Рестрикційної картування
Введення
Картування геному - швидко розвивається галузь досліджень. Для вчених, які обрали її своєю спеціальністю, це одночасно і добре, і погано. Добре, оскільки це звільняє нас від необхідності дотримуватися вузьку спрямованість у своїй роботі, а погано, оскільки ми поки незнаю, який спосіб картування дає найбільш реальну картину структури геному і, отже, які дані більше відповідають істині. Озираючись на шлях, пройдений нами у дослідженнях з картування, ми з прикрістю мусимо констатувати: якби довелося починати все спочатку, ми навряд чи б рухалися в тому ж напрямку.
Картування геному увазі створення систематизованої бібліотеки клонів, яка повністю представляє геном і містить набір генетичних маркерів, достатній, щоб будувати фізичну і генетичну карти. По ходу досліджень ми поступово наближаємося до істинної структурі. В ідеалі карти, отримані різними способами, повинні бути ідентичними. Вивчення структури геному не вимагає обов'язкового побудови рестрикційної карти, однак деякі способи картування автоматично призводять до її отримання.
Мета картування - полегшувати процедуру клонування відомих генів і сприятиме пошуку в геномі цікавлять клонів. Наявність картки дозволяє легко співвідносити один з одним результати розрізнених експериментів по локалізації в геномі різних клонів.
1. Стратегія
1.1 Порівняння клонів
У будь-якому методі картування геному центральної процедурою є порівняння клонів, що дозволяє виявити часткові перекривання. Найбільш просто перекривання можна виявити за допомогою гібридизації. Проте саму по собі гібридизацію не можна вважати задовільним критерієм взаємної відповідності клонів, оскільки наявні в геномі, особливо у еукаріотів, дисперговані повтори можуть давати хибно позитивні відповіді. Крім того, пряме порівняння пар - процедура дуже трудомістка, щоб використовувати її для реалізації програми, що вимагає зіставлення великої кількості клонів. Більш прийнятним видається такий підхід, який дозволяє поступово накопичувати інформацію про кожного клоні, а потім аналізувати її.
Більшість методів картування в даний час засновано на обробці ДНК геному однієї або декількома рестріктазами з наступним визначенням розмірів утворюються фрагментів. Для цієї мети запропоновано ряд методик.
Спочатку ми б хотіли торкнутися прийому, використаного нами при аналізі структури геному нематоди Caenorhabdltis elegans. Він отримав назву «метод відбитків пальців» і має на увазі використання невпорядкованих і неповних наборів фрагментів, які є характеристикою клону, хоча і описують його неповністю: фрагменти розділяють з допомогою електрофорезу в тонкошаровому поліакриламідному гелі.
1.2 Вектори
Стратегія картування грунтується на аналізі випадково відібраних клонів. Абсолютно ясно тому, що при картуванні необхідно мати як можна більш багатої бібліотеки клонів. Бажано також, щоб розмір клонованих вставок дозволяв їх використовувати в подальшому в біохімічній генетиці.
Спочатку ми вибрали для експериментів косміди через порівняно великих розмірів акцептовані ДНК. З тих пір, як більше 10 років тому Коллінс і Хон ввели в практику перший космідний вектор, було сконструйовано велика кількість нових векторів такого роду. Серед них використовується в картуванні Caenorhabdltis, вектори серії Lorist, розроблені Літл та Кроссом. Останні два мають цікаві структурні особливості, зокрема наявність постійного числа копій і, що ще більш важливо для описуваних тут методів, присутність елементів, що збільшують показність клональних бібліотек: термінаторів транскрипції, що запобігають вплив векторних генів, можливе при транскрипції клонованих вставок. Ці вектори містять також промоторні послідовності фагів SP6 і Т7, що полегшують зчитування. Методи конструювання, розщеплення і дефосфорилювання векторних ДНК описані Маниатис.
Я2001 - єдиний Я-вектор, використаний при картуванні Caenorhabditis. І хоча в цьому випадку вставка становить лише половину послідовності космідной вставки, клони виявляються більш стабільними. Нарешті, для деяких областей геному відзначено більш повне представництво саме в А-бібліотеці.
