На правах рукопису
НАЧАРОВ Петро Васильович
Прогностичне значення білків теплового шоку ПРИ ВІЛ-ІНФЕКЦІЇ
14.00.10-інфекційні хвороби
АВТОРЕФЕPAT дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
1997
Робота виконана у Військово-медичної академії.
Науковий керівник:
доктор медичних наук Є. І. Змушко.
Науковий консультант:
доктор медичних наук професор Ю. В. Лобзин.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук професор В. В. Іванова, доктор медичних наук професор А. Г. Рахманова.
Провідна установа-Російський науково-методичний центр та профілактиці і боротьбі зі СНІДом.
Захист дисертації відбудеться "" ............... 1997
в .... годині на засіданні спеціалізованої ради Д 106.03.05
при Військово-медичної академії (194044, м. Санкт-Петербург, вул. Лебедєва, 6).
З дисертацією можна ознайомитися у фундаментальній бібліотеці академії.
Автореферат розісланий
1997
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук професор Ю. І. Ляшенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА
РОБОТИ Актуальність проблеми. У Росії питання стратегії і тактики боротьби з ВІЛ-інфекцією визначені
роботами В. І. Покровського (1988: 1989; 1993). В. І. Покровський (1987) передбачив прийдешній розмах поширення ВІЛ-інфекції в країні і впровадив у практичну охорону здоров'я структуру, призначену для боротьби зі СНІДом. В даний час ВІЛ-інфекція охопила всі країни світу. На середину 1996 року загальна кількість інфікованих вірусом імунодефіциту у всьому світі досягло 27900 тисяч чоловік (Рахманова А.Г., 1996). Незважаючи на те, що виконаний безпрецедентно великий обсяг наукових досліджень з. проблемі ВІЛ-інфекції, запропоновані методи лікарської терапії, що дозволяють домагатися тимчасового поліпшення
стану хворих на
СНІД. до теперішнього часу не відомий жоден достовірний
випадок одужання, тому СНІД вважають хворобою з летальністю
100%. Проблема ВІЛ-інфекції ускладнюється ще й тим фактом, що з початку дев'яностих років ВІЛ все більш і більш завойовує основну популяцію населення, в той час як протягом перших десяти років поширення йшло переважно серед певних груп населення, так званих "груп ризику" - наркомани , гомосексуалісти. повії, хворі на гемофілію (Лобзин Ю.В., Казанцев А.П.. 1996). Актуальність проблеми визначає некероване інтенсивне зростання випадків інфікованості, хворобливості та смертності в усіх
країнах світу (Шувалова Е.П., 1995). Виявлення ВІЛ-інфікованих осіб не призводить до припинення передачі ВІЛ від них, незважаючи на повідомлення їх про
кримінальну відповідальність за зараження (Покровський В.В. з співавт., 1996). Не вирішеними залишаються основні
проблеми СНІДу (Бєлозьоров Є.С. з співавт., 1995): - відсутність методів ранньої діагностики: - повна некерованість
патологічних процесів у хворого: - відсутність надійних клінічних та лабораторних показників переходу інфекційного
процесу з латентної стадії в маніфестних. При СНІД та ВІЛ-інфекції досить добре вивчені основні лабораторні діагностичні показники, що свідчать про інфікування (Змушко Є.І. з співавт., 1996). Однак питання
прогнозування клінічного перебігу ВІЛ-інфекції вимагають подальшого вивчення. Найбільше клінічне значення має прогноз переходу від безсимптомної фази до персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ), а також від ПГЛ до стадії вторинних захворювань, який важливий для своєчасного призначення етіотропних і патогенетичних засобів (Рахманова А.Г..
