Ферментативний каталіз

Ферментативний каталіз

Ферментативний каталіз використовується людьми тисячі років, задовго до появи самого поняття "каталіз". Отримання молочно-кислих продуктів, сиру, приготування тіста, вина, барвників та ін продуктів включало застосування ферментативних процесів. Технологія цих процесів передавалася з покоління в покоління і була емпірично відпрацьована до досконалості. Вважають, що в еволюції життя і появу складних біологічних систем (включаючи людину) важливу роль зіграв ферментативний каталіз.

Ферменти (ензими) - біологічні каталізатори володіють унікальними властивостями: високою продуктивністю у розрахунку на один реакційний центр і селективністю, пов'язаної зі специфічністю дії. Працюють ферменти в дуже м'яких умовах, при атмосферному тиску і температурі до 40 ^о. У біологічних системах відсутні неводні розчинники та сильні кислоти та основи (рН ≈ 7). Наприклад фермент уреаза гідролізує тільки молекули сечовини, не звертаючи уваги на інші аміди, і робить це набагато ефективніше звичайних кислотних каталізаторів (табл.).

Таблиця

Реакція і субстрат	Каталізатор	Константа ско-рости другого за-рядка, моль -1 ∙ с-1	Температура, о С
Гідроліз складних ефірів Етілбензоат Етиловий ефір N-бензоїл-L-тирозину	Н 3 О + Хімотрипсин	9,0 ∙ 10 -5 1,9 ∙ 10 Квітня	54 25
Гідроліз аденозин-трифосфату (АТФ)	Н 3 О + Міозин	4,7 ∙ 10 -6 8,2 ∙ 10 червня	40 25
Гідроліз амідів Бензаміди Амід N-бензоїл- L-тирозину Сечовина	Н 3 О + Хімотрипсин Н 3 О + Уреаза	2,4 ∙ 10 -6 14,9 7,4 ∙ 10 -6 5,0 ∙ 10 червня	52 25 62 21

Міжнародні правила номенклатури ферментів в залежності від виконуваних ними функцій виділяють шість основних класів з відповідними підкласами всередині кожного класу (табл.).

Таблиця

Наведена таблиця може допомогти орієнтуватися в безлічі вже відомих ферментів їх назв.

Ферментом може бути глобулярний білок, в активному центрі якого зібрані функціональні групи, що входять до складу амінокислотних залишків цього білка. В інших випадках до складу активного центру входить міцно пов'язана з білковою ланцюгом простетичної група (наприклад, ліпоєва кислота) або слабо пов'язаний кофермент (наприклад, АТФ). Фермент в цілому називають холоферментом, а те, що залишається після видалення коферменту, - апоферментом.

Відповідно до вимог, що пред'являються при підборі каталізаторів-фементов, їх поділяють на такі групи:

1. Ферменти без коферментів - прості гідролази, ліази і ізомерази.

2. Ферменти, які не потребують наявності коферменту (містять міцно пов'язану простетичної групу, наприклад, флавінових або пірідоксальную) - трансамінази, пероксидази і т. п.

3. Ферменти, які вимагають регенерації коферменту, зазвичай АТФ або НАД (Ф) Н - наприклад, кінази, більшість оксидоредуктаз.

4. Ферменти, які зустрічаються в многоферментних системах.

Ферменти першої групи використовуються поки ширше, часто і в промисловому масштабі (синтез L-амінокислот, 6-амінопеніціліновой кислоти, ізомеризація глюкози у фруктозу і т. д.). Інші групи ферментів вимагають створення особливих умов і досі знаходять застосування тільки в лабораторних синтезах.

Що таке ферменти і за рахунок яких факторів вони працюють так ефективно?

Пояснення полягає в тому, що фермент має здатність формувати так званий активний центр і створювати в ньому специфічне оточення, в якому протікання каталізуються реакції відбувається незрівнянно швидше, ніж у розчині.

В активному центрі відбувається специфічне зв'язування субстрату. Наприклад, зброджування глюкози в спирт дріжджами вимагає участі понад 12 ферментів, кожен з яких виконує свою функцію. Це можливо тільки благо даруючи високої специфічності.

