Результати дослідження та їх обговорення.
У нашому дослідженні при аналізі інфікованості ВПЛ визначено, що в контрольній групі кількість випадків, в яких не було виявлено ВПЛ, достовірно перевищувала число спостережень з визначеними ВПЛ НКР та ВПЛ ВКР. З іншого боку, в групі ЦІН та РШМ кількість випадків з ВПЛ ВКР була значно більше, ніж число ВПЛ НКР-позитивних та ВПЛ-негативних спостережень. Такий розподіл інфікованості ВПЛ ВКР та НКР серед досліджуваних пацієнток свідчить про безумовне превалювання ВПЛ ВКР у пацієнток з пухлинними та передпухлинними процесами. Проте, з урахуванням можливого виявлення матеріалу ВПЛ у пацієнток з Н-ПІУ та відсутності ВПЛ ВКР у деяких В-ПІУ та інвазивних раках, визначення ДНК ВПЛ методом ПЛР не є достатнім для віднесення жінки з позитивним результатом до групи з високим ризиком прогресії ушкодження ЕШМ, що узгоджується з даними літератури (Meijer C.J. та ін., 1992; Nicolas F. Schlecht та ін., 2003).
У результаті проведеного імуногістохімічного дослідження експресії онкопротеїну р16INK4A визначено, що рівень експресії цього маркеру при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки суттєво відрізняється від контрольної групи (табл.1).
Таблиця 1
Експресія p16INK4A у залежності від ступеня
ушкоджень епітелію шийки матки
| Діагноз | n | Експресія p16INK4A | ||
| Негативна | Фокальна | дифузна | ||
| Норма | 7 | 7 (100%) | 0 | 0 |
| ЦІН І | 30 | 22 (73,3%) | 8 (26,7%) | 0 |
| ЦІН ІІ | 29 | 4 (13,8%) | 11 (37,9%) | 14 (48,3%) |
| ЦІН ІІІ | 32 | 1 (3,2%) | 5 (15,6%) | 26 (81,2%) |
| Раки | 36 | 1 (2,8%) | 4 (11,1%) | 31 (86,1%) |
| Всього | 134 | 35 (26,1%) | 28 (20,9%) | 71 (53,0%) |
У зв’язку з тим, що субклітинна локалізація барвника при визначенні онкопротеїну p16ІNK4a значно змінюється, ми вважали як позитивний кожен випадок, у якому забарвлення визначалось або в цитоплазмі, або в ядрах і в цитоплазмі, тобто спостерігалась змішана позитивна реакція.
Всі спостереження контрольної групи мали негативний імуногістохімічний статус до р16INK4A. При ЦІН І визначались два варіанти імуногістохімічної реакції – фокальний та негативний. При цьому кількість випадків з негативною реакцією статистично вагомо (більше ніж у 2,5 рази) перевищувала число ушкоджень з фокальним варіантом забарвлення. У групі ЦІН ІІ ми визначали всі можливі варіанти забарвлення – негативне, фокальне та дифузне, причому кількість випадків з дифузною реакцією була більшою, ніж з фокальним типом реакції на 10%, а з негативною експресією – майже у 3,5 рази (р<0,05). Встановлено, що при ЦІН ІІІ кількість випадків з дифузною реакцією достовірно перевищувала число випадків з фокальною та негативною реакцією – у 5 та 26 разів відповідно. У групі інвазивних раків ШМ дифузний тип реакції спостерігався в 31 випадку (86,1%), що було в 8 разів частіше, ніж фокальна реакція, та в 31 раз – ніж негативна.
При ЦІН І у випадках з фокальним забарвленням спостерігалась слабка реакція 20-35% клітин базального та парабазального шарів, у спостереженнях з негативною реакцією визначалось слабке забарвлення до 5% клітин базального шару. При ЦІН ІІ у спостереженнях з дифузним типом забарвлення ми виявили переважно помірну реакцію в клітинах нижніх двох третин епітеліального шару, у випадках, віднесених до фокального типу, кількість р16INK4A-позитивних клітин коливалась від 20 до 60%, останні розташовувались у нижніх ділянках епітеліального шару, інтенсивність реакції була помірною та слабкою. У групі ЦІН ІІІ у спостереженнях з дифузним забарвленням переважала інтенсивна змішана реакція в клітинах всієї товщі епітелію, кількість позитивно забарвлених клітин дорівнювала 80-95%, в спостереженнях з фокальним типом забарвлення з p16ІNK4a кількість клітин з помірною та високою позитивною реакцією коливалась від 40 до 70%.