Чайка Н.А., 1989) . При пошуку нових тестів, які давали б уявлення про стан імунокомпетентних клітин крові при ВІЛ-інфекції, звернула на себе увагу група порівняно недавно відкритих внутрішньоклітинних білків, які отримали назву "
білки теплового шоку" (БТШ) або "стресові білки". Ці
білки недостатньо вивчені, але вже наявні дані говорять, що вони високо консервативні в
процесі філогенезу (Lindqulst S., 1986), незвично поліфункціональні - відіграють важливу роль у багатьох внутрішньоклітинних імунобіохімічних
процесах як в екстремальних, так і в нормальних умовах (Polla BS, 1988), що дозволяє припустити про участь білків теплового шоку у формуванні патобіохімічних внутрішньоклітинних зв'язків при ВІЛ-інфекції. У
відповідь на вплив несприятливих факторів, в тому числі і вірусної
інфекції, формується неспецифічна клітинна реакція, яка супроводжується посиленням процесів вільнорадикального окислення (Іванова В.В. з співавт., 1992: 1996), синтезом білків теплового шоку (Kaufman SHE. 1990) і є одним з
механізмів дестабілізації геному клітин-мішеней. У цих умовах важливою є роль ферменту ксантиноксидази, яка служить генератором вільних радикалів при ряді патологічних станів клітини і є найбільш значущою серед прооксидантних систем,
характерних для лімфоїдної клітини (Кожем'якін Л.А. із співавт .. 1992). Відсутність у літературі даних по комплексній оцінці процесів дестабілізації геному, пов'язаних з активністю вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази в імунокомпетентних клітинах крові в динаміці розвитку ВІЛ-інфекції не дозволяє визначити значимість названих показників для прогнозу клінічного перебігу хвороби. Мета дослідження: дати оцінку можливості використання показників білків теплового шоку сімейства БТШ-70 та комплексу біохімічних змін в мононуклеарах периферичної крові в прогнозуванні клінічного перебігу ВІЛ-інфекції. Для досягнення зазначеної мети необхідно було вирішити следуюіе завдання: 1. Вивчити динаміку традиційних показників імунного стату-а у ВІЛ-інфікованих і визначити їх прогностичну значущість при переході клінічного перебігу хвороби з однієї стадії в іншу. 2. Вивчити зміни активності ксантиноксидази, інтенсивності процесів вільнорадикального окислення і показників нестабільності геному мононуклеарів периферичної крові при ВІЛ-інфекції та оцінити їх прогностичну значимість. 3. Розробити методичні підходи до створення імунологічного методу для кількісного та якісного аналізу білків сімейства БТШ-70. 4. Вивчити показники білків сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові на різних фазах ВІЛ-інфекції. 5. Визначити взаємозв'язок змін білків сімейства БТШ-70 та комплексу біохімічних показників дестабілізації геному. вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази мононуклеарів периферичної крові у хворих у динаміці захворювання та оцінити їх значимість для прогнозу клініко-маніфестних форм ВІЛ-інфекції. Наукова новизна: 1. Вперше встановлено, що наростання накопичення конститутивний ізоформи білків сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові ВІЛ-інфікованих пропорційно ступеня вираженості клінічних проявів хвороби. 2. Показано зв'язок зміни показників білків сімейства БТШ-70 з рівнем нестабільності геному, активністю процесів вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази в мононуклеарах периферичної крові у хворих на ВІЛ-інфекцію в процесі розвитку клінічної картини захворювання. 3. Встановлено, що зміна стану білків сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові адекватно відображає вірогідність переходу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази у фазу персистуючої генералізованої лімфаденопатії і від персистуючої генералізованої лімфаденопатії до стадії вторинних захворювань. 4. Встановлено, що ВІЛ-інфекція викликає порушення реакції білків теплового шоку (БТШ-70) мононуклеарів периферичної крові у відповідь на ушкоджують впливу (гіпертермія. ультрафіолетове опромінення). Практична значимість
роботи. Комплекс показників, що відображають стан системи білків теплового шоку, системи ксантиноксидази, процесів вільнорадикального і нестабільності геному мононуклеарів периферичної крові, в сукупності з традиційними імунологічними показниками може бути використаний для прогнозування переходу клінічного перебігу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази у фазу ПГЛ і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. Вивчення показників білків теплового шоку мононуклеарів периферичної крові людини як захисного механізму неспецифічної дії може може бути застосовано для оцінки ефективності лікарських засобів з імуномодулюючими властивостями, а також для розробки нових діагностичних підходів до прогнозування імунодефіцитних станів різної етіології. Основні положення, що виносяться на захист: 1. Перехід клінічного перебігу захворювання від безсимптомної фази до персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань характеризується збільшенням вмісту конститутивний ізоформи сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові. 2. Зміни вмісту білків сімейства БТШ-70 в процесі ВІЛ-інфекції відбуваються на тлі збільшення показників нестабільності геному, інтенсифікації процесів вільнорадикального окислення та підвищення активності ксантиноксидази в мононуклеарах периферичної крові. 3. Показники білків сімейства БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові в сукупності з традиційними імунологічними показниками можливо використовувати для прогнозування переходу клінічного перебігу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази у фазу персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. Апробація роботи. Результати досліджень були докладені на XI-й і XII-й наукових конференціях молодих вчених академії (ВМедА,
Ленінград, 1990; ВМедА, Санкт-Петербург, 1992), на VI-му Всесоюзному біохімічному з'їзді (Санкт-Петербург, 1992), на Першій міжнародній регіональній конференції з ВІЛ-інфекції "Соціальні та медичні проблеми СНІДу" (Санкт-Петербург, 1994). на засіданні Санкт-Петербурзького відділення Російського наукового товариства інфекціоністів (Санкт-Петербург, 1996), на IV міжнародній конференції "СНІД, рак і споріднені проблеми" (Санкт-Петербург. 1996), на III Всеросійському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Санкт-Петербург. 1996).
