Методичні вказівки з лабораторної діагностики лептоспірозу тварин
1. Загальні положення
1.1. Лептоспіроз представляє собою зооантропонозних пріродноочагових інфекцію домашніх, промислових, багатьох видів диких тварин і людини. Лептоспіроз хворіють велика рогата худоба, свині, коні, вівці, кози, олені, собаки, лисиці, песці і тварини інших видів.
1.2. Збудником хвороби є лептоспіри. Вони відносяться до сімейства спірохет (Spirochetaceae), роду лептоопір (Leptospira), виду патогенних лептоспір (interrogans). Останній включає 124 серологічних варіанта (серотипу - серовара). Серологічні варіанти за ступенем антигенного спорідненості об'єднані в 18 серологічних груп (додаток 1).
Збудником лептоспірозу сільськогосподарських тварин на території Радянського Союзу є лептоспіри наступних серогрупп (див. табл.).
Лептоспіроз у сільськогосподарських тварин інших видів викликають лептоспіри цих же серогруп.
Зараження великої та дрібної рогатої худоби лептоспірозом серогрупп Grippotyphosa і Hebdomadis часто масове, відбувається переважно при випасанні на території природного вогнища від полівок та інших видів мишоподібних гризунів - основних господарів лептоспір даних серогрупп. Заразилися сільськогосподарські тварини є джерелом збудника інфекції.
Джерелом і основними господарями лептоспір серогруп Tarassovi і Pomona (сероваріантів manjakov і pomona) є сільськогосподарські тварини і в першу чергу свині й велика рогата худоба. Природні вогнища лептоспір Tarassovi на території Радянського Союзу не виявлені. У природних вогнищах лептоспір Pomona паразитують у польових мишей лептоспіри сероваріантів mozdok, який викликає у сільськогосподарських тварин тільки спорадичні випадки інфекції. Лептоспірозом Tarassovi і Pomona в більшості випадків свині заражаються від свиней, велику рогату худобу від великої рогатої худоби. Може спостерігатися міжвидові зараження.
Лептоспірозом Icterohaemorrhagiae і Canicola сільськогосподарські тварини інфікуються від основних господарів цих лептоспір: сірих щурів і собак відповідно. Лептоспіроз, викликаний цими збудниками, протікає спорадично і не вражає великих груп тварин.
1.3. Тварини - лептоспіроносітелі виділяють лептоспір у зовнішнє середовище з сечею і інфікують воду, корми, пасовища, грунт, підстилку та інші об'єкти зовнішнього середовища, через які заражаються здорові тварини.
Найбільш сприятливе середовище для збереження лептоспір поза організмом - вода відкритих водойм: не висихають калюжі, ставки, болота, повільно поточні річки, вологий грунт з реакцією, близькою до нейтральної.
Водний шлях передачі збудника інфекції основною.
Зараження можливе при поїданні трупів гризунів - лептоспіроносітелей або кормів, інфікованих сечею цих гризунів. Промислові тварини при клітинному їх утриманні заражаються в основному при поїданні продуктів забою хворих на лептоспіроз тварин.
Лептоспіри проникають в організм тварин і людини через пошкоджені ділянки шкіри (подряпини, порізи, рани), слизові оболонки ротової порожнини, носа, очей, статевих шляхів.
1.4. Лептоспіроз у сільськогосподарських тварин протікає гостро, підгостро, хронічно і безсимптомно. Це спостерігається в будь-який час року, але у тварин з пасовищним змістом переважно у пасовищний період. Сприйнятливі до лептоспірозу тварини різного віку. Хвороба характеризується короткочасною лихоманкою, іноді жовтяничним фарбуванням та некрозами слизових і окремих ділянок шкіри, порушенням функції шлунково-кишкового тракту.
У свиней і підсвинків, дорослого великої рогатої худоби, коней, овець і кіз лептоспіроз протікає переважно безсимптомно. У не імунних свиноматок і рідше у корів лептоспіроз супроводжується абортами в останній місяць вагітності або народженням нежиттєздатного потомства. Аборти у свиноматок в раніше благополучних господарствах можуть бути масовими.
При спалаху лептоспірозу гострий перебіг інфекції з характерними клінічними ознаками є у невеликої кількості тварин, а основна маса їх хворіють безсимптомно.
Незалежно від перебігу інфекції та виду тварини на 5-7-й день після зараження в крові тварини виявляються специфічні антитіла, а через 10-20 днів у ряду тварин розвивається лептоспіроносітельство, яке триває протягом декількох місяців і до 1-2 років.
Поголів'я лептоспіроносітелей на неблагополучній щодо лептоспірозу фермі серед великої та дрібної рогатої худоби складає 1-5%, на окремих фермах до 10-20%, серед свиней лептоспіроносітелямі можуть бути 30-80% тварин і більше.
Перебіг хвороби не залежить від серогрупповой приналежності збудника. Однак лептоспіроз у великої рогатої худоби, викликаний збудниками групи Hebdomadis, протікає частіше проявів і лише в окремих випадках супроводжується лептоспіроносітельством.
1.5. Патологоанатомічні зміни у полеглих від лептоспірозу тварин характеризуються геморагічним діатезом і жовтяничним забарвленням підшкірної клітковини, збільшенням в обсязі печінки, в'ялої її консистенцією, на розрізі глинистого кольору, збільшенням лімфатичних вузлів, соковитих на розрізі і з крововиливами. Сечовий міхур переповнений сечею часто вишнево-червоного кольору. Желтушное фарбування тканин і кривава сеча не характерні для лептоспірозу свиней.
При безсимптомному лептоспіроносітельстве видимі ураження локалізуються переважно в нирках і проявляються змінами, характерними для гострого або хронічного паренхіматозного або інтерстиціального нефриту та дистрофії (мармурова забарвлення і зміна кольору поверхні, червоні інфаркти, точкові сіро-білі некротичні вогнища, крововиливи, згладженість кордону між мозковим і кірковим шарами).
2. Діагностика лептоспірозу
2.1. Підставою для підозри на неблагополуччя господарства щодо лептоспірозу служать клінічні ознаки, патологоанатомічні зміни, виявлення специфічних антитіл у крові окремих тварин і епідемічні свідчення (захворювання лептоспірозом людей).
2.2. З метою своєчасного виявлення лептоспірозу проводять дослідження сироватки крові тварин по РМА або РА:
а) у племінних господарствах (фермах) всіх виробників і не менше 10% за РМА або 15% по РА корів, нетелей, свиноматок і кобил один раз на рік; дрібна рогата худоба і тварин інших видів досліджують тільки при підозрі на захворювання на лептоспіроз;
б) на племпідприємства (станціях, пунктах) штучного осіменіння кров усіх виробників два рази на рік;
в) у групах свиней, великої та дрібної рогатої худоби і коней - перед введенням (ввезенням) і висновком для племінних або пользовательних цілей. При цьому в групах до 25 голів досліджують всіх тварин, у групах до 100 голів - не менше 25 тварин, а у великих групах - не менше 25% тварин по РМА або 35% - по РА;
г) в усіх випадках при підозрі на лептоспіроз.
2.3. У хворих, підозрілих на захворювання і підозрюваних у зараженні тварин кожного обори, свинарника, гурту, отари і т.д. досліджують кров і сечу, а у полеглих-паренхіматозні органи. Кров беруть не менше ніж від 50 тварин. Повторне взяття крові проводять через 7-10 днів у тих же тварин.
Сечу мікроскопують безпосередньо в господарстві не менше ніж від 100 тварин. Дослідження припиняють після виявлення лептоспір в одній з проб.
На фермах з поголів'ям меншим дослідженню піддають всіх тварин.
Взяття матеріалу для дослідження і лабораторну діагностику лептоспірозу проводять згідно з «Методичними вказівками по лабораторній діагностиці лептоспірозу тварин», рекомендованими ГУВ МСХ СРСР 15 жовтня 1975
2.4. За результатами лабораторних досліджень діагноз на лептоспіроз вважають встановленим, а господарство (ферму, відділення, підприємство, станцію, пункт штучного осіменіння, свинарник, гурт і т.д.) неблагополучними щодо лептоспірозу в будь-якому з наступних випадків:
а) лептоспіри виявлені при мікроскопічному дослідженні в крові чи суспензії із органів тварин, абортованою плоді, сечі «Чи органах лабораторної тварини, полеглого після зараження досліджуваним матеріалом;
б) культура лептоспір виділена із патологічного матеріалу або із органів лабораторної тварини, зараженого досліджуваним матеріалом;
в) лептоспіри виявлені в гістологічних зрізах нирок або печінки, насичені сріблом за Левадіті;
г) встановлено наростання титру антитіл в п'ять і більше разів при повторному дослідженні через 7-10 днів сироватки крові по РМА або при виявленні антитіл у раніше нереагіровавшіх тварин;
д) специфічні антитіла виявлені в сироватці крові при одноразовому дослідженні по РМА в титрі 1: 100 і вище більш ніж у 25% обстежених тварин або за РА (1-4 хреста) більш ніж у 20% тварин, а для великої рогатої худоби, що реагує з лептоспірозом групи Hebdomadis, і коней за РМА 1: 500 і вище або за РА на 3-4 хреста в тому ж відсотку випадків.
2.5. Лептоспіроз вважають причиною загибелі тварин при наявності клінічних ознак і патологоанатомічних змін, характерних для лептоспірозу, підтверджених виявленням лептоспір в крові чи паренхіматозних органах, або наростанням титру антитіл не менш ніж у п'ять разів.
При постановці діагнозу на лептоспіроз необхідно проводити диференційну діагностику і враховувати, що тварини - лептоспіроносітелі (особливо свині) і тварини, які мають у крові специфічні антитіла, можуть гинути від різних інфекційних та неінфекційних хвороб.
2.6. Лептоспіроз вважають причиною абортів в наступних випадках:
а) при виявленні лептоспір в органах (тканинах) абортовану (мертвонародженого) плоду;
б) при наростанні титру антитіл у абортованої матки не менш ніж у п'ять разів;
в) при високому титрі антитіл (1:2500 і більше) у групі абортовані тварин і низькому титрі (до 1: 500) або негативної реакції в групі здорових тварин.
3. Охорона благополучних господарств від заносу лептоспірозу
3.1. Благополучним з лептоспірозу вважають господарство, відділення, ферму, де немає тварин, хворих на лептоспіроз, немає тварин - лептоспіроносітелей і немає тварин, у сироватці крові яких виявляють по РМА або РА специфічні антитіла.