При інвазивних раках шийки матки імуногістохімічна реакція частіше була гетерогенною, з різною інтенсивністю. У зонах інвазивного росту пухлини інтенсивність реакцій в клітинах підсилювалась. Тільки 4 з 36 випадків були віднесені до фокального типу реакції, причому кількість р16INK4A-позитивних клітин коливалась у межах 65-75%, інтенсивність забарвлення розцінювалась як висока та помірна. В 31 випадку спостерігалась дифузна реакція з переважно високою інтенсивністю.
Ми встановили прямий зв'язок рівня р16INK4A експресії з наявністю ВПЛ ВКР. Так, негативна реакція з р16INK4A була асоційована з ВПЛ високого канцерогенного ризику в 8,95% випадків, тоді як фокальна та дифузна – в 14,1% та 49,2% спостережень відповідно. Отже, експресія онкопротеїну р16INK4A є 100% специфічним індикатором ЦІН, чутливим показником В-ПІУ (93,8%) та визначення ВПЛ ВКР (87,6%). Отримані нами результати щодо частоти експресії р16INK4A при різних ступенях ЦІН та інвазивних раках узгоджуються з літературними даними (Klaes R. та ін., 2001; Sano T. та ін., 1998). З іншого боку, в дослідженнях Wang S. та співавт. (2004) всі ЦІН ІІІ були дифузно забарвлені незалежно від ВПЛ статусу, а при дисплазіях легкого ступеня спостерігався дифузний тип реакцій.
У нашому дослідженні при аналізі рівня проліферативної активності було визначено, що показники індексу проліферації (ІП) при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки суттєво перевищують відповідні значення в контрольній групі (табл.2).
Зокрема, при ЦІН І ІП статистично вагомо перевищував аналогічний показник в групі жінок з патологією шийки матки без диспластичних ушкоджень більш ніж у 2 рази, тоді як при ЦІН ІІ – майже у 6 разів (р<0,05). Встановлено, що ІП при ЦІН ІІІ та РШМ достовірно перевищував параметри в контрольній групі (в 14 та 16 разів відповідно). Індекс проліферації в НПР вірогідно перевищував загальний показник ЗПР на 18,6%. Подібну тенденцію ми спостерігали і при АК: при НДАК ІП був вище на 17,3% (р<0,05), ніж у випадках ВДАК.
Таблиця 2
Середні значення індексу проліферації в залежності від ступеня
ушкоджень епітелію шийки матки
| Діагноз | n | Середнє значення ІП, (Mm) |
| Норма | 7 | 4,291,11 |
| ЦІН І | 30 | 9,230,68 |
| ЦІН ІІ | 29 | 23,92,30 |
| ЦІН ІІІ | 32 | 62,82,18 |
| Раки | 36 | 72,02,43 |
| ЗПР | 18 | 64,43,19 |
| НПР | 9 | 83,01,68 |
| ВДАК | 6 | 70,36,08 |
| НДАК | 3 | 87,64,29 |
| Всього | 134 | 41,81,18 |
У контрольній групі імуногістохімічна реакція з Кі-67 виявлялась в ядрах окремих клітин базального та парабазального шарів. При ЦІН І частота Кi-67-позитивних клітин парабазального шару коливалась від 5 до 20%. У випадках ЦІН ІІ кількість клітин з інтрануклеарною реакцією збільшувалась до 10-50%, позитивно забарвлені клітини займали від 1/3 до 2/3 товщі ЕШМ, інтенсивність імуногістохімічної реакції була помірною та високою. При ЦІН ІІІ кількість диспластично змінених клітин з переважно високою інтрануклеарною реакцією коливалась від 45 до 80%, розташовувались вони гетеротопічно в усіх шарах епітелію, в тому числі і зовнішніх. В РШМ ІП коливався в межах від 45% до 90% з високою інтенсивністю реакцій у більшості клітин. У випадках ЗПР ділянки зроговіння характеризувались відсутністю Кi-67-позитивності клітин. Найбільш чисельними й інтенсивними були інтрануклеарні ІГХ реакції в зонах інвазивного росту пухлин.