Матеріали дисертації використані у звітах по темі НДР N 50-93-В12 "Біохімічні механізми формування імунодефіцитів під впливом ВІЛ і імунодіагностика імунодефіцитних станів хворих на СНІД" і по темі НДР N 60-95-П4 "Дослідження ролі системи білків теплового шоку в
патогенезі ВІЛ- інфекції ". Реалізація результатів роботи. За темою дисертації опубліковано 7 наукових робіт. Результати роботи використовуються в практиці навчального процесу та науково-дослідній роботі кафедри інфекційних хвороб, кафедри клінічної біохімії і лабораторної діагностики, у роботі НДЛ СНІДу та інфекційних захворювань у ЗС РФ Військово-медичної академії, кафедри інфекційних хвороб
Семипалатинського державного медичного інституту, кафедри ЛОР-хвороб з курсом алергології та імунології Чімкентского державного медичного інституту, кафедри інфекційних хвороб Волгоградського державного медичного університету. Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 171 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, п'яти розділів власних досліджень. обговорення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку літератури, що включає 61 вітчизняний і 140 зарубіжних джерел. Дисертація ілюстрована 24 малюнками і 17 таблицями. ЗМІСТ РОБОТИ 1. Загальна характеристика хворих та методів дослідження У процесі роботи були обстежено 34 інфікованих та хворих на ВІЛ-інфекцією, серед яких переважали особи чоловічої статі у віковій категорії від 20 до 39 років. Клінічне спостереження та
обстеження хворих проводили в лікарні N 30 імені С.П. Боткіна м.
Санкт-Петербурга, Республіканської клінічної інфекційної лікарні м. Усть-Іжори Ленінградської області, в Центрі по боротьбі та профілактиці СНІДу м.Санкт-Петербурга. Хворі були розподілені по групах
відповідно до клінічної класифікації В. І. Покровського (1989). ВІЛ-інфікованих в стадії інкубації і хворих у термінальній стадії не обстежили.
Контрольну групу склали 25 практично здорових чоловіків (донорів крові) у віці від 20 до 39 років - військовослужбовці.