Нещодавно був отриманий вектор, за допомогою якого можна конструювати штучні дріжджові хромосоми. Це відкриття обіцяє переворот в картуванні: з'являється можливість клонувати фрагменти ДНК, на порядок перевищують за розмірами космідние вставки. Ймовірно також, що відповідні геномні бібліотеки виявляться більш представницькими. Метод «відбитків пальців» поки придатний лише для маленьких YAC, але, використовуючи гібридизацію, можна буде приєднувати до космідам і великі фрагменти. Швидше за все, в майбутньому для картування геному буде застосовуватися техніка підбору пар, спеціально розроблена для YAC.
1.3 Селекція клонів
Якщо створено банк клонів і розроблена техніка підбору пар, залишається тільки вибрати стратегію селекції для подальшого аналізу клонів. Для невеликих геномів більш ефективно спочатку підбирати клони випадковим чином. Потім, коли ця можливість вичерпується, необхідно заповнити залишилися прогалини в карті за допомогою гібридізаційного-них або інших методів.
2. Експериментальна частина
Оскільки саме космідная бібліотека є основою нашої роботи, ми вирішили докладно описати тут її створення.
Виділення геномної ДНК
Представлений тут приклад - екстракція ДНК з нематод. Цей метод універсальний і включає мінімум необхідних маніпуляцій.
Хробаків вирощують в рідкому поживному середовищі, відмивають, швидко заморожують і зберігають у рідкому азоті, в аліквотах по 1 г.
1. Подрібніть одну аліквотах до порошкоподібного стану в ступці, охолодженої в рідкому азоті, потім обережно змішайте її з 30 мл розчину, що містить 100 мМ етилен-діамінотетрауксусной кислоти, рН 8,0, 0,5% додецилсульфату натрію і 50 мкг / мл протеїнази К-
2. Інкубують 2 год при 50 ° С.
3. Охолодіть на льоду, додайте рівний обсяг фенолу і екстрагують 15 хв при 4 ° С, повільно перемішуючи. Отцентріфугіруйте і обережно видаліть водний шар піпеткою з широким носиком.
4. Додайте два обсягу 95%-ного спирту і обережно намотайте ДНК на товсту скляну паличку. Отмойте три рази 70%-ним спиртом, висушіть на повітрі і суспендують у 3 мл розчину, який містить 10 мм трис-HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЕДТА.
Для подальшого ефективного отримання космід не обов'язково використання градієнта CsCl.
Приготування фрагментів
Щоб уникнути помилок в процесі картування шляхом підбору пар за методом «відбитків пальців», важливо не використовувати при приготуванні фрагментів лігазну обробку. Ми вважаємо за краще двовимірну електрофоретичної очищення виділенню в градієнті щільності сахарози, так як це дає більш ясну картину розподілу за розмірами і достатній вихід ефективно клонованої фрагментів.
Для запобігання помилок, пов'язаних з «кінцевими ефектами», бажано при аналізі бібліотеки, отриманої на основі часткового гідролізу геномної ДНК, вводити ту ж рестріктази і в анализирующую рестрикційну систему. Так, наприклад, часткова 5а «за1-бібліотека, аналізована за допомогою mdIII і Sa« 3AI, не буде давати артефактів. Що стосується космідних клонів, у яких фінгерпрінтние картини можуть складатися з 20-30 смуг, це вимога необов'язково, однак при картуванні клонів кінцеві ефекти викликають серйозні труднощі.
1. Підберіть необхідні умови для часткового гідролізу. Виберіть чотири варіанти посилення жорсткості обробки так, щоб виходили фрагменти необхідного розміру.
2. Гідролізують 4 аліквотах по 40 мкг свежеекстрагірованной ДНК. Зразки заморозьте.
3. Перед проведенням препаративного електрофорезу порівняйте невелика кількість зразка з K / Hindlll-маркерами, провівши електрофорез в 150 мл 0,3%-ного агарозного гелю HGT ТАЄ, 1 В / см протягом 16 ч. Для коректного вимірювання розмірів фрагментів всі наступні визначення мають бути проведені в тих же умовах.
4. Після необхідного гідролізу об'єднайте аліквотах ДНК, проведіть фенольних екстракцію і спиртове осадження.
5. Розчиніть в 180 мкл розчину ТІ. Додайте 60 мкл неде-натурірующего барвника, нанесіть в 16 лунок 0,4%-ного агарозного гелю LGT ТАЄ.