3.2. З метою недопущення занесення в благополучні господарства лептоспірозу необхідно:
а) карантініровать протягом 30 днів всіх вступників до господарство тварин;
б) комплектувати господарства (ферми) тільки клінічно здоровими тваринами, при серологічному дослідженні сироватки крові яких отримані негативні результати; для комплектування відгодівельних господарств (відділень, ферм) дозволяється вводити клінічно здорових тварин без дослідження на лептоспіроз, але з обов'язковою вакцинацією їх проти лептоспірозу в період карантинування;
в) не допускати введення (ввезення) у племінні господарства (відділення, ферми) тварин або продуктів забою з неблагополучних господарств, незалежно від результатів серологічного дослідження;
г) виключити контакт тварин господарства з тваринами, що перебувають в особистому користуванні, бродячими собаками і т.д.;
д) заборонити спільний випас та використання загального водопою тварин благополучних і неблагополучних груп;
е) використовувати для напування тварин воду артезіанських свердловин або водопровідної мережі (якість води повинна постійно контролюватися);
ж) заборонити експлуатацію виробників, сироватка крові або сперма яких дає позитивну РМА або РА;
з) влаштовувати літні табори на піднесених сухих ділянках з гарним стоком дощових вод, без доступу тварин до води відкритих водойм (ставок, озеро, річка, струмок);
і) утримувати в належному ветеринарно-санітарному стані пасовища, водопою, тваринницькі приміщення, вигульні майданчики, загони і т.д., осушувати сирі і заболочені ділянки;
к) систематично знищувати гризунів в тваринницьких приміщеннях, на території ферми, в місцях складування грубих кормів тощо, а також дослідити відловлених тварин на лептоспіроз;
л) вести суворий облік випадків абортів, мертвонародження, клінічних ознак хвороби і падежу тварин, направляти патологічний матеріал для дослідження в лабораторію. Цей матеріал повинен бути взятий і досліджено протягом 6 годин в літній час і 10-12 годин в зимовий час або за умови зберігання його в охолодженому стані;
м) не допускати участі у виставках собак, невакцинованих проти лептоспірозу;
н) не згодовувати хутровим звірам і собакам сирі продукти забою хворих на лептоспіроз тварин і тварин - лептоспіроносітелей;
о) виявляти природні вогнища лептоспірозу і не випасати на їх території невакцинованих тварин.
4. Специфічна профілактика, лікування та дезінфекція при лептоспірозі
4.1. Для специфічної профілактики лептоспірозу застосовують поливалентную фенольних вакцину, яка виготовляється в двох варіантах. Перший варіант вакцини включає лептоспіри: Помона, Тарассові, Гріппотіфоза, Іктерогеморрагія і Канікола, другий варіант - лептоспіри Помона, Тарассові, Гріппотіфоза і Гебдомонадіс. Застосовують вакцину з урахуванням етіологічної структури лептоспірозу.
4.2. Вакцинують проти лептоспірозу всіх сприйнятливих тварин у наступних випадках:
а) у неблагополучних по лептоспірозу господарствах;
б) у відгодівельних господарствах, де поголів'я комплектують без обстеження «а лептоспіроз;
в) у загрозливих господарствах;
г) при випасанні тварин у зоні природного вогнища лептоспірозу;
д) при виявленні в господарстві тварин, сироватка крові яких реагує на лептоспіроз за РМА або РА;
е) у районах з відгінним тваринництвом. Вакцинація профілактує переболевание, аборти, виключає перезараження тварин і формування інтенсивного вогнища лептоспірозу.
4.3. Вакцинацію проводять відповідно до Настановою із застосування поливалентной феноловий вакцини проти лептоспірозу сільськогосподарських і промислових тварин, затвердженим ГУВ МСХ СРСР 22 липня 1974 Вакцину вводять дворазово.
Тривалість імунітету у поросят і ягнят, вакцинованих у місячному віці, не перевищує трьох місяців, а у телят, вакцинованих у 14/2-2-месячном віці, 4-6-місячних підсвинків, дорослих свиней і овець - • шести місяців, у великої рогатої худоби, вакцинованого у віці від року і старше, - 12 місяців. Після закінчення зазначених строків тварин ревакцинируют.
Тривалість колострального імунітету становить у поросят і ягнят, отриманих від матерів, вакцинованих за 35-75 днів до опоросу (окоту), - 1 -11 / 2 місяці, а у телят, отриманих від корів, вакцинованих за 1! / 2-6 місяців до отелення, - 14/2-2 * / 2 місяці.
Телят, одержаних від імунних до лептоспірозу матерів, прищеплюють у віці l '/ г-2 місяці, а ягнят і поросят-у віці 1 -1 * / 2 місяці.
Для профілактики абортів лептоспирозной етіології свиноматок необхідно вакцинувати за 1-2 місяці
до покриття або в перший місяць після покриття, а велика рогата худоба - в перші 1-3 місяці тільності.
При спалаху лептоспірозу молодняк, отриманий від невакцинованих або вакцинованих в останній місяць вагітності маток, обробляють у 1-3-денному віці гіпврім1мунной сироваткою проти лептоспірозу в лікувальній дозі і вакцинують у місячному віці.
4.4. Для лікування хворих тварин використовують гипериммунную сироватку і стрептоміцин.
Сироватка містить специфічні антитіла до лептоспір шести серогрупп: Помона, Тарассові, Гебдомонадіс, Гріппотіфоза, Іктерогеморрагія і Канікола.
Тварини, піддані лікуванню сироваткою при гострому перебігу лептоспірозу, одужують, але залишаються лептоспіроносітелямі. Сироватка не профілактує аборти.
Сироватка є гарним диференційно-діагностичним засобом. Відсутність лікувального ефекту після її введення свідчить про нелептоспірозной етіології хвороби.
Застосовують сироватку в дозах, зазначених в Повчанні з її застосування або на етикетці флакона з сироваткою.
Стрептоміцин використовують для лікування тварин при клінічно вираженому перебігу лептоспірозу і для лікування тварин - лептоспіроносітелей. Його вводять через кожні 12 годин протягом 4-5 днів по 10-12 тисяч одиниць на кілограм маси (ваги) тварини.
Стрептоміцінотерапію груп тварин, в яких виявлені лептоспіроносітелі, починають через 7-10 днів після введення другої дози вакцини.
4.5. Поточну дезінфекцію проводять в неблагополучному щодо лептоспірозу господарстві після кожного випадку виділення хворої тварини і в подальшому через кожні 10 днів до зняття обмежень. 1. Загальні положення
1.1. Лептоспіроз представляє собою зооантропонозних пріродноочагових інфекцію домашніх, промислових, багатьох видів диких тварин і людини. Лептоспіроз хворіють велика рогата худоба, свині, коні, вівці, кози, олені, собаки, лисиці, песці і тварини інших видів.
1.2. Збудником хвороби є лептоспіри. Вони відносяться до сімейства спірохет (Spirochetaceae), роду лептоопір (Leptospira), виду патогенних лептоспір (interrogans). Останній включає 124 серологічних варіанта (серотипу - серовара). Серологічні варіанти за ступенем антигенного спорідненості об'єднані в 18 серологічних груп (додаток 1).
Збудником лептоспірозу сільськогосподарських тварин на території Радянського Союзу є лептоспіри наступних серогрупп (див. табл.).
| Збудники | Свині | Велика рогата худоба | Дрібна рогата худоба |
| Основні | Pomona Tarassovi | Hebdomadis Pomona Grippotyphosa Tarassovi | Grippotyphosa Pomona j Tarassovi |
| Рідко зустрічаються | Hebdomadis Icterohaemorrhagiae Canicola Grippotyphosa | Canicola Icterohaemorrhagiae | Hebdomadis Icterohaemorrhagiae Canicola |
Зараження великої та дрібної рогатої худоби лептоспірозом серогрупп Grippotyphosa і Hebdomadis часто масове, відбувається переважно при випасанні на території природного вогнища від полівок та інших видів мишоподібних гризунів - основних господарів лептоспір даних серогрупп. Заразилися сільськогосподарські тварини є джерелом збудника інфекції.
Джерелом і основними господарями лептоспір серогруп Tarassovi і Pomona (сероваріантів manjakov і pomona) є сільськогосподарські тварини і в першу чергу свині й велика рогата худоба. Природні вогнища лептоспір Tarassovi на території Радянського Союзу не виявлені. У природних вогнищах лептоспір Pomona паразитують у польових мишей лептоспіри сероваріантів mozdok, який викликає у сільськогосподарських тварин тільки спорадичні випадки інфекції. Лептоспірозом Tarassovi і Pomona в більшості випадків свині заражаються від свиней, велику рогату худобу від великої рогатої худоби. Може спостерігатися міжвидові зараження.
Лептоспірозом Icterohaemorrhagiae і Canicola сільськогосподарські тварини інфікуються від основних господарів цих лептоспір: сірих щурів і собак відповідно. Лептоспіроз, викликаний цими збудниками, протікає спорадично і не вражає великих груп тварин.
1.3. Тварини - лептоспіроносітелі виділяють лептоспір у зовнішнє середовище з сечею і інфікують воду, корми, пасовища, грунт, підстилку та інші об'єкти зовнішнього середовища, через які заражаються здорові тварини.
Найбільш сприятливе середовище для збереження лептоспір поза організмом - вода відкритих водойм: не висихають калюжі, ставки, болота, повільно поточні річки, вологий грунт з реакцією, близькою до нейтральної.
Водний шлях передачі збудника інфекції основною.
Зараження можливе при поїданні трупів гризунів - лептоспіроносітелей або кормів, інфікованих сечею цих гризунів. Промислові тварини при клітинному їх утриманні заражаються в основному при поїданні продуктів забою хворих на лептоспіроз тварин.
Лептоспіри проникають в організм тварин і людини через пошкоджені ділянки шкіри (подряпини, порізи, рани), слизові оболонки ротової порожнини, носа, очей, статевих шляхів.
1.4. Лептоспіроз у сільськогосподарських тварин протікає гостро, підгостро, хронічно і безсимптомно. Це спостерігається в будь-який час року, але у тварин з пасовищним змістом переважно у пасовищний період. Сприйнятливі до лептоспірозу тварини різного віку. Хвороба характеризується короткочасною лихоманкою, іноді жовтяничним фарбуванням та некрозами слизових і окремих ділянок шкіри, порушенням функції шлунково-кишкового тракту.
У свиней і підсвинків, дорослого великої рогатої худоби, коней, овець і кіз лептоспіроз протікає переважно безсимптомно. У не імунних свиноматок і рідше у корів лептоспіроз супроводжується абортами в останній місяць вагітності або народженням нежиттєздатного потомства. Аборти у свиноматок в раніше благополучних господарствах можуть бути масовими.
При спалаху лептоспірозу гострий перебіг інфекції з характерними клінічними ознаками є у невеликої кількості тварин, а основна маса їх хворіють безсимптомно.
Незалежно від перебігу інфекції та виду тварини на 5-7-й день після зараження в крові тварини виявляються специфічні антитіла, а через 10-20 днів у ряду тварин розвивається лептоспіроносітельство, яке триває протягом декількох місяців і до 1-2 років.
Поголів'я лептоспіроносітелей на неблагополучній щодо лептоспірозу фермі серед великої та дрібної рогатої худоби складає 1-5%, на окремих фермах до 10-20%, серед свиней лептоспіроносітелямі можуть бути 30-80% тварин і більше.
Перебіг хвороби не залежить від серогрупповой приналежності збудника. Однак лептоспіроз у великої рогатої худоби, викликаний збудниками групи Hebdomadis, протікає частіше проявів і лише в окремих випадках супроводжується лептоспіроносітельством.
1.5. Патологоанатомічні зміни у полеглих від лептоспірозу тварин характеризуються геморагічним діатезом і жовтяничним забарвленням підшкірної клітковини, збільшенням в обсязі печінки, в'ялої її консистенцією, на розрізі глинистого кольору, збільшенням лімфатичних вузлів, соковитих на розрізі і з крововиливами. Сечовий міхур переповнений сечею часто вишнево-червоного кольору. Желтушное фарбування тканин і кривава сеча не характерні для лептоспірозу свиней.