Імунологічні та біохімічні дослідження проводили у Військово-медичної академії, визначення білків теплового шоку - на базі інституту цитології Академії наук. Діагноз ВІЛ-інфекції верифікували серологічно - за наявності в крові специфічних антитіл до ВІЛ за допомогою тест-систем для гетерогенного імуноферментного аналізу методом подвійних антитіл (виробництва фірм СП "діаплюс". Росія-Швейцарія, СП "Авіценна", Росія-Сирія). Результати імуноферментного аналізу підтверджували за допомогою імуноблотингу ("Du Pont", США). Для оцінки імунного статусу у обстежених пацієнтів вивчали такі показники: кількість
лейкоцитів, лімфоцитів; субпопуляції Т-лімфоцитів за допомогою проточного цитофлюориметр "EPICS-C" (Coulter elektronics. США-Франція) з застосуванням моноклональних антитіл
фірми "Ortho Diagnostic Systems" (США) : РГМЛ з Конан визначали за методом M. George. JHVaughan (1962); кількість В-лімфоцитів, які несуть Ig M, G, А, визначали методом імунофлюоресценції з використанням моноспецифічний сироваток до імуноглобулінів людини; концентрації Ig M. G, А, визначали методом радіальної иммунодиффузии в гелі (Mancini С. et al .. 1963); вміст циркулюючих імунних комплексів за методом Ю. А. Гриневича. А. Н. Алфьорова (1981). Для дослідження системи білків теплового шоку в мононуклеарах периферичної крові ВІЛ-інфікованих була отримана панель поліклональних антитіл. При імунізації тварин і афінної очистки антитіл застосовували препарат білків БТШ-70. Для отримання препарату БТШ-70 використовували білковий екстракт, отриманий з м'язової
тканини великої рогатої худоби та клітин культури HeLa. Виділили препарат методами іонообмінної (з DEAE-сефароза; і афінної (з АТФ-агарози) хроматографії. Чистоту отриманих білків БТШ-70 перевіряли за допомогою
електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфату натрію. Препарат БТШ-70 мав чистоту близько 98% і містив суміш конститутивний (hsc-70) і індуцибельної (hsp-70) ізоформ сімейства БТШ-70. З імунної сироватки кроликів виділяли антитіла до БТШ-70 методами висолювання і афінної хроматографії на колонках з сумішшю білків hsc-70 і hsp-70. Кожна серія антитіл піддавалася перевірці на специфічність двома методами - імуноферментного аналізу та иммуноблоттинга. Для визначення епітопів БТШ-70, з якими реагували отримані антитіла, використовували "сендвіч"-метод імуноферментного аналізу і реакція иммунопреципитации з попередніми мічених білків [35S]-метіоніном. Іммунопреціпітати були піддані одно- і двовимірному
електрофорез (Laemli UK, 1970; O'Farrel PH. 1978). Поліклональні антитіла використовували в конструкції іммуноблотінга з подальшою денситометрії проявлених зон білків, що дозволяло напівкількісне оцінювати зміст ізоформ сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові хворих. Для перевірки функціонального стану системи БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові служили навантажувальні тести In vitro - тепловий шок (прогрів клітин при 43 ± 0.3 ° С у водяному
термостаті) і ультрафіолетове опромінення з використанням приладу МД-73 "Ізольда". Визначення активності ксантиноксидази та її форми в мононуклеарной фракції крові проводили за методом У. Прайор (1979). Рівень процесів вільнорадикального окислення тотально в мононуклеарах периферичної крові і окремо в їх ядрах оцінювали за вмістом продуктів, що пов'язують тіобарбітурової кислоту, які визначали за методом M. Uchlyama, M. Michara (1978). У Як інтегральних біохімічних показників нестабільності геному клітин були обрані відносна частка продуктів деградації хроматину - полидезоксинуклеопротеидов, які є фрагментами ДНК, (Parks DA, Granger DN, 1986) і інтенсивність утворення однониткових розривів ДНК (Birnboim HC. Jewcac JJ. 1981).
Статистична обробка цифрових даних здійснювали методом варіаційної статистики з використанням параметричного критерію (t) Стьюдента. У випадку малих вибірок використовували непараметричні
статистичні критерії.
