Реферат
Легко-і трудногідролізуемие полісахариди
Тамбов, 2009
Зміст
Введення
1. Методи визначення редукуючих речовин в гидролизатах
2. Визначення легкогідролізуемих полісахаридів
3. Визначення трудногідролізуемих полісахаридів
4. Визначення масової частки PB в гидролизатах за методом Макена і Шоорля
5. Визначення масової частки PB в гидролизатах ебуліостатіческім методом
6. Аналіз гідролізатів методом газорідинної хроматографії
Введення
Визначення легко - і трудногідролізуемих полісахаридів в деревині засноване на реакціях їх гідролізу з подальшим перебуванням загальної кількості утворилися моносахаридів по редукуючої здібності. Для визначення вмісту окремих моносахаридів в гидролизатах - гексоз і пентоз - використовують хроматографічний аналіз.
Легко-і трудногідролізуемие полісахариди поділяють, використовуючи різні умови гідролізу. Для гідролізу легкогідролізуемих полісахаридів застосовують обробку деревини розведеними мінеральними кислотами, а для гідролізу трудногідролізуемих полісахаридів - обробку концентрованою кислотою при температурі 20 ... 25 ° С. Для повного гідролізу полісахаридів деревини замість сірчаної кислоти можна використовувати тріфторуксусную кислоту.
Гідроліз полісахаридів розведеною кислотою йде в гетерогенному середовищі, а гідроліз концентрованою кислотою - в гомогенної. В концентрованій кислоті полісахариди спочатку набухають і розчиняються, а потім вже відбувається їх гідролітична деструкція. Однак у зв'язку з нестачею води в реакційній суміші продуктами гідролізу в концентрованій кислоті є не моносахариди, а олігосахариди.
Вони утворюються, по-перше, при частковому гідролізі полісахаридів, а по-друге, в результаті реверсії моносахаридів - реакції зворотної гідролізу. Для доведення гідролізу до кінцевої стадії - отримання моносахаридів - проводять додатковий гідроліз - інверсію. Розчин олігосахаридів в концентрованій кислоті розбавляють і кип'ятять протягом 3 ... 5 ч.
При аналізі маловивченого сировини рекомендується проводити попередні досліди для встановлення необхідної тривалості стадії додаткового гідролізу до досягнення максимального виходу моносахаридів.
При дуже тривалої стадії додаткового гідролізу починається розпад моносахаридів, а також відбувається реакція реверсії.
1. Методи визначення редукуючих речовин в гидролизатах
Для визначення загальної кількості легко - або трудногідролізуемих полісахаридів знаходять концентрацію редуцирующих речовин в гидролизатах. Визначення легко - і трудногідролізуемих полісахаридів за концентрацією редукуючих речовин не є цілком точним. У гидролизатах редукуючими речовинами будуть не тільки моносахариди, але також і продукти їх розпаду в кислому середовищі. У гидролизатах трудногідролізуемих полісахаридів PB складаються головним чином із глюкози і невеликих кількостей манози, ксилози, фруктози. У гидролизатах легкогідролізуемих полісахаридів складу PB більш різноманітний: глюкоза, маноза, галактоза, ксилоза, арабиноза, Рамноза, глюкуронова і галактуроновая кислоти, продукти розпаду моносахаридів. Всі речовини мають різну редукує здатність. Врахувати ці відмінності при розрахунку результатів аналізу практично неможливо. Тому прийнято концентрацію PB в гидролизатах визначати найчастіше в перерахунку на глюкозу. Для визначення загального виходу PB користуються методом Бертрана або ебуліостатіческім методом, заснованими на реакції окислення Сахаров мідно-лужним розчином, в результаті якої двовалентне мідь Cu 2 + переходить в одновалентних Cu + і випадає в осад у вигляді оксиду міді Cu 2 O. Як мідно-лужного розчину використовують реактив Фелінга, який отримують безпосередньо при проведенні аналізу змішуванням розчинів сульфату міді та лужного розчину сегнетової солі, в результаті чого виходить розчинна комплекс, що містить Cu 2 +,
Спрощено окислення Альдози реактивом Фелінга можна схемою
Насправді ж окислення редуцирующих Сахаров мідно-лужним розчином представляє не одну певну реакцію, а безліч реакцій, що відбуваються одночасно. При цьому носіями редуцирующих властивостей є не тільки самі цукру, а й продукти їх подальших перетворень і розпаду. Таким чином, тут не можна очікувати стехіометрично протікає реакції і написати точне рівняння реакції фактично неможливо. Тому для перерахунку маси відновленої міді в масу Сахаров користуються емпіричними таблицями.
Спочатку при визначенні PB методом Бертрана осад Cu 2 O зважували. Згодом кількість відновленої міді стали визначати титриметрическим методами - прямого або зворотного титрування.
У прямому методі осад Cu 2 O розчиняють в розчині додекагідрат сульфату заліза - амонію NH 4 Fe 2 · 12Н 2 0 в присутності сірчаної кислоти. При цьому Cu + окислюється в Cu 2 +, a Fe 3 + відновлюється в Fe 2 + за рівнянням
Розчин FeSO 4 титрують розчином перманганату калію
За кількістю перманганату калію, витраченого на реакцію окислення заліза, обчислюють масу міді в Cu 2 O і по емпіричної таблиці знаходять масу Сахаров в перерахунку на глюкозу.
