Реферат:
Загальна вірусологія. Класифікація, структура та особливості біології вірусів. Бактеріофаги
Загальна вірусологія. Класифікація, структура та особливості біології вірусів. Бактеріофаги
Відкриття вірусів Д. І. Івановським в 1892р. поклало початок розвитку науки вірусології. Швидшому її розвитку сприяли: винахід електронного мікроскопа, розробка методу культивування мікроорганізмів в культурах клітин.
Слово "вірус" в перекладі з латинської-отрута (тваринного походження). Цей термін застосовують для позначення унікальних представників живої природи, не мають клітинного (еукаріотичного або прокаріотичної) будови і володіють облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом, тобто які не можуть жити без клітки.
В даний час вірусологія-бурхливо розвивається наука, що пов'язано з рядом причин:
- Провідною роллю вірусів в інфекційній патології людини (приклади-вірус грипу, ВІЛ-вірус імунодефіциту людини, цитомегаловірус та інші герпесвіруси) на тлі практично повної відсутності засобів специфічної хіміотерапії;
- Використанням вірусів для вирішення багатьох фундаментальних питань біології і генетики.
Основні властивості вірусів (і плазмід), за якими вони відрізняються від решти живого світу.
1.Ультрамікроскопіческіе розміри (вимірюються в нанометрах). Великі віруси (вірус віспи) можуть досягати розмірів 300 нм, дрібні-від 20 до 40 нм. 1мм = 1000мкм, 1мкм = 1000нм.
2.Віруси містять нуклеїнових кислот тільки одного типу-або ДНК (ДНК-віруси) або РНК (РНК-віруси). У всіх інших організмів геном представлений ДНК, в них міститься як ДНК, так і РНК.
3.Віруси не здатні до зростання і бінарним поділом.
4.Віруси розмножуються шляхом відтворення себе в інфікованій клітині хазяїна за рахунок власної геномної нуклеїнової кислоти.
5.У вірусів немає власних систем мобілізації енергії і білок-сінтензірующіх систем, у зв'язку з чим віруси є абсолютними внутрішньоклітинними паразитами.
6.Средой проживання вірусів є живі клітини-бактерії (це віруси бактерій або бактеріофаги), клітини рослин, тварин і людини.
Всі віруси існують у двох якісно різних формах: позаклітинної-віріон і внутрішньоклітинної-вірус. Таксономія цих представників мікросвіту заснована на характеристиці віріонів-кінцевої фази розвитку вірусів.
Будова (морфологія) вірусів.
1. Геном вірусів утворюють нуклеїнові кислоти, представлені одноланцюжковий молекулами РНК (у більшості РНК-вірусів) або дволанцюжкові молекулами ДНК (у більшості ДНК-вірусів).
2. Капсид - білкова оболонка, в яку упакована геномна нуклеїнова кислота. Капсид складається з ідентичних білкових субодиниць-капсомеров. Існують два способи упаковки капсомеров в капсид-спіральний (спіральні віруси) і кубічний (сферичні віруси).
При спіральної симетрії білкові субодиниці розташовуються по спіралі, а між ними, також по спіралі, укладена геномна нуклеїнова кислота (ниткоподібні віруси). При кубічному типі симетрії віріони можуть бути у вигляді багатогранників, найчастіше-двадцятигранниками - ікосаедра.
3.Просто влаштовані віруси мають тільки нуклеокапсид, тобто комплекс геному з капсидом і називаються "голими".
4. В інших вірусів поверх капсида є додаткова мембраноподобная оболонка, що купується вірусом у момент виходу з клітини господаря-суперкапсид. Такі віруси називають "одягненими".
Крім вірусів, є ще більш просто влаштовані форми здатних передаватися агентів - плазміди, віроіди і пріони.
Основні етапи взаємодії вірусу з клітиною хазяїна.
1.Адсорбція-пусковий механізм, пов'язаний із взаємодією специфічних рецепторів вірусу і господаря (у вірусу грипу-гемаглютинін, у вірусу імунодефіциту людини-глікопротеїн gp 120).
2.Пронікновеніе-шляхом злиття суперкапсиду з мембраною клітини або шляхом ендоцитозу (піноцитозу).
3.Освобожденіе нуклеїнових кислот-"роздягання" нуклеокапсиду і активація нуклеїнової кислоти.
4.Сінтез нуклеїнових кислот і вірусних білків, тобто підпорядкування систем клітини господаря і їх робота на відтворення вірусу.
5.Сборка віріонів-асоціація реплікованих копій вірусної нуклеїнової кислоти з капсидних білком.
6.Виход вірусних часток із клітини, придбання суперкапсиду оболонкових вірусів.
Виходячи взаємодії вірусів з клітиною хазяїна.
1. Абортивний процес - коли клітини звільняються від вірусу:
- При інфікуванні дефектним вірусом, для реплікації якого потрібен вірус-помічник, самостійна реплікація цих вірусів неможлива (так звані вірусоіди). Наприклад, вірус дельта (D) гепатиту може реплицироваться тільки при наявності вірусу гепатиту B, його Hbs - антигену, аденоассоціірованний вірус-у присутності аденовірусу);
- При інфікуванні вірусом генетично нечутливих до нього клітин;
- При зараженні чутливих клітин вірусом в Неразрешающаяся умовах.
2. Продуктивний процес - реплікація (продукція) вірусів:
- Загибель (лізис) клітин (цитопатический ефект) - результат інтенсивного розмноження та формування великої кількості вірусних частинок - характерний результат продуктивного процесу, викликаного вірусами з високою цитопатогенну. Цитопатический ефект дії на клітинні культури для багатьох вірусів носить досить впізнаваний специфічний характер;
- Стабільне взаємодія, що не приводить до загибелі клітини (персистуючі та латентні інфекції) - так звана вірусна трансформація клітини.
