Імунологічні методи засновані на взаємодії антігенантітело

8,6 и ионной силой 0,1. Моноспецифічний антисироватки, стандартні розчини антигенів і робочий стандарт, веронал-ацетатний буфер з pH 8,6 і іонною силою 0,1. ; стеклянные капилляры для определения гематокрита длиной около 50 мм, с внутренним диаметром 1-1,5 мм; измерительная лупа с точностью до 0,1 мм. Спеціальний агар Noble; скляні капіляри для визначення гематокриту довжиною близько 50 мм, з внутрішнім діаметром 1-1,5 мм; вимірювальна лупа з точністю до 0,1 мм.

У скляні капіляри насмоктують і видувають назад 1%-ний гарячий золь агару на воді. Потім капіляри висушують при 70 ° С. Новоутворена Агарова плівка підсилює зчеплення гелю зі склом і перешкоджає утворенню щілин, в які міг би проникнути антиген.

У 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендують 2 г сухого агару і нагрівають на водяній бані до розплавлення. Агар охолоджують до 48 ° С і змішують з рівним об'ємом підігрітою до 48 ° С антисироватки. У цю суміш занурюють капіляри, з тим щоб вона заповнила їх на 2-3 см. Коли гель затвердіє, капіляри готові до вживання.

Капіляри занурюють у розчини антигенів, але перед зануренням капілярів в антиген слід довести температуру всіх реагентів до потрібної величини, наприклад до 4 ° С. Реакція триває 48 ч. Потім вимірюють відстань, яку пройшов фронт преципітації в кожному капілярі.

Для того, щоб антиген міг дифундувати в гель, що містить антитіла, він повинен бути в надлишку. , на квадратный корень из времени диффузии t . Швидкість міграції преципітату До можна обчислити, розділивши відстань h, на квадратний корінь з часу дифузії t.

При постійному часі дифузії між логарифмом концентрації антигену і відстанню, яке проходить фронт преципітації, існує пряма лінійна залежність. Нахил калібрувальної кривої прямо пропорційний квадрату коефіцієнта дифузії антигену і обернено пропорційний концентрації антитіл в гелі й в'язкості гелю.

Оцінка методу

Критичним фактором є температура. Тривалість інкубації залежить від величини дифундуючих молекул, найчастіше триває 12, 24 або 48 годин.

3. Проста радіальна иммунодиффузии по Манчіні

3.1. Принцип

На рівну поверхню рівномірним шаром наносять гель, що містить антитіла. У гелі вирізають лунки і заповнюють їх розчином антигену. Молекули антигену радіально дифундують з лунки і, зустрівшись з антитілами, утворюють кільце преципітації. До тих пір поки в лунці зберігається надлишок антигену, відбувається поступове збільшення діаметру кільця преципітації.

3.2. Проведення дослідження

Реагенти та прилади

8,6 и ионной силой 0,1; агар; рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, кюветы для элюции из комплекта для электрофореза; измерительный инструмент с точностью до 0,1 мм; микрошприц. Моноспецифічний антисироватки; стандартні розчини антигенів; робочий стандарт; веронал-ацетатний буфер з pH 8,6 і іонною силою 0,1; агар; рамки для закріплення предметних стекол, штативи для цих рамок, кювети для елюції з комплекту для електрофорезу; вимірювальний інструмент з точністю до 0,1 мм; микрошприца.

Нагрівають 1,5 г агару до повного розплавлення в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяній бані і, охолодивши до 48 ° С, змішують в потрібній пропорції з антисироватки, підігрітою до тієї ж температури. Суміш розливають по 2 мл на предметні стекла, розташовані строго горизонтально. Золь повинен рівномірно розподілитися по поверхні скла. Щоб підсилити зчеплення гелю зі склом, рекомендується попередньо покрити скло тонкої агарної плівкою.

У платівці гелю вирізають лунки, розраховані на 2 мкл антигенного розчину кожна. Після внесення антигену платівки гелю поміщають у вологу камеру і проводять иммунодиффузии при кімнатній температурі. Кільця преципітації можна вимірювати прямо на вологій платівці. по 12 ч, затем гель высушивают и окрашивают красителями, например амидо-черным, и высушивают вновь. Якщо преципітати видно недостатньо чітко, то спочатку елюіруют непреціпітіровавшіе білки в двох змінах 0,15 М розчину NaCl по 12 год, потім гель висушують і фарбують барвниками, наприклад амідо-чорним, і висушують знову.