З огляду на те, що оксид міді легко окислюється на повітрі, визначення Сахаров призводить до неточних результатів. Крім того, для методу Бертрана характерно велике число операцій. При нагріванні мідно-лужного розчину можливо його самовідновлення. Самовідновлення міді можна врахувати, якщо провести контрольне визначення.
Більш точний і простий метод зворотного титрування був розроблений Макеном і Шоорлем. Цей метод заснований на визначенні йодометрическом надлишку реактиву Фелінга.
"
Самовідновлення в цьому методі враховують, тому що витрата реактиву Фелінга визначають за різницею між результатами контрольного і робочого титрування.
В обох методах взаємодія PB з реактивом Фелінга відбувається при вільному доступі кисню повітря, і необхідно користуватися емпіричними таблицями. Цих недоліків позбавлений ебуліостатіческій метод, заснований на прямому титруванні гарячого мідно-лужного розчину досліджуваним розчином цукру в спеціальному приладі - ебуліостате, що дозволяє проводити аналіз в струмі водяної пари, тобто без доступу повітря. Емпіричні таблиці не потрібні. Встановлюють титр мідно-лужного розчину по розчину глюкози відомої концентрації.
Загальний вихід PB при кількісному гідролізі визначають як суму редукуючих речовин, отриманих при визначенні легко - і трудногідролізуемих полісахаридів. Найбільш точне уявлення про якісний і кількісний склад редуцирующих речовин гідролізатів отримують за допомогою хроматографічних методів аналізу.
2. Визначення легкогідролізуемих полісахаридів
Методика аналізу. Наважку повітряно-сухих тирси масою близько 5 г поміщають в конічну колбу місткістю 500 см 3, додають 200 см 3 2%-ной HCI і кип'ятять із зворотним холодильником на електричній плитці протягом 3 ч. Для регулювання кипіння під колбу підкладають азбестову сітку або колбу піднімають над плиткою. Всі тирсу повинні знаходитися в кислоті. Для цього після розігріву вміст колби обережно перемішують. Після закінчення гідролізу відфільтровують тирсу на воронку Бюхнера з паперовим фільтром з відсмоктуванням. Залишок на фільтрі промивають гарячою водою до негативної реакції на кислоту по індикатору метиловому оранжевому і використовують для визначення трудногідролізуемих полісахаридів. Фільтрат і промивні води переносять в мірну колбу місткістю 500 см 3, доводять розчин після охолодження дистильованою водою до мітки і ретельно перемішують. В отриманому розчині визначають масову частку PB в процентах.
Масову частку легкогідролізуемих полісахаридів,% до абсолютно сухої деревини, розраховують за формулою
де з "- масова частка PB в гідролізаті легкогідролізуемих полісахаридів,%; V - обсяг гідролізату, V = 500 см 3; k" - коефіцієнт перерахунку моносахаридів в полісахариди; g - маса абсолютно сухої наважки деревини, м.
Коефіцієнт перерахунку k "обчислюється на підставі реакцій гідролізу полісахаридів. Для пентозанов 1г л -132/150 = 0,88, а для гексозанов A 1 = 162/180 = 0,90, де 132 і 162 - молекулярні маси ланок відповідних полісахаридів, а 150 і 180 - молекулярні маси пентоз і гексоз. Приймаючи зміст гексоз і пентоз в гідролізату деревини хвойних порід приблизно рівним, для розрахунку використовують значення коефіцієнта £, = 0,89; для гідролізатів деревини листяних порід беруть = 0,88.
3. Визначення трудногідролізуемих полісахаридів
Методика аналізу. Залишок деревини після гідролізу легкогідролізуемих полісахаридів і промивання кількісно переносять з фільтра в стакан місткістю 100 см 3 і підсушують при 50 ... 60 ° С приблизно до повітряно-сухого стану, а потім обробляють 35 ... 40 см 3 80%-ної H 2 SO 4 при кімнатній температурі протягом 3 годин, періодично перемішуючи скляною паличкою. Суміш зі склянки кількісно переносять в конічну колбу місткістю 1000 см 3, змиваючи дистильованою водою в кількості 600 см 3. Колбу приєднують до зворотного холодильника і кип'ятять на електричній плитці протягом 3 ч. Після закінчення додаткового гідролізу фільтрують розчин через воронку Бюхнера з паперовим фільтром з відсмоктуванням. Залишок на фільтрі промивають невеликими порціями гарячої води до негативної реакції на кислоту по індикатору метиловому помаранчевого. Фільтрат і промивні води переносять в мірну колбу місткістю 1000 см 3. Після охолодження доводять об'єм розчину до мітки дистильованою водою і ретельно перемішують.
