ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі подано теоретичне узагальнення та нове вирішення науково-практичного завдання, яке полягає у встановленні взаємозв’язку між характером і ступенем виразності диспластичних і неопластичних процесів епітелію шийки матки та рівнем експресії імуногістохімічних маркерів біологічних властивостей тканин, удосконаленні гістологічної діагностики передракових та ракових захворювань шийки матки, ступеня їх диференціювання та розробленні критеріїв прогнозування прогресії цервікальних інтраепітеліальних неоплазій для формування груп ризику. Отримані дані є основою для наступних експериментальних та клінічних досліджень у галузі гінекології та патологічної анатомії.
ДНК ВПЛ ВКР виявляється у 72,4% жінок, генетичний матеріал ВПЛ НКР визначається у 11,2% пацієнток, у 16,4% випадків не знаходиться ДНК ВПЛ будь-якого типу. Із них серед жінок контрольної групи не виявляються жодні фрагменти ДНК ВПЛ у 71,4% випадків, ДНК ВПЛ НКР визначаються в 14,3%, ДНК ВПЛ ВКР присутня в 14,3% спостережень. У жінок з диспластичними та неопластичними процесами не виявляються фрагменти ДНК ВПЛ жодного типу в 13,4% ушкоджень, ДНК ВПЛ НКР наявна в 11,0% спостережень, у 75,6% випадків визначається ДНК ВПЛ ВКР. Існує прямий кореляційний зв’язок між ступенем диспластичних ушкоджень шийки матки та інфікованістю ВПЛ ВКР (r=+0,67).
Дифузна реакція з р16INK4A спостерігається у 53,0% ушкоджень шийки матки, у 20,9% визначається фокальний варіант забарвлення, у 26,1% не виявляється експресія р16INK4A. Дифузне забарвлення з р16INK4A визначається у переважній більшості пацієнток із груп з ЦІН ІІ (48,3%), ЦІН ІІІ (81,2%) та інвазивними раками (86,1%) та корелює з визначенням ДНК вірусів папіломи людини високого ступеня ризику (r=+0,91) та ступенем диспластичних і неопластичних процесів епітелію шийки матки (r=+0,87). Позитивне забарвлення р16 INK4A є 100% специфічним індикатором ЦІН, чутливим показником В-ПІУ (93,8%) та визначення ВПЛ ВКР (87,6%).
Експресія білка Kі-67 збільшується з наростанням ступеня диспластичних ушкоджень епітелію шийки матки і досягає максимуму при інвазивному раці шийки матки; односпрямовано змінюється і локалізація Кi-67-позитивних клітин в товщі епітелію. Індекс проліферації позитивно корелює зі ступенем диспластичних та неопластичних ушкоджень (r=+0,89) та ступенем диференціювання, тобто агресивною поведінкою інвазивних пухлин (r=+0,65). При аналізі показників ІП у різних групах ЦІН нами запропоновано діапазони значень параметра, які відображають його залежність від ступеня диспластичних і неопластичних ушкоджень епітелію шийки матки: при ІП більше 50% проліферативна активність розцінюється як висока, при показниках менше 10% - як низька; значення ІП у діапазоні від 10% до 50% розглядаються як проміжна зона. Високий рівень проліферації є 100% специфічним індикатором ЦІН з 100% ППЧ і В-ПІУ, а також 100% чутливим маркером низького ступеня диференціювання РШМ.
Існує прямий кореляційний зв’язок між ступенем диспластичних ушкоджень шийки матки і експресією р53 (r=+0,69). Позитивна імуногістохімічна реакція з р53 характерна для ЦІН ІІІ та інвазивних раків (75,0% та 80,6% відповідно), в той час як випадки ЦІН І та ЦІН ІІ асоційовані з негативним р53-статусом (100% та 89,7% відповідно). Рівень експресії р53 не корелює з наявністю ВПЛ ВКР. Позитивна р53 експресія є 100% специфічним методом виявлення ЦІН з 100% ППЧ та є 100% чутливим маркером низького ступеня диференціювання РШМ.
Висока пряма кореляція характеризує зв’язок між ступенем диспластичних ушкоджень шийки матки, кількісними показниками інтрануклеарних реакцій та інтенсивністю забарвлення з р63 (r=+0,89). При аналізі експресії р63 нами запропоновано діапазони значень параметра, які відображають залежність порушення диференціювання клітин від ступеня дисплазій чи неоплазій: низький рівень р63 експресії - <30% клітин з інтрануклеарною реакцією, помірний рівень р63 експресії – 30%-75%, високий рівень - >75% клітин з імуногістохімічною міткою в ядрах. Не визначено значного кореляційного зв’язку експресії р63 з рівнем ІП. В аденокарциномах відсутня імуногістохімічна реакція з цим антитілом. Позитивна р63 експресія є 100% специфічним методом виявлення ЦІН та 100% специфічним та 100% чутливим маркером плоскоклітинного диференціювання при РШМ, високий рівень - 100% специфічним для виявлення В-ПІУ та ВПЛ ВКР.