Розрахунки проводили з використанням програми STATGRAF (Statistical Graphics System), версія 2.1. 2. Результати власних досліджень Гуморальний і клітинний
імунітет на різних стадіях хвороби Дослідження змін в імунній системі при розвитку ВІЛ-інфекції мало на меті виявити показники, достовірно змінюються при переході від однієї клінічної стадії (фази) до іншої. Аналіз змін
імунологічних параметрів хворих дозволяє зробити висновок, що в динаміці ВІЛ-інфекції, в першу чергу, відбувається прогресуюче зниження
функціональної спроможності імунної системи в міру розвитку клінічної картини захворювання. Виявлена дефектність імунного статусу стосується, перш за все. Т-системи
імунітету. Однак далеко не усі досліджені традиційні імунодіагностичні параметри у своїй динаміці достовірно відображають початок переходу від безсимптомної фази захворювання до маніфестним стадіях. достовірне розходження між групами хворих на ВІЛ-інфекцією спостерігалося у наступних показників: - при переході від безсимптомної фази (ІІБ) до ПГЛ (IIB) - збільшення відносного вмісту лімфоцитів від 39,00 ± 2,13 до 45,92 ± 1.96% (p < 0,05), зменшення вмісту СD8 +-лімфоцитів (супресорів) ВІД 36,90 ± 2.90 до 27,83 ± 1,80% (p <0,01); - при переході від ПГЛ (IIB) до стадії вторинних захворювань (IIIA ) - збільшення вмісту В (IgA +)-лімфоцитів від 0,06 ± 0,01 до 0,10 ± 0,01 xlO9 / л (p <0,01), збільшення концентрації IgG від 11,74 ± 0.89 до 13.77 ± 0.66 г / л (р <0.05), збільшення вмісту циркулюючих імунних комплексів - зменшення пропускання світлового потоку від 92,1 ± 1,2 до 84.3 ± 1.6% (р <0,01). Як показав аналіз, процентні (відносні) показники у багатьох випадках не можна використовувати без оцінки абсолютних значень. абсолютний вміст В (IgA +)-лімфоцитів, залишається незмінним на стадії IIIA в порівнянні з безсимптомною фазою, зміна концентрації імуноглобулінів IgG відбуваються в діапазоні нормальних значень (9-15 г / л), що знижує прогностичну інформативність зазначених показників. Важливий і той факт, що немає єдиного імунологічного показника, який би достовірно характеризував обидва переходу ВІЛ-інфекції - від безсимптомної фази до генералізованої лімфаденопатії і від генералізованої лімфаденопатії до стадії вторинних захворювань. Зміст продуктів, що пов'язують тіобарбітурової кислоту, в мононуклеарах периферичної крові Вже у безсимптомній фазі у ВІЛ-інфікованих відзначено збільшення середніх значень вмісту ТБК-зв'язуючих сполук у мононуклеарах периферичної крові на 56%, а в їх ядрах - на 90%. У міру розвитку захворювання рівень названих продуктів вільно-радикального окислення зростає, досягаючи максимуму у хворих у стадії IIIB. При цьому
середні значення в групі хворих в стадії IIIB перевищували
контрольні в 3.2 рази в мононуклеарах і в 4,6 рази в ядрах мононуклеарів. Однак достовірне зростання показників вільнорадикального окислення між групами хворих на ВІЛ-інфекцією відзначається в мононуклеарах. але не в ядрах, і тільки в одному з нас цікавлять переходах клінічного перебігу - з бессимптомной фази (ПБ) до ПГЛ (IIB) від 2,82 ± 0,30 до 3,61 ± 0.37 нмоль/106 клітин (р <0,01) . Активність форм ксантиноксидази в мононуклеарах периферичної крові Відзначається прогресивне зростання загальної ксантіноксідазной активності в мононуклеарах периферичної крові пацієнтів з розвитком захворювання. Однак динаміка стану D-і 0-форм ферменту, виявилася різноспрямованою: у міру прогресування захворювання відбувається поступове зниження середніх значень активності D- форми ксантиноксидази (на 12,5% у стадії IIB і на 75,5% у стадії III В) і наростання активності 0-форми ферменту (на 13,4% у стадії ПБ і в 6,5 разів в стадії IIIB). При цьому достовірного зменшення активності D-форми ксантиноксидази в переходах клінічного перебігу ІІБ-IIB і IIB-IIIA не відзначається, а активність 0-форми достовірно зростає тільки при переході від безсимптомної фази (ПБ) до ПГЛ (IIB) (р <0,05) . Інтегральні
метаболічні показники дестабілізації геному мононуклеарів периферичної крові У ВІЛ-інфікованих вже у безсимптомній фазі відзначається збільшення середніх значень вмісту полидезоксинуклеопротеидов (ПДН) в 1,3 рази, а вираженості однониткових розривів ДНК в 2.3 рази. Виявлені зміни прогресують по мірі розвитку ВІЛ-інфекції , однак достовірних відмінностей показників нестабільності ге-нома між групами хворих не відзначається, що не дозволяє розглядати їх в якості прогностичних критеріїв переходу клінічного перебігу хвороби з однієї стадії в іншу. Характеристика поліклональних антитіл до білків сімейства БТШ-70 Кожен з отриманих нами препаратів антитіл розпізнавав специфічний профіль ізоформ сімейства БТШ-70, денатурованих до-децілсульфатом натрію. Антитіла із сироватки кролика N5 (антитіла N5) розрізняють дві зони молекулярної маси 68-72 кДа, які являють собою дві ізоформи сімейства БТШ-70. Тепловий вплив (43 ° С - 30 хвилин) на клітини HeLa, білковий екстракт яких використовували для приготування імуноблоту. відбивалася на результаті імуноблоту посиленням інтенсивності зони,
відповідної hsp70. Антитіла N7 розпізнавали і hsp70. і Р75, тоді як антитіла N10 головним чином пов'язувалися тільки з Р75. a Nil - з hsp70. Такі ж приклади розпізнавання білків сімейства БТШ-70 на імуноблоту спостерігалися, коли замість клітин HeLa для аналізу використовували мононуклеари периферичної крові людини. Для
того, щоб визначити компоненти сімейства БТШ-70, які реагують у неденатурований стані з представленої панеллю антитіл, виконано дослідження иммунопреципитации. І одно-, і двовимірні електрофоретичні аналізи імунних комплексів не показували відмінностей між
антигенами, преціпітірованнимі з тестованими антитілами: імунні комплекси містили тільки одну зону.