Площа, яку займає преципітатом до кінця дифузії, прямо пропорційна вихідної концентрації антигену в лунці. Для побудови калібрувальної кривої беруть або площа преципітату як функцію концентрації антигену, або логарифм діаметра преципітату як функцію логарифма концентрації антигену:

_Г +S ₀ , S = K * Q _{A Г} + S _0,

– площадь преципитата, включая S ₀ , S ₀ – площадь стартовой лунки и Q _{A Г} -- количество антигена. де S - площа преципітату, включаючи S _0, S ₀ - площа стартовою лунки і Q _{A Г} - кількість антигену.

Нахил До отриманої прямої обернено пропорційний концентрації антитіл в гелі. Зменшивши зміст антисироватки в агарі, можна збільшити К. У результаті зросте діаметр преципітату, що підвищить чутливість і економність методу. Оптимальна концентрація антисироватки в гелі залежить насамперед від титру антитіл.

Результати иммунодиффузии істотно не залежать від температури. Досвід може бути поставлений при 4, 20 або 37 ° С. Слід уникати тільки різких (більше 5 °) коливань температури.

Необхідна тривалість иммунодиффузии залежить від природи досліджуваного антигену. Перший орієнтовний завмер преципітатів можна зробити вже через 24 ч.

3.3. Оцінка методу

У межах своєї чутливості радіальна иммунодиффузии придатна для кількісного визначення будь-якого антигену, якщо є відповідні моноспецифічний антисироватки і чисті або стандартні антигени, щоб побудувати калібрувальну криву для даної системи.

За допомогою цього методу частіше визначають білкові антигени, наприклад білки сироватки крові, цереброспінальної рідини, секретів залоз. Радіальна иммунодиффузии придатна також для порівняльного якісного і кількісного аналізу імунохімічних близьких білків.

4. Нефелометрія

4.1. Принцип методу

Розчин антигену змішують з відповідною моноспецифічний антисироватки і суміш інкубують. При цьому утворюються імунні агрегати, здатні розсіювати проходить світло. Інтенсивність розсіювання або поглинання прохідного світла прямо пропорційна кількості комплексів антиген-антитіло, і її можна вимірювати фотометричним.

Якщо обсяги реагентів, розведення антисироватки, час і температура інкубації постійні і єдиною змінною величиною є концентрація антигену, то останню можна визначити по кривій екстинкції. Щоб побудувати таку криву, з антисироватки інкубують розчини антигену зростаючої концентрації. Спочатку зі збільшенням концентрації антигену крива екстинкції йде вгору, потім, після деякого максимуму, знижується. При постійній кількості антитіл підйом концентрації антигену збільшує не тільки кількість, але і величину імунних агрегатів. При оптимальному співвідношенні антигену і антитіл кількість і розмір імунних агрегатів досягає максимуму. Область оптимальних співвідношень називають зоною еквівалентності. Подальший підйом концентрації антигену веде до зменшення агрегатів.

4.2. Проведення дослідження

Реагенти та прилади

. Забуференной фосфатами розчин NaCl. ₂ HPO ₄ ·2 H ₂ O растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl ; 9,1 г KH ₂ PO ₄ растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl . 11,9 г Na ₂ HPO ₄ · 2 H ₂ O розчиняють у 1000 мл 0,15 М розчину NaCl; 9,1 г KH ₂ PO ₄ розчиняють у 1000 мл 0,15 М розчину NaCl. 7,5. Виходить буфер з pH 7,5.

Моноспецифічний антисироватки.

Стандартні розчини. Використовуються стандартні сироватки з відомим вмістом білків або стандартні розчини, приготовлені з чистих білків.

Робочий стандарт, якщо потрібно визначити зміст різних білків у сироватці або сироваткових білків в інших рідинах організму.

с pH 7,5. Стандартні розчини, досліджувані зразки і антисироватки розводять забуференной розчином NaCl з pH 7,5. Визначення антигенів виробляють з кролячими антисироватки в розведенні 1:5-1:20. Для побудови кривої екстинкції спочатку готують серію розведень антигену від 0,5 до 10 мг на 100 мл. До останніх разведениям стандартної сироватки або розчину чистого білка додають рівний об'єм розведеною антисироватки, перемішують і залишають при кімнатній температурі (20 ° С) на 2 ч. Після цього визначають екстинкцію розчинів у прохідному світлі при 450 нм в мікрокювет з товщиною шару 1 см проти холостий проби (буфер + антисироватки). З досліджуваним зразком поводяться так само, як зі стандартними розчинами. Визначають його екстинкцію і по висхідній частині кривої встановлюють концентрацію антигену. Якщо доводиться досліджувати мутні чи забарвлені розчини антигенів, слід попередньо виміряти їх власну екстинкцію, щоб врахувати її при оцінці результатів. Потім з урахуванням розведення вихідного матеріалу обчислюють концентрацію досліджуваного антигену.