3. Інтегративний процес - інтеграція вірусного геному з геномом клітини хазяїна. Це особливий варіант продуктивного процесу за типом стабільного взаємодії. Вірус реплікується разом з геномом клітини хазяїна і може довго перебувати у латентному стані. Вбудовуватися у ДНК-геном господаря можуть тільки ДНК-віруси (принцип "ДНК-в ДНК"). Єдині РНК-віруси, здатні інтегруватися в геном клітини господаря-ретровіруси, мають для цього спеціальний механізм. Особливість їх репродукції-синтез ДНК провірусу на основі геномної РНК за допомогою ферменту зворотної транскриптази з наступним вбудовуванням ДНК в геном господаря.
Основні методи культивування вірусів.
1.В організмі лабораторних тварин.
2.В курячих ембріонах.
3.В клітинних культурах - основний метод.
Типи клітинних культур.
1. Первинні (тріпсінізірованние) культури - фібробласти ембріона курки (ФЕК), людини (ФЕЧ), клітини нирки різних тварин і т.д. Первинні культури отримують з клітин різних тканин частіше шляхом їх подрібнення і тріпсінізаціі, використовують одноразово, тобто постійно необхідно мати відповідні органи або тканини.
2. Лінії диплоїдних клітин придатні до повторного диспергуванню і росту, як правило не більше 20 пасажів (втрачають початкові властивості).
3. Перещеплюваних лінії (гетероплоідние культури), здатні до багаторазового диспергуванню і перевіванію, тобто до багаторазових пасажів, найбільш зручні у вірусологічній роботі-наприклад, лінії пухлинних клітин Hela, Hep та ін
Спеціальні живильні середовища для культур клітин.
Використовуються різноманітні синтетичні вірусологічні поживні середовища складного складу, що включають великий набір різних факторів росту-середовище 199, Голка, розчин Хенкса, гідролізат лактальбуміну. У середовища додають стабілізатори рН (Hepes), різні у видовому відношенні сироватки крові (найбільш ефективної вважають ембріональну телячу сироватку), L-цистеїн і L-глютамін.
У залежності від функціонального використання середовища можуть бути ростові (з великим вмістом сироватки крові) - їх використовують для вирощування клітинних культур до внесення вірусних проб, і підтримуючі (з меншим вмістом сироватки чи її відсутністю) - для утримання інфікованих вірусом клітинних культур.
Виявляються прояви вірусної інфекції клітинних культур.
1.Цітопатіческій ефект.
2.Виявлення тілець включень.
3. Виявлення вірусів методом флуоресцентних антитіл (МФА), електронної мікроскопії, авторадіографія.
4.Цветная проба. Звичайний колір використовуваних культуральних середовищ, що містять як індикатор рН феноловий червоний, при оптимальних для клітин умовах культивування (рН близько 7,2) - червоний. Розмноження клітин змінює рН і відповідно-колір середовища з червоного на жовтий за рахунок зміщення рН в кислу сторону. При розмноженні в клітинних культурах вірусів відбувається лізис клітин, зміни рН і кольору середовища не відбувається.
5.Виявленіе гемаглютиніну вірусів-гемадсорбції, гемаглютинація.
6.Метод бляшок (бляшкообразованія). У результаті цитолітичного дії багатьох вірусів на клітинні культури утворюються зони масової загибелі клітин. Виявляють бляшки-вірусні "клітинно-негативні" колонії.
Номенклатура вірусів.
Назва сімейства вірусів закінчується на "viridae", роду-"virus", для виду звичайно використовують спеціальні назви, наприклад - вірус краснухи, вірус імунодефіциту людини-ВІЛ, вірус парагрипу людини типу 1 і т.д.
Віруси бактерій (бактеріофаги).
Природним місцем існування фагів є бактеріальна клітина, тому фаги поширені повсюдно (наприклад, у стічних водах). Фагам притаманні біологічні особливості, властиві і інших вірусів.
Найбільш морфологічно поширений тип фагів характеризується наявністю голівки-ікосаедра, відростка (хвоста) зі спіральною симетрією (часто має порожнистий стрижень і скорочувальний чохол), шипів і відростків (ниток), тобто зовні дещо нагадують сперматозоїд.
Взаємодія фагів з клітиною (бактерією) суворо специфічно, тобто бактеріофаги здатні інфікувати тільки певні види і фаготип бактерій.
Основні етапи взаємодії фагів і бактерій.
1.Адсорбція (взаємодія специфічних рецепторів).
2.Внедреніе вірусної ДНК (ін'єкція фага) здійснюється за рахунок лізірованія речовинами типу лізоциму ділянки клітинної стінки, скорочення чохла, вштовхування стрижня хвоста через цитоплазматичну мембрану в клітину, упорскування ДНК в цитоплазму.
3.Репродукція фага.
4.Виход дочірніх популяцій.
Основні властивості фагів.
Розрізняють вірулентні фаги, здатні викликати продуктивну форму процесу, і помірні фаги, що викликають редуктивному фагів інфекцію (редукцію фага). В останньому випадку геном фага в клітині не не реплікується, а впроваджується (інтегрується) в хромосому клітини хазяїна (ДНК в ДНК), фаг перетворюється на профаг. Цей процес одержав назву лизогении. Якщо в результаті впровадження фага в хромосому бактеріальної клітини вона набуває нових успадковані ознаки, таку форму мінливості бактерій називають лизогенной (фагової) конверсією. Бактеріальну клітину, яка несе в своєму геномі профаг, називають лизогенной, оскільки профаг при порушенні синтезу особливого білка-репрессора може перейти в літичний цикл розвитку, викликати продуктивну інфекцію з лізисом бактерії.
Помірні фаги мають важливе значення в обміні генетичним матеріалом між бактеріями-у трансдукції (одна з форм генетичного обміну). Наприклад, здатністю виробляти екзотоксин володіють тільки збудник дифтерії, в хромосому якого інтегрований помірний профаг, що несе оперон tox, що відповідає за синтез дифтерійного екзотоксину. Помірний фаг tox викликає лизогенной конверсію нетоксигенних дифтерійної палички в токсигенних.
За спектром дії на бактерії фаги поділяють на:
- Полівалентні (лізують близькоспоріднені бактерії, наприклад сальмонели);
- Моновалентні (лізують бактерії одного виду);
- Типоспецифічні (лизируют тільки певні фаговар збудника).