відповідну індуцибельної формі hsp70. Іммобілізовані на твердій фазі антитіла N5 і N7 також вибірково реагували з
антигеном hsp70 з білкового екстракту клітин HeLa. У підсумку, з причин особливих властивостей отриманих антитіл до БТШ-70. які, як зробило-сь, розпізнають тільки один або кілька суміжних сайтів на нативних молекулах БТШ-70. а також з причини властивостей білків сімейства БТШ-70 легко утворювати міцні з'єднання е іншими білками клітини в звичайних умовах, не видається можливим використати отримані поліклональні антитіла для створення імуноферментної тест-системи, призначеної для кількісного визначення БТШ-70 в білкових екстрактах мононуклеарів периферичної крові. Тому довелося використовувати зазначені антитіла в конструкції іншого методу для визначення БТШ-70 в білкових екстрактах - методу імуноблотингу с-подальшою денситометрії проявлених зон білків. Зміни стану сімейства БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові на різних стадіях ВІЛ-інфекції Сімейство БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові всіх груп обстежених представлено повністю трьома ізоформами: індуцибельної (hsp-70), конститутивний (hsc-70) і білком Р75. Не виявлено достовірних відмінностей у співвідношенні ізоформ БТШ-70 між донорами та пацієнтами у безсимптомній фазі ВІЛ-інфекції. Навпаки, у хворих у більш пізніх стадіях захворювання виявлено достовірне зміна аналізованих параметрів у порівнянні з
контрольною групою. Спостерігається прогресивне зменшення середніх значень вмісту ізоформ hsp-70 і Р75, збільшення hsc-70 у міру розвитку клінічної картини захворювання. Однак достовірне розходження ізоформ сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові між групами хворих на ВІЛ-інфекцією спостерігали тільки по відношенню до конститутивний ізоформ (hsc-70). зміст якої збільшується при переході захворювання з бессимптомной фази (ПБ) до фази ПГЛ (IIB) від 59,3 ± 2,5 до 66.2 ± 2,7 у.г.о. (р <0,05) і від фази ПГЛ (IIB) до стадії вторинних захворювань (IIIA) від 66,2 ± 2.7 до 7l, l ± 3,0 у.г.о. (р <0,05). Дослідження впливу теплового впливу на мононуклеари периферичної крові обстежених осіб дозволило виявити прогресивне достовірне зменшення вмісту індуцибельної ізоформи hsp-70 при переходах ПБ до IIB від 38,9 ± 4,3 до 30.4 ± 3.1 у.г.о. 'і IIB до IIIA від 30 , 4 ± 3,1 до 22.1 ± 3.7 у.г.о. (р <0,05). Нами запропоновано індекс hsp-70 Tlll/hsp-70 N. представляє собою відношення змісту індуцибельної ізоформи сімейства БТШ-70 в клітці, підданої теплового шоку in vitro, до змісту цього білка в клітині, що знаходиться при t = 370С. Індекс hsp-70 TШ/hsp-70 N
характеризує реакцію клітини на екстремальний вплив синтезом і накопиченням індуцибельної ізоформи. за яким побічно можна судити про адаптивної спроможності досліджених клітин. Достовірне зменшення індексу hsp-70 TlB/hsp-70 N спостерігається в обох переходах клінічних стадій: ПБ - IIB від 4,23 до 3.42 (р <0,05) і IIB - IIIA від 3,42 до 2.99 (р < 0.05). що свідчить про прогресивний ослабленні адаптивної
функції мононуклеарів периферичної крові. Вплив ультрафіолетового опромінення на нононуклеари периферичної крові викликало аналогічні зрушення в системі білків теплового шоку у всіх групах хворих. Представлений аналіз отриманих результатів виявляє значущість динаміки показників сімейства білків теплового шоку БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові для прогнозу переходу клінічного розвитку ВІЛ-інфекції від безсимптомної фази до генералізованої лімфаденопатії і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. Патогенетична зв'язок досліджених біохімічних показників і білків теплового шоку БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові при ВІЛ-інфекції Виявлена