6. Нанесіть в якості маркерів ТП і інтактну ЯДНК-у препаративних гелі це не вкаже вам точно розміри фрагментів, але допоможе акуратно відрізати смужки гелю. Проведіть електрофорез на протязі 20 годин при 1 В / см і пофарбуйте гель бромідом етидію.
7. Результат електрофорезу ви можете побачити, помістивши гель під довгохвильову ультрафіолетову лампу. Відріжте смужки по 2 мм шириною від всіх 16 доріжок для відділення гідролізованого матеріалу.
8. Розплавте агарозного гель, нагріваючи протягом 10 хв необхідні зразки при 68 ° С в пластикових пробірках. Проведіть фенольних екстракцію, сконцентруйте ізобутанол до 0,3 мл, переосадіте спиртом і проаналізуйте фрагменти, як зазначено вище. 9. Проведіть повторно препаративний LGT-гель-електрофорез для очищення обраної вами фракції, екстрагують її з необхідної смужки гелю і остаточно проаналізуйте мінімальну аліквотах в аналітичному варіанті. Очікуваний вихід -2-4 мкг ДНК з 160 мкг матеріалу. 10. Розчиніть у 20 мкл ТІ.
Суміші для упаковки космід
У продажу є велика кількість пакувальних сумішей, але з міркувань економії можна готувати їх самим. Для цих цілей ми з успіхом використовували штами Escherichia coli: NS428 і NS433. Пакувальні суміші, отримані нами, дозволяли отримати до 10 6 космідних рекомбінантів на 1 мкг вставочний ДНК-
Отримано відомості, що Есо К-активність в пакувальних сумішах може впливати на репрезентативність Я-бібліотек, однак немає даних, що це можливо і для космідних. Є у продажу комерційні Есо К-пакувальні суміші.
З'єднання фрагментів з вектором
Пропонований метод придатний для лігування часткових гідролізатів Sau3Al у вектор Lorist2.
1. Додайте разом 1 мкл BamHI-обробленого де-фосфорильованого Lorist2; 2 мкл приготованих 5аіЗА1-фрагментів; 2 мкл 10 X лігазну буферного розчину; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дітіотрей-толу; 10 мкл води і 1 мкл лігази. Для досягнення максимально можливого лігування помістіть суміш в закритий капіляр.
2. Інкубують 16 год при 14 ° С.
3. Обережно упакуйте, керуючись відповідною методикою.
4. Зберігайте бібліотеку при 4 ° С під хлороформом.
5. Розведіть 5 мкл упакованої бібліотеки в 0,1 мл розчину для розведення.
Додайте 0,2 мл стаціонарної культури клітин. Ми використовуємо для цих цілей лінію 1046. Її слід регулярно пересівати через окремі колонії, контролюючи ознака reck.
Інкубують 20 хв при 37 ° С. Додайте 0,5 мл розчину CY і проінкубіруйте додатково 50 хв. Висейте різні обсяги на чашки з канамицином. Очікуваний вихід - 10 5 -10 6 рекомбінантів на 1 мкг вставочний ДНК.
Висновок
В даний час близько 90% генома С. elegans клоновано в космідах. Кількість клонів, завдяки космідним стиках впало з 900 до 700 і знизилося ще при використанні YAC-стиковок. Одна третина здаються розривів між косміднимі ланцюжками насправді являє собою ще невиявлені невеликі петлі; існує велика кількість реальних розривів, для яких космідние клони дуже рідкісні або недоступні для отримання. У цьому випадку багато дослідники сподіваються вирішити проблему за допомогою великих ланцюжків. Ми усвідомлюємо всю важливість і актуальність якнайшвидшого заповнення розривів.
Наш досвід підказує, що використання космід для картування геномів еукаріотів не позбавлене вад, хоча цей метод виявився дуже вдалим, принаймні для одного прокаріоти. Досить імовірно, що швидке заповнення розривів у карті буде забезпечено методом YAC. Швидше за все, вдасться отримати Я-клони, необхідні для більш точного заповнення прогалин у космідной карті.
Прописи розчинів
1. ТІ: 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЕДТА.
2. 10X лігазну буфер: 0,5 М трис-HCl рН 7,4, 0,1 М MgCl 2.