Існує прямий кореляційний зв’язок між рівнем експресії VEGF і відносним об’ємом капілярів (r=+0,76), ступенем тяжкості диспластичних ушкоджень (r=+0,79) та ступенем диференціювання інвазивних пухлин (r=+0,70). Помірна та інтенсивна експресія VEGF переважно спостерігається у випадках ЦІН ІІІ та РШМ (46,8 % та 83,3% відповідно), в той час як для ЦІН ІІ та ЦІН І характерною є негативна або слабка імуногістохімічна реакція (93,3% та 72,4% відповідно). Інтенсивність VEGF експресії вище при ушкодженнях, асоційованих з ВПЛ ВКР. Інтенсивне VEGF забарвлення є 100% специфічним індикатором ЦІН і В-ПІУ, а також є специфічним тестом для визначення ВПЛ ВКР (94,6%).
Показники експресії естрогенових та прогестеронових рецепторів зворотно корелюють зі ступенем тяжкості диспластичних ушкоджень (r=-0,57) та позитивно пов’язані зі ступенем диференціювання інвазивних пухлин (r=+0,62). Негативна експресія ER та PgR є 100% специфічним методом виявлення ЦІН, 100% чутливим маркером низького ступеня диференціювання РШМ та чутливим індикатором наявності ДНК ВПЛ ВКР (92,7%).
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
При виявленні диспластичних чи неопластичних процесів шийки матки необхідно проводити додаткове імуногістохімічне дослідження з використанням комплексу маркерів з діагностичною метою для уточнення ступеня диспластичного ушкодження, у випадку інвазивних пухлин – для визначення ступеня диференціювання та типу пухлини.
Для поліпшення гістологічної діагностики В-ПІУ доцільно використовувати як скринінгові маркери антитіла до р16 та Кі-67 (чутливість для позитивного забарвлення з р16 складає 93,8%, НПЧ – 82,8%, для Кі-67 (рівень ІП > 10%) – 90,1% і 93,2% відповідно).
Для поліпшення гістологічної діагностики В-ПІУ як уточнюючі маркери рекомендується використовувати тести з 100% специфічністю та 100% ППЧ (інтенсивне забарвлення з VEGF, високий рівень р63 експресії та високий рівень індексу проліферації).
Для визначення ступеня диференціювання та типу ракових пухлини рекомендовано ІГХ дослідження експресії з ER та PgR, р53, Кі-67. Позитивна р63 експресія є 100% специфічним та 100% чутливим маркером плоскоклітинного диференціювання при РШМ.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Шпонька І.С., Дорохова О.В., Шпонька О.В. Прогностичне та діагностичне значення експресії маркерів біологічних властивостей тканин при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки // Медичні перспективи.- 2005.- Т.X, № 4.- С.8-16 (пошукувачем особисто проведений літературний огляд).
Дорохова О.В., Шпонька О.В., Шпонька І.С., Потапов В.А. Прогностичне та діагностичне значення експресії VEGF при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки // Патологія.- 2006.- Т.3, №3.- С. 32-36 (пошукувачем особисто проведено загальноморфологічне та імуногістохімічне дослідження, аналіз даних та сформульовано загальні висновки).
Дорохова О.В. Експресія Кі67, p16INK4A та р53 як показник онкогенної трансформації та ймовірності прогресії цервікальних інтраепітеліальних неоплазій // Морфологія.- 2006.- Т.І, №1.- С. 45-55.
Дорохова О.В., Шпонька О.В., Ханіна О.І. Експресія рецепторів естрогену і прогестерону в цервікальних інтраепітеліальних неоплазіях // Морфологія.- 2007.- Т.І, №2.- С. 41-46.
Пат. 181143 Україна, МПК А61В10/02. Спосіб прогнозування клінічного перебігу раку гортані / О.В.Ковтуненко, І.С.Шпонька, С.М.Тимчук, В.В.Березнюк, П.О.Гриценко, В.О.Бондарєва, О.В.Дорохова (Україна) - № 200606965; Заявл. 22.06.2006; Опубл. 16.10.2006. Промислова власність. Офіційний бюлетень.- 2006.- № 10.- 6 с. (особисто здобувачем зроблені морфологічні дослідження).
Пат. 21282 Україна, МПК А61В5/00. Спосіб прогнозування клінічного перебігу диспластичних і неопластичних процесів шийки матки / І.С.Шпонька, О.В.Шпонька, О.В.Дорохова, О.І.Ханіна, Б.Ю.Корнілов (Україна) - № 200608740; Заявл. 04.08.2006; Опубл. 15.03.2007. Промислова власність. Офіційний бюлетень.- 2007.- № 3.- 6 с. (особисто здобувачем зроблені морфологічні дослідження).