З отриманого розчину відбирають піпеткою 50 см 3 в мірну колбу на 100 см 3 та обережно при постійному перемішуванні нейтралізують 20%-ним розчином NaOH по метиловому помаранчевого. Об'єм розчину доводять до мітки дистильованою водою. У нейтралізувати розчином визначають концентрацію PB.
Масову частку трудногідролізуемих полісахаридів,% до абсолютно сухої деревини, розраховують за формулою
"
де з т - масова частка PB в розбавленому нейтралізованої гідролізаті,%; V - загальний обсяг кислого гідролізату, V = = 1000 см 3; ж - розведення гідролізату при нейтралізації, л = 100/50 = 2; k T - коефіцієнт перерахунку моносахаридів в полісахариди, рівний 0,90; g - маса абсолютно сухої наважки деревини, м.
Коефіцієнт перерахунку беруть рівним 0,90, оскільки основним цукром в гідролізаті трудногідролізуемих полісахаридів є глюкоза.
4. Визначення масової частки PB в гидролизатах за методом Макена і Шоорля
Для отримання реактиву Фелінга готують два розчини А - 69,3 г CuSO 4 5Н 2 0 в 1 дм 3 водного розчину; Б - 346 г сегнетової солі і 100 г NaOH в 1 дм 3 водного розчину.
Методика аналізу. У конічну колбу місткістю 250 см 3 вливають піпеткою 10 см 3 розчину А, потім 10 см 3 розчину Б і 20 см 3 гідролізату легкогідролізуемих полісахаридів або нейтралізованого гідролізату трудногідролізуемих полісахаридів. Суміш розбавляють дистильованою водою до загального об'єму 50 см 3 і добре перемішують. Ставлять колбу на гарячу включену електроплитку, суміш нагрівають до кипіння протягом 3 хв і кип'ятять точно 2 хв, рахуючи з моменту появи першого бульбашки на поверхні розчину.
Під колбу рекомендується підкласти азбестову платівку з круглим вирізом діаметром близько 6 см. Кипіння має бути помірним, щоб об'єм рідини в колбі залишався приблизно постійним. Для зменшення випаровування в горло колби вставляють маленьку конусоподібну скляну воронку.
При недоліку реактиву Фелінга, про що свідчить зникнення синього забарвлення розчину після кип'ятіння, обсяг проби гідролізату зменшують, додавши при розведенні відповідний об'єм води. Після закінчення кип'ятіння колбу швидко охолоджують холодною водою до 25 ° С, додають розчин KI і 10 см 3 25%-ної H 2 SO 4 і відразу ж при безперервному перемішуванні титрують виділився йод розчином тіосульфату натрію концентрацією 0,1 моль / дм 3 до переходу коричневого забарвлення у світло-жовту.
Потім додають 10 см 3 0.5 ... 1%-ного розчину крохмалю і повільно дотітровивают розчин до повного зникнення синього забарвлення.
Розчин залишається пофарбованим в кремовий колір внаслідок утворення иодида міді. В аналогічних умовах, але без додавання розчину цукру, проводять контрольний дослід. По різниці витрат розчину Na 2 S 2 O 3 в контрольному і робочому дослідах, а, см 3, за допомогою емпіричної таблиці знаходять кількість цукру в пробі гідролізату, взятої на аналіз, Ь, мг.
При аналізі трудногідролізуемих полісахаридів розрахунок ведуть на глюкозу, а при аналізі гідролізату легкогідролізуемих полісахаридів - на ксилозу і манозу. Потім розраховують масову частку PB в гідролізаті з л або з т,%, за формулою
де b - кількість цукру в пробі гідролізату обсягом у, см 1, знайдене за таблицею, мг.
5. Визначення масової частки PB в гидролизатах ебуліостатіческім методом
Проводять титрування мідно-лужного розчину з відомим титром досліджуваним розчином цукру без доступу повітря в струмі водяної пари. Титр мідно-лужного розчину встановлюють по глюкози. Прилад для титрування складається з зовнішнього судини - конічної колби / і внутрішньої посудини - ебуліостата 1 з упаяний в його бічну стінку трубкою, яка доходить майже до дна посудини. Звужений кінець ебуліостата вставлений в колбу / на гумовій пробці і має отвір для виходу пари 3. У гумову пробку вставлена скляна трубка 4 для відведення надлишку пара з колби /. Струмінь пари регулюють гвинтовим затиском на гумовій трубці, одягненою на кінець скляної трубки. Під час титрування верхній кінець ебуліостата закривають гумовою пробкою, в яку вставлений кінець бюретки 5 для розчину цукру. Реагуюча рідину в ебуліостате обігрівається паровою сорочкою і пропусканням пари через рідину.
Індикатором при титруванні служить метиленовий блакитний, який в окислювальному середовищі має синій колір, а в відновлювальної безбарвний. Для запобігання випаданню осаду оксиду міді в мідно-лужний розчин додають жовту кров'яну сіль калію, яка утворює з Cu 2 O розчинне комплексне з'єднання.