3. 10X середньо-сольовий рестрикційний буфер: 500 мМ NaCl, 100 мМ трис-HCl рН 7,4, 100 мМ MgCl 2, 10 мМ дітіотрейтола.
4. 10 X ТВЕ в г / л: 108 г. трис-підстави, 55 м. борної кислоти, 9,3 г ЕДТА.
5. 50 X ТАЄ: 242 р. трис-підстави, 57,1 мл крижаної оцтової кислоти, 100 мл 0,5 М ЕДТА рН 8,0, вода до 1 л.
6. 4%-ний денатуруючих гель: 480 р. сечовини, 38 м. акриламіду, 2 г бісакріламіда, води приблизно 800 мл. Розчинити при незначному нагріванні. Додати 1920 смоли Амберліт МВ-3, повільно перемішувати 1 ч. Профільтрувати через скляний фільтр N2. Додати 100 мл 10х ТВЕ та води до 1 л.
7. Барвник з формамідом: 100 мл деіонізованої формамідом, 0,1 г ксіленціанола FF, 0,1 г бромфенолового синього, 0,3 г ЕДТА.
8. Прокип'ячена РНКаза: 100 мг РНКази А, 10 мл 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 15 мМ NaCl. Інкубувати при 100 ° С 15 хв. Охолодити, розлити по пробірках, зберігати зразки при -20 ° С.
9. 2Х TY-середовище в г / л: 1916 тріптона, 10 р. дріжджового екстракту, 5 г NaCl. Довести рН до 7,4. 10. CY-середовище в г / л: 10 г. казамінокіслот, 5 г дріжджового екстракту, 3 г NaCl, 2 г КС1. Довести рН до 7,0.
11. 20Х SSPE: 104 г. NaCl, 15,6 г NaH 2 P0 4 X2H 2 0; 3,7 г ЕДТАх2Н 2 0; 25 мл 4 М NaOH і води до 500 мл.
12. Буфер для розведення фага К: 10 мл 1 М трис-HCl рН 7,4, 5 мл 1 М MgS0 4, 11,7 г NaCl, 1 г желатину, води до 1 л.
Введення
Картування геному - швидко розвивається галузь досліджень. Для вчених, які обрали її своєю спеціальністю, це одночасно і добре, і погано. Добре, оскільки це звільняє нас від необхідності дотримуватися вузьку спрямованість у своїй роботі, а погано, оскільки ми поки незнаю, який спосіб картування дає найбільш реальну картину структури геному і, отже, які дані більше відповідають істині. Озираючись на шлях, пройдений нами у дослідженнях з картування, ми з прикрістю мусимо констатувати: якби довелося починати все спочатку, ми навряд чи б рухалися в тому ж напрямку.
Картування геному увазі створення систематизованої бібліотеки клонів, яка повністю представляє геном і містить набір генетичних маркерів, достатній, щоб будувати фізичну і генетичну карти. По ходу досліджень ми поступово наближаємося до істинної структурі. В ідеалі карти, отримані різними способами, повинні бути ідентичними. Вивчення структури геному не вимагає обов'язкового побудови рестрикційної карти, однак деякі способи картування автоматично призводять до її отримання.
Мета картування - полегшувати процедуру клонування відомих генів і сприятиме пошуку в геномі цікавлять клонів. Наявність картки дозволяє легко співвідносити один з одним результати розрізнених експериментів по локалізації в геномі різних клонів.
1. Стратегія
1.1 Порівняння клонів
У будь-якому методі картування геному центральної процедурою є порівняння клонів, що дозволяє виявити часткові перекривання. Найбільш просто перекривання можна виявити за допомогою гібридизації. Проте саму по собі гібридизацію не можна вважати задовільним критерієм взаємної відповідності клонів, оскільки наявні в геномі, особливо у еукаріотів, дисперговані повтори можуть давати хибно позитивні відповіді. Крім того, пряме порівняння пар - процедура дуже трудомістка, щоб використовувати її для реалізації програми, що вимагає зіставлення великої кількості клонів. Більш прийнятним видається такий підхід, який дозволяє поступово накопичувати інформацію про кожного клоні, а потім аналізувати її.
