Стандартні препарати і ефекти матриксу
ВСТУП
У цій роботі обговорюється проблема приготування стандартів і матриксу, а також їх вплив на стандартизацію імуноаналізу. Стандартизація базується на застосуванні певних принципів і звичайно включає в себе оцінку систематичних помилок, точності, відтворюваності та порівнянності даного методу з іншими. Незалежно від того, наскільки ускладнена або, навпаки, спрощена нова аналітична система, при її стандартизації повинні дотримуватися одні й ті ж принципи. Нерозуміння цих принципів і нехтування ними призводять до серйозних помилок.
Таким чином, в дану роботу включені наступні питання: 1) проблеми, пов'язані з так званим матриксних ефектом; 2) інші фактори, іноді помилково приписувані матріксиому ефекту; 3) наслідки заміни одного міжнародного стандарту на інший; 4) обмеження при використанні моноклональних антитіл; 5) проблеми приготування контрольних матриксом для гаптенов; 6) деякі нові та розробляються стандарти Національного інституту біологічних стандартів і контролю (NIBSC).
Стандартизація імуноаналізу необхідна для 1) поліпшення точності діагнозу і моніторингу захворювань; 2) вибору загальних критеріїв для діагнозу захворювань; 3) можливості прямого порівняння ефективності різних імунодіагностичних наборів.
Перш ніж перейти до обговорення зазначених питань, хотілося б звернутися з проханням до читачів прочитати цей розділ до кінця, яким би сухим і нудним він ні здався.
ПРОБЛЕМА МАТРІКС
Різні способи порівняння свідчать, що зазвичай різні методи імуноаналізу дають добре узгоджуються між собою результати. Однак іноді результати визначення конкретної речовини за допомогою даного методу виходять за розумні межі. Наприклад, два роки тому в одній з країн застосування декількох готових наборів постійно призводило до суттєво відрізняється результатами визначення тиреотропного гормону (TSH) у плазмі. Представники компаній, які випускають ці набори, вирішили, що розбіжності в результатах аналізу могли виникнути через застосування різних за складом розчинів для розведення міжнародного стандарту. Всесвітньою організацією охорони здоров'я (ВООЗ) * було запропоновано розробити метод вивчення ефекту різних матриксом. Потім ВООЗ спільно з Міжнародною організацією клінічної хімії (IFCC) провела спеціальний симпозіум з даної проблеми, на якому були запропоновані шляхи поліпшення порівнянності результатів різних методів імуноаналізу.
Калібрування імунодіагностичних наборів. Для калібрування будь-якого набору для аналізу кожна фірма, що випускає такі набори, має систему первинних і вторинних стандартів. Первинний контрольний стандарт зазвичай складається з Алік-ось, взятих із серії разбавлений стандарту. Кожна аліквотах містить відому кількість визначається речовини і зберігається при дуже низькій температурі. Ці аліквотах використовуються для калібрування робочих стандартів, які в свою чергу застосовують для калібрування випускаються наборів. Обумовлений речовина в первинному стандарті може бути або відомий кількістю чистого хімічної сполуки, або поліпептидом, зміст якого виражено в одиницях міжнародного біологічного стандарту, або препаратом, каліброваним з даного пептиду. Для розведення стандарту часто використовують сироватки, буферні розчини і розчини, що містять білок-носій. Склад цих розчинів, або, як їх ще називають, матриксом, може впливати на реакцію антиген - антитіло, в результаті чого і з'являються систематичні помилки і мінливість результатів аналізу. Це явище називають "матриксних ефектом". Принцип порівнянності аналізів полягає в тому, щоб аналізоване речовина в пробі взаємодіяло в тих же умовах, що і в стандартному розчині. Молекулярне оточення визначається речовини в обох розчинах має бути ідентичним або дуже близькою за складом; тільки тоді можна точно визначити його концентрацію. Визначення більшості речовин проводиться в сироватці, і, безсумнівно, матриксних ефекти пов'язані з типом і способом обробки матеріалу, що використовується для розведення стандартів. Ясно, що такий матриксних ефект відмінний від ефектів, обумовлених прис> гствіем аутоантитіл, лікарських препаратів, пухлинних клітин або незвично високих концентрацій попередників або метаболітів визначається речовини.
Матриксних ефекти найчастіше впливають на визначення ти-реотропіна (TSH), загального тироксину (Л4), загального трііодотіро-нина (З), пролактину, фолікулостимулюючого гормону (FSH), лютеїнізуючого гормону (LH) і стероїдів (кортизолу, прогестерону і тестостерону, якщо вони попередньо не виділені з проби екстракцією).
Інші можливі джерела систематичних помилок. Інші пов'язані з проблемами стандартизації причини розбіжностей в результатах аналізу можуть бути обумовлені 1) відмінностями в молекулярній структурі визначається речовини або речовин в пробі і стандартному розчині (по суті справи, в цьому випадку порівнюються різні сполуки), 2) відмінностями у складі, способі зберігання і стабільності стандартів, які використовуються фірмами-постачальниками в якості первинного і робочого стандартів, а також стандарту для наборів; 3) систематичними помилками, пов'язаними з різною специфічністю аналізу на кожній стадії калібрування; 4) помилками при технічних операціях (наприклад, при розведенні розчинів), а також невдалої оптимізації умов аналізу, особливо при поділі вільного та зв'язаного з антитілами речовини.
Відмінності в молекулярній структурі чистих хімічних сполук можуть бути обумовлені присутністю ізомерів, зв'язування яких з білками плазми може відбуватися інакше, ніж у гаптенов, що володіють тільки нативної просторову конфігурацію. У цьому випадку при приготуванні стандартів не допомагає і додавання екзогенного стероїду до сироватці. Крім того, ставлення пов'язаного з білком і вільного визначається речовини може змінюватися в залежності від умов аналізу, наприклад рН або іонної сили. Нарешті, невеликі відмінності в методах виділення визначається речовини з фізіологічних рідин можуть бути джерелами розкиду і систематичної помилки результатів аналізу.
Молекулярна гетерогенність стандартів. ВООЗ встановлені міжнародні стандарти, контрольні препарати або контрольні реагенти для двох груп складних біологічних сполук: 1) з'єднань (наприклад, пептидних гормонів), які можна очистити і визначити кількісно за допомогою біологічних аналізів; 2) речовин (наприклад, феритину або субодиниць глікопротеїнових гормонів) , які в даний час можна визначити лише по їх імунологічної активності.
Міжнародні стандарти для з'єднань першої групи звичайно містять препарати очищеного гормону і білок-носій. Такий склад стандартів дозволяє охарактеризувати їх за допомогою як певних методів біоаналіза in vivo або in vitro, так і фізико-хімічних методів. Ці методи використовуються для ідентифікації та кількісного визначення таких речовин [1].