При безсимптомному лептоспіроносітельстве видимі ураження локалізуються переважно в нирках і проявляються змінами, характерними для гострого або хронічного паренхіматозного або інтерстиціального нефриту та дистрофії (мармурова забарвлення і зміна кольору поверхні, червоні інфаркти, точкові сіро-білі некротичні вогнища, крововиливи, згладженість кордону між мозковим і кірковим шарами).
2. Діагностика лептоспірозу
2.1. Підставою для підозри на неблагополуччя господарства щодо лептоспірозу служать клінічні ознаки, патологоанатомічні зміни, виявлення специфічних антитіл у крові окремих тварин і епідемічні свідчення (захворювання лептоспірозом людей).
2.2. З метою своєчасного виявлення лептоспірозу проводять дослідження сироватки крові тварин по РМА або РА:
а) у племінних господарствах (фермах) всіх виробників і не менше 10% за РМА або 15% по РА корів, нетелей, свиноматок і кобил один раз на рік; дрібна рогата худоба і тварин інших видів досліджують тільки при підозрі на захворювання на лептоспіроз;
б) на племпідприємства (станціях, пунктах) штучного осіменіння кров усіх виробників два рази на рік;
в) у групах свиней, великої та дрібної рогатої худоби і коней - перед введенням (ввезенням) і висновком для племінних або пользовательних цілей. При цьому в групах до 25 голів досліджують всіх тварин, у групах до 100 голів - не менше 25 тварин, а у великих групах - не менше 25% тварин по РМА або 35% - по РА;
г) в усіх випадках при підозрі на лептоспіроз.
2.3. У хворих, підозрілих на захворювання і підозрюваних у зараженні тварин кожного обори, свинарника, гурту, отари і т.д. досліджують кров і сечу, а у полеглих-паренхіматозні органи. Кров беруть не менше ніж від 50 тварин. Повторне взяття крові проводять через 7-10 днів у тих же тварин.
Сечу мікроскопують безпосередньо в господарстві не менше ніж від 100 тварин. Дослідження припиняють після виявлення лептоспір в одній з проб.
На фермах з поголів'ям меншим дослідженню піддають всіх тварин.
Взяття матеріалу для дослідження і лабораторну діагностику лептоспірозу проводять згідно з «Методичними вказівками по лабораторній діагностиці лептоспірозу тварин», рекомендованими ГУВ МСХ СРСР 15 жовтня 1975
2.4. За результатами лабораторних досліджень діагноз на лептоспіроз вважають встановленим, а господарство (ферму, відділення, підприємство, станцію, пункт штучного осіменіння, свинарник, гурт і т.д.) неблагополучними щодо лептоспірозу в будь-якому з наступних випадків:
а) лептоспіри виявлені при мікроскопічному дослідженні в крові чи суспензії із органів тварин, абортованою плоді, сечі «Чи органах лабораторної тварини, полеглого після зараження досліджуваним матеріалом;
б) культура лептоспір виділена із патологічного матеріалу або із органів лабораторної тварини, зараженого досліджуваним матеріалом;
в) лептоспіри виявлені в гістологічних зрізах нирок або печінки, насичені сріблом за Левадіті;
г) встановлено наростання титру антитіл в п'ять і більше разів при повторному дослідженні через 7-10 днів сироватки крові по РМА або при виявленні антитіл у раніше нереагіровавшіх тварин;
д) специфічні антитіла виявлені в сироватці крові при одноразовому дослідженні по РМА в титрі 1: 100 і вище більш ніж у 25% обстежених тварин або за РА (1-4 хреста) більш ніж у 20% тварин, а для великої рогатої худоби, що реагує з лептоспірозом групи Hebdomadis, і коней за РМА 1: 500 і вище або за РА на 3-4 хреста в тому ж відсотку випадків.
2.5. Лептоспіроз вважають причиною загибелі тварин при наявності клінічних ознак і патологоанатомічних змін, характерних для лептоспірозу, підтверджених виявленням лептоспір в крові чи паренхіматозних органах, або наростанням титру антитіл не менш ніж у п'ять разів.
При постановці діагнозу на лептоспіроз необхідно проводити диференційну діагностику і враховувати, що тварини - лептоспіроносітелі (особливо свині) і тварини, які мають у крові специфічні антитіла, можуть гинути від різних інфекційних та неінфекційних хвороб.
2.6. Лептоспіроз вважають причиною абортів в наступних випадках:
а) при виявленні лептоспір в органах (тканинах) абортовану (мертвонародженого) плоду;
б) при наростанні титру антитіл у абортованої матки не менш ніж у п'ять разів;
в) при високому титрі антитіл (1:2500 і більше) у групі абортовані тварин і низькому титрі (до 1: 500) або негативної реакції в групі здорових тварин.
3. Охорона благополучних господарств від заносу лептоспірозу
3.1. Благополучним з лептоспірозу вважають господарство, відділення, ферму, де немає тварин, хворих на лептоспіроз, немає тварин - лептоспіроносітелей і немає тварин, у сироватці крові яких виявляють по РМА або РА специфічні антитіла.
3.2. З метою недопущення занесення в благополучні господарства лептоспірозу необхідно:
а) карантініровать протягом 30 днів всіх вступників до господарство тварин;
б) комплектувати господарства (ферми) тільки клінічно здоровими тваринами, при серологічному дослідженні сироватки крові яких отримані негативні результати; для комплектування відгодівельних господарств (відділень, ферм) дозволяється вводити клінічно здорових тварин без дослідження на лептоспіроз, але з обов'язковою вакцинацією їх проти лептоспірозу в період карантинування;
в) не допускати введення (ввезення) у племінні господарства (відділення, ферми) тварин або продуктів забою з неблагополучних господарств, незалежно від результатів серологічного дослідження;
г) виключити контакт тварин господарства з тваринами, що перебувають в особистому користуванні, бродячими собаками і т.д.;
д) заборонити спільний випас та використання загального водопою тварин благополучних і неблагополучних груп;
е) використовувати для напування тварин воду артезіанських свердловин або водопровідної мережі (якість води повинна постійно контролюватися);
ж) заборонити експлуатацію виробників, сироватка крові або сперма яких дає позитивну РМА або РА;
з) влаштовувати літні табори на піднесених сухих ділянках з гарним стоком дощових вод, без доступу тварин до води відкритих водойм (ставок, озеро, річка, струмок);
і) утримувати в належному ветеринарно-санітарному стані пасовища, водопою, тваринницькі приміщення, вигульні майданчики, загони і т.д., осушувати сирі і заболочені ділянки;
к) систематично знищувати гризунів в тваринницьких приміщеннях, на території ферми, в місцях складування грубих кормів тощо, а також дослідити відловлених тварин на лептоспіроз;
л) вести суворий облік випадків абортів, мертвонародження, клінічних ознак хвороби і падежу тварин, направляти патологічний матеріал для дослідження в лабораторію. Цей матеріал повинен бути взятий і досліджено протягом 6 годин в літній час і 10-12 годин в зимовий час або за умови зберігання його в охолодженому стані;
м) не допускати участі у виставках собак, невакцинованих проти лептоспірозу;
н) не згодовувати хутровим звірам і собакам сирі продукти забою хворих на лептоспіроз тварин і тварин - лептоспіроносітелей;
о) виявляти природні вогнища лептоспірозу і не випасати на їх території невакцинованих тварин.
4. Специфічна профілактика, лікування та дезінфекція при лептоспірозі
4.1. Для специфічної профілактики лептоспірозу застосовують поливалентную фенольних вакцину, яка виготовляється в двох варіантах. Перший варіант вакцини включає лептоспіри: Помона, Тарассові, Гріппотіфоза, Іктерогеморрагія і Канікола, другий варіант - лептоспіри Помона, Тарассові, Гріппотіфоза і Гебдомонадіс. Застосовують вакцину з урахуванням етіологічної структури лептоспірозу.
4.2. Вакцинують проти лептоспірозу всіх сприйнятливих тварин у наступних випадках:
а) у неблагополучних по лептоспірозу господарствах;
б) у відгодівельних господарствах, де поголів'я комплектують без обстеження «а лептоспіроз;
в) у загрозливих господарствах;
г) при випасанні тварин у зоні природного вогнища лептоспірозу;
д) при виявленні в господарстві тварин, сироватка крові яких реагує на лептоспіроз за РМА або РА;
е) у районах з відгінним тваринництвом. Вакцинація профілактує переболевание, аборти, виключає перезараження тварин і формування інтенсивного вогнища лептоспірозу.
4.3. Вакцинацію проводять відповідно до Настановою із застосування поливалентной феноловий вакцини проти лептоспірозу сільськогосподарських і промислових тварин, затвердженим ГУВ МСХ СРСР 22 липня 1974 Вакцину вводять дворазово.
Тривалість імунітету у поросят і ягнят, вакцинованих у місячному віці, не перевищує трьох місяців, а у телят, вакцинованих у 14/2-2-месячном віці, 4-6-місячних підсвинків, дорослих свиней і овець - • шести місяців, у великої рогатої худоби, вакцинованого у віці від року і старше, - 12 місяців. Після закінчення зазначених строків тварин ревакцинируют.
Тривалість колострального імунітету становить у поросят і ягнят, отриманих від матерів, вакцинованих за 35-75 днів до опоросу (окоту), - 1 -11 / 2 місяці, а у телят, отриманих від корів, вакцинованих за 1! / 2-6 місяців до отелення, - 14/2-2 * / 2 місяці.
Телят, одержаних від імунних до лептоспірозу матерів, прищеплюють у віці l '/ г-2 місяці, а ягнят і поросят-у віці 1 -1 * / 2 місяці.
Для профілактики абортів лептоспирозной етіології свиноматок необхідно вакцинувати за 1-2 місяці
до покриття або в перший місяць після покриття, а велика рогата худоба - в перші 1-3 місяці тільності.
При спалаху лептоспірозу молодняк, отриманий від невакцинованих або вакцинованих в останній місяць вагітності маток, обробляють у 1-3-денному віці гіпврім1мунной сироваткою проти лептоспірозу в лікувальній дозі і вакцинують у місячному віці.
4.4. Для лікування хворих тварин використовують гипериммунную сироватку і стрептоміцин.
Сироватка містить специфічні антитіла до лептоспір шести серогрупп: Помона, Тарассові, Гебдомонадіс, Гріппотіфоза, Іктерогеморрагія і Канікола.
Тварини, піддані лікуванню сироваткою при гострому перебігу лептоспірозу, одужують, але залишаються лептоспіроносітелямі. Сироватка не профілактує аборти.
Сироватка є гарним диференційно-діагностичним засобом. Відсутність лікувального ефекту після її введення свідчить про нелептоспірозной етіології хвороби.
Застосовують сироватку в дозах, зазначених в Повчанні з її застосування або на етикетці флакона з сироваткою.
Стрептоміцин використовують для лікування тварин при клінічно вираженому перебігу лептоспірозу і для лікування тварин - лептоспіроносітелей. Його вводять через кожні 12 годин протягом 4-5 днів по 10-12 тисяч одиниць на кілограм маси (ваги) тварини.
Стрептоміцінотерапію груп тварин, в яких виявлені лептоспіроносітелі, починають через 7-10 днів після введення другої дози вакцини.