Більшість методів картування в даний час засновано на обробці ДНК геному однієї або декількома рестріктазами з наступним визначенням розмірів утворюються фрагментів. Для цієї мети запропоновано ряд методик.
Спочатку ми б хотіли торкнутися прийому, використаного нами при аналізі структури геному нематоди Caenorhabdltis elegans. Він отримав назву «метод відбитків пальців» і має на увазі використання невпорядкованих і неповних наборів фрагментів, які є характеристикою клону, хоча і описують його неповністю: фрагменти розділяють з допомогою електрофорезу в тонкошаровому поліакриламідному гелі.
1.2 Вектори
Стратегія картування грунтується на аналізі випадково відібраних клонів. Абсолютно ясно тому, що при картуванні необхідно мати як можна більш багатої бібліотеки клонів. Бажано також, щоб розмір клонованих вставок дозволяв їх використовувати в подальшому в біохімічній генетиці.
Спочатку ми вибрали для експериментів косміди через порівняно великих розмірів акцептовані ДНК. З тих пір, як більше 10 років тому Коллінс і Хон ввели в практику перший космідний вектор, було сконструйовано велика кількість нових векторів такого роду. Серед них використовується в картуванні Caenorhabdltis, вектори серії Lorist, розроблені Літл та Кроссом. Останні два мають цікаві структурні особливості, зокрема наявність постійного числа копій і, що ще більш важливо для описуваних тут методів, присутність елементів, що збільшують показність клональних бібліотек: термінаторів транскрипції, що запобігають вплив векторних генів, можливе при транскрипції клонованих вставок. Ці вектори містять також промоторні послідовності фагів SP6 і Т7, що полегшують зчитування. Методи конструювання, розщеплення і дефосфорилювання векторних ДНК описані Маниатис.
Я2001 - єдиний Я-вектор, використаний при картуванні Caenorhabditis. І хоча в цьому випадку вставка становить лише половину послідовності космідной вставки, клони виявляються більш стабільними. Нарешті, для деяких областей геному відзначено більш повне представництво саме в А-бібліотеці.
Нещодавно був отриманий вектор, за допомогою якого можна конструювати штучні дріжджові хромосоми. Це відкриття обіцяє переворот в картуванні: з'являється можливість клонувати фрагменти ДНК, на порядок перевищують за розмірами космідние вставки. Ймовірно також, що відповідні геномні бібліотеки виявляться більш представницькими. Метод «відбитків пальців» поки придатний лише для маленьких YAC, але, використовуючи гібридизацію, можна буде приєднувати до космідам і великі фрагменти. Швидше за все, в майбутньому для картування геному буде застосовуватися техніка підбору пар, спеціально розроблена для YAC.
1.3 Селекція клонів
Якщо створено банк клонів і розроблена техніка підбору пар, залишається тільки вибрати стратегію селекції для подальшого аналізу клонів. Для невеликих геномів більш ефективно спочатку підбирати клони випадковим чином. Потім, коли ця можливість вичерпується, необхідно заповнити залишилися прогалини в карті за допомогою гібридізаційного-них або інших методів.
2. Експериментальна частина
Оскільки саме космідная бібліотека є основою нашої роботи, ми вирішили докладно описати тут її створення.
Виділення геномної ДНК
Представлений тут приклад - екстракція ДНК з нематод. Цей метод універсальний і включає мінімум необхідних маніпуляцій.
Хробаків вирощують в рідкому поживному середовищі, відмивають, швидко заморожують і зберігають у рідкому азоті, в аліквотах по 1 г.
1. Подрібніть одну аліквотах до порошкоподібного стану в ступці, охолодженої в рідкому азоті, потім обережно змішайте її з 30 мл розчину, що містить 100 мМ етилен-діамінотетрауксусной кислоти, рН 8,0, 0,5% додецилсульфату натрію і 50 мкг / мл протеїнази К-
2. Інкубують 2 год при 50 ° С.
3. Охолодіть на льоду, додайте рівний обсяг фенолу і екстрагують 15 хв при 4 ° С, повільно перемішуючи. Отцентріфугіруйте і обережно видаліть водний шар піпеткою з широким носиком.
4. Додайте два обсягу 95%-ного спирту і обережно намотайте ДНК на товсту скляну паличку. Отмойте три рази 70%-ним спиртом, висушіть на повітрі і суспендують у 3 мл розчину, який містить 10 мм трис-HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЕДТА.