Іншою причиною невідповідності між стандартами є природна гетерогенність молекулярної структури, яка найбільш часто спостерігається у разі глікопротеїнових гормонів (TSH, FSH, LH), а також пролактину і гормону росту. Зміст ізогормонов змінюється в залежності від джерела і способу отримання.
Молекулярна структура визначається речовини може змінюватися при ліофілізації, яка майже завжди включається в методики приготування міжнародних та більшості вторинних стандартів. Такі зміни можна виявити і оцінити кількісно за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) та ізоелектричного фокусування. Можна виділити два звичайних типу денатурації: 1) необоротна деформація молекули білка через пересушування; 2) утворення комплексів між пептидом і носієм, наприклад лактозою, Манні-том і трегалози.
І нарешті, не менш важливим фактором є власна нестабільність визначається речовини в стандарті. Причина, природа і ступінь змін структури багатьох складних білків (дезамінування, окислення, зміна конформації), які відбуваються при їх зберіганні, дуже мало або зовсім не вивчені, а часто просто ігноруються.
У імуноаналізу стандарт зазвичай розчиняють або розбавляють матриксом, аналогічним тому, в якому розчинена проба, що містить обумовлений речовина.
Матриксу. Для різних визначених речовин в якості матриксом використовують різноманітні матеріали, причому їх склад залежить від виробника. Найбільш часто використовувані матриксу включають цільну сироватку або плазму людини, містять обумовлений речовина у фізіологічних або патологічно низьких концентраціях. Іноді матриксу отримують зі свіжої крові, але набагато частіше для цього використовують препарати плазми людини, які вже непридатні для трансфузії. Крім того, в якості матриксом застосовують сироватки тварин і препарати альбуміну людини або тварин.
Перед використанням матриксу, особливо сироватки, повинні бути перевірені на патогени, наприклад, на поверхневий антиген вірусу гепатиту, а також відповідним чином оброблені з метою видалення або зниження до мінімуму змісту визначається речовини. Для цих цілей використовують обробку антитілами, активованим вугіллям, силікагелем та іонообмінними смолами. Деякі з цих методів і реагентів дають погано відтворювані результати, наприклад, різні партії активованого вугілля мають різні адсорбційні характеристики. Більшість методів, розроблених для видалення визначається речовини із сироватки в промисловому масштабі, зберігається в секреті.
Стандартизація матриксних ефектів. Для поліпшення порівнянності результатів, отриманих за допомогою різних методів імуноаналізу, ВООЗ було запропоновано поставляти загальний контрольний матрикс для використання з певними міжнародними стандартами. Такий матрикс міг би випускатися у вигляді ампул з ліофілізований цільної сироваткою, обробленої відповідним чином для видалення з неї визначається речовини. Будь-який використовується для обробки метод повинен точно відтворюватися при отриманні наступних партій, а технологія всього процесу повинна бути детально описана і опублікована. Ампули з таким матеріалом, який докладно охарактеризовано в незалежних дослідженнях і офіційно схвалений ВООЗ, потім поставлялися б разом з відповідними стандартами.
Проте реалізація такої програми передбачає виконання величезного обсягу наукової, організаційної та практичної роботи і відповідні витрати. Фактично витрати на введення міжнародного стандарту при цьому повинні були б подвоїтись. Відповідні пропозиції були поширені ВООЗ в 1985 р. для з'ясування думки вчених, фірм - виробників наборів та національних органів контролю [2]. Спектр надійшли відгуків був дуже широкий, починаючи від повної підтримки ідеї введення контрольного матриксу фірмами, що випускають набори, до прямо протилежної точки зору, згідно з якою всі проблеми ефекту матриксу можуть бути вирішені за допомогою відповідної оптимізації методу аналізу.
Спільні дослідження. Зрештою було вирішено підтримати ідею перевірки та отримання експериментальних доказів того, наскільки введення загального матриксу поліпшило б відповідність результатів аналізів. Для цієї мети була створена спільна робоча група ВООЗ і IFCC, в завдання якої входило з'ясування впливу двох різних матеріалів, використовуваних як матриксу при аналізі TSH. Вибір цього гормону був обумовлений тим, що його визначення має бути як можна більш точним і чутливим для отримання необхідної в клінічній практиці інформації. Крім того, препарати TSH гетерогенні, нестабільні і важко піддаються стандартизації.
Отримання сироватки з низькими концентраціями TSH являє собою складну проблему, оскільки її отримують тільки від хворих, що страждають певними видами тиреоїдної аденоми. У набагато більших кількостях таку сироватку можна отримати від здорових людей, у яких їх власна тиреоїдна функція була пригнічена введенням Тз протягом декількох днів. Останні розробки пропонують ще більш простий спосіб отримання матриксу шляхом обробки вже непридатною для клінічного застосування плазми з банку крові за допомогою лектинів, які адсорбують ендогенний TSH. В даний час проводяться спільні експерименти з першими двома типами сироваток. Отримані результати і висновки будуть представлені в Експертний комітет ВООЗ з біологічної стандартизації.
ВПЛИВ ОНОВЛЕННЯ МІЖНАРОДНИХ СТАНДАРТІВ
Перші стандарти для науково-дослідних робіт. Зараз ясно, що науково-дослідні роботи в області імуноаналізу розвивалися настільки швидкими темпами за рахунок введення загального стандартного матеріалу на самих ранніх етапах досліджень. Завдяки цьому лабораторії забезпечувалися досить хорошими стандартними препаратами при розробці методів очищення та кількісного визначення. У 60-х рр.. Відділ біологічних стандартів Національного інституту медичних досліджень (NIMR) ввів науково-дослідні стандарти для ряду речовин (кальцитонін свині, еритропоетин, гіпофізарним гормони людини FSH, LH, TSH, GH, пролактин). Скоро стало очевидним, що зіставлення якісних і кількісних даних сильно полегшується, якщо для порівняння використаний один і той же стандартний препарат. Згодом деякі з науково-дослідних стандартів NIMR були прийняті Експертним комітетом ВООЗ з біологічних стандартів в якості міжнародних. Крім того, система одиниць, яка використовується в науково-дослідних стандартах, була прийнята за основу при розробці застосовуваних зараз міжнародних одиниць.
Вибір відповідного матеріалу. Однією з перших проблем при введенні науково-дослідних стандартів став вибір відповідного матеріалу. На ранніх етапах дослідження молекулярна структура речовини часто взагалі або майже невідома. У цьому випадку звичайно використовують той доступний матеріал, який в рамках наявної про нього інформації вважається найбільш відповідним. Дуже часто доводиться використовувати грубий неочищений екстракт або навіть необроблені і нефракці-онірованние фізіологічні рідини, наприклад сироватки. У разі ряду речовин, наприклад гормонів, які ідентифікують на перших стадіях дослідження з їхньої біологічної активності, вихідний матеріал, що використовується для приготування стандарту, звичайно являє собою концентрований екстракт, придатний для характеристики гормону і застосування в біоаналізах in vivo. Якщо ж невідома підходяща біологічна функція, придатна для контролю визначених речовин (такі, наприклад, неактивні попередники або метаболіти), то найбільш розумним буде використання індивідуальної або змішаної сироватки.