Розрізняють абсолютну специфічність - специфічність по відношенню до одного конкретного субстрату (уреаза - сечовина; галактокіназа переносить фосфат від АТФ тільки на Д-галактозу, але не на її стерео ізомери Д-глюкозу і Д-манозу);

абсолютну групову специфічність - специфічність до певного класу субстратів (спирти, альдегіди, прості або складні ефіри). Так, протеолітичний фермент пепсин специфічний щодо гідролізу пептидного зв'язку. Алкогольдегідраза окисляє тільки спирти, а лактікодегідраза - тільки α-оксикислоти;

відносна групова специфічність - фермент діє переважно на один клас сполук, але може в деякій мірі діяти і на представників інших класів, перетворюючи їх з меншими швидкостями, ніж представників основного класу. Трипсин здатний розщеплювати як пептидні, так і складноефірні зв'язку.

Оптична специфічність - загальна властивість здебільшого ферментів взаємодіяти з речовинами, що мають певну оптичну активність.

Основу ферментів становлять білки, тому можна сказати, що ферменти - це білки, здатні каталізувати хімічні реакції. Відкрито ферменти були в 30-і роки 19-го століття, і приблизно сто років пішло на те, щоб прийти до наведеного визначення. Не всякий білок може бути ферментом. За зовнішньою формою білки бувають лінійні (фібрилярні) і глобулярні. Тільки глобулярні білки можуть бути ферментами. Білки - це поліпептиди, тобто полімери, що складаються з амінокислотних залишків, сполучених пептидной зв'язком. Нижче показана реакція утворення дипептиду. Всі природні білки побудовані з приблизно 20 різних амінокислотних

NH _2-CH-COOH + H ₂ N-CH-COOH → NH _{2-CH-CO-HN-CH-COOH} + H ₂ O

X ₁ X ₂ X ₁ X ₂

залишків, що відрізняються будовою групи Х. Каталітичні властивості можуть виявляти поліпептиди (білки), які мають молярну масу не менше 5000.

Будова білків має три різних рівня.

Первинна структура визначається послідовністю амінокислотних залишків, що утворюють поліпептидний ланцюг.

Вторинну структуру білка визначають додаткові зв'язки, що виникають між групами, що належать різним амінокислотним залишкам, що знаходяться в різних частинах поліпептидного ланцюга. До числа таких зв'язків відносяться водневі, електростатичні, координаційні, гідрофобно-гідрофобні і Ван-дер-ваальсови взаємодії. У результаті утворення додаткових зв'язків окремі ділянки поліпептидного ланцюга утворюють α-спіралі, петлі і β-тяжі.

Третинна структура білка формується в результаті згортання окремих ділянок поліпептидного ланцюга у відносно автономні глобулярні освіти, звані доменами. Остаточне формування третинної структури відбувається завдяки специфічним взаємодіям, що виникають між окремими доменами, кожен з яких згортається самостійно. Довгі поліпептидні ланцюги зазвичай формують декілька доменів, величина яких значно варіює, складаючи в середньому 150 амінокислотних залишків. Взаємодії між доменами призводять до утворення глобули.

Домени характеризуються тим, що число взаємодій між амінокислотними залишками в складі домену значно перевищує таке між сусідніми доменами. Завдяки цьому міждоменної області виявляються порівняно легко доступними для розчинника і містять порожнини об'ємом 20-30 кубічних ангстрем, що включають кілька молекул води. «Архітектурні принципи» побудови окремих доменів різні, що можебути пов'язано з виконанням ними різних функцій.

Активні центри Мультидоменні (у більшості випадків - двухдоменних) ферментів, як правило, розташовуються в междоменной області. Таким чином, кожен з доменів вносить свій внесок у зв'язування учасників реакції.

Важливим наслідком розташування активного центру на кордоні між доменами є забезпечення гнучкості, рухливості даної області молекули завдяки тому, що в ході конформаційних змін, викликаних зв'язуванням субстратів, домени зазнають взаємне переміщення.