Для подальшого ефективного отримання космід не обов'язково використання градієнта CsCl.
Приготування фрагментів
Щоб уникнути помилок в процесі картування шляхом підбору пар за методом «відбитків пальців», важливо не використовувати при приготуванні фрагментів лігазну обробку. Ми вважаємо за краще двовимірну електрофоретичної очищення виділенню в градієнті щільності сахарози, так як це дає більш ясну картину розподілу за розмірами і достатній вихід ефективно клонованої фрагментів.
Для запобігання помилок, пов'язаних з «кінцевими ефектами», бажано при аналізі бібліотеки, отриманої на основі часткового гідролізу геномної ДНК, вводити ту ж рестріктази і в анализирующую рестрикційну систему. Так, наприклад, часткова 5а «за1-бібліотека, аналізована за допомогою mdIII і Sa« 3AI, не буде давати артефактів. Що стосується космідних клонів, у яких фінгерпрінтние картини можуть складатися з 20-30 смуг, це вимога необов'язково, однак при картуванні клонів кінцеві ефекти викликають серйозні труднощі.
1. Підберіть необхідні умови для часткового гідролізу. Виберіть чотири варіанти посилення жорсткості обробки так, щоб виходили фрагменти необхідного розміру.
2. Гідролізують 4 аліквотах по 40 мкг свежеекстрагірованной ДНК. Зразки заморозьте.
3. Перед проведенням препаративного електрофорезу порівняйте невелика кількість зразка з K / Hindlll-маркерами, провівши електрофорез в 150 мл 0,3%-ного агарозного гелю HGT ТАЄ, 1 В / см протягом 16 ч. Для коректного вимірювання розмірів фрагментів всі наступні визначення мають бути проведені в тих же умовах.
4. Після необхідного гідролізу об'єднайте аліквотах ДНК, проведіть фенольних екстракцію і спиртове осадження.
5. Розчиніть в 180 мкл розчину ТІ. Додайте 60 мкл неде-натурірующего барвника, нанесіть в 16 лунок 0,4%-ного агарозного гелю LGT ТАЄ.
6. Нанесіть в якості маркерів ТП і інтактну ЯДНК-у препаративних гелі це не вкаже вам точно розміри фрагментів, але допоможе акуратно відрізати смужки гелю. Проведіть електрофорез на протязі 20 годин при 1 В / см і пофарбуйте гель бромідом етидію.
7. Результат електрофорезу ви можете побачити, помістивши гель під довгохвильову ультрафіолетову лампу. Відріжте смужки по 2 мм шириною від всіх 16 доріжок для відділення гідролізованого матеріалу.
8. Розплавте агарозного гель, нагріваючи протягом 10 хв необхідні зразки при 68 ° С в пластикових пробірках. Проведіть фенольних екстракцію, сконцентруйте ізобутанол до 0,3 мл, переосадіте спиртом і проаналізуйте фрагменти, як зазначено вище. 9. Проведіть повторно препаративний LGT-гель-електрофорез для очищення обраної вами фракції, екстрагують її з необхідної смужки гелю і остаточно проаналізуйте мінімальну аліквотах в аналітичному варіанті. Очікуваний вихід -2-4 мкг ДНК з 160 мкг матеріалу. 10. Розчиніть у 20 мкл ТІ.
Суміші для упаковки космід
У продажу є велика кількість пакувальних сумішей, але з міркувань економії можна готувати їх самим. Для цих цілей ми з успіхом використовували штами Escherichia coli: NS428 і NS433. Пакувальні суміші, отримані нами, дозволяли отримати до 10 6 космідних рекомбінантів на 1 мкг вставочний ДНК-
Отримано відомості, що Есо К-активність в пакувальних сумішах може впливати на репрезентативність Я-бібліотек, однак немає даних, що це можливо і для космідних. Є у продажу комерційні Есо К-пакувальні суміші.
З'єднання фрагментів з вектором
Пропонований метод придатний для лігування часткових гідролізатів Sau3Al у вектор Lorist2.