Заміна некоректних стандартів. Впровадження науково-дослідних стандартів може супроводжуватися низкою труднощів. Даний матеріал може виявитися непридатним для стандарту частіше за все в силу того, що він містить або обумовлений речовина в денатурованому вигляді, або його попередники і метаболіти, або інші речовини, досить близькі за молекулярною структурою, в таких кількостях, які можуть перешкодити протіканню імунологічної реакції. Якщо такі факти точно встановлені, необхідно замінити "невідповідний" стандарт на інший, що складається по можливості з найбільш чистого препарату, який є в розпорядженні. Слід підкреслити, що стандарт є тільки "робочою гіпотезою матеріалу". Це всього лише препарат, який, за наявними в даний час відомостями, можна використовувати для коректного кількісного визначення цієї речовини. У будь-який момент у світлі нових наукових даних цей стандарт може виявитися невідповідним
Заміна "брудних" стандартів. Дуже часто не розуміють значення та причин заміни одного стандарту на інший, більш високого ступеня чистоти. Якщо змінюється міжнародний стандарт, то наслідки нерозуміння причин такої заміни можуть проникнути в національне законодавство, промисловість і клінічну практику. Тому дуже важливо чітко уявляти собі, чому замінений даний стандарт і що в цьому випадку слід робити.
~ Розглянемо перший стандарт, у цьому кількості якого (масі, вмісті ампули) міститься х молекул речовини А і деяка кількість молекул, схожих за низкою властивостей (наприклад, імунореактивності) з речовиною А. Цей стандарт замінюють на інший, містить подвійну кількість 2х (на мг або на ампулу) чистого речовини А. Коли другий стандарт аналізують за допомогою методу, специфічного до А (тобто коли визначається тільки А), то результати аналізу повинні Показати подвоєне зміст А в другому стандарті по відношенню до першого стандарту. Якщо ж другий стандарт аналізують за допомогою методу, в якому взаємодіють і домішки, подібні А, і перебувають у першій стандарті, та кількість речовини А в другому стандарті за даними цього аналізу буде менше'с. Ступінь заниження результатів залежить від специфічності даного аналізу. Ця проблема описана в роботі [3] і проілюстрована на рис. 2.1. Як зазначав професор Фіняі, важлива не стільки математика біологічної стандартизації, скільки розуміння лежать в її основі принципів.
Наслідки впровадження міжнародного стандартного препарату (МСП) для визначення хоріонічного гону-дотропіна людини. Яскравим прикладом того, які непорозуміння можуть виникнути при заміні "брудного" міжнародного стандарту на інший, який містить більш чистий матеріал, є ситуація, що виникла в ході впровадження другого міжнародного стандарту (МО хоріонічного гонадотропіну людини (hCG) для калібрування міжнародного стандартного препарату (МСП), призначеного для імуноаналізу hCG. Визначення hCG в сироватці крові або в сечі використовують для діагностики ранніх стадій вагітності. Природно, чим більше чутливий тест, тим раніше він дасть позитивний сигнал. При перекалібрування різних продажних наборів за новим МСП в тих наборах, в яких відбувалося неспецифічне взаємодія з численними домішками, що містяться у 2-му МС (а-і / 5 - субодиниці, денатуровані форми hCG), довелося міняти градуювання стандартів, що входять до-набори. У результаті такої заміни погіршилася справжня чутливість визначення майже всіх наборів. Наслідки виявилися вельми неприємними, оскільки довелося давати пояснення медикам і споживачам наборів. Такі пояснення були опубліковані [4, 5]. Коректність нового МСП була підтверджена за допомогою специфічних моноклональних антитіл [6]. Цей приклад не є єдиним. Подібна ситуація може виникнути зараз після введення в 1986 р. нового міжнародного стандарту для FSH; калібрування відповідних іммуноаналітіческіх наборів (в деяких випадках в 5 разів), мабуть, зустрінеться з тими ж труднощами, що й у випадку hCG.
Перший міжнародний стандарт для гіпофізар-ного FSH. З огляду на важливість визначення гіпофізарного і сироваткового FSH перший міжнародний стандарт і другий МСП були запроваджені саме для цих гормонів (МСП також для LH). Ці МСП були приготовлені професором Рейчертом в лабораторії професора Вільгельм шляхом екстракції гіпофізів, що зберігалися в ацетоні. Оригінальний вихідний матеріал відомий в Америці під шифром LER 907. Частина цього матеріалу була ліофілізо-вана в ампулах (код 69/104) у Відділі біологічних стандартів NIMR і надалі була використана в якості науково-дослідного стандарту. Отриманий препарат був прийнятий ВООЗ в 1.973 р. як МСП для біоаналіза гіпофізарних FSH і LH [7]. Коли перша серія ампул (близько 3500 штук) була витрачена, в якості другого МСП для біоаналіза FSH і LH стали використовувати нову серію (код 78/549), також отриману з LER 907. Хоча різні аліквотах одного і того ж матеріалу були оброблені аналогічним чином [8], не можна стверджувати, що за складом LER 907, 69/104 і 78/549 ідентичні, оскільки невідомо, які молекулярні зміни відбулися в зразках в процесі зберігання і ліофілізації.
Починаючи з 1973 р. були проведені численні дослідження з вивчення властивостей гіпофізарного FSH і введенню чистого стандарту. Ця робота була пророблена професором Е.Дізфалу-сі, Д. Робертсоном і А. Завдіїлів в Каролінському інституті в Стокгольмі і професором П. Сторрінгом у Відділі ендокринології Національного інституту біологічних стандартів і контролю (National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) у Лондоні . За допомогою елегантних і детальних експериментів були виявлені ізогормони, сильно розрізняються за своєю біологічною активністю [9, 10]. Незважаючи на гетерогенність гормону, було прийнято рішення в якості нового стандарту використовувати суміш цих глікопротеїдів. Відповідно до правил Експертного комітету ВООЗ з біологічної стандартизації як стандарт був обраний екстракт, що має найвищу фол-лікулостімулірующей активністю in vivo. Відповідний тест заснований на визначенні збільшення маси яєчників у групі статевонезрілих щурів, які отримували певні дози FSH і надлишок LH протягом 4-5 днів.
Був вибраний і ліофілізованих в ампулах кращий зразок. Після попередньої перевірки новий стандарт був калібровані проти МСП для біоаналіза гіпофізарних FSH і LH 1927 групами вчених в 13 країнах. Експерименти включали також використання ряду інших каліброваних матеріалів, в тому числі і відповідних сироваток.