На щільних середовищах фаги виявляють частіше за допомогою спот (spot) - тесту (освіта негативного плями при зростанні колоній) або методом агарових шарів (титрування за Граціа).
Практичне використання бактеріофагів.
1.Для ідентифікації (визначення фаготип).
2.Для фагопрофілактика (купірування спалахів).
3.Для фаготерапія (лікування дисбактеріозів).
4.Для оцінки санітарного стану навколишнього середовища та епідеміологічного аналізу.
Генетика бактерій та вірусів.
Молекулярна біологія, що вивчає фундаментальні основи життя, є в значній мірі дітищем мікробіології. Як основні об'єкти вивчення в ній використовують віруси і бактерії, а основний напрямок-молекулярна генетика заснована на генетиці бактерій і фагів.
Бактерії-зручний матеріал для генетики. Їх відрізняє:
- Відносна простота генома (сопокупності нуклеотидів хромосом);
- Гаплоїдні (один набір генів), що виключає домінантність ознак;
- Різні інтегровані в хромосоми та відокремлені фрагменти ДНК;
- Статева диференціація у вигляді донорських та реципієнтного клітин;
- Легкість культивування, швидкість накопичення біомас.
Загальні уявлення про генетику.
Ген-унікальна структурна одиниця спадковості, носій і хранитель життя. Він має три фундаментальні функції.
1. Безперервність спадковості - забезпечується механізмом реплікації ДНК.
2. Управління структурами і функціями організму - забезпечується за допомогою єдиного генетичного коду з чотирьох основ (А-аденін, Т-тимін, Г-гуанін, Ц-цитозин). Код триплетних, оскільки кодон - функціональна одиниця, що кодує амінокислоту, складається з трьох підстав (літер).
3. Еволюція організмів-завдяки мутаціям і генетичним рекомбінація.
У вузькоспеціальному плані ген найчастіше представляє структурну одиницю ДНК, розташування кодонів в якій детермінує первинну структуру відповідної поліпептидного ланцюга (білка). Хромосома складається з особливих функціональних одиниць-Оперон.
Основні етапи розвитку (ускладнення) генетичної системи можна представити у вигляді такої схеми:
кодон à ген à оперон à геном вірусів і плазмід à хромосома прокаріотів (нуклеоїд) à хромосоми еукаріотів (ядро).
Генетичний матеріал бактерій.
1. Ядерні структури бактерій - хроматіновие тільця або нуклеоїд (хромосомна ДНК). У бактерій одна замкнута кільцеподібна хромосома (до 4 тисяч окремих генів). Бактеріальна клітина гаплоидная, а подвоєння хромосоми (реплікація ДНК) супроводжується поділом клітини. Вегетативна реплікація хромосомної (і плазмідної) ДНК обумовлює передачу генетичної інформації по вертикалі-від батьківської клітини-к дочірньою. Передача генетичної інформації по горизонталі здійснюється різними механізмами-в результаті кон'югації, трансдукції, трансформації, сексдукціі.
2.Внехромосомние молекули ДНК представлені плазмідами, які мігрують генетичними елементами-транспозона і інсерваціоннимі (Інтернейрони) або IS - послідовностями.
Плазміди-екстрахромосомний генетичний матеріал (ДНК), більш просто влаштовані в порівнянні з вірусами організми, які наділяють бактерії додатковими корисними властивостями. За молекулярній масі плазміди значно менше хромосомної ДНК, містять від 40 до 50 генів.
Їх об'єднання в одне царство життя з вірусами пов'язано з наявністю ряду загальних властивостей-відсутністю власних систем мобілізації енергії і синтезу білка, самореплікаціей геному, абсолютним внутрішньоклітинним паразитизмом.
Їх виділення в окремий клас визначається істотними відмінностями від вірусів.
1.Среда їх проживання-тільки бактерії (серед вірусів, крім вірусів бактерій-бактеріофагів є віруси рослин і тварин).
2.Плазміди співіснують з бактеріями, наділяючи їх додатковими властивостями. У вірусів ці властивості можуть бути тільки у помірних фагів при лизогении бактерій, частіше ж за все віруси викликають негативний наслідки, лізис клітин.
3.Геном представлений двунітевой ДНК.
4.Плазміди представляють собою "голі" геноми, що не мають ніякої оболонки, їх реплікація не потребує синтезу структурних білків і процесів самозбірки.
Плазміди можуть розповсюджуватися по вертикалі (на клітинному розподілі) і по горизонталі, перш за все шляхом кон югаційного переносу. Залежно від наявності або відсутності механізму самопереноса (його контролюють гени tra-оперону) виділяють кон'югатівние і некон'югатівние плазміди. Плазміди можуть вбудовуватися в хромосому бактерій-інтегративні плазміди або знаходитися у вигляді окремої структури-автономні плазміди (еф).
Класифікація та біологічна роль плазмід.
Функціональна класифікація плазмід заснована на властивостях, якими вони наділяють бактерії. Серед них-здатність продукувати екзотоксини і ферменти, стійкість до лікарських препаратів, синтез бактеріоцинів.
Основні категорії плазмід.
1.F-плазміди - донорські функції, індукують поділ (від fertility - плідність). Інтегровані F - плазміди-Hfr-плазміди (високої частоти рекомбінації).
2.R-плазміди (resistance) - стійкість до лікарських препаратів.
3.Col-плазміди-синтез коліцінов (бактеріоцинів) - чинників конкуренції близькоспоріднених бактерій (антогонизм). На цій властивості засновано коліцінотіпірованіе штамів.
4.Hly-плазміди-синтез гемолізинів.
5.Ent-плазміди-синтез ентеротоксинів.
6.Tox-плазміди-токсиноутворення.
Близькоспоріднені плазміди не здатні стабільно співіснувати, що дозволило об'єднати їх за ступенем спорідненості в Inc-групи (incompatibility-несумісність).
Біологічна роль плазмід різноманітна, в тому числі:
- Контроль генетичного обміну бактерій;
- Контроль синтезу факторів патогенності;
- Вдосконалення захисту бактерій.