Перед зняттям обмежень проводять механічну очистку та заключну дезінфекцію.
При обробці стрептоміцином груп тварин, серед яких виявлені лептоспіроносітелі, дезінфекцію проводять після другої ін'єкції антибіотика.
Знезараженню піддаються верстати (стійла) ', вигульні майданчики та інші місця утримання тварин, які могли бути інфіковані сечею лептоспіроносітелей.
4.6. Лептоспіри швидко гинуть при дії різних дезінфікуючих речовин. Для дезінфекції при лептоспірозі застосовують освітлений розчин хлорного вапна з 2%-яим вмістом активного хлору, 2%-ний гарячий розчин їдкого натру, 3%-ний гарячий розчин сернокарболовой суміші, 5%-ную емульсію дезінфекційного (фенольного) креоліну, 5% - ную емульсію нафталіну, 2%-ний розчин формальдегіду та інші речовини, використовувані для дезінфекції тваринницьких приміщень та об'єктів зовнішнього середовища, інфікованих патогенними неспоровимі мікробами.
5. Заходи з оздоровлення неблагополучних господарств
Спільні заходи
5.1. При виявленні в господарстві (на фермі, у відділенні, стаді, свинарнику і т.д.) хворих на лептоспіроз тварин або тварин - лептоспіроносітелей ветеринарний фахівець, обслуговуючий господарство, негайно повідомляє про це керівника господарства, головному ветеринарному лікарю району та районної санітарно-епідеміологічної станції ; одночасно з'ясовує джерело заносу збудника інфекції в господарство та організовує 'заходи з ліквідації інфекції.
5.2. Господарство (ферма, відділення, гурт, індивідуальний двір і т.д.), у якому діагностовано лептоспіроз, в установленому порядку оголошують неблагополучним.
Головний ветеринарний лікар району бере такі господарства на облік, розробляє разом з їхніми керівниками й фахівцями план оздоровчих заходів та здійснює контроль за їх виконанням.
5.3. План оздоровчих заходів щодо лептоспі-троянду погоджують із санітарно-епідеміологічною станцією, районної чи обласної ветеринарної лабораторії та вносять на затвердження до виконкому районної (міської) Ради депутатів трудящих. У плані передбачають необхідні діагностичні дослідження тварин, відповідні ветеринарно-санітарні та організаційно-господарські заходи, передбачені цією інструкцією, із зазначенням термінів їх проведення та відповідальних осіб.
5.4. У господарстві, неблагополучному щодо лептоспірозу, вводять обмеження, на підставі яких забороняється:
а) виводити (вивозити) тварин для племінних і користувальних цілей;
б) продавати молодняк робітникам і службовцям в особисте користування;
в) вводити (ввозити) невакцинованих проти лептоспірозу тварин;
г) перегруповувати тварин без відома ветеринарного спеціаліста;
д) продавати продукти забою вимушено убитих тварин. Їх використовують згідно «Правил ветеринарного огляду забійних тварин і ветеринарно-санітарної експертизи м'яса і м'ясних продуктів»;
е) використовувати воду відкритих водойм для напування тварин;
ж) водити здорових тварин у приміщення, в яких раніше містилися хворі тварини, до проведення очищення, санітарного ремонту, дезінфекції та дератизації;
з) містити здорових невакцинованих тварин на пасовищних ділянках, на яких випасалися хворі лептоспірозом тварини (сухі ділянки пасовища в сонячну погоду дозволяється використовувати через 7 днів; на вологих і заболочених ділянках, інфікованих лептоспірозом, випасають тільки вакцинованих тварин);
і) допускати на неблагополучну ферму сприйнятливих до лептоспірозу тварин інших видів.
5.5. Тваринницькі приміщення і територію навколо них містять у належному санітарному стані і покращують умови утримання і догляду за тваринами; знешкодження стічних вод, поточну і заключну дезінфекцію приміщень, загонів, вигульних майданчиків, обладнання, інвентарю та інших об'єктів, а також дератизацію проводять відповідно до « Інструкції з проведення ветеринарної дезінфекції, дезінвазії, дезінсекції та дератизації ».
5.6. У неблагополучних по лептоспірозу господарствах тварин запліднюють штучно спермою від здорових виробників.
5.7. Молоко, отримане від хворих на лептоспіроз тварин, нагрівають до кипіння і використовують для годування худоби. Молоко клінічно здорових корів (кобил), сироватка крові яких дає позитивну РМА або РА без наростання титру, використовують без обмежень.
5.8. Грубі корми, у яких виявлені заражені лептоспірозом гризуни, згодовують тільки вакцинованих проти лептоспірозу тварин.
5.9. Тварин, хворих або підозрілих на захворювання лептоспірозом, вбивають на санітарній бойні, а при її відсутності - у забійному цеху м'ясокомбінату в кінці зміни, після видалення продуктів забою здорових тварин, з дотриманням заходів особистої профілактики. Приміщення та обладнання після забою таких тварин дезинфікують. Продукти забою використовують згідно з «Правилами ветеринарного огляду забійних тварин і ветеринарно-санітарної експертизи м'яса і м'ясних продуктів».
Спеціальні заходи
5.10. У неблагополучному щодо лептоспірозу господарстві (фермі, відділенні, стаді, свинарнику і т.д.) проводять клінічний огляд всіх тварин та вимірювання температури у підозрілих щодо захворювання тварин.
Хворих та підозрілих на захворювання тварин ізолюють, уточнюють діагноз і лікують (див. пункт 4.4.), Клінічно здорових. вакцинують, як зазначено в пункті 4.3.
5.11. У відгодівельних комплексах і репродукторних господарствах, поголів'я яких не має племінної цінності, хворих і підозрілих на захворювання тварин після лікування і одужання також вакцинують і переводять у загальне стадо. Усіх тварин відгодовують і здають на забій. У ветеринарному свідоцтві вказують, що поголів'я здорово, але вийшло з неблагополучного по лептоспірозу господарства.
Обмеження знімають після здачі на забій всіх тварин неблагополучного господарства (ферми, відділення, свинарника, обори і т.д.), проведення ретельного очищення, санітарного ремонту та заключної дезінфекції.
5.12. У племінних і користувальних господарствах хворих і підозрілих на захворювання тварин ізолюють, лікують і здають на забій.
У решти тварин беруть кров для дослідження з РМА або РА і, не чекаючи результатів дослідження, вакцинують їх, як зазначено в пункті 4.3.
а. Тварин, сироватка крові яких містить специфічні лептоспірозного антитіла, крім групи Hebdomadis, ізолюють відгодовують і здають на забій. Отриманий від цих тварин молодняк використовувати на племінні цілі забороняється.
б. У господарствах (відділеннях, фермах, гуртах), де сироватка крові великої рогатої худоби реагує з лептоспірозом тільки групи Hebdomadis, але немає клінічно хворих на лептоспіроз тварин і не виявлені лептоспіраносітеЛ'І, все поголів'я прищеплюють проти лептоспірозу вакциною другого варіанту.
Висновок тварин з таких господарств для цілей відгодівлі не обмежують.
Для племінних і користувальних цілей виводять тварин, сироватка крові яких не має специфічних антитіл або всіх клінічно здорових тварин незалежно від наявності антитіл після попередньої обробки стрептоміцином, як зазначено в пункті 4.4.
в. Молодняк, що народився в господарстві до проведення протіволептоспірозних заходів або протягом місяця після їх проведення, вважають підозрюваним у зараженні лептоспірозом. Його вакцинують, як зазначено в пункті 4,3., І не використовують для племінних цілей.
Молодняк, що народився в більш пізні терміни від імунних до лептоспірозу матерів, вакцинують, містять після відлучення ізольовано від інших вікових груп тварин і після зняття обмежень реалізують для племінних цілей.
р. Висновок тварин для відгодівлі дозволяється в межах даної області (краю, республіки) через місяць після останнього випадку одужання хворої тварини та проведення заключних ветеринарно-санітарних заходів.
Висновок тварин для племінних і користувальних цілей дозволяється після зняття обмежень.
д. Обмеження знімають у племінних і користувальних господарствах після встановлення їх благополуччя з лептоспірозу лабораторними методами дослідження. Для цієї мети через два місяці після завершення протіволептоспірозних заходів беруть кров у ремонтного молодняку, як зазначено в пункті 2.2.в., і досліджують по РМА або РА. У кнурів, ремонтних і основних свиноматок і великої рогатої худоби різних вікових груп, крім того, беруть по 100 проб сечі від кожної тисячі тварин, але не менше ніж від 100 тварин на фермі.
Господарство вважають благополучним при отриманні негативних результатів досліджень у всіх обстежених тварин.
У разі виявлення тварин - лептоспіроносітелей господарство (ферму, відділення, стадо, свинарник і т.д.) продовжують вважати неблагополучним щодо лептоспірозу. При виявленні позитивних реакцій тільки в окремих тварин проводять додаткові дослідження, як зазначено в пункті 2.3.
е. Повторні дослідження тварин на лептоспіроз в раніше неблагополучних племінних господарствах проводять через 6 місяців після зняття обмежень, виконують при цьому обсяг досліджень, зазначений у пункті 5.12.д.
5.13. На неблагополучних з лептоспірозу підприємствах (станціях, пунктах) штучного осіменіння виробників, у яких при черговому плановому обстеженні виявлено специфічні антитіла, ізолюють і припиняють отримання від них сперми. Малоцінних виробників з числа позитивно реагують вибраковують. Проводять 3-кратну мікроскопію сечі всіх виробників з інтервалом в 1-2 дні і повторно досліджують кров через 7-10 днів після першого дослідження.
а. На підприємствах (станціях, пунктах), де всі тварини клінічно здорові, не виявлені лептоспіроносітелі і не встановлено 'наростання титру антитіл, все поголів'я вакцинують, як зазначено в пункті 4.3. У виробників, які не мають специфічних лептоспірозного антитіл, продовжують отримання сперми. Усіх виробників обробляють стрептоміцином, як зазначено в пункті 4.4., І контролюють на лептоспіроносітельство шляхом 3-кратної мікроскопії сечі. При негативних результатах дослідження підприємство продовжують вважати благополучним щодо лептоспірозу.
6. На підприємствах (станціях, пунктах), неблагополучних по лептоспірозу (дивись пункт 2.4), припиняють отримання сперми, знищують запаси (залишки) сперми, отриманої від клінічно хворих виробників і лептоспіроносітелей. Хворих та підозрілих на захворювання виробників (були або є ознаки хвороби, лептоспіри в сечі, позитивна РМА або РА) ізолюють. Клінічно здорових тварин, у яких не виявлено специфічні антитіла, вакцинують і обробляють стрептоміцином відповідно до пунктів 4.3 та 4.4. Через п'ять днів після закінчення обробки тварин стрептоміцином від них дозволяється отримувати сперму.
Виробників, у яких встановлено лептоспіроносітельство, і низькопродуктивних тварин з числа позитивно реагують по РМА або РА, вибраковують.
Високопродуктивних виробників, сироватка яких реагує позитивно по РМА або РА, містять ізольовано протягом 3 місяців. За цей термін у них після вакцинації та обробки стрептоміцином досліджують через кожні 5-10 днів сечу шляхом мікроскопії на наявність лептоспір і, крім того, через два місяці після обробки сечу і сперму біопроб а дорослих кроликах. При негативних результатах досліджень від таких виробників дозволяють отримувати сперму.