Для проведення аналізу готують два розчини: А - 10 г CuSO 4 · 5З 2 0 і 0,04 г метиленового блакитного розчиняють у воді в мірній колбі на 1 дм 3 доведенням до мітки; Б - 50 г сегнетової солі розчиняють у воді, окремо розчиняють у воді 4 г жовтої кров'яної солі, переносять обидва розчини в мірну колбу на 1 дм \ додають 75 г NaOH у вигляді 50%-ного водного розчину і доводять водою до мітки.
Прилад для визначення PB ебуліостатіческім методом та дозатори розчинів. Дозатор для відмірювання розчину А являє собою дві сполучені посудини. Посудина місткістю близько 100 см 3 служить для зберігання розчину А і посудина-піпетка для його відмірювання. На верхньому і нижньому відводах судини-піпетки нанесені мітки, відповідні обсягом 5 cm j. Для відмірювання розчину А відкривають кран / і заповнюють посудину-піпетку до верхньої позначки. Потім кран закривають. При відмірюванні розчину А і заливанні його в ебуліостат відкривають кран 2 і спускають розчин до нижньої позначки. Другий дозатор для відмірювання розчину Б являє собою піпетку місткістю 5 см, до верхнього кінця якої припаяний триходовий кран. На верхній відвід трійника надіта гумова груша. Розчин Б зберігають в колбі місткістю 100 см ', звідки набирають у піпетку, а з піпетки спускають в ебуліостат.
Залежно від масової частки PB в розчині і інтенсивності його забарвлення застосовують два варіанти титрування: для світлих розчинів, що містять 0,13 ... 0,05% PB 1 використовують пряме титрування розчином цукру; для темних розчинів або розчинів, що містять менше 0, 05% PB 1 застосовують дотітровиваніе розчином глюкози.
Методика аналізу по першому варіанту. У колбу приладу наливають воду і ставлять прилад на електричну плитку. Для рівномірного утворення пари на дно колби поміщають шматочки пористого скла або шамота. Коли вода закипить, виймають з колби ебуліостат і наливають в нього з дозаторів спочатку 5 см 3 розчину А, а потім 5 см 3 розчину Б. Обережно перемішують розчини в ебуліостате і повільно вставляють ебуліостат разом з пробкою в колбу.
Потім верхній отвір ебуліостата закривають пробкою з бюретки, в яку наливають досліджуваний розчин цукру. Регулюють вихід пари через відвідну трубку таким чином, щоб рідина в ебуліостате нагрілася до температури кипіння води приблизно за 0,5 хв. Як тільки пар почне проходити через мідно-лужний розчин, починають титрування розчином цукру.
Спочатку проводять орієнтовне визначення. Розчин цукру з бюретки додають по краплях зі швидкістю одна крапля за 1 ... 2 с до переходу забарвлення розчину з синьої в жовту і помічають об'єм розчину цукру, витраченого на титрування. Потім проводять остаточне визначення. У ебуліостат заливають нову порцію мідно-лужного розчину, готують ебуліостат до титрування, як зазначено вище, і починають титрування. Спочатку відразу додають 80 ... 90% об'єму розчину цукру, витраченого при орієнтовному визначенні, і через 2 хв з початку пробульківанія пари через рідину в ебуліостате дотітровивают, додаючи розчин цукру зі швидкістю одна крапля за 6 ... 7 с, до переходу синьої забарвлення в жовту від однієї краплі цукрового розчину.
За бюретці визначають обсяг розчину цукру, витраченого на титрування 10 CM i мідно-лужного розчину.
Масову частку PB 1%, в гідролізаті легкогідролізуемих полісахаридів або в розведеному нейтралізованої гідролізаті трудногідролізуемих полісахаридів г, і з т відповідно розраховують за формулою
1
де T 1 - титр мідно-лужного розчину по глюкози для першого варіанту, мг; х - обсяг гідролізату, витрачений на титрування 10 см 1 мідно-лужного розчину.
Методика аналізу по другому варіанту. Готують прилад до роботи, як і в першому варіанті, але в ебуліостат крім 5 см 1 розчину А та 5 см 3 розчину Б, додають, відмірюючи піпеткою, певний обсяг розчину цукру. У разі темного розчину, що містить більше 0,05% PB, цей обсяг повинен становити 1 ... 2 см 3, а в разі розчину з масовою часткою PB менше 0,05% - 5 см 3. Потім до рідини в ебуліостате додають з бюретки такий обсяг розчину глюкози концентрацією близько 0,1 г/100 см 3, щоб на дотітровиваніе після 2 хв кип'ятіння треба було б не більше 1 см 3 цього розчину. Додається обсяг визначають попереднім аналізом. Концентрація додається розчину глюкози повинна бути встановлена точно; найзручніше користуватися розчином глюкози, приготованим для установки титру мідно-лужного розчину,
Після перемішування рідини ебуліостат з пробкою повільно вставляють у колбу, закривають його пробкою з бюретки, в яку налито розчин глюкози. Через 2 хв з початку пробульківанія пари через рідину в ебуліостате проводять дотітровиваніе розчином глюкози, додаючи його зі швидкістю одна крапля за 6 ... 7 с до переходу забарвлення в жовту від однієї краплі розчину глюкози, витраченого на дотітровиваніе.