Бактерії для плазмід-середовище проживання, плазміди для них-стерпні між ними додаткові геноми з наборами генів, що сприяють збереженню бактерій у природі.
Мігруючі генетичні елементи - окремі ділянки ДНК, здатні визначати свій перенесення між хромосомами або хромосомою і плазміди за допомогою ферменту рекомбінації транспозази. Найпростішим їх типом є но інсерційні послідовності (IS - елементи) або вставні елементи, що несуть тільки один ген транспозази, за допомогою якої IS-елементи можуть вбудовуватися в різні ділянки хромосоми. Їх функції-координація взаємодії плазмід, помірних фагів, транспозонов і генофора для забезпечення репродукції, регуляція активності генів, індукція мутацій. Величина IS-елементів не перевищує 1500 пар основ.
Транспозони (Tn - елементи) включають до 25 тисяч пар нуклеотидів, містять фрагмент ДНК, що несе специфічні гени, і два Is-елемента. Кожен транспозон містить гени, привносять важливі для бактерії характеристики, як і плазміди (множинна стійкість до антибіотиків, токсиноутворення і т.д.). Транспозони-самоінтегрірующіеся фрагменти ДНК, можуть вбудовуватися і переміщатися серед хромосом, плазмід, помірних фагів, тобто мають потенційну здатність поширюватися серед різних видів бактерій.
Поняття про генотип і фенотип.
Генотип-вся сукупність наявних в організму генів.
Фенотип - сукупність реалізованих (тобто зовнішніх) генетично детермінованих ознак, тобто індивідуальне (в певних умовах зовнішнього середовища) прояв генотипу. При зміні умов існування фенотип бактерій змінюється при збереженні генотипу.
Мінливість у бактерій може бути ненаследуемой (модификационной) і генотипической (мутації, рекомбінації).
Тимчасові, спадково не закріплені зміни, що виникають як адаптивні реакції бактерій на зміни навколишнього середовища, називаються модифікаціями (частіше - морфологічні та біохімічні модифікації). Після усунення причини бактерії реверсують до вихідного фенотипу.
Стандартне прояв модифікації-розподіл однорідної популяції на дві або більше двох типів-дисоціація. Приклад-характер росту на живильних середовищах: S-(гладкі) колонії, R-(шорсткуваті) колонії, M-(мукоїдне, слизові) колонії, D-( карликові) колонії. Дисоціація протікає зазвичай у напрямку Sà R. Дисоціація супроводжується змінами біохімічних, морфологічних, антигенних і вірулентних властивостей збудників.
Мутації - стрибкоподібні зміни спадкової ознаки. Можуть бути спонтанні та індуковані, генні (зміни одного гена) та хромосомні (зміни двох або більше двох ділянок хромосоми).
Одночасно у бактерій є різні механізми репарації мутацій, в тому числі з використанням ферментів-ендонуклеаз, лігази, ДНК-полімерази.
Генетичні рекомбінації-мінливість, пов'язана з обміном генетичної інформації. Генетичні рекомбінації можуть здійснюватися шляхом трансформації, трансдукції, кон'югації, злиття протопластів.
1.Трансформація-захоплення і поглинання фрагментів чужий ДНК і утворення на цій основі рекомбінантів.
2.Трансдукція-перенесення генетичного матеріалу фагами (помірними фагами-специфічна трансдукція).
3.Кон'югація-при безпосередньому контакті клітин. Контролюється tra (transfer) опероном. Головну роль відіграють кон'югатівние F-плазміди.
Генетика вірусів.
Геном вірусів містить або РНК, або ДНК (РНК-і ДНК-віруси відповідно). Виділяють позитивну (+) РНК, яка має матричної активністю і відповідно-інфекційними властивостями, і негативну (-) РНК, не виявляє інфекційні властивості, яка для відтворення толжна транскрибувати (перетворюватися) в + РНК. Механізми репродукції різних вірусів дуже складні й істотно відрізняються. Основні їх схематичні варіанти представлені нижче.
1. вирионах (матрична) + РНК à комплементарна-РНК (у рибосомах) à вирионах + РНК.
2. - РНК à вірусна (інформаційна) + РНК à - РНК (формується на геномі зараженої клітини).
3. однониткових ДНК: + ДНК à + ДНК-ДНК à + ДНК-ДНК + ДНК à + ДНК.
4. ретровірусна однониткових РНК: РНК à ДНК (провірус) à РНК.
5. двунітевих ДНК: поділ ниток ДНК і формування на кожній комплементарної нитки ДНК.
Генофонд вірусів створюється і поповнюється з чотирьох основних джерел:
двох внутрішніх (мутації, рекомбінації) і двох зовнішніх (включення в геном генетичного матеріалу клітини господаря, потік генів з інших вірусних популяцій).
Комплементації - функціональна взаємодія двох дефектних вірусів, що сприяє їх реплікації і горизонтальної передачі.
Фенотипическое змішування - при зараженні клітини близькородинними вірусами з утворенням віріонів з гібридними капсида, кодованими геномами двох вірусів.
Популяційна мінливість вірусів пов'язана з двома різноспрямованими процесами - мутаціями і селекцією, пов'язаними із зовнішнім середовищем як індуктором мутацій і фактором стабілізуючого відбору. Гетерогенність вірусних популяцій-адаптаційний генетичний механізм, що сприяє пластичності (стійкості, пристосовності) популяцій, фактор еволюції і збереження видів у зовнішньому середовищі.
Генофонд вірусних популяцій зберігається за рахунок декількох механізмів:
- Відновлення мінливості за рахунок мутацій;
- Резервують механізмів (можливість переходу будь-яких, навіть негативних мутацій в наступну генерацію) - комплементації, рекомбінація;
- Буферних механізмів (освіта дефектних вірусних частинок, імунних комплексів та ін), що сприяють збереженню вірусу в мінливих зовнішніх умовах.
Слово "вірус" в перекладі з латинської-отрута (тваринного походження). Цей термін застосовують для позначення унікальних представників живої природи, не мають клітинного (еукаріотичного або прокаріотичної) будови і володіють облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом, тобто які не можуть жити без клітки.