Підприємство (станцію, пункт) оголошують благополучним щодо лептоспірозу через 3 місяці після останнього випадку одужання 'хворої тварини або лептоспіроносітеля при отриманні в наступні терміни негативних результатів дослідження на лептоспіроз в кожного виробника.
в. Повторне серологічне дослідження крові і сечі мікроскопію всіх виробників на раніше неблагополучних з лептоспірозу підприємствах проводять через 3 місяці і при одержанні негативних результатів - у строки, зазначені в пункті 2.2.6.
р. На підприємствах (станціях, пунктах) штучного осіменіння, розташованих у неблагополучній або загрозливій з лептоспірозу зоні, всіх виробників вакцинують проти лептоспірозу.
6. Порядок ветеринарної обробки племінних і користувальних тварин, виведених з господарств
6.1. Висновок тварин (свині, велика і дрібна рогата худоба, коні), відібраних для продажу чи переведення в інші господарства для племінних або користувачів цілей, дозволяється тільки з благополучних щодо лептоспірозу господарств (ферм, відділень і т.д.).
6.2. Для племінних і користувальних цілей продають тварин, сироватка крові яких не дає позитивної реакції. Обстеження тварин проводять перед виведенням шляхом одноразового дослідження у них сироватки крові по РМА або РА в 'кількості, зазначеній у пункті 2.2.в.
6.3. Висновок тварин дозволяється без обмежень при негативних результатах досліджень по всій групі.
При виявленні хоча б однієї тварини, сироватка крові якого позитивно реагує по РМА або РА, всю групу затримують в карантині і вирішують питання про благополуччя господарства по лептоспірозу, для чого проводять дослідження, як зазначено в пункті 2.3. Якщо господарство благополучно з лептоспірозу, то всю групу, в якій виявлені позитивно реагують тварини, обробляють стрептоміцином (пункт 4.4). Тварин, що не мають специфічних антитіл до лепту-спірит, виводять без додаткових досліджень, а позитивно реагують залишають у господарстві для додаткових досліджень або відгодівлі з подальшим забоєм.
Велика рогата худоба, реагує з лептоспірозом групи Hebdomadis, обробляють стрептоміцином і виводять без обмежень. У разі визнання господарства неблагополучним щодо лептоспірозу керуються при виведенні тварин пунктами 5.12.6., 5.12.в., 5.12.г.
7. Охорона людей від зараження лептоспірозом
7.1. Керівники господарства зобов'язані:
а) забезпечити всіх працівників тваринництва спецодягом і спецвзуттям, включаючи гумові чоботи, халати, прогумований фартух, нарукавники, рукавички, косинку чи чепчик;
б) забезпечити інструктаж обслуговуючого персоналу про заходи особистої гігієни і промсанітарії при лептоспірозі;
в) мати в кожному тваринницькому приміщенні (оборі, свинарнику, кошарі і т.д.) умивальник, мило, рушник, аптечку першої допомоги, ємності з дезратвором (пункт 4.6), а також приміщення, обладнані для зберігання спецодягу і спецвзуття;
г) мати в господарстві санітарний журнал для запису вказівок «пропозицій фахівців ветеринарно-санітарного нагляду та органів охорони здоров'я, забезпечити виконання зроблених вказівок і пропозицій;
д) при появі захворювання лептоспірозом серед тварин негайно вжити заходів щодо попередження зараження людей та надання допомоги по виявленню джерел збудника інфекції.
7.2. Особи, які обслуговують тварин в неблагополучних по лептоспірозу господарствах, повинні виконувати правила особистої профілактики і бути вакцинованими проти лептоспірозу.
Методичні вказівки з лабораторної діагностики лептоспірозу
Діагноз на лептоспіроз встановлюють бактеріологічними, серологічним і гістологічним методами дослідження з урахуванням епізоотологічних, клінічних та патологоанатомічних даних і проведенням диференціальної діагностики.
1. Бактеріологічна діагностика лептоспірозу
Бактеріологічна діагностика заснована на виявленні лептоспір в досліджуваному матеріалі шляхом мікроскопії або виділення культури і складається з наступних етапів:
- Взяття патологічного матеріалу;
- Мікроскопія в темному полі мікроскопа;
- Виділення культур лептоспір посівом у спеціальні середовища або біологічної пробою на лабораторних тварин;
- Ідентифікація і диференціація виділених культур.
1.1. Порядок взяття матеріалу для лабораторного аналізу
1.1.1. Матеріалом для прижиттєвої діагностики служать кров і сеча, для посмертної - трупи дрібних тварин. Від трупів ірупних тварин беруть серце, шматочки паренхіматозних органів, нирку, транссудат з грудної та черевної порожнин, перикардіальну рідина, сечовий міхур з вмістом, спинномозкову рідину.
Абортований плід доставляють в лабораторію цілком або беруть шлунок з вмістом і паренхіматозні органи плоду.
1.1.2. Сечу збирають при природному сечовипусканні в чисті пробірки, закріплені на дроті, або до банків, чашки Петрі, гуртки і т.д. Легше всього брати проби після ранкового підйому тварин, а у свиней в будь-який час дня після 1-2-годинного лежання. У корів і свиноматок сечу можна брати катетером.
1.1.3. Кров у кількості 3-5 мл беруть для бактеріологічного дослідження в період лихоманки на 1-7-й день хвороби, для серологічного дослідження - 5-10 мл і не раніше ніж через 5-7 днів після прояву клінічних ознак хвороби або через 60 днів після введення вакцини.
1.1.4. Нирку витягають в нерозкритій капсулі. Серце, сечовий міхур і шлунок плоду беруть із вмістом, для чого накладають лігатури на відповідні судини і сфінктери. Кожен орган або шматочок органу загортають окремо в пергамент.
1.1.5. Ліквор, транссудат, спинномозкову рідину та інші рідкі субстрати насмоктують стерильним шприцом або піпеткою в стерильні пробірки.
1.1.6. Воду з вододжерела для виявлення лептоспір беруть в обсязі 1,5-2 л у стерильні колби з ватно-марлевими пробками.
1.1.7. Узятий матеріал поміщають в ящик, опечатують і направляють у лабораторію з нарочним.
1.1.8. Патологічний матеріал повинен бути взятий і досліджено протягом 6 годин в літній час і 10-12 годин - за умови зберігання його в охолодженому стані.
1.1.9. Мікроскопія сечі повинна бути закінчена при температурі 30-40 ° С протягом 3 годин, 25-30 ° С - 4 - 5 годин, 20-25 ° С - 6-8 годин, 16-20 ° С - до 10-12 годин з моменту взяття.
Ймовірність виявлення лептоспір в досліджуваному матеріалі в більш пізні терміни не виключена, але значно знижується.
1.1.10. Ветеринарний спеціаліст, направляючи матеріал у лабораторію для дослідження на лептоспіроз, повинен розраховувати, щоб взяття матеріалу, доставка в лабораторію і проведення дослідження вкладалися в терміни виживання лептоспір в патологічному матеріалі, в іншому випадку відповідь буде свідомо негативним.
У супровідній до патологічного матеріалу повинно бути вказано час загибелі тварини або час взяття проби за життя.
1.2. Мікроскопічне дослідження
1.2.1. Для мікроскопічного дослідження на лептоспіроз необхідні:
- Біологічний мікроскоп (МБІ-3, МБІ-1, МБИ-11 і ін);
- Конденсор темного поля (ОІ-7, ОЙ-13 і ін);
- Освітлювач (ОІ-19, ОІ-21 та ін) з точковою лампою;
- Предметні скла товщиною не більше 0,8-1,1 мм;
- Покривні скла стандартні.
Скла, що використовуються для мікроскопії, повинні бути безбарвними, прозорими, чистими, без подряпин і відблисків.
1.2.2. Порядок мікроскопії в темному полі наступний. Освітлювач з'єднують з мікроскопом сполучної планкою. Пересуваючи лампочку освітлювача, фокусують світло на центрі плоского дзеркала мікроскопа. При цьому чітко повинні бути видні завитки спіралі. Верхню лінзу конденсора встановлюють на рівні предметного столика. Центрують конденсор за допомогою регулювальних гвинтів по оптичної осі мікроскопа. На верхній лінзі конденсора при правильній установці видно рівномірно освітлене коло.
Препарат для мікроскопічних досліджень готують за принципом роздавленої краплі. Невеликий обсяг досліджуваного матеріалу наносять піпеткою або бактеріологічною петлею на предметне скло і накривають покривним склом, уникаючи утворення пухирців повітря. На одному предметному склі готують три роздавлені краплі.
На верхню лінзу конденсора наносять краплю дистильованої води і встановлюють препарат для мікроскопії. Простір між лінзою конденсора і предметним склом повинен бути заповнений тонким шаром води, без бульбашок повітря, що зменшує розсіювання світлових променів. Фокус конденсора повинен знаходитися в площині препарату. Конденсор при цьому зазвичай впритул прилягає до скла. Іноді в залежності від товщини препарату його доводиться опускати на 0,5-1 мм.
Мікроскопують досліджуваний матеріал при збільшенні 40X7-10 і 20X1, 5X7, а для більш детального розгляду препарату-при збільшенні 40ХЮ-15 або 40X1, 5X10.
1.3. Характеристика лептоспір
1.3.1. Лептоспіри при розгляді в темному полі мікроскопа представляють собою спіралеподібні тонкі сріблясті нитки, - кінці яких, обидва або один, загнуті і булавовидний потовщені. Зустрічаються і бескрючковие форми лептоспір. Лептоспіри рухливі. У рідких середовищах звичайними формами руху є: обертальний, прямолінійне поступальний з одночасним обертанням навколо власної осі і кругові. Одна і та ж особина може здійснювати і обертальні і поступальні рухи.
1.3.2. Морфологія і характер руху настільки типові, що дозволяють безпомилково розпізнавати лептоспір в патологічному матеріалі. Крім того, лептоспіри при мікроскопії на відміну від інших мікроорганізмів ніколи не бувають блискучими.
1.3.3. Можливість безпомилкової диференціації лептоспір від мікроорганізмів інших видів за морфологічними ознаками дає право при лептоспірозі встановлювати діагноз тільки на підставі мікроскопічних досліджень, без подальшого виділення чистих культур та їх ідентифікації.
1.4. Мікроскопія сечі
1.4.1. Сечу мікроскопують в нативному вигляді або після центрифугування. Прозору сечу, що не містить кристалів солей, пластівців, сперміїв та інших сторонніх часток, центрифугують при 10-15 тис. об / хв протягом 30 хвилин, зливають надосадову рідину, осад ресуспензіруют в рештою краплі сечі і мікроскопіруют.
Сечу, що містить значну кількість сторонніх часток, очищають центрифугуванням при 3 тис. об / хв протягом 10 хвилин, потім зливають надосадову рідину і центрифугують її для осадження лептоспір при 10-15 тис. об / хв протягом 30 хвилин.
При масовому дослідженні тварин у господарстві готують по одній, а при наявності небагатьох тварин - не менше трьох розчавлених крапель з кожної проби сечі. Переглядають 50 і більше полів зору в кожній краплині.