Проведений нами аналіз відмінностей показників ІП у різних групах ЦІН та інвазивних раках дав підстави запропонувати діапазони значень параметра, які відображають залежність останніх від ступеня диспластичних та неопластичних ушкоджень ЕШМ: високий ІП при забарвленні більш 50% клітин, низький – при реакції менше10% клітин, 10-50% - помірна проліферативна активність. Це загалом узгоджується з підходами ряду авторів (Cambruzzi E., 2005), хоча деякі автори пропонують інші варіанти оцінки рівня експресії Кі-67 при патології ШМ (Фролова И. И. та ін., 2002).
Виявлено, що ІП в однорідних групах був суттєво вищим в ушкодженнях асоційованих з ВПЛ ВКР. Так, низький ІП визначався лише в 8,2% випадків, що містили ДНК ВПЛ ВКР, в той час як помірний та високий – в 25,3% та 40,2% спостережень відповідно. Індекс проліферації позитивно корелює зі ступенем диспластичних та неопластичних ушкоджень (r=+0,89) та ступенем диференціювання, тобто агресивною поведінкою інвазивних пухлин (r=+0,65). Таким чином, експресія Kі-67 збільшується з мірою наростання рівня онкотрансформацій епітелію шийки матки і досягає максимуму при інвазивному раці шийки матки. Високий рівень проліферації є 100% специфічним індикатором ЦІН та В-ПІУ та специфічним тестом для визначення ВПЛ ВКР (94.6%), рівень ІП вищий за 10% є чутливим тестом виявлення В-ПІУ (90,1%), що узгоджується з іншими дослідженнями (Ohara M., 2004).
При вивченні рівня експресії VEGF в контрольній групі нами не виявлено випадків VEGF - позитивного статусу. Відносний об’єм капілярів у субепітеліальній і глибоких зонах слизової оболонки дорівнював 13,51,00 мкм3/мкм3 та 13,20,97 мкм3/мкм3 відповідно. При оцінці експресії VEGF в епітелії шийки матки при ЦІН І 63,3% випадків ми розцінили як негативні, в 2 ушкодженнях визначалась помірна експресія цього маркера. ВОК під епітелієм складав 19,40,67 мкм3/мкм3, в глибоких зонах – 17,80,61 мкм3/мкм3. При ЦІН ІІ в 48,2% випадків спостерігалось слабке забарвлення, в 27,5% – помірне, в 24,1% ушкоджень ми не виявили імуногістохімічної реакції. ВОК під епітелієм та в глибоких зонах дорівнював 22,10,54 мкм3/мкм3 та 20,10,49 мкм3/мкм3 відповідно. Помірна та інтенсивна експресія VEGF асоціювалась з випадками ЦІН ІІІ та інвазивними раками. Зокрема, при ЦІН ІІІ кількість випадків з помірним і інтенсивним забарвленням було 10 (31,2%) і 15 (46,8%) відповідно, в решті спостережень спостерігались слабка та негативна експресія. ВОК під епітелієм дорівнював 34,21,06 мкм3/мкм3, в глибоких зонах – 28,70,92 мкм3/мкм3. При інвазивних раках помірна реакція зустрічалась в 25% спостережень, а інтенсивна - в 58,3%. 2 спостереження ВДАК та 3 випадки ЗПР ми віднесли до групи із слабкою реакцією, один випадок ЗПР був розцінений як негативний. Серед групи пухлин з інтенсивною експресією VEGF переважали НПР та НДАК. Показники ВОК в стромі раків складали в середньому 32,10,95 мкм3/мкм3.
Інтенсивність імуногістохімічних реакцій з VEGF була вищою в ушкодженнях, асоційованих з ВПЛ ВКР. Так, негативний статус до VEGF в ушкодженнях, асоційованих з ВПЛ ВКР, спостерігався тільки у 5,22% випадків, тоді як слабка, помірна та інтенсивна – в 20,1%, 21,6% та 25,3% випадків відповідно. З одного боку, ці дані узгоджуються з рядом досліджень (Branca M. та ін., 2006; Terlikowski S. та ін., 2001). З іншого, в літературі описана відсутність кореляції між рівнем VEGF та відносним об’ємом капілярів (Soini Y. та ін., 1996; Hashimoto I. та ін., 2001). У нашому дослідженні визначено прямий кореляційний зв’язок рівня експресії VEGF з відносним об’ємом капілярів (r=+0,76), ступенем тяжкості диспластичних ушкоджень (r=+0,79) та низьким ступенем диференціювання інвазивних пухлин (r=+0,70). Таким чином, інтенсивне VEGF забарвлення є 100% специфічним індикатором ЦІН і В-ПІУ та є специфічним тестом для визначення ВПЛ ВКР (специфічність дорівнює 94,6%).