В даний час вірусологія-бурхливо розвивається наука, що пов'язано з рядом причин:
- Провідною роллю вірусів в інфекційній патології людини (приклади-вірус грипу, ВІЛ-вірус імунодефіциту людини, цитомегаловірус та інші герпесвіруси) на тлі практично повної відсутності засобів специфічної хіміотерапії;
- Використанням вірусів для вирішення багатьох фундаментальних питань біології і генетики.
Основні властивості вірусів (і плазмід), за якими вони відрізняються від решти живого світу.
1.Ультрамікроскопіческіе розміри (вимірюються в нанометрах). Великі віруси (вірус віспи) можуть досягати розмірів 300 нм, дрібні-від 20 до 40 нм. 1мм = 1000мкм, 1мкм = 1000нм.
2.Віруси містять нуклеїнових кислот тільки одного типу-або ДНК (ДНК-віруси) або РНК (РНК-віруси). У всіх інших організмів геном представлений ДНК, в них міститься як ДНК, так і РНК.
3.Віруси не здатні до зростання і бінарним поділом.
4.Віруси розмножуються шляхом відтворення себе в інфікованій клітині хазяїна за рахунок власної геномної нуклеїнової кислоти.
5.У вірусів немає власних систем мобілізації енергії і білок-сінтензірующіх систем, у зв'язку з чим віруси є абсолютними внутрішньоклітинними паразитами.
6.Средой проживання вірусів є живі клітини-бактерії (це віруси бактерій або бактеріофаги), клітини рослин, тварин і людини.
Всі віруси існують у двох якісно різних формах: позаклітинної-віріон і внутрішньоклітинної-вірус. Таксономія цих представників мікросвіту заснована на характеристиці віріонів-кінцевої фази розвитку вірусів.
Будова (морфологія) вірусів.
1. Геном вірусів утворюють нуклеїнові кислоти, представлені одноланцюжковий молекулами РНК (у більшості РНК-вірусів) або дволанцюжкові молекулами ДНК (у більшості ДНК-вірусів).
2. Капсид - білкова оболонка, в яку упакована геномна нуклеїнова кислота. Капсид складається з ідентичних білкових субодиниць-капсомеров. Існують два способи упаковки капсомеров в капсид-спіральний (спіральні віруси) і кубічний (сферичні віруси).
При спіральної симетрії білкові субодиниці розташовуються по спіралі, а між ними, також по спіралі, укладена геномна нуклеїнова кислота (ниткоподібні віруси). При кубічному типі симетрії віріони можуть бути у вигляді багатогранників, найчастіше-двадцятигранниками - ікосаедра.
3.Просто влаштовані віруси мають тільки нуклеокапсид, тобто комплекс геному з капсидом і називаються "голими".
4. В інших вірусів поверх капсида є додаткова мембраноподобная оболонка, що купується вірусом у момент виходу з клітини господаря-суперкапсид. Такі віруси називають "одягненими".
Крім вірусів, є ще більш просто влаштовані форми здатних передаватися агентів - плазміди, віроіди і пріони.
Основні етапи взаємодії вірусу з клітиною хазяїна.
1.Адсорбція-пусковий механізм, пов'язаний із взаємодією специфічних рецепторів вірусу і господаря (у вірусу грипу-гемаглютинін, у вірусу імунодефіциту людини-глікопротеїн gp 120).
2.Пронікновеніе-шляхом злиття суперкапсиду з мембраною клітини або шляхом ендоцитозу (піноцитозу).
3.Освобожденіе нуклеїнових кислот-"роздягання" нуклеокапсиду і активація нуклеїнової кислоти.
4.Сінтез нуклеїнових кислот і вірусних білків, тобто підпорядкування систем клітини господаря і їх робота на відтворення вірусу.
5.Сборка віріонів-асоціація реплікованих копій вірусної нуклеїнової кислоти з капсидних білком.
6.Виход вірусних часток із клітини, придбання суперкапсиду оболонкових вірусів.
Виходячи взаємодії вірусів з клітиною хазяїна.
1. Абортивний процес - коли клітини звільняються від вірусу:
- При інфікуванні дефектним вірусом, для реплікації якого потрібен вірус-помічник, самостійна реплікація цих вірусів неможлива (так звані вірусоіди). Наприклад, вірус дельта (D) гепатиту може реплицироваться тільки при наявності вірусу гепатиту B, його Hbs - антигену, аденоассоціірованний вірус-у присутності аденовірусу);
- При інфікуванні вірусом генетично нечутливих до нього клітин;
- При зараженні чутливих клітин вірусом в Неразрешающаяся умовах.
2. Продуктивний процес - реплікація (продукція) вірусів:
- Загибель (лізис) клітин (цитопатический ефект) - результат інтенсивного розмноження та формування великої кількості вірусних частинок - характерний результат продуктивного процесу, викликаного вірусами з високою цитопатогенну. Цитопатический ефект дії на клітинні культури для багатьох вірусів носить досить впізнаваний специфічний характер;
- Стабільне взаємодія, що не приводить до загибелі клітини (персистуючі та латентні інфекції) - так звана вірусна трансформація клітини.
3. Інтегративний процес - інтеграція вірусного геному з геномом клітини хазяїна. Це особливий варіант продуктивного процесу за типом стабільного взаємодії. Вірус реплікується разом з геномом клітини хазяїна і може довго перебувати у латентному стані. Вбудовуватися у ДНК-геном господаря можуть тільки ДНК-віруси (принцип "ДНК-в ДНК"). Єдині РНК-віруси, здатні інтегруватися в геном клітини господаря-ретровіруси, мають для цього спеціальний механізм. Особливість їх репродукції-синтез ДНК провірусу на основі геномної РНК за допомогою ферменту зворотної транскриптази з наступним вбудовуванням ДНК в геном господаря.
Основні методи культивування вірусів.
1.В організмі лабораторних тварин.
2.В курячих ембріонах.
3.В клітинних культурах - основний метод.
Типи клітинних культур.