Дорохова О.В., Шпонька О.В. Експресія р63 при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки // Мат-ли II Всеукр. наук. морфол. конф. „Карповські читання”.- Дніпропетровськ: Пороги, 2005.- С. 28-30. (особисто здобувачем виконані морфологічні дослідження).
Дорохова О.В., Шпонька О.В. Показники васкуляризації тканин шийки матки при цервікальних інтраепітеліальних неоплазіях // Мат-ли ІII Всеукр. наук. морфол. конф. „Карповські читання”.- Дніпропетровськ: Пороги, 2006.- С. 16-18. (здобувачем зроблені морфологічні дослідження).
Дорохова Е.В., Шпонька Е.В., Потапов В.А. Прогностическое значение экспрессии р16ІNK4a, Кі67, р53, VEGF в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях // Патология шейки матки и генитальные инфекции – от теории к практике: Сб. науч. тр. (мат-лы Рос. науч.-практ. конф.).- Москва, 2007.- С. 25. (особисто здобувачем виконаний імуногістохімічний фрагмент дослідження).
АНОТАЦІЯ
Дорохова О.В. Діагностичне та прогностичне значення експресії маркерів при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки (імуноморфологічні аспекти).- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.02 - патологічна анатомія.- Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, Дніпропетровськ, 2007.
Дисертація присвячена вивченню експресії маркерів при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки для удосконалення їх гістологічної діагностики. В дослідженні вивчена інтенсивність процесів проліферації, диференціювання та онкотрансформації при диспластичних та неопластичних процесах та їх зв’язок з персистуючою інфекцією, викликаною вірусами папіломи людини. Вперше визначено взаємозв’язок між характером та ступенем виразності диспластичних та неопластичних процесів та рівнем експресії імуногістохімічних маркерів.
У результаті комплексного дослідження розроблені категорії оцінки експресії імуногістохімічних маркерів. Визначені чутливість, специфічність, негативне передбачувальне число та позитивне передбачувальне число для використання оцінки експресії кожного маркеру для виявлення диспластичних ушкоджень, наявності генетичного матеріалу вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику та ступеня диференціювання пухлин.
Ключові слова: рак шийки матки, дисплазії шийки матки, імуногістохімія, віруси папіломи людини.
АННОТАЦИЯ
Дорохова Е.В. Диагностическое и прогностическое значение экспрессии маркеров при диспластических и неопластических процессах шейки матки (иммуноморфологические аспекты).- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.02 - патологическая анатомия.- Днепропетровская государственная медицинская академия МЗ Украины, Днепропетровск, 2007.
Диссертация посвящена изучению экспрессии маркеров биологических свойств тканей при диспластических и неопластических процессах эпителия шейки матки для усовершенствования гистологической диагностики.
В исследовании изучена экспрессия VEGF, Кі-67, p63, ER, PGR, CD34, p16ІNK4A и р53 для определения интенсивности процессов неоваскулогенеза, пролиферации, дифференцировки, апоптоза и онкотрансформации при диспластических и неопластических процессах шейки матки и их связи с персистирующей инфекцией, вызванной вирусами папилломы человека высокого канцерогенного риска.
В работе изучена частота выявления возбудителя инфекции, вызываемой вирусами папилломы человека высокого и низкого канцерогенного риска в ткани шейки матки методом полимеразной цепной реакции и определена корреляция этих данных с вариантом дисплазий и инвазивных опухолей и уровнем экспрессии иммуногистохимических маркеров.
Впервые определена взаимосвязь характера и степени выраженности патологических процессов эпителия шейки матки с уровнем экспрессии иммуногистохимических маркеров биологических свойств тканей.
Нами установлено, что диффузная реакция с р16ІNK4A, маркером онкотрансформации, определяется в подавляющем большинстве наблюдений с умеренными и тяжелыми дисплазиями, инвазивными раками шейки матки и коррелирует с определением вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска, а также степенью выраженности диспластических и неопластических процессов эпителия шейки матки.
Индекс пролиферации, который определялся нами как процент клеток с положительной интрануклеарной реакция с Кі-67 к общему числу клеточных элементов, положительно коррелирует со степенью выраженности цервикальных интраэпителиальных неоплазий и степенью дифференцировки опухолей шейки матки. В работе предложены диапазоны значений индекса пролиферации, которые отражают степень нарушения процессов пролиферации при диспластических и раковых поражениях шейки матки.
Установлена прямая корреляционная связь степени диспластических изменений шейки матки с уровнем экспрессии р53. Определено, что положительная иммуногистохимическая реакция с р53 характерна для тяжелых дисплазий, раков in situ и инвазивных раков, тогда как случаи легкой и умеренной дисплазий ассоциированы с отрицательным р53-статусом. По нашим данным уровень экспрессии р53 не ассоциирован с инфицированностью вирусами папилломы человека высокого канцерогенного риска.