Масову частку PB,%, в гідролізаті легкогідролізуемих полісахаридів або в розведеному нейтралізованої гідролізаті трудногідролізуемих полісахаридів з л і з г відповідно розраховує за формулою
де T 2 - титр мідно-лужного розчину по глюкози для другого варіанту, мг; с.
При фотоколориметричним методом для виявлення безбарвних Сахаров на папері хроматограму проявляють - обробляють розчином проявника, що дає з цукрами забарвлені сполуки. Кількості розділених моносахаридів приблизно можна визначити безпосередньо на хроматограмі прямим вимірюванням інтенсивності забарвлення плям. Проте через нестабільність забарвлення і істотного впливу умов обробки хроматограм точність цього методу невелика: відносна помилка вимірів досягає 10 ... 15%. Більш точним способом є отримання забарвлених продуктів з хроматограми - е л ю і з о в а н і е з подальшим фотометрірованія отриманих розчинів - злюатов на фотозлектроколоріметре або спектрофотометрі.
Для поділу Сахаров застосовують спеціальну хроматографическую папір № 1 або Ne 2, яку нарізають смужками. Швидкість поділу більше на смужці паперу з подовжнім розташуванням волокон, ніж на смужці з поперечним розташуванням. Іноді для кращого поділу Сахаров необхідно забезпечити більш повільний рух розчинника. З цією метою папір нарізають в напрямку, перпендикулярному напрямку волокон.
Хроматографирования здійснюють спадним або висхідним потоками рідини. У першому випадку папір підвішують, зміцнюючи верхній кінець в посудині з розчинником. У другому випадку папір поміщають в розчинник нижнім кінцем. Коли цукру важко розділяються, рекомендується повторне хроматографирования.
Розчинник повинен забезпечувати максимальну різницю в значеннях R t і сам повинен бути високоподвіжен. При поділі Сахаров використовують, наприклад, такі системи розчинників: етилацетат - піридин - вода.,; Н-бутанол - оцтова кислота - вода; н-бутанол - ацетон - вода, і ін Поділ Сахаров залежить від складу розчинника.
Для підвищення ефективності розділення розчинника дають можливість стікати до тих пір, поки цукру не розділяться по всій довжині хроматограми. При цьому обчислити значення R 1 неможливо, так як невідомий шлях, пройдений фронтом розчинника. У цьому випадку рухливість визначають непрямим способом, порівнюючи шляху, пройдені поділюваними речовинами, з переміщенням плями речовини з відомим R j. У хімії вуглеводів часто використовують ксилозу і визначають коефіцієнт рухливості R kc як відношення відстані, пройденої цукром, до відстані, пройденого в цих же умовах ксилозою. Крім природи цукру і складу розчинника на коефіцієнт рухливості впливають якість паперу і температура середовища.
Як проявителей застосовують різноманітні реагенти в залежності, від складу поділюваних сумішей. Для прояву хроматограм гідролізатів рослинних тканин, що містять редукуючимцукру, одним з кращих проявителей вважають розчин анілінфталата в етанолі. При прояві анілінфталатом пентози в залежності від кількості дають забарвлення від рожевого до темно-червоного, гексози - зеленувато-коричневе, Рамноза - світло-коричневу. Для елюювання забарвлених сполук з хроматограми використовують крижану оцтову кислоту або розчин соляної кислоти в етанолі.
Методика аналізу. Поділ Сахаров проводять низхідним способом при безперервному протіканні розчинника по паперу.
Підготовка гідролізату. Концентрація PB в гідролізаті, підготовленому для хроматографування, повинна знаходитися в межах 1 ... 3%. При необхідності гідролізат упарюють. Упарювання проводять у вакуум-сушильній шафі при температурі 50 ... 60 ° С або при нагріванні на водяній бані в порцеляновій чашці або в скляному стакані. Гідролізат легкогідролізуемих полісахаридів попередньо нейтралізують концентрованим розчином гідроксиду натрію до слабощелочной реакції і підкисляють концентрованої оцтової кислотою до рН 5, потім упарюють і фільтрують через просту конусоподібну воронку з паперовим фільтром. Гідролізат трудногідролізуемих полісахаридів нейтралізують карбонатом барію і відфільтровують осад сульфату барію. Отриманий фільтрат відразу піддають хроматографирования. При необхідності роблять упарювання після підкислення оцтовою кислотою до рН 5 і знову фільтрують. Кратність упарювання точно визначають і враховують при розрахунку мас моносахаридів.
Приготування розчинника. Для приготування суміші етилацетат - піридин - вода 150 см 3 етилацетату і 30 см 3 піридину добре збовтують ділильної воронки місткістю 500 см 3, потім додають до суміші 150 см 3 дистильованої води і знову добре збовтують протягом 2 ... 3 хв. Після цього суміш залишають для розшаровування. Коли верхній шар рідини стане прозорим, нижній шар зливають, а верхній використовують для хроматографування. Подібним чином готують і інші склади розчинників, змішуючи органічні розчинники і воду у відповідних пропорціях.
Хроматографічне розділення. Установка для хроматографирования являє собою широкий циліндр із притертою кришкою. Всередину циліндра поміщають малий циліндр, на який ставлять чашку з розчинником.
