Реферат
на тему:
«ЯМР - спектроскопія нуклеїнових кислот, полісахаридів і ліпідів»
Введення
Поряд з протеїнами суті ю т та інші макромолекули, які виконують важливі біологічні функції. Більшість методів ЯМР, використовуваних для дослідження протеїнів, можуть бути при цьому безпосередньо перенесені на інші макромолекули. У цій роботі розглянемо характерні особливості застосування методу ЯМР для дослідження нуклеїнових кислот, полісахаридів та ліпідів.
1. Склад і структура нуклеїнових кислот
Нуклеїнові кислоти займають ключову позицію в процесах зберігання і передачі інформації про спадкові властивості організму. Як і протеїни, вони явля ю ться лінійними макромолекулами, що складаються з невеликого числа різних фрагментів, нуклеотидів.
ЯМР нуклеїнових кислот в принципі стикається з тими ж проблемами, що і ЯМР протеїнів. У той же час визначення просторової структури нуклеїнових кислот є більш простим завданням, тому що тут вибір основної пари нуклеотидів істотно обмежує число можливих просторових структур.
Основними ф рагментамі дезоксирибонуклеїнової кислоти є дезоксирибонуклеотидів, а основними фрагментами рибонуклеїнових кислот - рибонуклеотиди. За аналогією з амінокислотами в протеїнах ці ф рагменти відрізняються тільки своїми бічними ланцюгами, які в ДНК в основному складаються з піримідинових похідних - цитозину та тиміну - і пуринових похідних - аденіну та гуаніну. У РНК присутні ті ж бічні ланцюги, тільки підстава тимін замінено на урацил. Крім цих основних фрагментів нуклеїнових кислот є ще невелика кількість похідних цих підстав - так звані рідкі підстави.
ДНК є подвійну спіраль, утворену двома переплетеними нитками. Вона може існувати в кількох різних формах, значення яких для процесів регуляції і контролю передачі спадкової інформації в подальшому буде докладно обговорюватися. РНК, як правило, існує у вигляді мономера. Основними формами РНК є матрична РНК, транспортна РНК і рибосомна РНК. Як ДНК, так і РНК вступаєте різноманітні взаємодії з протеїнами, в результаті чого відбувається або зчитування інформації, або її регуляція. Додатково ДНК в еукаріотичних клітинах утворюють асоціати з протеїнами: гістонами, які беруть участь у будівництві хромосом. Подібні взаємодії демонструють РНК, наприклад рРНК зв'язується з протеїнами, з яких складаються рибосоми. У процесах розшифровки і передачі інформації мРНК і тРНК вступають в різноманітні взаємодії з ферментами, які беруть участь у цих процесах. Тому ясно, що дослідження взаємодій між протеїнами і нуклеїновими кислотами є однією з найбільш цікавих галузей застосування методу ЯМР до біологічних завданням.
2. Дослідження методом ЯМР нуклеїнових кислот і комплексів нуклеїнових кислот з протеїнами
Застосування методу ЯМР до дослідження нуклеїнових кислот має низку особливостей у порівнянні з дослідженням протеїнів. Так як основу нуклеотидів складають ароматичні системи, то має місце досить сильна залежність хімічних зсувів від конформації молекул, що призводить до значного ускладнення спектрів ЯМР. наряду с ЯМР З может быть использован в качестве достаточно чувствительного метода исследований.
Основним фрагментом у послідовності нуклеїнових кислот є фосфатний залишок, так що ЯМР 31 З поряд з ЯМР З може бути використаний як досить чутливого методу досліджень. 2+ связываются с тРНК и стабилизируют структуру. Іони Mg 2 + зв'язуються з тРНК і стабілізують структуру. На рис. . 3. 40 показаний приклад спектру 31 Р тРНК при різних концентраціях Mg.
наблюдаются хорошо разрешенные линии, положение которых изменяется в зависимости от концентрации.