Для вивчення процесів диференціювання в ЕШМ ми провели аналіз показника експресії р63 у пацієнток з диспластичними та неопластичними процесами шийки матки. Середнє значення індексу експресії р63 при ЦІН І (27,01,05) статистично вагомо перевищувало аналогічний показник у контрольній групі (9,140,91) майже у 3 рази, при ЦІН ІІ (45,22,22) –у 5 разів (р<0,05). Показники р63 позитивності при ЦІН ІІІ (72,22,06) та інвазивних раках (65,06,33) достовірно перевищували контрольні показники у 8 та 7 разів відповідно.
У незміненому епітелії позитивна імуногістохімічна реакція з р63 виявлялась виключно в ядрах клітин базального шару. При ЦІН І частота р63-позитивних ядер коливалась від 20 до 40%, усі вони переважно розташовувалися в базальному та парабазальному шарах. У випадках ЦІН ІІ позитивно забарвлені клітини займали від 1/3 до 1/2 товщі епітеліального шару шийки матки, кількість клітин з р63-позитивними ядрами складала 40-60%. При ЦІН ІІІ частота диспластично змінених клітин з ядрами, що позитивно реагують на р63, коливалась від 60 до 90%, при цьому клітини з імуногістохімічною міткою виявлялися в усіх шарах епітелію.
У випадках ПР спостерігались найбільш високі показники експресії р63, кількість клітин з інтрануклеарною реакцією сягала 90-100%. Індекс р63 позитивності при НПР статистично вагомо перевищував аналогічний показник у ЗПР на 11%. Слід відзначити, що експресія р63 в аденокарциномах була мінімальною, що обумовлює використання цього маркеру як диференціальнодіагностичного для визначення плоскоепітеліальної природи пухлини.
При аналізі експресії р63 нами запропоновано діапазони значень параметра, які відображають залежність порушення диференціювання клітин ЕШМ від ступеня диспластичних та неопластичних ушкоджень: низький рівень р63 експресії (<30% клітин з інтрануклеарною реакцією), помірний рівень (30-75%) та високий - >75% клітин з імуногістохімічною міткою в ядрах. Згідно нашим даним, рівень експресії р63 був суттєво вищим в ушкодженнях, асоційованих з ВПЛ ВКР. Зокрема, низький рівень р63 експресії визначався лише в 11,9% випадків, що містили ДНК ВПЛ ВКР, тоді як помірний та високий – в 29,1% та 31,3% спостережень відповідно.
Не визначено значного кореляційного зв’язку експресії р63 з рівнем ІП. Позитивна р63 експресія є 100% специфічним методом виявлення ЦІН та 100% специфічним і 100% чутливим маркером плоскоклітинного диференціювання при РШМ, високий рівень р63 експресії є 100% специфічним методом виявлення В-ПІУ та ВПЛ ВКР. При цьому була визначена висока пряма кореляція між ступенем диспластичних ушкоджень шийки матки, кількісними показниками інтрануклеарних реакцій та інтенсивністю забарвлення з р63 (r=+0,89).
Проведений нами аналіз відмінностей середніх значень р53 експресії у всіх клінічних групах дає підстави передбачати зв’язок між рівнем р53 експресії та ступенем диспластичних і непластичних процесів ЕШМ. Так, при ЦІН І індекс р53 експресії (1,900,23) статистично вагомо перевищував аналогічні показники в контрольній групі (0,210,14) (більш як в 9 разів), а при ЦІН ІІ (4,550,42) – у 21 раз (р<0,05). Середній рівень р53 позитивності при ЦІН ІІІ (27,13,19) та інвазивних раках (27,13,19) різко перевищував контрольні показники – в 129 та 183 рази відповідно. Середнє значення р53 позитивності при НПР достовірно перевищувало аналогічний показник у ЗПР майже у 2 рази. Подібну тенденцію ми спостерігали і в аденокарциномах: у НДАК середній показник р53 експресії був вище майже у 2 рази, ніж у випадках ВДАК (р<0,05).