1.4.2. Лептоспір з активною рухливістю виявляють приблизно у 50% позитивних проб, в решті випадків вони нерухомі і досить часто мають змінену морфологію. Кількість їх також буває різним. У сечі приблизно у 30% тварин - лептоспіроносітелей містяться по 1-2, рідше по 5-7 і дуже рідко по 10-15 лептоспір у кожному полі зору, в 30 - 35% 'випадків вдається виявити 1-2 лептоспіри в 5 -' 10 полях. В інших випадках виявляють 1-2 лептоспіри в 20-50 і більше полях зору.
У кислій сечі з рН 5,0-6,0 лептоспіри швидко втрачають рухливість і гинуть. Деякі мертві клітини зберігають форму, типову для лептоспір, але у них по довжині тіла буває видно зернистість, досить часто кінцеві гачки розпрямлені.
1.5. Мікроскопія крові
1.5.1. Кров, узяту від хворого або підозрюваного в захворюванні тварини, змішують з подвійною кількістю 1,5%-ного розчину лимоннокислого натрію, центрифугують при 2-3 тис. об / хв протягом 5 хвилин або відстоюють протягом години, мікроскопують прозорий надосадової шар рідини . Доцільно осадження лептоспір з надосадової рідини проводити центрифугуванням при 10-15 тис. об / хв протягом 30 хвилин.
1.6. Мікроскопія суспензії з тканини органів
1.6.1. При безсимптомному перебігу лептоспірозу суспензію готують з шматочків коркового шару нирки, а при гострому перебігу - з нирки та печінки. У абортовану плоду мікроскопують 'Суспензію з усіх органів.
1.6.2. Шматочки досліджуваного органу вагою 2-3 р. розтирають у ступці з 5-7 мл живильного середовища, фізіологічного розчину або стерильної води до отримання гомогенної суспензії. Суспензію відстоюють в холодильнику 1-2 години або центрифугують при 3 тис. об / хв протягом 10 хвилин і мікроскопують надосадову рідину.
1.6.3. Транссудат з грудної та черевної порожнин, навколосерцеву рідина, вміст шлунка плоду та інші рідкі субстрати мікроскопують за тією ж методикою, що і сечу.
1.6.4. З проб крові і суспензії кожного органу готують не менше трьох розчавлених крапель і проглядають в кожній з них не менше 50 полів зору
1.7. Диференціальна діагностика
1.7.1. При мікроскопічної діагностики лептоспіри необхідно диференціювати від ниток фібрину, уламків хвостових частин сперміїв, зруйнованих еритроцитів, спіралло-і вібріоподобних мікроорганізмів, Інтерспіро у кнурів та інших мікроорганізмів.
1.7.2. Спермії постійно містяться в сечі биків і кнурів і часто у великій кількості. Уламки їх хвостових частин не мають кінцевих гачків, нерухомі і внаслідок заломлення світла здаються блискучими.
1.7.3. Нитки фібрину постійно виявляють у крові, транссудате і іноді у «сечі. Вони не заломлюють світло, але не мають кінцевих гачків і не мають рухливість.
1.7.4. Вміст еритроцитів може видавлюватися через пори мембрани у вигляді тонких ниток. Такий еритроцит дуже нагадує «павучок» з аглютинованими лептоспір. Вільний кінець кожної нитки під дією струму рідини безперервно звивається і коливається. Частина ниток відривається від еритроцитів і дуже нагадує за формою і розмірами лептоспір, але на відміну від останніх вони тонше, не мають гачків і не здатні самостійно рухатися.
1.7.5. Спірил-і вібріоподобние мікроорганізми виявляють у 10-15% випадків в сечі свиней і великої рогатої худоби і постійно - в крові, спинномозкової рідини, суспензії з органів, а також у тканинах і рідинах абортованих плодів. Ці мікроорганізми відрізняються від лептоспір змієподібний рухом і відсутністю кінцевих гачків.
1.7.6. Інтерспіро мешкають в препуциального мішку свиней. У сечі, взятої при природному сечовипусканні, їх виявляють повсюдно в 50-80% випадків. У сечі, взятої з сечового міхура, вони не містяться. Інтерспіро рухливі. Обидва або один кінець мікробної клітини переміщається судорожними, маятникоподібними з широкою амплітудою рухами. Після декількох коливальних рухів клітина деякий час залишається нерухомою, а потім знову можна спостерігати кілька чергових рухів. Рухливість зберігається не більше 1-2 годин з моменту отримання сечі. Нерухома Інтерспіро має, так само як і лептоспіра, один або два гачки і не заломлює світло, але на відміну від лептоспір у шиї видно первинні завитки і тіло клітини запам'ятовує нитка, що складається з намистин. Кінці гачків загострені.
1.7.7. Інші мікроорганізми диференціюють від лептоспір за формою і характером руху, і всі вони, крім того, заломлюють світло і здаються блискучими.
1.8. Виділення культур лептоспір
1.8.1. Виділення лептоспір з крові за життя можливо у перші 5-7 днів хвороби в період лихоманки. Для цієї мети кров з яремної або вушної вени вносять через стерильну голку по 3-5 крапель у 5-7 пробірок з живильним середовищем або висівають з проби крові, надісланої до лабораторії (додатки 2 і 3).
1.8.2. Від трупа при діагностичному забої висівають пастерівською піпеткою кров із серця, тканини печінки і нирки, а від абортовану плоду, крім того, і з вмісту шлунка. При забої клінічно здорових тварин висіви роблять з нирки і сечового міхура. З кожного органу засівають 3-5 пробірок з живильним середовищем.
1.8.3. Для виділення культур з нирки її звільняють від капсули, поверхню припікають шпателем або палаючим спиртовим тампоном, піпетку вводять паралельно поверхні в корковий шар. Висів роблять у великої рогатої худоби з 2-3 часткою нирки, у свиней-з декількох ділянок нирки.
1.8.4. Висіви з інших органів роблять за загальноприйнятою методикою.
Сечу, ліквор, навколосерцевої, черевної транссудат та інші рідкі біосубстратах засівають по 1-3 краплі в 3-5 пробірок з живильним середовищем.
1.8.5. Посіви культивують при температурі 28 - 30 ° протягом трьох місяців. Лептоспіри, розмножуючись у живильному середовищі, не змінюють її зовнішнього вигляду. Тому для виявлення росту лептоспір через 3, 5, 7, 10 і далі кожні 5 днів культивування з усіх пробірок мікроскопують краплі, які наносять на предметне скло бактеріологічною петлею. Більшість культур виростає через 7-20 днів. Іноді лептоспіри виявляють в середовищі на 3-5-й день, через 1-2 місяці і дуже рідко через 2-3 місяці культивування.
Вміст Кожній пробірки, в якій виявлені лептоспіри, пересівають в 3-5 пробірок зі свіжої живильним середовищем. Пробірки з рясним зростанням сторонньої мікрофлори знищують.
1.9. Порядок збереження культур
1.9.1. Пересівання культур лептоспір виробляють пастерівських піпетками. У пробірку з 5-10 мл живильного середовища вносять 0,5-1,0 мл культури. Максимальне накопичення лептоспір спостерігається через 4-7 днів культивування при температурі 28-30 °.
1.9.2. Зростання і чистоту культури лептоспір у рідких поживних середовищах контролюють мікроскопічно у темному полі мікроскопа і макроскопічно - переглядом пробірок з культурами в промені світла від освітлювача. При цьому після струшування у живильному середовищі чітко проглядаються муарові хвилі, утворювані виросла культурою.
Культуру лептоспір пересівають через кожні 10-15 днів не менше ніж в 3-4 пробірки.
1.9.3. Штами лептоопір, постійно підтримувані б лабораторії, можна зберігати в пробірках під вазеліновим маслом, в запаяних ампулах, в морозильній камері при -70-80 ° С або при температурі рідкого азоту (-190 ° С). Лептоспіри консервують будь-яким з цих методів після вирощування в сироваткової середовищі до максимального накопичення.
У пробірку на культуру нашаровують 1 - 1,5 мл стерильного вазелінового масла або культуру розфасовують у стерильні 1-5 мл ампули з нейтрального скла і запаюють.
Зберігають пробірки і ампули в темному місці при кімнатній температурі. У таких умовах лептоспіри можна зберігати без пересівань протягом трьох місяців.
1.9.4. Для зберігання в замороженому стані культури розфасовують в ампули, запаюють, охолоджують до 0-4 ° С і поміщають в судини Дьюара, заповнені азотом, або морозильну камеру.
У рідкому азоті лептоспіри можна зберігати без пересівань протягом року, при цьому вони помітно не змінюють своїх біологічних властивостей.
1.10. Очищення забруднених культур лептоспір
1.10.1. Культури лептоспір, забруднені мікрофлорою, очищають біологічним методом, фільтрацією через бактерійні фільтри або пересівом на щільні живильні середовища.
1.10.2. Для очищення біологічним методом забруднену культуру вводять внутрішньочеревно морським свинкам в дозі 1-2 мл, кроленята - 1-2 мл, хом'якові або миші - 0,5 мл. Через 30-60 хвилин кров із серця зараженої тварини висівають у пробірки з живильним середовищем.
1.10.3. Лептоспіри проходять через азбестові фільтрувальні пластини марки СФ і свічки Шімберляна Л-5. Для очищення методом фільтрації забруднену культуру фільтрують через простерилізовані фільтр. Фільтрат розсіюють у 5-10 пробірок з живильним середовищем. У висіву з фільтрату отримують чисту культуру лептоспір.
1.11. Постановка біологічної проби
1.11.1. Сприйнятливі до лептоспірозу при експериментальному зараженні золотисті хом'яки, кроленята, морські свинки, крапчасті ховрахи, щенята собак, кошенята, білі і сірі миші.
Для повсякденної практичної роботи використовують золотистих хом'яків 20-30-денного віку і кроленят-сосунов у віці 10-20 днів.
Молоді свинки (3-5-тижневого віку) вагою 150-200 г. найбільш чутливі до L. icterohaemorrhagiae, у меншій мірі - до L. pomona і мало чутливі до лептоспір інших серологічних груп.
1.11.2. Лабораторних тварин заражають для виділення культур лептоспір з патологічного матеріалу та об'єктів зовнішнього середовища, очищення культур лептоспір від сторонньої мікрофлори, визначення вірулентності виділених культур і диференціації від сапрофітів.
1.11.3. Для виділення культур лептоспір тварин заражають кров'ю, сечею, суспензією з паренхіматозних органів тварин (абортовану плоду) або спермою.
Досліджуваний матеріал вводять підшкірно або внутрішньочеревно хом'якам від 0,3-0,5 до 1 мл, крольчатам - 2-3 мл.
1.11.4. На кожну пробу досліджуваного матеріалу необхідно брати по два звірка: одного з них убивають на 4-5-й, іншого, якщо він не гине, на 14-16-й день після зараження. Кров звірка, вбитого на 14-16-й день після зараження, досліджують з реакції мікроаглютинації, починаючи з розведення 1:10 з лептоспіра-ми 13 серологічних груп. Позитивна РМА свідчить про наявність лептоспйр в досліджуваному матеріалі.
1.11.5. Висіви від убитих і полеглих звірів роблять з серця, печінки і нирки в 2-3 пробірки з кожного органу. Другу нирку, шматочки печінки, транссудат з грудної та черевної порожнин, навколосерцеву рідину і вміст сечового міхура мікроскопіруют.