2.3.7. Введення одиниці міжнародного стандарту FSH. Експерименти по стандартизації нового препарату гіпофізарного FSH були сплановані і виконані д-ром Сторрінгом і д-ром Дас. Отримані результати, які пізніше будуть опубліковані повністю, можна віднести до однієї з трьох груп: 1) близько 80 м.ед. FSH на ампулу при біоаналізе in vivo, 2) близько 30 м.ед. FSH на ампулу при біоаналізе in vitro і в рецепторному тесті; 3) близько 16 м.ед. FSH на ампулу за даними різних видів им-муноаналіза.
Який же тип аналізу повинен бути взятий за основу для введення нового стандарту? Згідно з рекомендаціями ВООЗ, це повинен бути біоаналіз in vivo, оскільки це єдина відома система, в якій сіалілірованние та глікозильованих ізогормони FSH, а також їх метаболіти оцінюються по фізіологічному ефекту на інтактні клітини in situ. З іншого боку, можна стверджувати, що біоаналіз in vitro і рецепторний тест дозволяють визначити кількість активного гормону точніше, проте отримані результати сильно залежать від якості ізольованих тканин, клітин і рецепторів, які в процесі обробки можуть модифікуватися, наприклад, ферментами. Крім того, ці методи не відображають природні міжклітинні взаємодії та занадто нетривалі за часом, щоб зафіксувати інші медленнр проявляються ефекти активності FSH. Більш низькі результати імуноаналізу можна пояснити перехресними реакціями антитіл з іншими глікопротеїнами і домішками, що містяться в МСП гіпофізарних FSH і LH.
Слід пам'ятати, що біоаналіз гормонів in vivo широко використовується і добре описаний в науковій літературі і посібниках з фармакології. Одні й ті ж лінії щурів і мишей є в багатьох лабораторіях світу, тому наблюдаЈй <г *, реакція пов'язана тільки з біологічною активністю гормону. У разі ж імуноаналізу використовувані реагенти сильно розрізняються за складом. і мають обмежений час життя. Характеристики кожної системи аналізу рідко бувають детально документовані, і спостережувані коливання результатів '(наприклад, частка пов'язаної мітки), як правило, не пов'язані з біологічною активністю гормону.
Оскільки новий стандарт повинен представляти активний FSH, то величина 80 м.ед. на ампулу здається найбільш обгрунтованою. Більшість учасників міжнародних випробувань погодилися з цим висновком, і пізніше Експертний комітет ВООЗ з біологічних стандартів затвердив матеріал з кодом 83/575 в якості третього міжнародного стандарту FSH з вмістом 80 м.ед. на ампулу.
2.3.8. Наслідки запровадження нового МС. Рішення прийняти величину 80 м.ед. FSH на ампулу в якості третьої міжнарод-/ рідного стандарту має далекосяжні наслідки як для фірм, що випускають відповідні набори, так і для клініцистів. Першим доведеться перекалібровать їх власні стандарти набори, а також переоцінити специфічність аналізу. У клінічній хімії потрібно провести велику навчальну та роз'яснювальну роботу. Наприклад, величина відношення LH / FSH, часто використовується при діагнозі полікістозу яєчника, після введення нового стандарту зміниться. Ясно, що введення нового МС вимагатиме багато часу. У перехідний період було запропоновано використовувати обидва стандарти, проте виробникам і споживачам наборів і редакторам періодичних наукових журналів рекомендувалося вказувати, який стандарт в кожному випадку використовували при визначенні FSrf. Такий підхід був прийнятий після введення очищеного МСП для hCG, і можна сподіватися, що він згладить незручності перехідного періоду як для постачальників, так і для клініцистів.
Після прийняття більш чистого стандарту для FSH повинні бути введені і стандарти для субодиниць або подібних FSH речовин, якщо буде доведено, що їх визначення представляє практичний інтерес. При необхідності будуть введені міжнародні стандарти і для ізольованих а-і / 3-субодиниць FSH.
У цій роботі процедурі заміни міжнародних стандартів було приділено багато уваги, оскільки, на думку автора, дуже часто заміна стандартів викликає непорозуміння тільки тому, що не зрозумілі важливість і сутність цього процесу.
ТЕХНОЛОГІЯ РЕХОМБІНАНТНИХ ДНК
В останні роки для великомасштабного отримання важкодоступних пептидів все більш широке поширення набувають методи генної інженерії (технології рекомбінантних ДНК). Деякі з білків (інсулін, гормон росту), отриманих цим методом, абсолютно ідентичні природним білкам людини. Інші речовини, наприклад глікопротеїн еритропоетин, ідентичні нативним речовин за структурою поліпептидного ланцюга, але трохи відрізняються від них за будовою бокових вуглеводних ланцюгів в залежності від продукує лінії клітин тварин. Отримання білків і деяких глікопротеїнів в якості стандартів генно-інженерним шляхом найбільш зручно у випадку важкодоступних об'єктів (інтерлейкіни la і /?, Ренін, інтерферони людини). Проблеми контролю виробництва та детального дослідження властивостей рекомбінантних продуктів розглянуті в роботах [П, 12].
Із застосуванням моноклональних антитіл
Застосування моноклональних антитіл для йммуноаналіза пептидів вимагає великої обережності, оскільки високоспецифічні моноклональні антитіла можуть взаємодіяти, наприклад, тільки з одним з ізогормонов. З цих же причин не можна використовувати "занадто" специфічні моноклональні антитіла і для афінної очистки пептидів. Крім того, існує небезпека руйнування зразка при його елюювання з афінної колонки під дією рН та іонної сили розчину. І нарешті, слідові кількості антитіл можуть забруднювати очищений продукт і впливати на результати аналізу.
ПРИГОТУВАННЯ СТАНДАРТНИХ ПРЕПАРАТІВ гаптеном
Високоочищені стандартні препарати гаптенов можна отримати від виробляють їх фірм і з деяких некомерційних джерел, наприклад з колекції стандартів стероїдів Медичного науково-дослідного центру. Багато гаптени (наприклад, певні гормони і ліки) досить погано і з різною аффінність зв'язуються з білками крові, тому частково (як правило: <5%) вони перебувають у вільному вигляді. Раніше імуноаналізу багатьох гаптенов передувало їх виділення екстракцією. Останнім часом інтенсивно розробляються методи визначення сумарної кількості певного гаптену в сироватці або плазмі без його виділення. Крім того; розроблений прямий розділовий метод для визначення не пов'язаного З білками вільного гаптену (наприклад, вільного Т4) в сироватці. Ці Розробки включають створення та калібрування відповідних матриксом, склад яких є комерційним секретом. Мабуть, отримання ідеального матриксу, придатного для вирішення будь-фізіологічної або патологічної завдання, є недосяжною метою.