Повну впевненість у тому, що отримана величина екстинкції відповідає області надлишку антитіл, дає дослідження, проведене з кількома разведениями антигену. Умови інкубації повинні бути суворо постійними. Для фотометрії слід вибирати довжину хвилі, що лежить за межами областей поглинання гемоглобіну (400 - 420 нм). Необхідно також враховувати спектр власного поглинання реагентів та їх суміші до утворення імунних агрегатів.

4.3. Оцінка методу

Переваги нефелометрії - відносна простота і швидкість процедури, а також можливість її автоматизації. Однак цей метод пред'являє особливі вимоги до якості антисироватки. Вона повинна містити достатньо антитіл, щоб у розведенні антитіл не менше 1:5 забезпечити величину максимальної екстинкції вище 0,2. Антисироватка повинна бути прозорою.

5. Іммунодот і іммуноспот

Твердофазний імуноферментний аналіз є найбільш популярним методом у діагностиці різних вірусних, бактеріальних, грибкових і паразитарних хвороб людини і тварин. Однак цей метод має ряд недоліків. У модифікованому варіанті для адсорбції різних антигенів використовують нітроцелюлозні фільтри. - ELISA (точечный твердофазный иммуноферментный анализ). Таку модифікацію називають dot - ELISA (точковий твердофазний імуноферментний аналіз). - ELISA минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку в виде серии точек. У dot - ELISA мінімальні обсяги розчинів антигену або антитіл наносять на нітроцелюлозну підкладку у вигляді серії точок. Преципитирующие хромогенні субстрати на білому нітроцелюлози фільтрі утворюють кольорові плями. Фільтри з результатами аналізу можуть зберігатися в темряві протягом багатьох років без втрати забарвлення.

- ELISA можно применять различные препараты антигенов. У dot - ELISA можна застосовувати різні препарати антигенів. На нітроцелюлозних мембранах можна сорбувати як життєздатні або фіксовані формаліном найпростіші, так і супернатант, отримані після руйнування клітин.

Пляма антигену наносять в обсязі від 0,1 до 3 мкл. У разі препаратів солюбізірованних антигенів краще використовувати мембрани з малим діаметром пор. При застосуванні цілих клітин величина пір не грає великої ролі.

Всі стадії інкубації і промивання виконують при кімнатній температурі. Спочатку диски з антигеном обробляють блокуючим розчином (3 - 5%-ний розчин очищеного бичачого сироваткового альбуміну в сольовому тріетаноламіновом буферному розчині). . Можна успішно застосовувати і цільну кінську сироватку або 1%-ний розчин нормальної сироватки кролика у фосфатному буферному розчині з NaCl. При виявленні антитіл 50 мкл сироватки в 1%-ном розчині БСА-СТБ інкубують на диску. Антитіла специфічно зв'язуються з антигеном, сорбованих на диску. ). Потім диски тричі промивають у розчині детергенту (0,05%-ний розчин нонідета Р-40 в СТБ, 0,05%-ний розчин твін-20 в сольовому розчині трис-Н Cl). Після промивання диски інкубують з 50 мкл кон'югату афінно очищених антивидових антитіл з ферментом (пероксидаза, лужна фосфатаза).

Після відмивання незв'язаного матеріалу додають преципитирующие хромогенний субстрат. При окислюванні субстрату ферментом у присутності пероксиду водню утворюється чітке пляма.

При визначенні антигенів проби наносять безпосередньо на підкладку, потім проводять імунологічну реакцію або зі специфічними антитілами і кон'югатом вторинних антитіл з ферментом і хромогенних субстратом, або з кон'югатом специфічних антитіл з ферментом-маркером і субстратом.

- ELISA при определении антигенов сначала на подложку наносят специфические антитела. У двухсайтовом dot - ELISA при визначенні антигенів спочатку на підкладку наносять специфічні антитіла. Антигени в пробі зв'язуються з антитілами. Потім додають мічені специфічні антитіла проти іншого епітопів антигену і проводять реакцію з преципитирующие субстратом. Для таких методик характерна висока специфічність.

- ELISA является возможность его применения для самых разнообразных медицинских целей. Важливою перевагою методу dot - ELISA є можливість його застосування для найрізноманітніших медичних цілей. - ELISA отличаются экономичным расходом реагентов, не требуют приборов с электропитанием для регистрации результатов. Всі модифікації dot - ELISA відрізняються економічною витратою реагентів, не вимагають приладів з електроживленням для реєстрації результатів.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. Нові методи імуноаналізу. - М.: Світ, 1991. - С.116.

2. Імунологічні методи. Під ред. Х. Фримель. - М.: Світ, 1979. - С. 31 - 55.