1. Первинні (тріпсінізірованние) культури - фібробласти ембріона курки (ФЕК), людини (ФЕЧ), клітини нирки різних тварин і т.д. Первинні культури отримують з клітин різних тканин частіше шляхом їх подрібнення і тріпсінізаціі, використовують одноразово, тобто постійно необхідно мати відповідні органи або тканини.
2. Лінії диплоїдних клітин придатні до повторного диспергуванню і росту, як правило не більше 20 пасажів (втрачають початкові властивості).
3. Перещеплюваних лінії (гетероплоідние культури), здатні до багаторазового диспергуванню і перевіванію, тобто до багаторазових пасажів, найбільш зручні у вірусологічній роботі-наприклад, лінії пухлинних клітин Hela, Hep та ін
Спеціальні живильні середовища для культур клітин.
Використовуються різноманітні синтетичні вірусологічні поживні середовища складного складу, що включають великий набір різних факторів росту-середовище 199, Голка, розчин Хенкса, гідролізат лактальбуміну. У середовища додають стабілізатори рН (Hepes), різні у видовому відношенні сироватки крові (найбільш ефективної вважають ембріональну телячу сироватку), L-цистеїн і L-глютамін.
У залежності від функціонального використання середовища можуть бути ростові (з великим вмістом сироватки крові) - їх використовують для вирощування клітинних культур до внесення вірусних проб, і підтримуючі (з меншим вмістом сироватки чи її відсутністю) - для утримання інфікованих вірусом клітинних культур.
Виявляються прояви вірусної інфекції клітинних культур.
1.Цітопатіческій ефект.
2.Виявлення тілець включень.
3. Виявлення вірусів методом флуоресцентних антитіл (МФА), електронної мікроскопії, авторадіографія.
4.Цветная проба. Звичайний колір використовуваних культуральних середовищ, що містять як індикатор рН феноловий червоний, при оптимальних для клітин умовах культивування (рН близько 7,2) - червоний. Розмноження клітин змінює рН і відповідно-колір середовища з червоного на жовтий за рахунок зміщення рН в кислу сторону. При розмноженні в клітинних культурах вірусів відбувається лізис клітин, зміни рН і кольору середовища не відбувається.
5.Виявленіе гемаглютиніну вірусів-гемадсорбції, гемаглютинація.
6.Метод бляшок (бляшкообразованія). У результаті цитолітичного дії багатьох вірусів на клітинні культури утворюються зони масової загибелі клітин. Виявляють бляшки-вірусні "клітинно-негативні" колонії.
Номенклатура вірусів.
Назва сімейства вірусів закінчується на "viridae", роду-"virus", для виду звичайно використовують спеціальні назви, наприклад - вірус краснухи, вірус імунодефіциту людини-ВІЛ, вірус парагрипу людини типу 1 і т.д.
Віруси бактерій (бактеріофаги).
Природним місцем існування фагів є бактеріальна клітина, тому фаги поширені повсюдно (наприклад, у стічних водах). Фагам притаманні біологічні особливості, властиві і інших вірусів.
Найбільш морфологічно поширений тип фагів характеризується наявністю голівки-ікосаедра, відростка (хвоста) зі спіральною симетрією (часто має порожнистий стрижень і скорочувальний чохол), шипів і відростків (ниток), тобто зовні дещо нагадують сперматозоїд.
Взаємодія фагів з клітиною (бактерією) суворо специфічно, тобто бактеріофаги здатні інфікувати тільки певні види і фаготип бактерій.
Основні етапи взаємодії фагів і бактерій.
1.Адсорбція (взаємодія специфічних рецепторів).
2.Внедреніе вірусної ДНК (ін'єкція фага) здійснюється за рахунок лізірованія речовинами типу лізоциму ділянки клітинної стінки, скорочення чохла, вштовхування стрижня хвоста через цитоплазматичну мембрану в клітину, упорскування ДНК в цитоплазму.
3.Репродукція фага.
4.Виход дочірніх популяцій.
Основні властивості фагів.
Розрізняють вірулентні фаги, здатні викликати продуктивну форму процесу, і помірні фаги, що викликають редуктивному фагів інфекцію (редукцію фага). В останньому випадку геном фага в клітині не не реплікується, а впроваджується (інтегрується) в хромосому клітини хазяїна (ДНК в ДНК), фаг перетворюється на профаг. Цей процес одержав назву лизогении. Якщо в результаті впровадження фага в хромосому бактеріальної клітини вона набуває нових успадковані ознаки, таку форму мінливості бактерій називають лизогенной (фагової) конверсією. Бактеріальну клітину, яка несе в своєму геномі профаг, називають лизогенной, оскільки профаг при порушенні синтезу особливого білка-репрессора може перейти в літичний цикл розвитку, викликати продуктивну інфекцію з лізисом бактерії.
Помірні фаги мають важливе значення в обміні генетичним матеріалом між бактеріями-у трансдукції (одна з форм генетичного обміну). Наприклад, здатністю виробляти екзотоксин володіють тільки збудник дифтерії, в хромосому якого інтегрований помірний профаг, що несе оперон tox, що відповідає за синтез дифтерійного екзотоксину. Помірний фаг tox викликає лизогенной конверсію нетоксигенних дифтерійної палички в токсигенних.
За спектром дії на бактерії фаги поділяють на:
- Полівалентні (лізують близькоспоріднені бактерії, наприклад сальмонели);
- Моновалентні (лізують бактерії одного виду);
- Типоспецифічні (лизируют тільки певні фаговар збудника).
На щільних середовищах фаги виявляють частіше за допомогою спот (spot) - тесту (освіта негативного плями при зростанні колоній) або методом агарових шарів (титрування за Граціа).
Практичне використання бактеріофагів.
1.Для ідентифікації (визначення фаготип).
2.Для фагопрофілактика (купірування спалахів).
3.Для фаготерапія (лікування дисбактеріозів).
4.Для оцінки санітарного стану навколишнього середовища та епідеміологічного аналізу.
Генетика бактерій та вірусів.