ВСТУП
У цій роботі обговорюється проблема приготування стандартів і матриксу, а також їх вплив на стандартизацію імуноаналізу. Стандартизація базується на застосуванні певних принципів і звичайно включає в себе оцінку систематичних помилок, точності, відтворюваності та порівнянності даного методу з іншими. Незалежно від того, наскільки ускладнена або, навпаки, спрощена нова аналітична система, при її стандартизації повинні дотримуватися одні й ті ж принципи. Нерозуміння цих принципів і нехтування ними призводять до серйозних помилок.
Таким чином, в дану роботу включені наступні питання: 1) проблеми, пов'язані з так званим матриксних ефектом; 2) інші фактори, іноді помилково приписувані матріксиому ефекту; 3) наслідки заміни одного міжнародного стандарту на інший; 4) обмеження при використанні моноклональних антитіл; 5) проблеми приготування контрольних матриксом для гаптенов; 6) деякі нові та розробляються стандарти Національного інституту біологічних стандартів і контролю (NIBSC).
Стандартизація імуноаналізу необхідна для 1) поліпшення точності діагнозу і моніторингу захворювань; 2) вибору загальних критеріїв для діагнозу захворювань; 3) можливості прямого порівняння ефективності різних імунодіагностичних наборів.
Перш ніж перейти до обговорення зазначених питань, хотілося б звернутися з проханням до читачів прочитати цей розділ до кінця, яким би сухим і нудним він ні здався.
ПРОБЛЕМА МАТРІКС
Різні способи порівняння свідчать, що зазвичай різні методи імуноаналізу дають добре узгоджуються між собою результати. Однак іноді результати визначення конкретної речовини за допомогою даного методу виходять за розумні межі. Наприклад, два роки тому в одній з країн застосування декількох готових наборів постійно призводило до суттєво відрізняється результатами визначення тиреотропного гормону (TSH) у плазмі. Представники компаній, які випускають ці набори, вирішили, що розбіжності в результатах аналізу могли виникнути через застосування різних за складом розчинів для розведення міжнародного стандарту. Всесвітньою організацією охорони здоров'я (ВООЗ) * було запропоновано розробити метод вивчення ефекту різних матриксом. Потім ВООЗ спільно з Міжнародною організацією клінічної хімії (IFCC) провела спеціальний симпозіум з даної проблеми, на якому були запропоновані шляхи поліпшення порівнянності результатів різних методів імуноаналізу.
Калібрування імунодіагностичних наборів. Для калібрування будь-якого набору для аналізу кожна фірма, що випускає такі набори, має систему первинних і вторинних стандартів. Первинний контрольний стандарт зазвичай складається з Алік-ось, взятих із серії разбавлений стандарту. Кожна аліквотах містить відому кількість визначається речовини і зберігається при дуже низькій температурі. Ці аліквотах використовуються для калібрування робочих стандартів, які в свою чергу застосовують для калібрування випускаються наборів. Обумовлений речовина в первинному стандарті може бути або відомий кількістю чистого хімічної сполуки, або поліпептидом, зміст якого виражено в одиницях міжнародного біологічного стандарту, або препаратом, каліброваним з даного пептиду. Для розведення стандарту часто використовують сироватки, буферні розчини і розчини, що містять білок-носій. Склад цих розчинів, або, як їх ще називають, матриксом, може впливати на реакцію антиген - антитіло, в результаті чого і з'являються систематичні помилки і мінливість результатів аналізу. Це явище називають "матриксних ефектом". Принцип порівнянності аналізів полягає в тому, щоб аналізоване речовина в пробі взаємодіяло в тих же умовах, що і в стандартному розчині. Молекулярне оточення визначається речовини в обох розчинах має бути ідентичним або дуже близькою за складом; тільки тоді можна точно визначити його концентрацію. Визначення більшості речовин проводиться в сироватці, і, безсумнівно, матриксних ефекти пов'язані з типом і способом обробки матеріалу, що використовується для розведення стандартів. Ясно, що такий матриксних ефект відмінний від ефектів, обумовлених прис> гствіем аутоантитіл, лікарських препаратів, пухлинних клітин або незвично високих концентрацій попередників або метаболітів визначається речовини.
Матриксних ефекти найчастіше впливають на визначення ти-реотропіна (TSH), загального тироксину (Л4), загального трііодотіро-нина (З), пролактину, фолікулостимулюючого гормону (FSH), лютеїнізуючого гормону (LH) і стероїдів (кортизолу, прогестерону і тестостерону, якщо вони попередньо не виділені з проби екстракцією).
Інші можливі джерела систематичних помилок. Інші пов'язані з проблемами стандартизації причини розбіжностей в результатах аналізу можуть бути обумовлені 1) відмінностями в молекулярній структурі визначається речовини або речовин в пробі і стандартному розчині (по суті справи, в цьому випадку порівнюються різні сполуки), 2) відмінностями у складі, способі зберігання і стабільності стандартів, які використовуються фірмами-постачальниками в якості первинного і робочого стандартів, а також стандарту для наборів; 3) систематичними помилками, пов'язаними з різною специфічністю аналізу на кожній стадії калібрування; 4) помилками при технічних операціях (наприклад, при розведенні розчинів), а також невдалої оптимізації умов аналізу, особливо при поділі вільного та зв'язаного з антитілами речовини.
Відмінності в молекулярній структурі чистих хімічних сполук можуть бути обумовлені присутністю ізомерів, зв'язування яких з білками плазми може відбуватися інакше, ніж у гаптенов, що володіють тільки нативної просторову конфігурацію. У цьому випадку при приготуванні стандартів не допомагає і додавання екзогенного стероїду до сироватці. Крім того, ставлення пов'язаного з білком і вільного визначається речовини може змінюватися в залежності від умов аналізу, наприклад рН або іонної сили. Нарешті, невеликі відмінності в методах виділення визначається речовини з фізіологічних рідин можуть бути джерелами розкиду і систематичної помилки результатів аналізу.
Молекулярна гетерогенність стандартів. ВООЗ встановлені міжнародні стандарти, контрольні препарати або контрольні реагенти для двох груп складних біологічних сполук: 1) з'єднань (наприклад, пептидних гормонів), які можна очистити і визначити кількісно за допомогою біологічних аналізів; 2) речовин (наприклад, феритину або субодиниць глікопротеїнових гормонів) , які в даний час можна визначити лише по їх імунологічної активності.
Міжнародні стандарти для з'єднань першої групи звичайно містять препарати очищеного гормону і білок-носій. Такий склад стандартів дозволяє охарактеризувати їх за допомогою як певних методів біоаналіза in vivo або in vitro, так і фізико-хімічних методів. Ці методи використовуються для ідентифікації та кількісного визначення таких речовин [1].