динаміка показників нестабільності геному мононуклеарів периферичної крові у хворих на ВІЛ-інфекцією супроводжувалася істотним збільшенням концентрації сполук, що пов'язують тіобарбітурової кислоту, (продуктів вільнорадикального окислення) у клітинах і їх ядрах, що свідчить про пошкодження ДНК мононуклеарів вільними радикалами. Провідним генератором активних форм кисню при цьому. судячи з отриманих результатів, служить 0-форма ксантиноксидази, яка утворюється з D-форми ферменту в результаті її обмеженого протеолізу. У свою чергу, протеолітична трансформація D-форми ксантиноксидази в 0-форму може бути прооксидантно-індукованої. Таким чином можна припустити, що ушкодження ДНК мононуклеарів викликано вільними радикалами , що генеруються ксантінок-сідазой. У результаті атаки ДНК вільними радикалами спостерігається образованіе.апурінових / апірімідінових сайтів і однониткових розривів ДНК мононуклеарів периферичної крові. Причому ступінь зазначених процесів перебуває в залежності від клінічного перебігу ВІЛ-інфекції. У свою чергу, утворення однониткових розривів є стимулюючим чинником підвищення активності ксантиноксидази в мононуклеарах, а які утворюються олігонуклеотиди можуть служити факторами активації експресії провірусної геному ВІЛ. інтегрованого в ДНК мононуклеарів периферичної крові. У результаті формується
патологічний круг. сприяє реплікації ВІЛ (рис.1, в кінці). Описані
процеси, серед яких найбільш значущим є вільнорадикальне окислення, супроводжуються
характерними змінами системи білків теплового шоку в мононуклеарах периферичної крові, що відбуваються в тісному зв'язку з клінічним перебігом ВІЛ-інфекції. Зазначені зміни БТШ-70 в неінфікованих клітинах можуть бути опосередковані впливом вірусного білка gplZO. взаємодія якого з рецептором CD4 НЕ тільки викликає стресову реакцію. виявляється поруч
функціональних змін, у тому числі і посиленням транскрипції з генів БТШ-70 (G. Furlini at al .. 1994) .. а й призводить до програмованої клітинної загибелі -
апоптозу зрілих СD4 +-лімфоцитів або СD34 +-гематопоетичних клітин-попередників (Hofman Во, 1991; Montagnier L. et al., 1992). У інфікованих клітинах
експресія генів ВІЛ і генів, що кодують синтез БТШ-70. здійснюється за загальними
механізмами з участю ядерного чинника NF-kB (Krumm A. et al .. 1993). Таким чином, і в неінфікованих, і в інфікованих ВІЛ імунокомпетентних клітинах крові хворих показники сімейства БТШ-70 можуть обгрунтовано розглядатися як індикатор активності реплікативного процесу вірусу, формування вторинного імунодефіциту (внаслідок дисфункції і загибелі СБ4 +-клітин) і розвитку клінічного перебігу хвороби. ВИСНОВКИ 1. Традиційні для оцінки імунного статусу лабораторні показники (кількість CD3 +. CD4 +. С08 +-лімфоцитів. В-лімфоцитів. несучих Ig М, G. А; РГМЛ з Конан; концентрація Ig M, G. А; зміст циркулюючих імунних комплексів) недостатньо повно відображають динаміку переходу ВІЛ-інфекції з бессимптомной фази до персистуючої генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань. 2. Підвищення активності 0-форми ксантиноксидази та інтенсивності процесів вільнорадикального окислення в мононуклеарах периферичної крові прогресують в динаміці захворювання, при цьому достовірні відмінності (р <0,05 і р <0.01 відповідно) спостерігаються тільки при переході від безсимптомної фази до персістірувщей генералізованої лімфаденопатії. 3. При розвитку ВІЛ-інфекції спостерігається збільшення відносної частки продуктів деградації хроматину (рівня полидезоксинуклеопротеидов) і інтенсивності освіти однониткових розривів ДНК в мононуклеарах периферичної крові без достовірних відмінностей в динаміці хвороби (р> 0,05). 