1. Додайте разом 1 мкл BamHI-обробленого де-фосфорильованого Lorist2; 2 мкл приготованих 5аіЗА1-фрагментів; 2 мкл 10 X лігазну буферного розчину; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дітіотрей-толу; 10 мкл води і 1 мкл лігази. Для досягнення максимально можливого лігування помістіть суміш в закритий капіляр.
2. Інкубують 16 год при 14 ° С.
3. Обережно упакуйте, керуючись відповідною методикою.
4. Зберігайте бібліотеку при 4 ° С під хлороформом.
5. Розведіть 5 мкл упакованої бібліотеки в 0,1 мл розчину для розведення.
Додайте 0,2 мл стаціонарної культури клітин. Ми використовуємо для цих цілей лінію 1046. Її слід регулярно пересівати через окремі колонії, контролюючи ознака reck.
Інкубують 20 хв при 37 ° С. Додайте 0,5 мл розчину CY і проінкубіруйте додатково 50 хв. Висейте різні обсяги на чашки з канамицином. Очікуваний вихід - 10 5 -10 6 рекомбінантів на 1 мкг вставочний ДНК.
Висновок
В даний час близько 90% генома С. elegans клоновано в космідах. Кількість клонів, завдяки космідним стиках впало з 900 до 700 і знизилося ще при використанні YAC-стиковок. Одна третина здаються розривів між косміднимі ланцюжками насправді являє собою ще невиявлені невеликі петлі; існує велика кількість реальних розривів, для яких космідние клони дуже рідкісні або недоступні для отримання. У цьому випадку багато дослідники сподіваються вирішити проблему за допомогою великих ланцюжків. Ми усвідомлюємо всю важливість і актуальність якнайшвидшого заповнення розривів.
Наш досвід підказує, що використання космід для картування геномів еукаріотів не позбавлене вад, хоча цей метод виявився дуже вдалим, принаймні для одного прокаріоти. Досить імовірно, що швидке заповнення розривів у карті буде забезпечено методом YAC. Швидше за все, вдасться отримати Я-клони, необхідні для більш точного заповнення прогалин у космідной карті.
Прописи розчинів
1. ТІ: 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЕДТА.
2. 10X лігазну буфер: 0,5 М трис-HCl рН 7,4, 0,1 М MgCl 2.
3. 10X середньо-сольовий рестрикційний буфер: 500 мМ NaCl, 100 мМ трис-HCl рН 7,4, 100 мМ MgCl 2, 10 мМ дітіотрейтола.
4. 10 X ТВЕ в г / л: 108 г. трис-підстави, 55 м. борної кислоти, 9,3 г ЕДТА.
5. 50 X ТАЄ: 242 р. трис-підстави, 57,1 мл крижаної оцтової кислоти, 100 мл 0,5 М ЕДТА рН 8,0, вода до 1 л.
6. 4%-ний денатуруючих гель: 480 р. сечовини, 38 м. акриламіду, 2 г бісакріламіда, води приблизно 800 мл. Розчинити при незначному нагріванні. Додати 1920 смоли Амберліт МВ-3, повільно перемішувати 1 ч. Профільтрувати через скляний фільтр N2. Додати 100 мл 10х ТВЕ та води до 1 л.
7. Барвник з формамідом: 100 мл деіонізованої формамідом, 0,1 г ксіленціанола FF, 0,1 г бромфенолового синього, 0,3 г ЕДТА.
8. Прокип'ячена РНКаза: 100 мг РНКази А, 10 мл 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 15 мМ NaCl. Інкубувати при 100 ° С 15 хв. Охолодити, розлити по пробірках, зберігати зразки при -20 ° С.
9. 2Х TY-середовище в г / л: 1916 тріптона, 10 р. дріжджового екстракту, 5 г NaCl. Довести рН до 7,4. 10. CY-середовище в г / л: 10 г. казамінокіслот, 5 г дріжджового екстракту, 3 г NaCl, 2 г КС1. Довести рН до 7,0.
11. 20Х SSPE: 104 г. NaCl, 15,6 г NaH 2 P0 4 X2H 2 0; 3,7 г ЕДТАх2Н 2 0; 25 мл 4 М NaOH і води до 500 мл.
12. Буфер для розведення фага К: 10 мл 1 М трис-HCl рН 7,4, 5 мл 1 М MgS0 4, 11,7 г NaCl, 1 г желатину, води до 1 л.