1.11.6. Культури лептоспір частіше вдається виділити з органів звірка в період прояву клінічних ознак хвороби, що виявляються відмовою від корму, млявістю, тремтінням, скуйовджене вовни, кон'юнктивітом, желтушностью видимих слизових оболонок і т.д.
1.11.7. У кроленят і морських свинок проводять після зараження термометрію. У кроленят нормальною температурою вважається 38,5-39,5 ° С, у свинок - 38-39,5 ° С. У період лихоманки кров беруть з вуха або серця шприцом для мікроскопії та посіву.
1.11.8. Патогенність і вірулентність виділених культур лептоспір перевіряють на золотистих хом'яках або кроленят. Патогенні лептоспіри здатні розмножуватися в організмі тварини, викликати клінічні прояви хвороби, характерні патологоанатомічні зміни і загибель тварини. Лептоспіри-сапрофіти такими властивостями не володіють. Зараження тварин проводять внутрішньочеревно 5-7-денний культурою, що містить 70-100 лептоспір у полі зору мікроскопа. Культури лептоспір, що вбивають золотистих хом'яків на 5-12-й день дозою менше 0,1 мл, вважають високовірулентних, 0,2-0,4 мл - середньої вірулентності і 0,5-1 мл - слабовірулентних.
1.11.9. Визначення серогрупповой належності культур лептоспір проводять відповідно до Настановою із застосування групових аглютинуючих лептоспірозного сироваток, затвердженим Головним управлінням ветеринарії МСГ СРСР 31 травня 1974
1.11.10. В якості біологічної моделі для виявлення лептоспір можуть бути використані дорослі кролики та морські свинки. Кров тварин досліджують по РМА на наявність специфічних антитіл. Тварин, у крові яких не виявлені специфічні антитіла, заражають досліджуваним матеріалом.
Кров заражених тварин досліджують три рази через кожні сім днів з реакції мікроаглютинації починаючи з розведення 1: 10 з лептоспірозом 13 серологічних груп. Виявлення в крові заражених тварин специфічних антитіл свідчить про наявність лептоспір у досліджуваному матеріалі і дозволяє орієнтовно судити про їх серогрупповой приналежності.
2. Бактеріологічне дослідження води
2.1. Вода є основним чинником у передачі збудника лептоспірозу.
Лептоспір виявляють у воді біологічної пробою на кроленят, свинках, хом'яків, 'крапчастий ховрах, дорослих кроликах, використовуючи одну з наступних методик.
2.2. Проби води об'ємом 1-2 л беруть у стерильний посуд, підігрівають до 30 ° і виливають в емальований кювет, - поміщають в нього на одну годину двох піддослідних тварин. шкіра черевця або задні ноги яких скаріфіціровани, так щоб скаріфіцірованная поверхня була занурена у воду. Починаючи з четвертого дня у великих звірів (кроленят, морські свинки) беруть кров із серця з метою виділення гемокультур, досліджують мікроскопічно черевної ексудат. Одного з дрібних звірків вбивають. На 14-20-й день всіх тих, що вижили тварин також вбивають. Патологічний матеріал досліджують на наявність лептоспір. Кров досліджують на РМА.
2.3. Пробу води (до 500 мл) центрифугують при 10-15 тис. об / хв протягом 30 - хвилин, зливають надосадову рідину, а опади з усіх центріфужний склянок суспензії в стерильному - живильному середовищі для лептоспір або фізіологічному розчині. Суспензію вводять внутрішньочеревно або підшкірно хом'якам по 0,5-1 мл, крольчатам і морським свинкам по 1-2 мл. Надалі досліджують, як зазначено в п. 2.2.
2.4. Отриманий після центрифугування осад підшкірно вводять у дозі 2-3 мл дорослим кроликам, не мають у крові лептоспірозного антитіл,
Через 7-14 і 20 днів кров кролика досліджують по РМА з лептоспірозом 13 серологічних груп. Виявлення специфічних антитіл в титрі 1: 10 і вище свідчить про наявність лептоспір в досліджуваній пробі води.
3. Імпрегнація гістологічних зрізів з органів сріблом за левадіті
3.1. Матеріалом для гістологічного дослідження служать шматочки коркового шару нирок і печінки товщиною не більше 1 см, консервовані 10%-ним розчином формаліну.
Лептоспіри вдається виявити за найбільшою сталістю в гістологічних зрізах імпрегноване сріблом за Левадіті. Методи Крантц, Полагута і Майера менш ефективні.
3.2 Кілька шматочків органів не товщі за 1 см, краще 2-'3 мм, фіксують у 10%-ном водному розчині нейтрального формаліну 24-48 годин. Після фіксації шматочки переносять в 96 ° спирт на 24 години. Промивають в дистильованій воді до тих пір, поки шматочки не осядуть на дно бюкса (не менше 2-3 годин), воду міняють три рази.
3.3. Поміщають шматочки в 1-3%-ний розчин азотнокислого срібла на 3-6 днів. Процес сріблення ведуть при температурі 37 ° С. Розчин азотнокислого срібла готують на свіжій дистильованої воді з розрахунку 15 мл розчину на один шматочок.
3.4. Прополіскують в дистильованій воді протягом 2-5 хвилин. Після промивання шматочки переносять в невелику порцію редукуючої суміші в окремій чашці на 2 хвилини (розчин швидко темніє) і потім розміщують їх у приготований перед вживанням основний редукуючих розчин наступного складу: пирогалловой кислота - 4 г, дистильована вода - 100 мл, формалін чистий - 5 мл.
Розчин готують з розрахунку 20-25 мл на один шматочок тканини. Відновлення обов'язково проводять у банці з темного скла.
3.5. Шматочки витримують у редукуючої суміші 24-48 годин при кімнатній температурі в темному місці або в банці з темного скла.
Час витримки контролюють приготуванням одиничних зрізів через кожні 12-16 годин, щоб уникнути передержанія, так як зрізи можуть стати чорними. Промивають в дистильованій воді 1-2 години.
3.6. Обробляють препарати послідовно спиртами: в 96 ° спирт (спирт 1) на добу; в 96 ° спирт (спирт 2) на добу; в 96 ° спирт (спирт 3) - на добу; спирт-метил (спирти етиловий та метілсаліціловий порівну) - до опускання шматочків на дно бюкса, а потім у метілсаліціловий - до ранку.
3.7. Після цього перекладають у кашу-парафін (ксилол та парафін порівну) на 30 хвилин при 57 °; парафін 1 - на 60 хвилин при 57 ° С; парафін 2 - на 60 хвилин при 57 ° С.
З швидко остудженого парафіну вирізують блок з шматочком органу і наклеюють на дерев'яний кубик. Готують тонкі зрізи на санному мікротому і наклеюють на предметне скло, депарафініруют в трьох бюксах з ксилолом по 10-15 хвилин у кожному і укладають під покривне скло в канадський бальзам, підсушують і переглядають під мікроскопом зі светлопольним конденсором при збільшенні 90X7-10.
У разі незадовільних результатів імпрегнації лептоспір готують препарати з інших одночасно приготованих блоків. Препарати необхідно зберігати в темряві.
3.8. Мікрокартіна: лептоспіри чорні, навколишнє тканину буро-жовта. Лептоспіри розташовуються на поверхні епітелію і в просвітах сечових канальців нирок, дещо рідше - в цитоплазмі епітелію, переважно групами. Після імпрегнації сріблом типові лептоспіри мають S-подібну з 1-2 вигинами або змієподібні форму з грубими, товстими завитками, які в окремих випадках слабо помітні. Іноді в просвіті і на поверхні епітелію сечових канальців зустрічаються аргірофільних гранули (пофарбовані в колір лептоспір), 'які за відсутності типових форм не можна приймати за лептоспір.
4. Серологічна діагностика лептоспірозу
4.1. Серологічна діагностика лептоспірозу заснована на виявленні специфічних антитіл у крові тварин, реакцією мікроаглютинації (РМА) або реакцією мікроаглютинації (РА).
4.2. Сироватку крові тварин досліджують на лепту-спіроз по РМА або РА для з'ясування благополуччя господарства щодо цього захворювання і встановлення діагнозу на лептоспіроз в окремих тварин.
В останньому випадку проводять 2-3-кратне дослідження. Кров беруть для дослідження на 5-7-й день хвороби і повторно через 7-10 днів.
4.1. Порядок постановки та обліку реакції мікроаглютинації (РМА)
4.1.1. Для постановки реакції мікроаглютинації необхідні:
- Досліджувана сироватка крові тварин;
- Антигени - культури діагностичних штамів лептоспір;
- Електроліт - фізіологічний розчин;
- Мікроскоп, конденсор темного поля й освітлювач ті ж, що для мікроскопічної діагностики;
- Аглютинаційний пластинки або пробірки Флоринського;
- 40-100-гніздова штативи;
- Бактеріологічні пробірки;
- Градуйовані піпетки на 1, 2, 5 і 10 мл;
- Апарат Флорінокого;
- Предметні скла.
4.1.2. Досліджувана сироватка. Для дослідження придатна сироватка свіжа, заморожена, висушена на фільтрувальному папері, консервована фенолом або борною кислотою. Консервують відстояну сироватку, злиту в сухі стерильні пробірки.
Додають 5%-ний розчин фенолу при постійному помішуванні 0,05 мл (1 крапля) на кожен мілілітр сироватки.
Борну кислоту вносять у сироватку до отримання насиченого розчину і освіти на дні пробірки невеликого осаду кристалів. Кристали кислоти не повинні потрапляти в піпетку під час постановки реакції.
Висушують сироватку на квадратах (5X5 см) 'білої фільтрувального паперу по 3-5 крапель (0,05 мл кожна) при кімнатній температурі або в термостаті при температурі 37 ° С. Консервовані проби сироватки придатні для дослідження протягом місяця. Гемолізованих, загнили, плісняві і пророслі сироватки не досліджують.
4.1.3. Антигени. В якості антигенів в РМА використовують живі культури лептоспір різних серологічних груп. Республіканські лабораторії ставлять реакцію з лептоспірозом 13 серологічних груп: Icterohaemorrhagiae, Javanica, Canicola, Pyrogenes, Cynoptery, Autumnalis, Pomona, Grippotyphosa, Hebdomadis, Tarassovi, Bataviae, Australis, Ballum.
Крайові, обласні, міжрайонні лабораторії досліджують сироватку домашніх тварин з антигенами 6 серогрупп: Grippotyphosa, Pomona, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi, Hebdomadis, Canicola.
Сироватку крові диких тварин досліджують з лептоспірозом 13-15 серогрупп.
У РМА використовують еталонні штами лептоспір або їх аналоги, рекомендовані Всесоюзним державним науково-контрольним інститутом ветеринарних препаратів МСХ СРСР.
Діагностичні штами лептоспір лабораторії отримують у Всесоюзному державному науково-контрольному інституті ветеринарних препаратів МСХ СРСР, і підтримують їх періодичними пересіву через кожні 10 -15 днів.
Придатність культури для використання в реакції оцінюють шляхом перегляду пробірок в світлі, і мікроскопією.
При достатньому накопиченні лептоспір після струшування пробірки з культурою в світлі, що проходить в середовищі добре помітні муарові хвилі, а в спокійному стані легка опалесценція. Наявність осаду, плівки, помутніння середовища свідчить про проростання культури сторонньої мікрофлорою, повна прозорість середовища - про відсутність лептоспір.