У спектрі С спостерігаються добре дозволені лінії, положення яких змінюється в залежності від концентрації. Навіть у одновимірному спектрі ЯМР * Н можна досить чітко розрізнити окремі лінії всіх протонів іміногрупи, взаємодіючих між собою, і провести їх віднесення. Ці протони мають більш важливе значення для визначення структури, так як саме їх взаємодія відіграє основну роль при визначенні структури нуклеїнових кислот.Послідовне віднесення резонансних ліній і розрахунок тривимірної структури проводять тими ж методами, що і при дослідженні протеїнів. У принципі нуклеїнові кислоти можуть приймати різноманітні форми. Головна ланцюжок фрагмента завжди характеризується значеннями шести торсіонних кутів, один з яких розташовується в площині кільця рибози, а значить, має обмеженою областю значень, яка залежить від чотирьох ендоцікліческіх торсіонних кутів. Положення підстави щодо рибози визначається одним торсіонним кутом в глікозидного зв'язку. Усередині рибози спини всіх протонів пов'язані непрямим спін-спінові взаємодією. .
Це означає, що віднесення резонансних ліній, що належать рібозному залишку, може бути проведено за методи буд у COSY. Для заснування константи непрямого спін-спінової взаємодії, як правило, невеликі, так що з ростом молекулярної маси підстави їх далеко не завжди вдається зафіксувати. Всередині підстави констаіти непрямого спін-спінової взаємодії дають неповну інформацію, тому сле д ует додатково використовувати ЯЕО. На відміну від протеїнів окремі фрагменти пов'язані скалярним взаємодією через фосфатні групи, і в даному випадку для розшифровки структури можна скористатися зна ють константи гетероядерні непрямого спін-спінового взаємодії 1 З . - 31 С.
ф ос ф атной группы показывает, что имеется взаимодействйе .
Аналіз структури резонансних ліній у спектрах 31 З ф ос ф атной групи показує, що є взаімодействйе. ф ос ф ора з протоном в положенні 3 ', з протоном в положенні 5' СН 2-групи і 4 '- протоном дезоксирибози. Це означає, що провівши віднесення в спектрі лінії, що відповідає атому ф ос ф ора, пов'язаному з цим протоном, можна знайти лінію, відповідну протону в положенні 4 'наступного залишку. П равильне віднесення можна перевірити, визначивши, яка з ліній відповідає лінії протона в положенні 5 '. – 31 Р – J H , полученный по методу RCT , позволяет отнести линии, соответствующие протонам в положениях 3' и 4', которые принадлежат двум соседним кольцам дезоксирибозы. Спектр З - 31 Р - J H, отриманий за методом RCT, дозволяє віднести лінії, відповідні протонам в положеннях 3 'і 4', які належать двом сусіднім кільцям дезоксирибози.Інформація, що отримується з значень констант спін-спінової взаємодії та ЯЕО, почасти є надмірною, так що спінова система нуклеозиду може бути визначена досить надійно. Поряд з цим є залежні від просторової структури дані по ЯЕО для послідовності, виходячи з яких можна иденти ф іціровать сусідні нуклеотиди, а також дані по сильному ЯЕО для спарених підстав комплементарних ниток.
Розрахунок структури для подвійної спіралі ДНК відносно простий, тому що внаслідок спарювання основ і регулярності структур вже є досить надійно підтверджувані структурні гіпотези, серед яких необхідно провести вибір найбільш вірогідною і потім уточнити структуру. Подібне справедливо також і для ДНК з одного спіраллю або для РНК, есліоні володіють такою структурою, як, наприклад, тРНК.
Якщо структура фрагмента ДНК відома та проведено віднесення резонансних ліній, то можна вивчити взаємодію ДНК зі специфічними протеїнами. Прикладом цього може служити взаємодія з протеїном, який є лакрепрессором і пригнічує транскрипцію лактозоспеціфіческіх ферментів, так що лактоза практично відсутня в клітинах. Структура головної частини цього протеїну, яка відповідальна за зв'язування з ДНК, недавно було встановлено методом ЯМР і опублікована в. , можно определить положение протеина относительно ДНК в том случае, если известно лишь несколько расстояний из измерений ЯЭО. За спектрами комплексу, отриманим за методом NOESY, можна визначити положення протеїну щодо ДНК у тому випадку, якщо відомо лише кілька відстаней з вимірів ЯЕО. Експериментально за даними ЯЕО для 1 Н для трьох різних ароматичних кілець лак-репрессора знайдені структури, що відповідають певним нуклеотидам лак-оператора. За цим оцінним значенням відстаней отримана структура комплексу, в якому лак-репрессор розгорнутий на 180 ° в порівнянні зі структурою, полученнной з модельних уявлень.