Іншою причиною невідповідності між стандартами є природна гетерогенність молекулярної структури, яка найбільш часто спостерігається у разі глікопротеїнових гормонів (TSH, FSH, LH), а також пролактину і гормону росту. Зміст ізогормонов змінюється в залежності від джерела і способу отримання.
Молекулярна структура визначається речовини може змінюватися при ліофілізації, яка майже завжди включається в методики приготування міжнародних та більшості вторинних стандартів. Такі зміни можна виявити і оцінити кількісно за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) та ізоелектричного фокусування. Можна виділити два звичайних типу денатурації: 1) необоротна деформація молекули білка через пересушування; 2) утворення комплексів між пептидом і носієм, наприклад лактозою, Манні-том і трегалози.
І нарешті, не менш важливим фактором є власна нестабільність визначається речовини в стандарті. Причина, природа і ступінь змін структури багатьох складних білків (дезамінування, окислення, зміна конформації), які відбуваються при їх зберіганні, дуже мало або зовсім не вивчені, а часто просто ігноруються.
У імуноаналізу стандарт зазвичай розчиняють або розбавляють матриксом, аналогічним тому, в якому розчинена проба, що містить обумовлений речовина.
Матриксу. Для різних визначених речовин в якості матриксом використовують різноманітні матеріали, причому їх склад залежить від виробника. Найбільш часто використовувані матриксу включають цільну сироватку або плазму людини, містять обумовлений речовина у фізіологічних або патологічно низьких концентраціях. Іноді матриксу отримують зі свіжої крові, але набагато частіше для цього використовують препарати плазми людини, які вже непридатні для трансфузії. Крім того, в якості матриксом застосовують сироватки тварин і препарати альбуміну людини або тварин.
Перед використанням матриксу, особливо сироватки, повинні бути перевірені на патогени, наприклад, на поверхневий антиген вірусу гепатиту, а також відповідним чином оброблені з метою видалення або зниження до мінімуму змісту визначається речовини. Для цих цілей використовують обробку антитілами, активованим вугіллям, силікагелем та іонообмінними смолами. Деякі з цих методів і реагентів дають погано відтворювані результати, наприклад, різні партії активованого вугілля мають різні адсорбційні характеристики. Більшість методів, розроблених для видалення визначається речовини із сироватки в промисловому масштабі, зберігається в секреті.
Стандартизація матриксних ефектів. Для поліпшення порівнянності результатів, отриманих за допомогою різних методів імуноаналізу, ВООЗ було запропоновано поставляти загальний контрольний матрикс для використання з певними міжнародними стандартами. Такий матрикс міг би випускатися у вигляді ампул з ліофілізований цільної сироваткою, обробленої відповідним чином для видалення з неї визначається речовини. Будь-який використовується для обробки метод повинен точно відтворюватися при отриманні наступних партій, а технологія всього процесу повинна бути детально описана і опублікована. Ампули з таким матеріалом, який докладно охарактеризовано в незалежних дослідженнях і офіційно схвалений ВООЗ, потім поставлялися б разом з відповідними стандартами.
Проте реалізація такої програми передбачає виконання величезного обсягу наукової, організаційної та практичної роботи і відповідні витрати. Фактично витрати на введення міжнародного стандарту при цьому повинні були б подвоїтись. Відповідні пропозиції були поширені ВООЗ в 1985 р. для з'ясування думки вчених, фірм - виробників наборів та національних органів контролю [2]. Спектр надійшли відгуків був дуже широкий, починаючи від повної підтримки ідеї введення контрольного матриксу фірмами, що випускають набори, до прямо протилежної точки зору, згідно з якою всі проблеми ефекту матриксу можуть бути вирішені за допомогою відповідної оптимізації методу аналізу.
Спільні дослідження. Зрештою було вирішено підтримати ідею перевірки та отримання експериментальних доказів того, наскільки введення загального матриксу поліпшило б відповідність результатів аналізів. Для цієї мети була створена спільна робоча група ВООЗ і IFCC, в завдання якої входило з'ясування впливу двох різних матеріалів, використовуваних як матриксу при аналізі TSH. Вибір цього гормону був обумовлений тим, що його визначення має бути як можна більш точним і чутливим для отримання необхідної в клінічній практиці інформації. Крім того, препарати TSH гетерогенні, нестабільні і важко піддаються стандартизації.
Отримання сироватки з низькими концентраціями TSH являє собою складну проблему, оскільки її отримують тільки від хворих, що страждають певними видами тиреоїдної аденоми. У набагато більших кількостях таку сироватку можна отримати від здорових людей, у яких їх власна тиреоїдна функція була пригнічена введенням Тз протягом декількох днів. Останні розробки пропонують ще більш простий спосіб отримання матриксу шляхом обробки вже непридатною для клінічного застосування плазми з банку крові за допомогою лектинів, які адсорбують ендогенний TSH. В даний час проводяться спільні експерименти з першими двома типами сироваток. Отримані результати і висновки будуть представлені в Експертний комітет ВООЗ з біологічної стандартизації.
ВПЛИВ ОНОВЛЕННЯ МІЖНАРОДНИХ СТАНДАРТІВ
Перші стандарти для науково-дослідних робіт. Зараз ясно, що науково-дослідні роботи в області імуноаналізу розвивалися настільки швидкими темпами за рахунок введення загального стандартного матеріалу на самих ранніх етапах досліджень. Завдяки цьому лабораторії забезпечувалися досить хорошими стандартними препаратами при розробці методів очищення та кількісного визначення. У 60-х рр.. Відділ біологічних стандартів Національного інституту медичних досліджень (NIMR) ввів науково-дослідні стандарти для ряду речовин (кальцитонін свині, еритропоетин, гіпофізарним гормони людини FSH, LH, TSH, GH, пролактин). Скоро стало очевидним, що зіставлення якісних і кількісних даних сильно полегшується, якщо для порівняння використаний один і той же стандартний препарат. Згодом деякі з науково-дослідних стандартів NIMR були прийняті Експертним комітетом ВООЗ з біологічних стандартів в якості міжнародних. Крім того, система одиниць, яка використовується в науково-дослідних стандартах, була прийнята за основу при розробці застосовуваних зараз міжнародних одиниць.
Вибір відповідного матеріалу. Однією з перших проблем при введенні науково-дослідних стандартів став вибір відповідного матеріалу. На ранніх етапах дослідження молекулярна структура речовини часто взагалі або майже невідома. У цьому випадку звичайно використовують той доступний матеріал, який в рамках наявної про нього інформації вважається найбільш відповідним. Дуже часто доводиться використовувати грубий неочищений екстракт або навіть необроблені і нефракці-онірованние фізіологічні рідини, наприклад сироватки. У разі ряду речовин, наприклад гормонів, які ідентифікують на перших стадіях дослідження з їхньої біологічної активності, вихідний матеріал, що використовується для приготування стандарту, звичайно являє собою концентрований екстракт, придатний для характеристики гормону і застосування в біоаналізах in vivo. Якщо ж невідома підходяща біологічна функція, придатна для контролю визначених речовин (такі, наприклад, неактивні попередники або метаболіти), то найбільш розумним буде використання індивідуальної або змішаної сироватки.