4. Білки теплового шоку сімейства БТШ-70 індукують утворення поліклональних антитіл високої специфічності та афінності, які розпізнають один або кілька суміжних сайтів на нативних молекулах білків , що виключає можливість використання отриманих імуноглобулінів в конструкції імуноферментних тест-систем для кількісного визначення БТШ-70. але допускає їх застосування в методі іммуноблотінга. 5. При переході клінічного перебігу захворювання від безсимптомної фази до персистуючою генералізованої лімфаденопатії (ПГЛ) і від ПГЛ до стадії вторинних захворювань відбувається достовірне збільшення вмісту конститутивний ізоформи сімейства БТШ-70 в мононуклеарах периферичної крові, що характеризує перебування імунокомпетентних клітин у стані хронічного стресу (р <0.05). 6. Функціональне виснаження системи БТШ-70 мононуклеарів периферичної крові ВІЛ-інфікованих проявляється зниженням інтенсивності
відповіді ( синтез індуцибельної ізоформи БТШ-70) на стресові
впливи у вигляді гіпертермії та ультрафіолетового опромінення. 7. Динаміка змін білків теплового шоку сімейства БТШ-70 в сукупності з показниками вільнорадикального окислення та системи ксантиноксидази мононуклеарів периферичної крові
відповідає клінічному розвитку ВІЛ-інфекції, що дозволяє використовувати их для прогнозирования перехода клинического течения заболевания из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Предложенный способ оценки функционального состояния системы белков теплового шока мононуклеаров периферической крови с применением стрессорных воздействий - гипертермии и ультрафиолетового излучения - целесообразно использовать в экспериментальных исследованиях, направленных на изучение
патогенеза вторичных иммунодефицитных состояниях при ВИЧ-инфекции и других инфекционных заболеваниях. Комплекс показателей, отражающих состояние семейства белков теплового шока БТШ-70 (повышение содержания конститутивной изофор-мы hsc-70 более 68,9 у. д.е.) и системы ксантиноксидазы (повышение активности 0-формы более 1,03 мкмоль/мг белка-мин) мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными показателями иммунного статуса может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии. Для перехода ПГЛ в стадию вторичных заболеваний
характерно повышение содержания конститутивной изоформы hsc-70 более 74,1 у.д.е. Включение указанных методов в комплексное лабораторно-диагностическое обследование больных
ВИЧ-инфекцией позволяет прогнозировать клиническое течение заболевания. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Приготовление специфических поликлональных антител к белкам теплового шока // Мат. XI науч. конф. молодых ученых и специалистов академии.- Л.:ВМедА, 1990.- С.18-19. 2. The characterization and use of different antibodies against the hsp70 major heat shock protein family for the development of an Immunoassay // Electrophoresls.- 1991.-N12.-P.670- 673 (coавт. Б.А.Маргулис и др.). 3. The state of HSP-70 in lymphocytes In transition of HIV Infection to the clinical manifestation stage // Social and medical problem of AIDS.- St.-Petersburg. 1994.- P. 14 (соавт. Л.А.Кожемякин и др. ). 4. HSP-70 state significance In the diagnosis and prognosis HIV-Infection // AIDS. cancer and related problems.- St.-Petersburg, 1996.- P. 130-131 (соавт. Е.И.Змушко). 5. Лабораторный
контроль донорской крови в целях безопасности по ВИЧ-инфекции // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии.- СПб. 1996.- С. 67 (соавт. Е.И.Змушко и др.). 6. Диагностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Новые информационные технологии в медицине и экологии. -Гурзуф. Ялта, 1996.- С. 56 (соавт. Е.И.Змушко). 7. Прогностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Инфектология. Достижения и перспективы. -СПб: ВМедА, 1996.-С.99 (соавт. Е.И.Змушко и др.).