3. Склад і структура полісахаридів
Третю групу біологічних макромолекул, що складаються з простих фрагментів, утворюють оліго-і полісахариди. Вони складаються з простих моносахаридних фрагментів, пов'язаних між собою. Функції полісахаридів вельми різноманітні. Вони грають роль резервних речовин, наприклад крохмаль, і структурних елементів, наприклад целюлоза. Важливу функцію розпізнавання клітин, а також роль рецепторів виконують поверхневі елементи: олігосахариди і малі полісахариди, пов'язані з ліпідами, властивості яких визначає їх первинна структура.
Основні фрагменти полісахаридів - моносахариди - виявляють більшу різноманітність, ніж амінокислоти. Правда, моносахариди з п'ятьма атомами вуглецю і з шістьма атомами вуглецю зустрічаються частіше, ніж інші вуглеводи.
Моносахаридних ф рагменти зазвичай пов'язані між собою глікозидними зв'язками. На відміну від протеїнів для них в основному характерна наявність розгалужених ланцюгів, так як для сахаридов кожна з гідроксигруп може утворювати точку розгалуження.
4. Визначення структури полісахаридів
Хімічний аналіз полісахаридів досить складний, тому багато досліджень сахаридов спрямовані на визначення їх хімічної структури. Кільце молекули сахаридов може приймати різні конформації: найбільш часто зустріч ю щиеся серед них - крісло і ванна. Обидві кон ф ормаціі характеризу ю тся типовими значеннями констант непрямого спін-спінової взаємодії і можуть досить просто визначатися з допомогу ю ЯМР Н. У обох конформаціях відстані між окремими кільцевими протонами також будуть розрізняти абсолютно певним чином. Отже, і дані по ЯЕО також повинні істотно відрізнятися. На противагу тому, що було отримано при рутинному поста-гур визначенні структури протеїнів, в хімії сахаридов відсутні прості методи послідовного визначення структури.
Для повного опису структури необхідно знати не тільки картину зв'язків моносахаридів, але й характер їх зв'язування, тобто - или /3 гликозидной. необхідно додатково визначити те, якою є зв'язок: CL - або / 3 глікозидної. Тут самим надійним є метод двовимірного ЯМР. Якщо ж нас цікавить тільки картина зв'язків моносахаридів, то віднесення сигналів у спектрах може бути істотно спрощено у разі проведення процедури деріватізаціі.
З точки зору біології значний інтерес представляє тривимірна структура полісахаридів, яка визначається конформацією кільцевих систем і обертанням щодо простих зв'язків у нециклічних частинах молекул. Принципово структуру полісахаридів можна визначити шляхом вимірювання констант зв'язку та ЯЕО, хоча тут можуть виникнути істотні труднощі при оцінці біологічного відповідності визначених структур. Зв'язування полісахаридів з ліпідами і протеїнами, а також характер упаковки їх в клітинні мембрани, мабуть, робить сильний вплив на їх просторову ю структуру, так що вимірювання, проведені в ізольованих полісахаридах, навіть за умови, що вони проводяться у водному середовищі, необов'язково повинні давати реальне уявлення про інтактною структурі. Але з іншого боку, такі вимірювання, мабуть, дають найкраще уявлення про структуру полісахаридів.