Установлена прямая корреляционная связь уровня дисплазии с количественными показателями интрануклеарных реакций и интенсивностью окрашивания с р63, маркером базальноклеточной дифференцировки. При анализе экспрессии р63 нами предложены диапазоны значений параметра, которые отражают степень нарушения дифференцировки клеток эпителия шейки матки при различных уровнях диспластических и неопластических процессов. Определено отсутствие корреляционной связи экспрессии р63 с уровнем индекса пролиферации. Установлено, что этот маркер является показателем плоскоклеточной дифференцировки и, следовательно, может использоваться как дифференциальнодиагностический критерий плоскоэпителиальной дифференцировки.
В нашем исследовании определена прямая корреляционная связь уровня экспрессии фактора роста эндотелия сосудов с относительным объемом капилляров (определялся с помощью маркера CD34, избирательно окрашивающего эндотелий сосудов), степенью тяжести диспластических повреждений и низкой степенью дифференцировки инвазивных опухолей шейки матки. Умеренная и интенсивная экспрессия фактора роста эндотелия сосудов наблюдается преимущественно в случаях тяжелых дисплазий, раков in situ и инвазивных раков, тогда как для легкой и умеренной дисплазий характерна отрицательная и слабая иммуногистохимическая реакция. Интенсивность иммуногистохимических реакций с антителами к фактору роста эндотелия сосудов выше при повреждениях, ассоциированных с вирусами папилломы человека высокого канцерогенного риска.
Определяется обратная корреляционная связь показателей экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов со степенью тяжести диспластических повреждений и прямая корреляционная связь параметров экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов со степенью дифференцировки инвазивных опухолей.
В результате комплексного исследования определены такие параметры как чувствительность, специфичность, отрицательное предсказательное число, положительное предсказательное число для использования оценки экспрессии каждого маркера для выявления степени диспластических процессов в эпителии шейки матки, наличия вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска и степени дифференцировки опухолей. Представлены возможные точки приложения использования иммуногистохимического исследования маркеров в клинике как скрининговых и подтверждающих методов.
Ключевые слова: рак шейки матки, дисплазии шейки матки, иммуногистохимия, вирусы папилломы человека.
SUMMARY
Dorokhova O.V. Diagnostic and prognostic value of marker expression in dysplastic and neoplastic processes of uterine cervix (immunomorphological aspects).- Manuscript.
The thesis for a scientific degree of Candidate of Medical Sciences in specialty 14.03.02 - pathologic anatomy.- Dnipropetrovsk state medical academy of MHP of Ukraine, Dnipropetrovsk, 2007.
The thesis is dedicated to the study of expression of markers in dysplastic and neoplastic processes of uterine cervix for the improvement of their hystological diagnostics. The intensity of processes of proliferation, differentiation and oncotransformation in displastic and neoplastic processes and their relation to persistent oncogenic human papillomavirus infection was studied in this assay. Correlation between the nature and the degree of extent of displastic and neoplastic processes and intensity of expression of immunohistochemical markers was determined for the first time.
Categories for evaluation of expression of immunohistochemical markers were developed as a result of complex research. Sensitivity, specificity, negative predictive value, positive predictive value for use of evaluation of expression of each marker for detection of displastic lesions, presence of oncogenic human papillomaviruses and grade of tumor differentiation were defined.
Key words: cancer of uterіne cervіx, cervіcal іntraepіthelіal dysplasіa, іmmunohіstochemіstry, human papіlloma vіruses.
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АК - аденокарциноми
ВДАК - високодиференційовані аденокарциноми
В-ПІУ - плоскоінтраепітеліальні ушкодження високого ступеня
ВПЛ ВКР - віруси папіломи людини високого канцерогенного ризику
ВПЛ НКР - віруси папіломи людини низького канцерогенного ризику
ДНК - дезоксірібонуклеїнова кислота
ЕШМ - епітелій шийки матки
ЗПР - зроговілі плоскоклітинні раки
ІГХ - імуногістохімія
ІП - індекс проліферації
НДАК - низькодиференційовані аденокарциноми
НПР - незроговілі плоскоклітинні раки
НПЧ - негативне передбачувальне число
Н-ПІУ - плоскоінтраепітеліальні ушкодження низького ступеня
ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція
ППЧ - позитивне передбачувальне число
ПР - плоскоклітинні раки
РШМ - рак шийки матки
ЦІН – цервікальні інтраепітеліальні неоплазії
ШМ - шийка матки
CIS - carcinoma in situ
ER - естрогенові рецептори
PgR - прогестеронові рецептори
VEGF - фактор росту ендотелію судин
1 2 3