У контрольній групі виявлялось 0-1% позитивно забарвлених з р53 клітин базального шару слабкої інтенсивності. При ЦІН І кількість р53-позитивних ядер коливалась від 0 до 4 % зі слабкою та помірною інтенсивністю реакції. При ЦІН ІІ кількість клітин з позитивно забарвленими ядрами коливалася від 0 до 10%; інтенсивність реакції була слабкою та помірною. При ЦІН ІІІ кількість клітин з інтрануклеарною реакцією коливалась від 0 до 55%, інтенсивність реакцій переважно була помірною, рідше слабкою та інтенсивною. Топологічно більшість позитивно забарвлених клітин визначалась у базальному та парабазальному шарах епітелію. В групі пацієнток з ВДАК та ЗПР реакція спостерігалася у 10-40% клітин зі слабкою інтенсивністю реакції. В НДАК та НПР кількість забарвлених клітин досягала 60-70%, з помірним та високим ступенем інтенсивності реакцій.
У нашому дослідженні ми розподілили всі випадки диспластично та неопластично зміненого ЕШМ та спостереження контролю на групи з позитивним і негативним статусом щодо р53 експресії з урахуванням ступеня інтенсивності імуногістохімічного забарвлення та кількості клітин з інтрануклеарною реакцією. При забарвленні менше 5% ядер, поза залежністю від інтенсивності, пухлина або диспластично змінений епітелій вважалися р53-негативними. Позитивний статус до р53 встановлювався при: 1) забарвленні більш 50% ядер поза залежністю від інтенсивності, 2) інтенсивному забарвленні більш 5% ядер, 3) помірному забарвленні 10-50% ядер. Ряд авторів використовують спрощений варіант оцінки р53 експресії: при забарвленні більше 5% ядер, поза залежністю від інтенсивності, матеріал вважають р53-позитивним (Herbsleb M. та ін., 2001; Klussmann J.P. та ін., 2003).
Згідно з нашими даними, рівень експресії р53 не залежав від наявності ВПЛ ВКР. Позитивна р53 експресія є 100% специфічним методом виявлення ЦІН та є чутливим, але не специфічним, маркером низького ступеня диференціювання РШМ (чутливість – 100%, специфічність - 29,2%). Дослідження виявило прямий кореляційний зв’язок між ступенем диспластичних ушкоджень шийки матки і експресією р53 (r=+0,69). Отже, з наростанням неопластичних процесів в епітелії шийки матки від ЦІН І до ЦІН ІІІ та інвазивних раків експресія продуктів цього гена збільшується і забарвлення з р53 виявляється в ядрах клітин з ознаками атипії в усіх епітеліальних шарах.
При проведенні імуногістохімічних реакцій до рецепторів стероїдних гормонів було визначено, що в незміненому епітелії шийки матки (контрольна група) клітини базального шару були негативними у відношенні експресії PgR та позитивними у відношенні експресії ER, без кореляції з фазою менструального циклу. Парабазальні клітини демонстрували позитивну реакцію з ER та негативну – з PgR у фолікулярній фазі. При ЦІН І ми спостерігали позитивну реакцію з PgR у 26,6% та з ER у 20,0% спостережень. Всі позитивно забарвлені клітини розташовувались у базальному та парабазальному шарах епітелію. При ЦІН ІІ позитивна реакція з PgR була визначена в 20,7%, з ER - у 13,7% спостережень. 6 випадків ЦІН ІІІ (18,7%) були ER-позитивними та 5 випадків (15,6%) – PgR-позитивними, в той час як більшість ушкоджень такого типу були негативними щодо експресії стероїдних рецепторів.
При інвазивних плоскоклітинних раках імуногістохімічна реакція з PgR спостерігалась у 19,4% випадків, причому в 1 випадку кількість клітин з імуногістохімічною реакцією сягала 40-50%. Експресія ER спостерігалась у 4 випадках РШМ (11,1%), кількість клітин з імуногістохімічною реакцією (не лише в різних пухлинах, але і в різних зонах однієї і тієї ж пухлини) коливалася значною мірою та становила від 5 до 20%. АК шийки матки були PgR-позитивними в 3 із 9 випадків, ER-позитивними – в 2 спостереженнях. Інтенсивність забарвлення та кількість позитивних клітин позитивно корелювали зі ступенем гістологічного диференціювання інвазивних пухлин (r=+0,62).
Негативна експресія як ER, так і PgR є 100% специфічним методом виявлення ЦІН та 100% чутливим маркером низького ступеню диференціювання пухлин шийки матки; негативна реакція з ER рецепторами є чутливим індикатором наявності ДНК ВПЛ ВКР (92.7%), хоча специфічність та ППЧ дорівнюють лише 16,6% та 37,5% відповідно. Таким чином, в нашому дослідженні був визначений зворотний зв’язок ступеня ушкодження шийки матки з інтенсивністю забарвлення з ER та PgR.
1 2 3