Нарізають 10 ... 12 смужок хроматографічного паперу розміром 3ч45 см. При хроматографирования нижній кінець смужки може вільно звисати або його вирізують у вигляді "язичка", який вставляють в шийку колби-приймача. На відстані 10 ... 15 см від іншого кінця смужки відзначають точку старту, на яку наносять певну кількість підготовленого гідролізату. Всі позначки, на паперовій смужці роблять тільки графітовим олівцем.
Пробу гідролізату наносять мікропіпеткою зі спеціальним пристосуванням, що складається з гумової груші в металевому кожусі і мікровінта з кулькою. Якщо упарювання гідролізату небажано, то на папір наносять кілька разів в одне і те ж місце необхідний об'єм розчину цукру, який розраховують виходячи з масової частки PB. Після нанесення кожної порції розчину пляма добре просушують. Діаметр нанесеного плями не повинен перевищувати 5 ... 6 мм.
Смужки встановлюють у строго вертикальному положенні. Кінець смужки, на який нанесена проба, загинають в чашку. Пляма проби повинно знаходитися зовні чашки нижче її краю не менш ніж на 2 см. Другий кінець вставляють у колбу-приймач. Для кращої ідентифікації Сахаров в установку поміщають також смужку паперу з нанесеним розчином суміші чистих моносахаридів: галактози, глюкози, манози, арабінози, ксилози. У чашку наливають розчинник і установку герметично закривають кришкою.
Хроматографирования проводять при температурі 18 ... 22 ° С, поміщаючи установку в спеціальну кімнату або шафу. Поділ здійснюється за 24 ... 90 ч. хроматографирования вважають закінченим тоді, коли на виявленої хроматограмме відстані між плямами будуть не менш 3 мм.
Після закінчення поділу Сахаров хроматограми сушать на повітрі протягом приблизно 4 год до повного видалення розчинника. При сушінні хроматограми перекидають через скляну паличку, укріплену на двох штативах.
Прояв хроматограм. Проявником служить розчин, що містить 1,66 г фталевої кислоти і 0,92 см 3 свежеперегнанного аніліну в 100 см 3 етанолу.
Сухі хроматограми змочують рівномірно проявником короткочасним зануренням в розчин, віджимають між листами фільтрувального паперу і трохи підсушують на повітрі. Потім хроматограми поміщають в сушильну шафу, попередньо нагрітий до потрібної температури. M Кілька хроматограм одночасно кладуть на ребро так, щоб вони не торкалися один одного і стінок шафи. Прояв ведуть при температурі 100 ... 105 ° С протягом 5 хв. Аналогічним чином проявляють смужки паперу з нанесеним розчином суміші чистих Сахаров. При встановленні природи Сахаров керуються кольором плям, їх відносним розташуванням і розташуванням плям чистих Сахаров.
Фотоколориметричні визначення Сахаров. З виявленої хроматограми вирізають ділянки, що відповідають окремим сахарам, і розрізають їх на вузькі смужки. Поміщають шматочки хроматограм в пробірки з прішліфованном пробками і заливають 8 см 3 розчину HCI в етанолі. Елюювання ведуть протягом 1 год при кімнатній температурі, помістивши пробірки в темряву. Через кожні 5 ... 10 хв пробірки енергійно струшують.
Елюатів зливають в підготовлені сухі пробірки і фото-метріруют - вимірюють оптичну щільність на фотоелектричні колориметрі при синьому світлофільтрі в кюветі товщиною 10 мм або ж на спектрофотометрі при довжині хвилі 420 нм.
Масу кожного моносахариду визначають за відповідними градуювальними графіками.
Знаючи масу цукру в пробі гідролізату, нанесеної на хроматограмі, обсяг цієї проби, кратність упарювання і загальний обсяг гідролізату, розраховують масову частку,% до абсолютно сухої деревини, відповідних полісахаридів Р - глюканов, маннанов, галактанов, ксіланов, арабінанов
де Ь - маса моносахариду в пробі гідролізату, мкг; х - обсяг проби гідролізату, взятий на хроматографирования, см 3; V - загальний обсяг гідролізату, V = 500 - або 200 см 3; k - коефіцієнт перерахунку моносахаридів на полісахариди, £ = 0 , 90 для гексозанов і 0,88 для пентозанов; ж - кратність упарювання; g - маса абсолютно сухої наважки деревини, м.
Побудова градуювальних графіків. Градуювальний графік для кожного моносахариду являє собою залежність оптичної щільності елюату від маси цукру на хроматограмі. Для побудови графіків готують точно 1%-ні розчини чистих моносахаридів. На смужку хроматографічного паперу на відстані 3 ... 4 см один від одного наносять різні кількості 1%-ного розчину цукру: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 і 0,05 см 3. Після висихання плям смужку проявляють розчином анілінфталата в етанолі в точно таких же умовах, як і при аналізі гідролізатів. Проводять елюювання і фотометрирование, як описано вище. На підставі середніх даних декількох паралельних визначень для кожного моносахариду будують градуювальний графік. Іноді градуювальний графік для глюкози використовують для всіх гексоз, а графік для ксилози - для всіх пентоз. Останній спосіб менш точний.