Між розміром молекули біологічного каталізатора (тобто довжиною його поліпептидного ланцюга) і складністю виконуваної ним функції існує пряма залежність. Ускладнення функціональних властивостей досягається як за рахунок формування активного центру на межі розділу між двома каталітичними доменами, так і за рахунок появи додаткових доменів, відповідальних за регуляцію активності. Такі ферменти, як лізоцим і глікогенфосфорілазу, різко розрізняються за розмірами (129 амінокислотних залишків в першому і 842 - у другому), хоча обидва каталізують реакції розщеплювання гликозидной зв'язку. Функціональний сенс «обважнення» молекули глікогенфосфорілазу полягає в наданні їй додаткової здатності координувати роботу активного центру відповідно до сигналів, які надходять із зовнішнього середовища (зміна концентрацій метаболітів, нервові і гормональні сигнали).

До факторів, що визначає високу ефективність ферментів, відносять:

1. Концентраційний ефект.

2. Орієнтаційний ефект.

3. Поліфункціональність реакційного центру.

Сутність концентраційного ефекту в разі ферментів нічим не відрізняється від концентраційного ефекту в гетерогенному каталізі. Фермент у своєму реакційному центрі створює локальну концентрацію субстрату, яка істотно вище, ніж середня концентрація в розчині. У реакційному центрі ферменту селективно концентруються молекули, які мають прореагувати між собою. Такий ефект може призводити до прискорення реакції на кілька порядків.

При протіканні звичайних хімічних реакцій важливо, якими частинами відбувається зіткнення реагуючих молекул. Тобто, молекули при зіткненні повинні бути відповідним чином орієнтовані один щодо одного. У реакційному центрі ферменту при координації молекули субстрату та освіті фермент-субстратного комплексу відбувається чітка орієнтація реагують молекул за рахунок взаємодії з функціональними групами реакційного центру. Це призводить до прискорення реакцій приблизно на три порядки.

Під поліфункціональністю реакційного центру ферменту розуміють одночасне або узгоджене вплив функціональних груп, що входять до складу реакційного центру, на молекулу субстрату. При цьому відбувається не тільки фіксація перетворюється молекули в строго певному положенні (див. попередній пункт), але й зміна характеристик самої молекули: розтягування зв'язків, зміна валентних кутів. Ці зміни призводять до підвищення реакційної здатності субстратів, тобто, до їх активації і прискоренню їх перетворення.

Кінетика ферментативного каталізу має деякі особливості. Здатність ферментів специфічно зв'язувати свої субстрати обумовлює найважливішу особливість каталізуються ними реакцій: вони починаються з утворення фермент-субстратного комплексу. Зв'язування субстратів обмежує їх рухливість, зближує і орієнтує їх відносно один одного оптимальним чином для здійснення реакції, зменшення ступенів свободи поступального і обертального руху призводить до зниження ентропії. Важливим наслідком зближення і взаємної орієнтації реагуючих груп субстратів, з одного боку, і функціональних груп ферменту, з іншого, є те, що каталіз стає внутрішньомолекулярним. Це істотно збільшує його ефективність, так як продуктивні зіткнення між молекулами в розчині відносно рідкі.

По Л. Міхаелісу і М. Ментен освіта фермент-субстратного комплексу здійснюється в результаті порівняно швидкої оборотної стадії:

k ₁

E + S ES

k _-1

Потім комплекс більш повільно розпадається з утворенням продукту і вивільненням ферменту:

k ₂

ES E + P

k _-2

Друга стадія реакції є лімітуючої. Загальна швидкість реакції пропорційна концентрації фермент-субстратного комплексу. У початковий період реакції концентрація продукту пренебрежимо мала, і другу стадію можна вважати незворотною. У такому випадку початкова швидкість ферментативної реакції виражається рівнянням:

R _o = k ₂ [ES]

Прийнявши, що [E _o] - загальна концентрація ферменту, а ([E _o] - [ES]) відповідає концентрації вільного ферменту, а також що [S]>> [E _o], можна отримати вираз для [ES]:

[ES] = ([E _o] ∙ [S] / {[S] + (k ₂ + k _-1) / k _1}

Відношення (k ₂ + k _-1) / k ₁ називається константою Міхаеліса (К _М); з урахуванням цього кон-

рація фермент-субстратного комплексу і початкова швидкість можуть бути описані рівнянням нями:

[ES] = [E _o] ∙ [S] / (К _М + [S])

R _o = k ₂ [ES] = k ₂ [E _o] ∙ [S] / (К _М + [S])

Останнє рівняння називають рівнянням Міхаеліса-Ментен. Необхідно зазначити, що величина К _М збігається з термодинамічною константою дисоціації фермент-субстратного комплексу тільки в разі квазірівноваги першій стадії і лімітування процесу другою стадією. У всіх інших випадках До _М є складним комплексом констант швидкості стадій ферментативного процесу.

Розглянемо механізм функціонування ферментативного каталізатора на прикладі гідролітичного ферменту хімотрипсину.

Хімотрипсин - фермент підшлункової залози, функція якого в організмі полягає в розщепленні білків їжі, тобто пептидного зв'язку. Крім цього хімотрипсин може каталізувати гідроліз складних ефірів та деякі інші реакції. Брутто формула хімотрипсину, що включає 241 залишок амінокислот, не несе інформації про будову: З ₁₁₀₅ H ₁₇₃₂ O ₃₄₄ N ₃₀₀ S _12, також як перерахування кількості амінокислотних залишків: аланін ₂₂ аргінін ₃ аспарагінова кислоти ₈ аспарагін ₁₄ глутамінова кислота ₃ глутамін ₁₀ гліцин ₂₄ гістидин ₂ ізолейцин ₁₀ лейцин ₁₉ лізин ₁₄ метіонін ₂ полуцістін ₁₀ пролін ₉ серин ₂₈ треонін ₂₂ триптофан ₈ тирозин ₄ валін ₂₃ фенілаланін _6. Перераховані амінокислотні залишки з'єднані в поліпептидних ланцюг в певній послідовності (первинна структура). Окремі частини поліпептидного ланцюга за рахунок утворення додаткових зв'язків (див. вище) скручуються в α-спіралі, β-тяжі і петлі (вторинна структура). Перераховані елементи вторинної структури за рахунок додаткових взаємодій згортаються в два домени, в місці зіткнення яких виникає активний центр ферменту, що включає залишок серину (Х --СН ₂ ОН), аспарагінової кислоти (Х _--СН2 СОО ^-), гістидину.

Механізм реакції гідролізу складного ефіру показаний на схемі. 2. При підході субстрату до активного центру ферменту неполярная гідрофобна частина субстрату взаємодіє з гідрофобною частиною активного центру, протон від серину переходить на азот гістидину, а протон від другого азоту гістидину зміщується до аниону залишку аспарагінової кислоти. Утворився з гідроксильної групи серину сильний нуклеофил --О атакує електрофільні вуглець субстрату, в той час як нуклеофільних частина субстрату взаємодіє з протоном, пов'язаних з гистидином. У результаті цих взаємодій утворюється фермент-субстратної комплекс. На наступній стадії рветься зв'язок С-Х в субстраті, йде молекула НХ, а її місце в активному центрі займає молекула води. Протон від залишку аспарагінової кислоти повертається до другого азоту гістидину. Потім рветься попередньо активована зв'язок О-Н в молекулі води (протон зв'язується з першим азотом гістидину, а гідроксил - з вуглецем колишнього субстрату). Протон від другого азоту гістидину знову повертається до залишку аспарагінової кислоти. І нарешті виділяється кислота, місце якої займає новий субстрат або активний центр повертається в початковий стан.

Рекомендовано література

1. Г. Хенріці-Оліве顟С. Оліве. Хімія каталітичного гідрування СВ. Москва, Мир, 1987 р.

2. Ф. басолі, Р. Джонсон. Хімія координаційних сполук. Москва, Мир, 1966.

3. Під ред. Г. Цейсс. Хімія металоорганічних сполук. Москва, Мир, 1964.

4. Е. Фішер, Г. Вернер. Π-Комплекси металів. Москва, Мир, 1968.