Заміна некоректних стандартів. Впровадження науково-дослідних стандартів може супроводжуватися низкою труднощів. Даний матеріал може виявитися непридатним для стандарту частіше за все в силу того, що він містить або обумовлений речовина в денатурованому вигляді, або його попередники і метаболіти, або інші речовини, досить близькі за молекулярною структурою, в таких кількостях, які можуть перешкодити протіканню імунологічної реакції. Якщо такі факти точно встановлені, необхідно замінити "невідповідний" стандарт на інший, що складається по можливості з найбільш чистого препарату, який є в розпорядженні. Слід підкреслити, що стандарт є тільки "робочою гіпотезою матеріалу". Це всього лише препарат, який, за наявними в даний час відомостями, можна використовувати для коректного кількісного визначення цієї речовини. У будь-який момент у світлі нових наукових даних цей стандарт може виявитися невідповідним
Заміна "брудних" стандартів. Дуже часто не розуміють значення та причин заміни одного стандарту на інший, більш високого ступеня чистоти. Якщо змінюється міжнародний стандарт, то наслідки нерозуміння причин такої заміни можуть проникнути в національне законодавство, промисловість і клінічну практику. Тому дуже важливо чітко уявляти собі, чому замінений даний стандарт і що в цьому випадку слід робити.
~ Розглянемо перший стандарт, у цьому кількості якого (масі, вмісті ампули) міститься х молекул речовини А і деяка кількість молекул, схожих за низкою властивостей (наприклад, імунореактивності) з речовиною А. Цей стандарт замінюють на інший, містить подвійну кількість 2х (на мг або на ампулу) чистого речовини А. Коли другий стандарт аналізують за допомогою методу, специфічного до А (тобто коли визначається тільки А), то результати аналізу повинні Показати подвоєне зміст А в другому стандарті по відношенню до першого стандарту. Якщо ж другий стандарт аналізують за допомогою методу, в якому взаємодіють і домішки, подібні А, і перебувають у першій стандарті, та кількість речовини А в другому стандарті за даними цього аналізу буде менше'с. Ступінь заниження результатів залежить від специфічності даного аналізу. Ця проблема описана в роботі [3] і проілюстрована на рис. 2.1. Як зазначав професор Фіняі, важлива не стільки математика біологічної стандартизації, скільки розуміння лежать в її основі принципів.
Наслідки впровадження міжнародного стандартного препарату (МСП) для визначення хоріонічного гону-дотропіна людини. Яскравим прикладом того, які непорозуміння можуть виникнути при заміні "брудного" міжнародного стандарту на інший, який містить більш чистий матеріал, є ситуація, що виникла в ході впровадження другого міжнародного стандарту (МО хоріонічного гонадотропіну людини (hCG) для калібрування міжнародного стандартного препарату (МСП), призначеного для імуноаналізу hCG. Визначення hCG в сироватці крові або в сечі використовують для діагностики ранніх стадій вагітності. Природно, чим більше чутливий тест, тим раніше він дасть позитивний сигнал. При перекалібрування різних продажних наборів за новим МСП в тих наборах, в яких відбувалося неспецифічне взаємодія з численними домішками, що містяться у 2-му МС (а-і / 5 - субодиниці, денатуровані форми hCG), довелося міняти градуювання стандартів, що входять до-набори. У результаті такої заміни погіршилася справжня чутливість визначення майже всіх наборів. Наслідки виявилися вельми неприємними, оскільки довелося давати пояснення медикам і споживачам наборів. Такі пояснення були опубліковані [4, 5]. Коректність нового МСП була підтверджена за допомогою специфічних моноклональних антитіл [6]. Цей приклад не є єдиним. Подібна ситуація може виникнути зараз після введення в 1986 р. нового міжнародного стандарту для FSH; калібрування відповідних іммуноаналітіческіх наборів (в деяких випадках в 5 разів), мабуть, зустрінеться з тими ж труднощами, що й у випадку hCG.
Перший міжнародний стандарт для гіпофізар-ного FSH. З огляду на важливість визначення гіпофізарного і сироваткового FSH перший міжнародний стандарт і другий МСП були запроваджені саме для цих гормонів (МСП також для LH). Ці МСП були приготовлені професором Рейчертом в лабораторії професора Вільгельм шляхом екстракції гіпофізів, що зберігалися в ацетоні. Оригінальний вихідний матеріал відомий в Америці під шифром LER 907. Частина цього матеріалу була ліофілізо-вана в ампулах (код 69/104) у Відділі біологічних стандартів NIMR і надалі була використана в якості науково-дослідного стандарту. Отриманий препарат був прийнятий ВООЗ в 1.973 р. як МСП для біоаналіза гіпофізарних FSH і LH [7]. Коли перша серія ампул (близько 3500 штук) була витрачена, в якості другого МСП для біоаналіза FSH і LH стали використовувати нову серію (код 78/549), також отриману з LER 907. Хоча різні аліквотах одного і того ж матеріалу були оброблені аналогічним чином [8], не можна стверджувати, що за складом LER 907, 69/104 і 78/549 ідентичні, оскільки невідомо, які молекулярні зміни відбулися в зразках в процесі зберігання і ліофілізації.
Починаючи з 1973 р. були проведені численні дослідження з вивчення властивостей гіпофізарного FSH і введенню чистого стандарту. Ця робота була пророблена професором Е.Дізфалу-сі, Д. Робертсоном і А. Завдіїлів в Каролінському інституті в Стокгольмі і професором П. Сторрінгом у Відділі ендокринології Національного інституту біологічних стандартів і контролю (National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) у Лондоні . За допомогою елегантних і детальних експериментів були виявлені ізогормони, сильно розрізняються за своєю біологічною активністю [9, 10]. Незважаючи на гетерогенність гормону, було прийнято рішення в якості нового стандарту використовувати суміш цих глікопротеїдів. Відповідно до правил Експертного комітету ВООЗ з біологічної стандартизації як стандарт був обраний екстракт, що має найвищу фол-лікулостімулірующей активністю in vivo. Відповідний тест заснований на визначенні збільшення маси яєчників у групі статевонезрілих щурів, які отримували певні дози FSH і надлишок LH протягом 4-5 днів.
Був вибраний і ліофілізованих в ампулах кращий зразок. Після попередньої перевірки новий стандарт був калібровані проти МСП для біоаналіза гіпофізарних FSH і LH 1927 групами вчених в 13 країнах. Експерименти включали також використання ряду інших каліброваних матеріалів, в тому числі і відповідних сироваток.