6. Аналіз гідролізатів методом газорідинної хроматографії
У гидролизатах відбувається мутаротація моносахаридів, тобто освіта рівноважної суміші таутомерних форм: б-, в-пиранозной, б-, в-фуранозних і відкритою. Для глюкози це ілюструє наступна схема:
Існування таутомерних форм ускладнює визначення складу моносахаридів в гідролізаті.
Моносахариди нелетких і безпосереднє поділ їх сумішей методом газорідинної хроматографії неможливо. Цукру можуть бути хроматографически розділені у вигляді летючих похідних - простих і складних ефірів. Широко поширений метод аналізу у вигляді тріметілсілільних похідних моносахаридів. Останні є летючими глікозидами простих О-тріметілсілілових ефірів вуглеводів, що утворюються в результаті повного заміщення гідроксильних груп моносахаридів при їх сілірованіі.
Як сілірующего реагенту моносахаридів використовують суміш тріметілхлорсілана і гексаметілдісілазана в середовищі піридину.
Як приклад наводиться схема реакції сілірованія для галактози
Подібним чином синтезуються TM С-похідні інших моносахаридів. При цьому встановлюється нова рівноважна суміш, у якій переважають пиранозной формі. Співвідношення таутомерія в залежності від умов коливається. Склад ТМС-похідних таутомерних форм індивідуальних моносахаридів наведено нижче.
Для зменшення числа піків на хроматограмі і спрощення її обробки моносахариди відновлюють до відповідних багатоатомних спиртів з подальшим їх перетворенням в ацетати. Кожен поліол дає на хроматограмі один пік, оскільки таутомерія у поліолів неможлива.
При аналізі ТМС-похідних методом газорідинної хроматографії інертний газ служить рухомою фазою, нерухомою фазою є рідина, нанесена тонким шаром на твердий носій. Як рідкої фази використовують різні силіконові масла і поліефіри. Найбільш селективними фазами з вироблюваних вітчизняною промисловістю є неполярні метілхлорсіліконовое масло і полярний политриэтиленгликольсебацинат. Як твердого носія застосовують адсорбенти порохром-3 або хромат N.
Для хроматографічного розділення суміші летючих похідних моносахаридів використовують газові хроматографи, що складаються з колонки з термостатом, в якій відбувається поділ суміші, полум'яно-іонізаційного детектора, що дає сигнал прямо пропорційний кількості аналізованої речовини, блоків управління і самопишущего приладу. Вихід ТМС-похідних, що реєструється самопишущим приладом у вигляді піка на діаграмної стрічці, відповідає часу утримування t R - часу, що пройшов з моменту введення проби в колонку до моменту появи компонента суміші в детекторі.
Відповідно до t R на хроматограмі в певному порядку з'являються піки індивідуальних сполук. Xpo матограмма - сукупність піків, відповідна порядку виходу і масі індивідуальних компонентів суміші. Порядок виходу при хроматографическом поділі ТМС-похідних залежить від рідкої фази. Його встановлюють попередньо для даної фази з використанням модельних ТМС-похідних чистих моносахаридів по їх часу утримування. На рис. наведена як приклад хроматограмма модельної суміші, розділеної на колонці з метілхлорфеніл-силіконовим маслом в якості рідкої фази.
Існує кілька методів кількісного визначення складу суміші за отриманими хроматограмах. За першим методом визначають площі піків всіх таутомерія кожного моносахариду розрахунком площі трикутної апроксимацією піку - множенням підстави піку на половину висоти. При частковому накладення піків один на одного і неможливості прямого вимірювання підстави площа піку визначають множенням його висоти на ширину, виміряну на половині висоти. Можливо також визначати частку кожного піку його перенесенням на папір і зважуванням вирізаного з неї піку на аналітичних вагах, відносячи знайдену масу до маси всіх аналізованих піків. Результат виражають у відсотках, використовуючи метод нормування площ.
Хроматограмма модельної суміші TMC похідних моносахаридів
За другим методом кількісне визначення масової частки конкретного моносахариду в суміші виробляють за площею піку одного з його таутомерія, виходячи з умови, що при синтезі ТМС-похідних в строго постійних умовах співвідношення таутомерія зберігається постійним. Це дозволяє для розрахунку вибрати найбільш дозволений пік, званий характеристичним. В якості таких піків зазвичай використовують піки ТМС-похідних в-Ж,-арабінопіранози, в-П-ксі-лопіранози, a - D-маннопіранози, a - D-галактопіранози і в - D-глюкопіраноз. Площі піків інших таутомерія безпосередньо не вимірюють, а знаходять розрахунком. З урахуванням частки характеристичного піку обчислюють загальну площу піків всіх таутомерія даного моносахариду. Кількісне співвідношення таутомерних форм необхідно встановлювати для даних умов хроматографування і при. їх зміну визначення слід проводити знову. Частку конкретного моносахариду знаходять віднесенням площі всіх піків даного моносахариду до загальної площі всіх піків.