5. Дослідження біологічних мембран
Ліпіди утворюють великий гетерогенний клас органічних молекул, які можуть бути екстрагувати неполярними розчинниками. Поряд з ізольованими молекулами, такими, як жиророзчинні вітаміни і стероїдні гормони, для яких ЯМР успішно застосовується для встановлення хімічної структури, важливі також фос ф оліпіди, які утворюють шюскіе, надмолекулярні структури - подвійні ліпідні мембрани. У відповідності до тієї ролі, яку відіграють мембрани, вони були вичерпно досліджені з використанням усіх наявних у розпорядженні біо ф ізіческіх методів, включаючи ЯМР.
При дослідженні мембран завжди мають справу з великою кількістю молекул. Мембрани, що зустрічаються в природі, являють собою дуже складні системи, що складаються з великої кількості різних ліпідів і протеїнів, вбудованих в ліпідну мембрану. У силу цього виключно складно отримати детальне уявлення про індивідуальні молекулах подібно до того, як це було зроблено для протеїнів у розчинах. Тільки для деяких модельних систем, таких, як міцели і ліпосоми, які складаються з цілком визначених компонентів, можна сподіватися на те, що будуть отримані надійні відповіді на принципові питання, що стосуються їх організації та рухи. Надалі результати, отримані для модельних мембран, можуть бути перенесені на мембрани, що зустрічаються в природі.
У залежності від температури і складу мембрани можуть існувати в різних ф ізіческіх фазах. При зниженні температури мембрани виявляють властивості твердих тіл, при підвищенні температури вони переходять в рідкокристалічний стан, що характеризується більшою рухливістю молекул в площині мембрани. У рідкокристалічному стані знайдено, що коефіцієнти латеральної дифузії майже так само високі, як і у воді. Як правило, у такому стані перебувають біологічно активні мембрани при фізіологічних умовах. Обмеження руху в одній площині приводить до того, що в спектрах ЯМР спостерігаються досить широкі лінії, так як в даному випадку изотропное рух неможливо.
Нижче температури переходу ширина спектральних ліній дуже велика і складає декілька мільйонних доль, що відповідає значенням, які спостерігаються для спектрів ЯМР в твердих тілах.
можно наблюдать фос ф орсодержащие липосомы. Так як ф осфоліпіди містять ф ос ф атние групи, за допомогою ЯМР 31 З можна спостерігати фос ф орсодержащіе ліпосоми. Вище температури фазового переходу за сприятливих умов у штучних мембранних везикулах можна спостерігати сигнали від різних фосфоліпідів. У малих везикулах вдається розрізнити лінії, відповідні фосфоліпідів, що знаходяться на внутрішній і зовнішній сторонах мембрани. Для більш надійного віднесення відповідних резонансних ліній фосфоліпідів на внутрішню або зовнішню поверхню мембрани, необхідно додати парамагнітне речовина, для якого проникність мембрани невелика, і в основному буде спостерігатися зв'язування цієї речовини з фосфоліпідів, що знаходяться на одній зі сторін поверхні. Резонансні лінії ліпідів, пов'язаних з парамагнітними речовиною, в цьому випадку сильно уширяется і практично не спостерігаються в спектрі. Спектри ЯМР 31 Р ліпосом також є підтвердженням зробленого раніше висновку про те, що збільшення напруженості магнітного поля далеко не завжди забезпечує більш високий дозвіл, тому що для ядер фосфору внесок у релаксацію за рахунок анізотропії хімічного зсуву буде значним. У цьому випадку швидкість релаксації зростає як квадрат напруженості магнітного поля), а різниця значень хімічних зсувів збільшується із зростанням поля лінійно, тому розширення ліній може компенсувати зростання дозволу.
П про цієї причини в розглянутих вище системах для більш сильних полів не вдається розрізнити сигнали від фосфоліпідів, що знаходяться на внутрішній та зовнішній сторонах мембрани. Звичайно ліпіди, що входять до складу мембран, можна досліджувати за допомогою ЯМР * Н. У цьому випадку вдається окремо спостерігати сигнали від різних груп, що входять до складу ліпідів. За спектрами ЯМР 13 Сі'Н за умови, що ізотопне заміщення проводиться за строго визначеними положенням, вдається селективно спостерігати атоми, що знаходяться в довгих вуглеводневих ланцюжках.