2.3.7. Введення одиниці міжнародного стандарту FSH. Експерименти по стандартизації нового препарату гіпофізарного FSH були сплановані і виконані д-ром Сторрінгом і д-ром Дас. Отримані результати, які пізніше будуть опубліковані повністю, можна віднести до однієї з трьох груп: 1) близько 80 м.ед. FSH на ампулу при біоаналізе in vivo, 2) близько 30 м.ед. FSH на ампулу при біоаналізе in vitro і в рецепторному тесті; 3) близько 16 м.ед. FSH на ампулу за даними різних видів им-муноаналіза.
Який же тип аналізу повинен бути взятий за основу для введення нового стандарту? Згідно з рекомендаціями ВООЗ, це повинен бути біоаналіз in vivo, оскільки це єдина відома система, в якій сіалілірованние та глікозильованих ізогормони FSH, а також їх метаболіти оцінюються по фізіологічному ефекту на інтактні клітини in situ. З іншого боку, можна стверджувати, що біоаналіз in vitro і рецепторний тест дозволяють визначити кількість активного гормону точніше, проте отримані результати сильно залежать від якості ізольованих тканин, клітин і рецепторів, які в процесі обробки можуть модифікуватися, наприклад, ферментами. Крім того, ці методи не відображають природні міжклітинні взаємодії та занадто нетривалі за часом, щоб зафіксувати інші медленнр проявляються ефекти активності FSH. Більш низькі результати імуноаналізу можна пояснити перехресними реакціями антитіл з іншими глікопротеїнами і домішками, що містяться в МСП гіпофізарних FSH і LH.
Слід пам'ятати, що біоаналіз гормонів in vivo широко використовується і добре описаний в науковій літературі і посібниках з фармакології. Одні й ті ж лінії щурів і мишей є в багатьох лабораторіях світу, тому наблюдаЈй <г *, реакція пов'язана тільки з біологічною активністю гормону. У разі ж імуноаналізу використовувані реагенти сильно розрізняються за складом. і мають обмежений час життя. Характеристики кожної системи аналізу рідко бувають детально документовані, і спостережувані коливання результатів '(наприклад, частка пов'язаної мітки), як правило, не пов'язані з біологічною активністю гормону.
Оскільки новий стандарт повинен представляти активний FSH, то величина 80 м.ед. на ампулу здається найбільш обгрунтованою. Більшість учасників міжнародних випробувань погодилися з цим висновком, і пізніше Експертний комітет ВООЗ з біологічних стандартів затвердив матеріал з кодом 83/575 в якості третього міжнародного стандарту FSH з вмістом 80 м.ед. на ампулу.
2.3.8. Наслідки запровадження нового МС. Рішення прийняти величину 80 м.ед. FSH на ампулу в якості третьої міжнарод-/ рідного стандарту має далекосяжні наслідки як для фірм, що випускають відповідні набори, так і для клініцистів. Першим доведеться перекалібровать їх власні стандарти набори, а також переоцінити специфічність аналізу. У клінічній хімії потрібно провести велику навчальну та роз'яснювальну роботу. Наприклад, величина відношення LH / FSH, часто використовується при діагнозі полікістозу яєчника, після введення нового стандарту зміниться. Ясно, що введення нового МС вимагатиме багато часу. У перехідний період було запропоновано використовувати обидва стандарти, проте виробникам і споживачам наборів і редакторам періодичних наукових журналів рекомендувалося вказувати, який стандарт в кожному випадку використовували при визначенні FSrf. Такий підхід був прийнятий після введення очищеного МСП для hCG, і можна сподіватися, що він згладить незручності перехідного періоду як для постачальників, так і для клініцистів.
Після прийняття більш чистого стандарту для FSH повинні бути введені і стандарти для субодиниць або подібних FSH речовин, якщо буде доведено, що їх визначення представляє практичний інтерес. При необхідності будуть введені міжнародні стандарти і для ізольованих а-і / 3-субодиниць FSH.
У цій роботі процедурі заміни міжнародних стандартів було приділено багато уваги, оскільки, на думку автора, дуже часто заміна стандартів викликає непорозуміння тільки тому, що не зрозумілі важливість і сутність цього процесу.
ТЕХНОЛОГІЯ РЕХОМБІНАНТНИХ ДНК
В останні роки для великомасштабного отримання важкодоступних пептидів все більш широке поширення набувають методи генної інженерії (технології рекомбінантних ДНК). Деякі з білків (інсулін, гормон росту), отриманих цим методом, абсолютно ідентичні природним білкам людини. Інші речовини, наприклад глікопротеїн еритропоетин, ідентичні нативним речовин за структурою поліпептидного ланцюга, але трохи відрізняються від них за будовою бокових вуглеводних ланцюгів в залежності від продукує лінії клітин тварин. Отримання білків і деяких глікопротеїнів в якості стандартів генно-інженерним шляхом найбільш зручно у випадку важкодоступних об'єктів (інтерлейкіни la і /?, Ренін, інтерферони людини). Проблеми контролю виробництва та детального дослідження властивостей рекомбінантних продуктів розглянуті в роботах [П, 12].
Із застосуванням моноклональних антитіл
Застосування моноклональних антитіл для йммуноаналіза пептидів вимагає великої обережності, оскільки високоспецифічні моноклональні антитіла можуть взаємодіяти, наприклад, тільки з одним з ізогормонов. З цих же причин не можна використовувати "занадто" специфічні моноклональні антитіла і для афінної очистки пептидів. Крім того, існує небезпека руйнування зразка при його елюювання з афінної колонки під дією рН та іонної сили розчину. І нарешті, слідові кількості антитіл можуть забруднювати очищений продукт і впливати на результати аналізу.
ПРИГОТУВАННЯ СТАНДАРТНИХ ПРЕПАРАТІВ гаптеном
Високоочищені стандартні препарати гаптенов можна отримати від виробляють їх фірм і з деяких некомерційних джерел, наприклад з колекції стандартів стероїдів Медичного науково-дослідного центру. Багато гаптени (наприклад, певні гормони і ліки) досить погано і з різною аффінність зв'язуються з білками крові, тому частково (як правило: <5%) вони перебувають у вільному вигляді. Раніше імуноаналізу багатьох гаптенов передувало їх виділення екстракцією. Останнім часом інтенсивно розробляються методи визначення сумарної кількості певного гаптену в сироватці або плазмі без його виділення. Крім того; розроблений прямий розділовий метод для визначення не пов'язаного З білками вільного гаптену (наприклад, вільного Т4) в сироватці. Ці Розробки включають створення та калібрування відповідних матриксом, склад яких є комерційним секретом. Мабуть, отримання ідеального матриксу, придатного для вирішення будь-фізіологічної або патологічної завдання, є недосяжною метою.