Кількісне визначення маси індивідуальних моносахаридів виробляють з використанням внутрішнього стандарту. Маса сорбіту, що додається в аналізовану суміш, повинна забезпечити його концентрацію в розчині, приблизно відповідну концентрації індивідуальних моносахаридів. Розрахунок ведуть за градуювальним графіком. Графік отримують, за даними хроматографирования еталонних розчинів, що містять індивідуальний моносахарид і сорбіт. Градуювальний графік будують в координатах: по осі абсцис - маса чистого моносахариду в еталонному розчині, по осі ординат - відношення площі характеристичного піку цього ж моносахариду до площі піка внутрішнього стандарту. Графік має лінійну форму. Пряму лінію проводять з використанням методу найменших квадратів.
Відносна помилка визначень Сахаров в гідролізаті залежить від їхньої масової частки в жалізіруемой суміші і становить 1 ... 5%. Загальний час аналізу при серійному проведенні визначень близько 2 год, не враховуючи часу на отримання градуювальних графіків.
Методика аналізу. Аналіз гідролізатів методом газорідинної хроматографії включає підготовку гідролізатів до аналізу, синтез ТМС-похідних моносахаридів, хроматографічне розділення цих похідних і обробку хроматограм.
Підготовка гідролізатів до аналізу. Гідролізати, отримані при обробці деревини концентрованої сірчаної кислотою, нейтралізують карбонатом барію до рН 5. Розчин фільтрують через конусоподібну скляну лійку з паперовим фільтром від осаду сульфату барію. Гідролізати, отримані при обробці деревини соляною кислотою, нейтралізують карбонатом натрію до рН 5. В отриманих гидролизатах визначають масову частку PB. При необхідності гідролізат упарюють у вакуум-сушильній шафі при температурі 40 ° С.
Синтез ТМС-похідних моносахаридів. У круглодонну колбу місткістю 50 см 3 вносять піпеткою пробу нейтралізованого і упаренного гідролізату, що містить близько 20 мг PB.
Роботу виконують у двох варіантах - з внутрішнім стандартом або без нього.
Розчин сорбіту вносять в колбу піпеткою в обсязі, відповідному його масі, рівної 2 ... 5 мг. Колбу приєднують до ротаційного вакуумному випарника і випарюють розчин при температурі 40 ... 42 ° С і залишковому тиску 0,5 ... 1 кПа. Випарювання виробляють насухо. Для видалення слідів води до упаренной пробі додають 2 ... 3 рази по 1 см 3 спіртотолуольной суміші, яку також видаляють упариванием. Потім сухий залишок в цій же колбі розчиняють в 2 см 3 свежеперегнанного сухого піридину, додають 0,6 см 3 гексаметілдісілазана і 0,3 см 3 тріметілхлорсілана. Колбу закривають пробкою, енергійно струшують 30 с і при кімнатній температурі витримують реакційну суміш протягом 10 хв.
Якщо аналізована проба погано розчиняється, колбу нагрівають на водяній бані при температурі 75 ... 85 ° С протягом 2 ... 3 хв. Потім проводять упарювання піридину з реакційної суміші на ротаційному випарнику при температурі 40 ° С і залишковому тиску 0,5 ... 1 кПа протягом 10 хв. Залишок розчиняють в цій же колбі в 2 см 3 "-гексану. У добре закритих колбах ТМС-похідні стійкі протягом декількох тижнів.
Масову частку кожного моносахариду в гідролізаті,%, розраховують за формулою
де т, - маса моносахариду в пробі гідролізату, мг; х - обсяг проби гідролізату, см 3.
За отриманими значеннями с, Для гідролізатів легко - і трудногідролізуемих полісахаридів розраховують масові частки відповідних полісахаридів у відсотках по відношенню до абсолютно сухої деревини.
За другим варіантом розраховують частку кожного моносахариду у відсотках від їх загальної маси за методом нормування площ. Обчислюють суму площ всіх піків S і площі піків кожного моносахариду S 4.
Масову частку кожного моносахариду,% до їх загальної маси, розраховують за формулою
Визначення часу утримування моносахаридів і побудова градуювальних графіків. За першим варіантом аналізу готують еталонні розчини певної концентрації чистих моносахаридів і внутрішнього стандарту - сорбіту. Для кожного моносахариду готують п'ять еталонних розчинів концентрацією від 2 до 10 мг / см 3. Концентрація розчину сорбіту постійна - 4 мг / см 3. З кожного розчину відбирають три проби, синтезують TMC-похідні і хроматографують, як зазначено вище. На кожній з трьох хроматограм для кожного піку фіксують значення t R, обчислюють площу характеристичного піку таутомерія моносахариду S 1 і площа піку сорбіту S cl. Таким чином знаходять S, / S cr для всіх п'яти еталонних розчинів. За середнім значенням результатів трьох паралельних аналізів для кожного з п'яти еталонних розчинів будують графіки залежності відносин SJS cr від маси моносахаридів, користуючись методом найменших квадратів.
Час утримування для кожного моносахариду знаходять за шкалою часу хроматограм.