У реакції використовують чисті культури лептоспір у віці 5-15 днів без ознак аглютинації і лізису (четкообразние, нерухомі клітини) з накопиченням 70-100 мікробних клітин в полі зору мікроскопа при збільшенні 20X10X1, 5 або 40X7-10. Культури, що містять 150-200 і більше лептоспір у полі зору мікроскопа, розводять перед постановкою реакції живильним середовищем або фізіологічним розчином до зазначеної концентрації.
Кожне розведення сироватки розливають в окремий ряд, що складається з 5-13 лунок (пробірок) в залежності від кількості антигенів, використовуваних в реакції. Кожну культуру-антиген вносять по 0,1 мл в три лунки з різними разведениями сироватки. Після додавання антигенів пластини струшують і витримують у термостаті при температурі 30 ° С протягом години.
Контролем служить суміш культури лептоспір з фізіологічним розчином по 0,1 мл. Лептоспіри в контролі повинні залишатися рухливими, не мати ознак лізису і аглютинації.
4.1.8. Реакцію враховують шляхом мікроскопії крапель з кожної лунки в темному полі мікроскопа при збільшенні 20X10 або 20X7X1, 5. Краплі з лунок виносять на предметне скло бактеріологічною петлею від більшого розведення до меншому і переглядають їх без покривного скла. Краплі можна наносити двома способами: 1) бактеріологічною петлею діаметром 3 мм наносять на скло відразу до 30 крапель і потім переглядають їх під мікроскопом, 2) бактеріологічною петлею діаметром 1 мм наносять на предметне скло в освітлений центр поля зору одну краплю і проглядають її, пересувають столик на 2-3 мм і поряд з першою наносять і враховують другу краплю. У цьому випадку на одному предметному склі враховують 60-80 крапель.
Після кожного антигену петлю прожарюють і охолоджують.
4.1.9. Результати реакції оцінюють в хрестах за чотирибальною системою:
+ + + + Агглютинировала 100% лептоспір;
+ + + - Агглютинировала 75% лептоспір;
+ + - - Агглютинировала 50% лептоспір;
+ - - - Агглютинировала 25% лептоспір;
- (Знак мінус) аглютинація відсутня. Аглютинація проявляється у склеюванні лептоспір та освіті павучків. Павучок включає від 3-5 до декількох десятків і навіть сотень лептоспір. Вільні кінці лептоспір зберігають рухливість.
У початкових розведеннях сироватки може спостерігатися лізис лептоопір, яка у набуханні і знерухомлення, появі зернистості і повного розпаду мікробних клітин.
4.1.10. Позитивною вважають реакцію, оцінену не менше ніж на два хрести, за відсутності аглютинації в 'контролі.
При повторному дослідженні сироватки крові реакцію ставлять у тих же розведеннях.
4.2. Порядок постановки та обліку реакції макроагглютінаціі (РА)
Реакцію макроагглютінаціі ставлять і враховують відповідно до Тимчасового настановою по застосуванню антигенів для діагностики лептоспірозу у тварин реакцією макроагглютінаціі, затвердженим Головним управлінням ветеринарії Міністерства сільського господарства СРСР 12 травня 1974 року.
4.3. Оцінка показань РМА і РА
4.3.1. Тварин з титром сироватки в РМА 1: 100 або реагують по РА на 1-2 хреста, крім коней та великої рогатої худоби, що реагують з лептоспірозом групи Hebdomadis, вважають підозрюваними у зараженні.
Велика рогата худоба, реагує з лептоспірозом групи Hebdomadis, і коней, що реагують з лептоспірозом будь серологічної групи, вважають підозрюваними у зараженні при титрі антитіл в РМА 1: 500 або реагують в РА на 1-2 хреста з нерозведеною сироваткою.
Кров від тварин, підозрюваних у зараженні, і від тварин, не реагували при першому дослідженні, повторно перевіряють через 7-10 днів.
4.3.2. Виявлення антитіл у тварин, не реагували при першому дослідженні, або наростання титру у реагували в РМА в п'ять і більше разів, або позитивна РА на 3-4 хреста свідчать про активний інфекційний процес у обстежуваних тварин.
4.3.3. Тварин (крім коней і реагує з лептоспірозом групи Hebdomadis великої рогатої худоби) з титром сироватки в РМА 1: 500 і більше або в РА на 3-4 хреста і велику рогату худобу, реагує з лептоспірозом групи Hebdomadis і коней, що реагують з лептоспірозом будь серогрупи при титрі в РМА 1:2500 і більше або в РА на 3-4 хреста, розглядають як можливих лептоспіроносітелей.
4.3.4. Збудниками лептоспірозу при серологічної діагностики вважають лептоспір тієї серологічної групи, до якої виявлені антитіла в найбільш високому титрі.
Необхідно враховувати, що в сироватці крові свиней, великої рогатої та дрібної рогатої худоби і коней при дослідженні по РМА виявляють у 5 - 15% випадків (з числа позитивно реагують) антитіла в найбільш високому титрі до лептоспір Australis, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery , Bataviae, які не були виділені в жодному випадку від сільськогосподарських тварин.
Такі реакції слід розглядати як міжгрупові, що є наслідком зараження лептоспірозом Pomona, Tarassovi та іншими, зазвичай виділяються від сільськогосподарських тварин.
Лептоспіри Australis, Bataviae, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Kazachstanica можуть бути визнані збудниками лептоспірозу у сільськогосподарських тварин тільки після виділення цих лептоспір у чистій культурі або підтвердження їх ролі реакцією іммуноабсорбціі.
4.4. Методика постановки реакції іммуноабсорбціі при дослідженні проб сироватки
4.4.1. У реакції іммуноабсорбціі вивчають проби сироватки тварин, агглютинирующие лептоспіри декількох серологічних груп в одно високих титрах або мають найбільш високий титр - по відношенню до лептоспір, раніше не відомим в якості збудника лептоспірозу у сільськогосподарських тварин.
4.4.2. Для проведення абсорбції вирощують в 0,2 - 0,5 - літрових флаконах всі штами лептоспір, з якими ця проба сироватки дала реакцію аглютинації. До 5-7-добовим культурам додають 0,3% формаліну і витримують 10-12 годин. Потім лептоспіри осаджують центрифугуванням при 10 000 об / хв протягом 30 хвилин. Зливають надосадову рідину, а осад суспензії в обсязі 0,9 мл середовища або фізіологічного розчину, 0,1 мл досліджуваної сироватки змішують з 0,9 мл концентрованого антигену і витримують протягом 48 годин при температурі 1-5 ° С. Абсорбований сироватку перевіряють в РМА на наявність залишкових антитіл до штаму-абсорбенту, а потім досліджують за лептоспірозом груп, з якими реагувала сироватка до абсорбції.
4.4.3. У процесі абсорбції лептоспіри, що є збудником інфекції у даної особини, витягують із сироватки антитіла до лептоспір всіх інших серологічних груп, в той час як антитіла до штаму-збудника хвороби не абсорбуються із сироватки гетерологічние типами лептоспір.
Для скорочення обсягу роботи сироватку можна на початку абсорбувати лептоспірозом, які є найбільш частими збудниками хвороби у тварин даного виду.
4.4.4. Оцінка епізоотичної ситуації в господарстві за результатами лабораторних досліджень наведена в Інструкції про заходи щодо боротьби з лептоспірозом тварин пп. 2.4., 2.5. і 2.6.
Для скорочення обсягу роботи сироватку можна на початку абсорбувати лептоспірозом, які є найбільш частими збудниками хвороби у тварин даного виду.
4.4.4. Оцінка епізоотичної ситуації в господарстві за результатами лабораторних досліджень наведена в Інструкції про заходи щодо боротьби з лептоспірозом тварин пп. 2.4., 2.5. і 2.6.
| Серологічна група | Серологічний варіант | Типовий штам |
| Icterohae-morrhagiae | icterohaemorrhagiae copenhageni mankarso naa'm mwogolo dakota sarmin birkini smithi ndambari ndahambukuje budapest weaveri | RGA M-20 Mankarso Naam Mwogolo Grand River Sarmin Birkin Smith Ndambari Ndahambukuje PV-1 GZ-390-U |
| Javanica | javanica poi sorex-jalna coxi sofia | Veldrat Batavia 46 Poi Sorex Jalna Cox Sofia 874 |
| Celledoni | celledoni whitcombi | Celledoni Whitcombi |
| Canicola | canicola bafani kamituga jonsis sumneri broomi bindjei schnueffneri benjamin malaya | Hond Utrecht IV Bafani Kamituga Jones Sumner Patane Bindjei Vleermuise 90-C Benjamin H-6 |
| Ballum | ballum castellonis arboreae | MUS-127 Castellon-3 Arboreae |
| Pyrogenes | pyrogenes Zanoni myocastoris abramis biggis hamptoni alexi robinsoni rnanilae | Salinem Zanoni LSU-1551 Abraham Biggs Hampton HS-616 Robinson LT-398 |
| Cynopteri | cynopteri canalzoniae butembo | 3522-C Cz-188k Butembo |
| Autumnalis | autumnalis rachmati fortbragg sumatrana bulgarica bangkinang erinaceiauriti mooris sentot louisiana Orleans djasiman gurungi | Akiyama A Rachmat Fort Bragg Sapulette Nikolaevo Bangkinang-1 Erinaceus auritus 670 Moores Sentot LSU-1945 LSU-2580 Djasiman Gurung |
| Australis | australis lora muenchen jalna bratislava fugis bangkok peruviana pina nicaragua | Ballico Lora Munchen C-90 Jalna Jez Bratislava Fudge Bangkok D-92 Lt-941 LT-932 Lt-990 |
| Pomona | pomona kennewieni monjakov mozdok tropika proechimys | Pomona Lt-1026 Monjakov 5621 CZ-299U LT-796 |
| Grippotypho-sa | grippotyphosa valbuzzi | Moskva-V Valbuzzi |
| Hebdomadis | hebdomadis nona kambale kremastos worsfoldi jules maru borincana kabura mini | Nebdomadis Nona Kambale Kremastos Worsfold Jules CZ-285-В HS-622 Kabura Sari |
| Hebdomadis | szwajizak georgia perameles wolffi hardjo recreo medanensis trinidad seiroe balcanica polonica nero haemolytica ricardi | Szwajizak LT-117 Bandicoot-343 3705 Hardjoprajitno LT-957 Hond-HC LT-1098 M-84 тисяча шістсот двадцять-сім Burgas 493-Poland Qamsulin March Richardson |
| Bataviae | bataviae paidjan djatzi kobbe balboa claytoni brasiliensis | Van Tienen Paidjan HS-26 CZ-320-K LT-761 LT-818 LT-996 |
| Tarassovi | tarassovi bakeri atlantae guidae kisuba bravo atchafalaya chagres rama gatuni | Perepelicin LT-79 LT-81 RP-29 Kisuba Bravo LSU-1013 LT-924 LT-955 LT-839 |
| Panama | panama | CZ-214-K |
| Sherman! | shermani | LT-821 |
| Semaranga | semaranga patoc sao-paulo | Veldrat Semarang-173 Patoc I Sao Paulo |
| Andamana | andamana | CH-11 |