Молекулярна біологія, що вивчає фундаментальні основи життя, є в значній мірі дітищем мікробіології. Як основні об'єкти вивчення в ній використовують віруси і бактерії, а основний напрямок-молекулярна генетика заснована на генетиці бактерій і фагів.
Бактерії-зручний матеріал для генетики. Їх відрізняє:
- Відносна простота генома (сопокупності нуклеотидів хромосом);
- Гаплоїдні (один набір генів), що виключає домінантність ознак;
- Різні інтегровані в хромосоми та відокремлені фрагменти ДНК;
- Статева диференціація у вигляді донорських та реципієнтного клітин;
- Легкість культивування, швидкість накопичення біомас.
Загальні уявлення про генетику.
Ген-унікальна структурна одиниця спадковості, носій і хранитель життя. Він має три фундаментальні функції.
1. Безперервність спадковості - забезпечується механізмом реплікації ДНК.
2. Управління структурами і функціями організму - забезпечується за допомогою єдиного генетичного коду з чотирьох основ (А-аденін, Т-тимін, Г-гуанін, Ц-цитозин). Код триплетних, оскільки кодон - функціональна одиниця, що кодує амінокислоту, складається з трьох підстав (літер).
3. Еволюція організмів-завдяки мутаціям і генетичним рекомбінація.
У вузькоспеціальному плані ген найчастіше представляє структурну одиницю ДНК, розташування кодонів в якій детермінує первинну структуру відповідної поліпептидного ланцюга (білка). Хромосома складається з особливих функціональних одиниць-Оперон.
Основні етапи розвитку (ускладнення) генетичної системи можна представити у вигляді такої схеми:
кодон à ген à оперон à геном вірусів і плазмід à хромосома прокаріотів (нуклеоїд) à хромосоми еукаріотів (ядро).
Генетичний матеріал бактерій.
1. Ядерні структури бактерій - хроматіновие тільця або нуклеоїд (хромосомна ДНК). У бактерій одна замкнута кільцеподібна хромосома (до 4 тисяч окремих генів). Бактеріальна клітина гаплоидная, а подвоєння хромосоми (реплікація ДНК) супроводжується поділом клітини. Вегетативна реплікація хромосомної (і плазмідної) ДНК обумовлює передачу генетичної інформації по вертикалі-від батьківської клітини-к дочірньою. Передача генетичної інформації по горизонталі здійснюється різними механізмами-в результаті кон'югації, трансдукції, трансформації, сексдукціі.
2.Внехромосомние молекули ДНК представлені плазмідами, які мігрують генетичними елементами-транспозона і інсерваціоннимі (Інтернейрони) або IS - послідовностями.
Плазміди-екстрахромосомний генетичний матеріал (ДНК), більш просто влаштовані в порівнянні з вірусами організми, які наділяють бактерії додатковими корисними властивостями. За молекулярній масі плазміди значно менше хромосомної ДНК, містять від 40 до 50 генів.
Їх об'єднання в одне царство життя з вірусами пов'язано з наявністю ряду загальних властивостей-відсутністю власних систем мобілізації енергії і синтезу білка, самореплікаціей геному, абсолютним внутрішньоклітинним паразитизмом.
Їх виділення в окремий клас визначається істотними відмінностями від вірусів.
1.Среда їх проживання-тільки бактерії (серед вірусів, крім вірусів бактерій-бактеріофагів є віруси рослин і тварин).
2.Плазміди співіснують з бактеріями, наділяючи їх додатковими властивостями. У вірусів ці властивості можуть бути тільки у помірних фагів при лизогении бактерій, частіше ж за все віруси викликають негативний наслідки, лізис клітин.
3.Геном представлений двунітевой ДНК.
4.Плазміди представляють собою "голі" геноми, що не мають ніякої оболонки, їх реплікація не потребує синтезу структурних білків і процесів самозбірки.
Плазміди можуть розповсюджуватися по вертикалі (на клітинному розподілі) і по горизонталі, перш за все шляхом кон югаційного переносу. Залежно від наявності або відсутності механізму самопереноса (його контролюють гени tra-оперону) виділяють кон'югатівние і некон'югатівние плазміди. Плазміди можуть вбудовуватися в хромосому бактерій-інтегративні плазміди або знаходитися у вигляді окремої структури-автономні плазміди (еф).
Класифікація та біологічна роль плазмід.
Функціональна класифікація плазмід заснована на властивостях, якими вони наділяють бактерії. Серед них-здатність продукувати екзотоксини і ферменти, стійкість до лікарських препаратів, синтез бактеріоцинів.
Основні категорії плазмід.
1.F-плазміди - донорські функції, індукують поділ (від fertility - плідність). Інтегровані F - плазміди-Hfr-плазміди (високої частоти рекомбінації).
2.R-плазміди (resistance) - стійкість до лікарських препаратів.
3.Col-плазміди-синтез коліцінов (бактеріоцинів) - чинників конкуренції близькоспоріднених бактерій (антогонизм). На цій властивості засновано коліцінотіпірованіе штамів.
4.Hly-плазміди-синтез гемолізинів.
5.Ent-плазміди-синтез ентеротоксинів.
6.Tox-плазміди-токсиноутворення.
Близькоспоріднені плазміди не здатні стабільно співіснувати, що дозволило об'єднати їх за ступенем спорідненості в Inc-групи (incompatibility-несумісність).
Біологічна роль плазмід різноманітна, в тому числі:
- Контроль генетичного обміну бактерій;
- Контроль синтезу факторів патогенності;
- Вдосконалення захисту бактерій.
Бактерії для плазмід-середовище проживання, плазміди для них-стерпні між ними додаткові геноми з наборами генів, що сприяють збереженню бактерій у природі.
Мігруючі генетичні елементи - окремі ділянки ДНК, здатні визначати свій перенесення між хромосомами або хромосомою і плазміди за допомогою ферменту рекомбінації транспозази. Найпростішим їх типом є но інсерційні послідовності (IS - елементи) або вставні елементи, що несуть тільки один ген транспозази, за допомогою якої IS-елементи можуть вбудовуватися в різні ділянки хромосоми. Їх функції-координація взаємодії плазмід, помірних фагів, транспозонов і генофора для забезпечення репродукції, регуляція активності генів, індукція мутацій. Величина IS-елементів не перевищує 1500 пар основ.