Ліпідні мембрани облада ю т тим характерним властивістю, що молекули ліпідів певним чином впорядковані. В одному з граничних випадків всі молекули повністю у п орядочени, як у кристалічному стані. Іншим граничним випадком є статистичний п орядок, який більшою чи меншою сте п єни спостерігається для рідин і порошкоподібних середовищ. Для кількісного опису ступеня у п орядоченія, званого рідкокристалічним, ис п Ользен поняття параметра порядку. Ця величина є мірою макроскопічного впорядкування деякої величини у зразку: наприклад, упорядкування напрямку вектора, що з'єднує два виділених атома в молекулі, щодо деякої осі. Параметр порядку може бути визначений як величина, яка приймає значення, рівне одиниці, якщо відповідні величини, що вимірюються в молекулах, є однаковими для всіх молекул, і значення, рівне нулю, якщо ці величини приймають всі можливі значення. На практиці параметр порядку не завжди допускає таку просту і наочну інтерпретацію, а також не завжди вдається встановити безпосередній зв'язок з величинами, які можуть бути виміряні за спектрами.
Важливі результати, необхідні для встановлення структури мембран, можуть бути отримані для орієнтованих мембран за допомогою резонансу на ядрах дейтерію. Орієнтація створюється наступним чином. Плівку поміщають між двома тонкими скляними пластинами, кожна з яких задає орієнтацію прилеглого шару, тобто виходить подвійний шар. При проведенні експериментів необхідно, перш за все, вирішити проблему поліпшення відношення сигнал / шум. Тут існує достатньо п зростанням варіант рішення: для цього необхідно скласти декілька скляних пластинок з мембранами чаркою і отримати спектр в такому зразку. При наявності орієнтації спектри мембран переходять з області резонансу, характерного для рідини, коли внаслідок ізотропного руху велика частина взаємодій повністю усереднюється, в область резонансу, характерного для твердих тіл. У орієнтованих системах спостерігається розщеплення резонансних ліній Бн, яке залежить від орієнтації системи щодо зовнішнього магнітного поля і характеризується константою квадрупольного взаємодії, відмінною від нуля для дейтерію, спін ядра якої дорівнює одиниці. У рідкокристалічному стані обертальна ді ФФ узія щодо осі, перпендикулярної поверхні мембрани, як правило, відбувається з досить високими швидкостями, тому розходження в спектрах, які спостерігаються для молекул, що знаходяться в цих площинах, усереднюються до нуля. Величина квадрупольного розщеплення Д V залежить від вугілля і між напрямком зв'язку 13 С - 2 Н і нормаллю до площини мембрани, а також від кута, який становить ця нормаль по відношенню до зовнішнього магнітного поля. Відповідний параметр порядку визначається за наступною ф ормуле:
Якщо розглянути не орієнтовану мембрану, а ліпосом та провести усереднення по всіх можливих напрямах нормалі до поверхні мембрани, то знайдемо максимум, відповідний перпендикулярної орієнтації. Отже, в повному спектрі будуть спостерігатися в основному дублетні сигнали від цих молекул, і отримаємо два максимуми. Спостережуване розщеплення дається ф ормулой
– постоянная Планка, e 2 q де h - постійна Планка, e 2 q – градиент электрического поля в направлении связи 13 С – Н. На рис. - Квадрупольний момент дейтерію S CD - градієнт електричного поля в напрямку зв'язку 13 С - Н. На рис. наведено спектр ЯМР 2 Н реконструйованих саркоплазматический везикул нижче і вище температури ф азово переходу. Жирні кислоти мембранних ліпідів селективно позначені дейтерієм в положеннях 9 і 10. При вбудовуванні саркоплазматичної АТ Фази в мембрану спостерігається константа квадрупольного взаємодії убуває, тобто параметр порядку зменшується. Нижче температури переходу спостерігається розширений спектр, типова ширина ліній якого характерна для стану гелю. Вбудовування протеїну в мембрану ще більш сильно позначається на вигляді спектру ЯМР.