зв'язування з ліпідом і активацію ліпідом. В експериментах з одношаровим фосфоліпідних везикулами вдалося з'ясувати, що критичним параметром для обох стадій є фізичний стан бішару. Показано, наприклад, що фосфоліпаза А2 найкраще зв'язується з дипальмитоилфосфатидилхолином у фазі гелю, причому Са 2 + для цього не потрібний. Для активації ж ферменту в такій системі, очевидно, потрібно Са 2 +, причому у разі везикул фосфатіділхоліновий бішар повинен володіти дефектами упаковки і в ньому повинні відбуватися структурні флуктуації, подібні тим, які мають місце в ході термоіндуціруемого фазового переходу. Взаємодії молекул білків можуть бути важливі як для зв'язування, так і для активації. У деяких умовах активоване фермент зберігає активність принаймні протягом 30 хв.
Кращими субстратами для ферменту є фосфоліпіди з короткою ацильної ланцюгом і невеликими за обсягом полярними заступниками при фосфаті. Хоча для активації ферменту кислі фосфоліпіди не є необхідними, негативний заряд на поверхні розділу все-таки підвищує спорідненість до субстрату. Зв'язавшись з межею поділу, фермент може латерально переміщатися по поверхні бішару та гідролізувати до декількох тисяч фосфоліпідних молекул в хвилину до тих пір, поки не відокремиться від бішару. Час перебування білка на поверхні бішару в значній мірі залежить від природи ліпіду і властивостей навколишнього розчину.
Які саме конформаційні зміни призводять до активації і яким способом відбувається зв'язування ферменту з бішару, невідомо. . Обнаруживаемая при вивченні модельних біслойних систем залежність кінетики від наявності дефектів бішару представляється дуже цікавою, хоча неясно, наскільки такі дефекти важливі для роботи ферменту in vivo.
І на закінчення необхідно відзначити, що фосфоліпаза Аг відповідальна за вивільнення з мембрани арахідонової кислоти, подальше перетворення якої в лейкотрієни і простагландини є частиною запального процесу. Стероїди, що володіють протизапальною ефектом, активують групу білків, званих ліпокортинів, які в свою чергу специфічно інгібують фосфоліпазу Аг. Ліпокортинів є також субстратами протеїнкінази С і тирозинових протеїнкіназ, які, ймовірно, можуть таким чином брати участь у регуляції активності ліпокортинів. Інгібуючий ефект ліпокортинів, мабуть, пов'язаний не з утворенням міцного комплексу з фосфоліпазою Аг, а з їх взаємодією безпосередньо з мембраною.
Резюме
Багато клітинні процеси катализируются мембранозв'язаних ферментів. При цьому мембрана може виконувати цілий ряд функцій. Зв'язавши фермент з певною мембраною або ділянкою на мембрані, можна локалізувати каталітичний центр в певній частині клітини. Існує безліч прикладів, коли кілька діючих послідовно ферментів організовані таким чином в якийсь суперкомплекс, що дозволяє збільшити сумарну швидкість реакції. Багато мембранні ферменти представляють собою білки, які пронизують мембрану наскрізь, і беруть участь у трансмембранному транспорті розчинених речовин або в передачі інформації з одного боку бішару на іншу у формі трансмембранного аллостеріческого сигналу. Інші ферменти є периферичними мембранними білками і в деяких випадках здатні зв'язуватися з мембраною тільки у відповідь на певний фізіологічний сигнал.
У багатьох випадках ліпідний бішар грає пасивну роль у функціонуванні мембранозв'язаних ферментів, будучи лише середовищем, в якій відбувається взаємодія ферменту із субстратом. Нерідко, однак, оптимальне функціонування мембранних ферментів виявляється можливим тільки у присутності певних ліпідів, хоча абсолютна специфічність конкретного ліпіду в активації ферменту зустрічається вкрай рідко. Інтерпретувати дані по впливу ліпідів на активність ізольованих мембранних ферментів часто дуже непросто. ставит перед исследователем огромное множество совершенно особых проблем, не встречающихся при работе с растворимыми ферментами. Вивчення очищених мембранних білків in vitro ставить перед дослідником величезна безліч абсолютно особливих проблем, які не зустрічаються при роботі з розчинними ферментами.