Транспозони (Tn - елементи) включають до 25 тисяч пар нуклеотидів, містять фрагмент ДНК, що несе специфічні гени, і два Is-елемента. Кожен транспозон містить гени, привносять важливі для бактерії характеристики, як і плазміди (множинна стійкість до антибіотиків, токсиноутворення і т.д.). Транспозони-самоінтегрірующіеся фрагменти ДНК, можуть вбудовуватися і переміщатися серед хромосом, плазмід, помірних фагів, тобто мають потенційну здатність поширюватися серед різних видів бактерій.
Поняття про генотип і фенотип.
Генотип-вся сукупність наявних в організму генів.
Фенотип - сукупність реалізованих (тобто зовнішніх) генетично детермінованих ознак, тобто індивідуальне (в певних умовах зовнішнього середовища) прояв генотипу. При зміні умов існування фенотип бактерій змінюється при збереженні генотипу.
Мінливість у бактерій може бути ненаследуемой (модификационной) і генотипической (мутації, рекомбінації).
Тимчасові, спадково не закріплені зміни, що виникають як адаптивні реакції бактерій на зміни навколишнього середовища, називаються модифікаціями (частіше - морфологічні та біохімічні модифікації). Після усунення причини бактерії реверсують до вихідного фенотипу.
Стандартне прояв модифікації-розподіл однорідної популяції на дві або більше двох типів-дисоціація. Приклад-характер росту на живильних середовищах: S-(гладкі) колонії, R-(шорсткуваті) колонії, M-(мукоїдне, слизові) колонії, D-( карликові) колонії. Дисоціація протікає зазвичай у напрямку Sà R. Дисоціація супроводжується змінами біохімічних, морфологічних, антигенних і вірулентних властивостей збудників.
Мутації - стрибкоподібні зміни спадкової ознаки. Можуть бути спонтанні та індуковані, генні (зміни одного гена) та хромосомні (зміни двох або більше двох ділянок хромосоми).
Одночасно у бактерій є різні механізми репарації мутацій, в тому числі з використанням ферментів-ендонуклеаз, лігази, ДНК-полімерази.
Генетичні рекомбінації-мінливість, пов'язана з обміном генетичної інформації. Генетичні рекомбінації можуть здійснюватися шляхом трансформації, трансдукції, кон'югації, злиття протопластів.
1.Трансформація-захоплення і поглинання фрагментів чужий ДНК і утворення на цій основі рекомбінантів.
2.Трансдукція-перенесення генетичного матеріалу фагами (помірними фагами-специфічна трансдукція).
3.Кон'югація-при безпосередньому контакті клітин. Контролюється tra (transfer) опероном. Головну роль відіграють кон'югатівние F-плазміди.
Генетика вірусів.
Геном вірусів містить або РНК, або ДНК (РНК-і ДНК-віруси відповідно). Виділяють позитивну (+) РНК, яка має матричної активністю і відповідно-інфекційними властивостями, і негативну (-) РНК, не виявляє інфекційні властивості, яка для відтворення толжна транскрибувати (перетворюватися) в + РНК. Механізми репродукції різних вірусів дуже складні й істотно відрізняються. Основні їх схематичні варіанти представлені нижче.
1. вирионах (матрична) + РНК à комплементарна-РНК (у рибосомах) à вирионах + РНК.
2. - РНК à вірусна (інформаційна) + РНК à - РНК (формується на геномі зараженої клітини).
3. однониткових ДНК: + ДНК à + ДНК-ДНК à + ДНК-ДНК + ДНК à + ДНК.
4. ретровірусна однониткових РНК: РНК à ДНК (провірус) à РНК.
5. двунітевих ДНК: поділ ниток ДНК і формування на кожній комплементарної нитки ДНК.
Генофонд вірусів створюється і поповнюється з чотирьох основних джерел:
двох внутрішніх (мутації, рекомбінації) і двох зовнішніх (включення в геном генетичного матеріалу клітини господаря, потік генів з інших вірусних популяцій).
Комплементації - функціональна взаємодія двох дефектних вірусів, що сприяє їх реплікації і горизонтальної передачі.
Фенотипическое змішування - при зараженні клітини близькородинними вірусами з утворенням віріонів з гібридними капсида, кодованими геномами двох вірусів.
Популяційна мінливість вірусів пов'язана з двома різноспрямованими процесами - мутаціями і селекцією, пов'язаними із зовнішнім середовищем як індуктором мутацій і фактором стабілізуючого відбору. Гетерогенність вірусних популяцій-адаптаційний генетичний механізм, що сприяє пластичності (стійкості, пристосовності) популяцій, фактор еволюції і збереження видів у зовнішньому середовищі.
Генофонд вірусних популяцій зберігається за рахунок декількох механізмів:
- Відновлення мінливості за рахунок мутацій;
- Резервують механізмів (можливість переходу будь-яких, навіть негативних мутацій в наступну генерацію) - комплементації, рекомбінація;
- Буферних механізмів (освіта дефектних вірусних частинок, імунних комплексів та ін), що сприяють збереженню вірусу в мінливих зовнішніх умовах.
Література:
1. Паттерсон Р.Р. «Алергічні хвороби», 2000.
2. Петров Р.В. «Імунологія», в 2-х томах, 1987.
3. Петров Р.В., Хасетов Р.М. «Штучні антигени і вакцини», 1988.
4. Петров Р.В., Хасетов Р.М. «Вакцини нового покоління» / / «Імунологія», № 5, 1998.
5. Плейфера Дж. «Наочна імунологія», 1994.
1. Паттерсон Р.Р. «Алергічні хвороби», 2000.
2. Петров Р.В. «Імунологія», в 2-х томах, 1987.
3. Петров Р.В., Хасетов Р.М. «Штучні антигени і вакцини», 1988.
4. Петров Р.В., Хасетов Р.М. «Вакцини нового покоління» / / «Імунологія», № 5, 1998.
5. Плейфера Дж. «Наочна імунологія», 1994.